JPH08500737A

JPH08500737A - グルカゴン・レセプタ

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Publication number: JPH08500737A
Application number: JP6507380A
Authority: JP
Inventors: アール．キンズボーグル，ウェイン; ジェイ．ジェリネク，ローラ; オー．シェパード，ポール; ジェイ．グラント，フランシス; エル．カイパー，ジョセフ; シー．フォスター，ドナルド; ロク，シ; ジェイ．オハラ，パトリック
Original assignee: ザイモジェネティクス，インコーポレイティド
Priority date: 1992-08-28
Filing date: 1993-08-30
Publication date: 1996-01-30
Anticipated expiration: 2019-04-05
Also published as: EP0658200B1; NZ255922A; PL307746A1; PL178685B1; HU219674B; EP0658200A1; AU5097493A; CA2142819A1; RU2184779C2; DE69333726T8; AU689078B2; DE69333726D1; HU9500596D0; US5919635A; CA2142819C; ATE285472T1; HUT74352A; WO1994005789A1; US5770445A; DE69333726T2

Abstract

(57)【要約】本発明は、グルカゴン・レセプタをエンコードしているDNAセグメントを含んで成る単離されたDNA分子を提供する。また、グルカゴン・レセプタをエンコードしている第一DNAセグメントであってその第一DNAセグメントの発現に必要な追加のDNAセグメントに作用可能な状態で結合されものを含んで成るDNA構築物、並びにこのようなDNA構築物を含む宿主細胞をも提供する。また、本発明は、グルカゴン拮抗物質の存在を検出する方法であって、（ａ）グルカゴン作用物質の存在中、化合物を、レセプタへのその化合物の結合を許容するのに十分な条件及び時間にわたり、応答経路及びその経路を通しての関連応答に結合した組換え体グルカゴン・レセプタに、晒し；そして（ｂ）そのグルカゴン作用物質単独によるその応答経路の剌激に対して、そのグルカゴン・レセプタへのその化合物の結合から生じる応答経路の剌激における減少を検出し、そしてそれからグルカゴン桔抗物質の存在を検出する、段階を含んで成る方法をも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】グルカゴン・レセプタ技術分野本発明は、一般的に、細胞表面レセプタに、そしてより特に、グルカゴン・レセプタ(glucagon receptors)に関する。発明の背景グルカゴンは、膵臓の島のアルファ細胞により生産される29アミノ酸ホルモンである。グルカゴンは、インシュリン反作用ホルモンとして作用することによる、ヒトを含む多くの動物におけるグルコースの正常レベルの維持の原因である。特に、インシュリンが、血中グルコース・レベルを速く減少させることが知られているが、グルカゴンは、その血中グルコース・レベルの上昇に寄与することによりこれらの効果を逆にバランスさせる。グルカゴン及びインシュリンの相互作用は、体内のグルコース・レベルの維持に非常に重要である。グルカゴン又はインシュリンの不均衡は、幾つかの疾患、例えば、真性糖尿病及び糖尿病性ケトアシドーシスにおいて役割を演じると信じられている。ある理論に従えば、真性糖尿病の高血糖状態は、（減少したインシュリンによる）グルコースの不十分利用によるだけではなく、グルカゴンの上昇濃度によるグルコースの過剰生産よってももたらされることができる("Diabetes and the alpha cell,"Diabetes 25:136-151, 1976; Under and Orci,"The esse ntial role of glucagon in the pathogenesis of diabetes mellitus,"Lancet 1:14-16,1975を参照のこと。）。グルカゴンの研究における、並びに疾患、例えば、真性糖尿病におけるグルカゴンの役割における重要な因子は、グルカゴンとの結合の間にその細胞にシグナルを変換し、これにより糖原分解((glycogenolysis)グリコーゲン加水分解）及び糖新生((gluconeogenesis)グルコース合成）の引き金を引くグルカゴン・レセプタである。クルカゴンの効果がサイクリック・アデノシン・モノホスフェート(cAMP)の細胞内レベルの上昇により部分的に仲介されるということが従来信じられている。特に、その細胞レセプタへのグルカゴンの結合はアデニレート・シクラーゼを活性化し、cAMPを作り出し、このように細胞内cAMPのレベルを上昇させる。cAMPの細胞内レベルのこの上昇は、肝臓によるグルコース生産において得られた上昇により糖原分解及び糖新生をもたらすと信じられている(Unson et al.,"Biologica l Activities of des-His¹[Glu⁹]Glucagon Amide,aGlucagon Antagonist,"Pepti des 10:1171-1177,1989を参照のこと。）。しかしながら、追加の経路も、糖原分解及び糖新生の刺激について示唆されている。特に、グルカゴンが、G-プロテインを介してのホスホリパーゼCに結合された肝細胞膜内のレセプタに結合することが報告されている。剌激の間、このタンパク質は、ホスファチジルイノシトール4,5ビホスフェートの分解を引き起こし、第二のメッセンジャー・イノシトール及び1,2ジアシルグリセロールを作り出す(WaRelam et al.,"Activation of two signal-transductionsystems in hep atocytes by glucagon,"Nature 323:68-71,1986: Unson et al., Peptides 10:1 171-1177,1989;及びpittner and Fain.Biochem. J. 277:371-378,1991を参照のこと。）。イノシトール・リン脂質代謝のグルカゴンによる剌激は、それによりグルカゴンが糖原分解及び糖新生を刺激することができる追加の経路であることができる。本発明は、グルカゴン・レセプタ（単数又は複数）を開示し、そしてさらに、他の関連の利点を提供する。発明の要約本発明の態様において、グルカゴン・レセプタをエンコードしている単離されたDNA分子を提供する。用語”単離されたDNA分子”とは、本明細書中で使用するとき、別々であり、離れて且つ単独で置かれ、又は他の成分から分離されたDNA 分子又は配列をいう。例えば、DNA分子は、それがそのゲノム内で自然に会合するところの他の染色体配列を含み、そして特に他の構造遺伝子を含まない他のDN A分子からそれが分離されるときに、単離される。単離されたDNA分子は、それが自然に会合するところの5'及び3'未翻訳配列を含むことができる。本発明の中の１つの態様においては、グルカゴン・レセプタは、ラット及びヒトのグルカゴン・レセプタから成る群から選ばれる。他の態様においては、このDNA分子はヌクレオチド145からヌクレオチド1599までの配列番号14の分子の配列を含んで成る。他の態様においては、このDNA分子は、メチオニン、アミノ酸番号１からトレオニン、アミノ酸番号485までの配列番号15のアミノ酸の配列を含んで成るグルカゴン・レセプタをエンコードしている。他の態様においては、このDNA分子はヌクレオチド53からヌクレオチド1486までの配列番号24の分子のヌクレオチドの配列を含んで成る。さらに他の態様においては、このDNA分子は、メチオニン、アミノ酸番号１からフェニルアラニン、アミノ酸番号477までの配列番号25のアミノ酸の配列を含んで成るグルカゴン・レセプタをエンコードしている。第一DN Aセグメントの発現に必要な追加のDNAセグメントに作用可能な状態で結合されたグルカゴン・レセプタをエンコードしている第一DNAセグメントを含んで成るDNA構築物、このような DNA構築物を含む宿主細胞、並びにグルカゴン・レセプタをエンコードしているD NAセグメントの発現を促進する条件下で宿主細胞を培養する段階を含んで成るグルカゴン・レセプタの生産方法も提供される。本発明の他の態様においては、単離されたグルカゴン・レセプタが提供される。ある態様においては、グルタミン、アミノ酸番号28からチロシン、アミノ酸番号142までの配列番号15のヌクレオチドの配列を含んで成る単離されたグルカゴン・レセプタが提供される。本発明の他の態様においては、グルカゴン・レセプタに特異的に結合する単離された抗体が提供される。ある態様においては、抗体はモノクロナール抗体である。追加の態様においては、グルカゴン・レセプタへのグルカゴンの結合をブロッキングすることができるモノクロナール抗体が提供される。先に記載のモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマも提供される。本発明のさらなる態様においては、グルカゴン拮抗物質の存在の検出方法であって、(a) グルカゴン作用物質(agonist)の存在中、化合物を、そのレセプタへのその化合物の結合を許容するのに十分な条件下及び時間にわたり、応答経路及びその経路を通しての関連応答に結合した組換え体グルカゴン・レセプタに、晒し、そして(b)グルカゴン作用物質単独による応答経路の刺激に対して、グルカゴン・レセプタへの化合物の結合から生じる応答経路の剌激における減少を検出して、そしてそれからグルカゴン拮抗物質の存在を測定する、段階を含んで成る方法が提供される。本発明の様々な態様において、応答経路は、膜結合アデニレート・シクラーゼ応答経路であり、そしてその検出段階は、その膜結合アデニレート・シクラーゼ応答経路によるサイクリックAMP生産における減少の測定を含んで成る。本発明の他の態様においては、その応答経路は、ルシフェラーゼ・リポーター系を含む。本発明のさらに他の態様においては、少なくとも12ヌクレオチドを有するプローブであって、グルカゴン・レセプタをエンコードしている核酸とハイブリダイズすることができるものが、提供される。これらの及び本発明の他の態様は、以下の詳細な説明及び添付図面を参照して明確になるであろう。さらに、より詳細に特定の手順又は組成物物（例えば、プラスミド等）を記載し、そしてそれ故にその全体として引用により取り込まれる様々な文献を以下に記載する。図面の簡単な説明図１は、代表的なグルカゴン・レセプタの構造を例示している。使用される記号は、点線により囲われたEATD（細胞外アミノ末端ドメイン）；CM（細胞膜）；ダッシュ線により囲われたED（エフェクター・ドメイン）；1ID，第一細胞内ループ・ドメイン；2ID，第二細胞内ループ・ドメイン；3ID，第三細胞内ループ・ドメイン；C-ID，カルボキシ末端細胞内ドメイン；1ELD，第一細胞外ループ・ドメイン；2ELD，第二細胞外ループ・ドメイン；3ELD，第三細胞外ループ・ドメイン；TMD1，第一トランスメンブラン・ドメイン；TMD2，第二トランスメンブラン・ドメイン；TMD3，第三トランスメンブラン・ドメイン；TMD4，第四トランスメンブラン・ドメイン；TMD5，第五トランスメンブラン・ドメイン；TMD6，第六トランスメンブラン・ドメイン；及びTMD7，第七トランスメンブラン・ドメインである。図２は、ラット・グルカゴン・レセプタの疎水性を図示している。図３は、グルカゴン・レセプタへの¹²⁵I-グルカゴンの結合を図示している。図４は、グルカゴン・レセプタについての見かけKdのScatchard分析である。図５は、ラット・グルカゴン・レセプタのアミノ酸配列であり、そのトランスメンブラン・ドメインに下線を引いてある。発明の詳細な説明先に述べたように、本発明は、グルカゴン・レセプタをエンコードしている単離されたDNA分子を提供する。それらの生来の立体配置においては、グルカゴン・レセプタは、細胞外アミノ末端ドメイン並びに幾つかのより小さい外部及び内部ドメインから成る膜結合タンパク質として存在すると信じられている（図１参照）。本発明の文脈中では、”グルカゴン・レセプタ”とは、このようなタンパク質及び実質的に同様の誘導体をいう。誘導体は、対立遺伝子変異体及び遺伝子操作された変異体であって保存的アミノ酸置換及び/又はアミノ酸の僅かな付加、置換又は欠失を含むものを包含する。本発明に係るグルカゴン・レセプタは、グルカゴンに結合し、そしてグルカゴンにより提供されたシグナルを細胞に変換することができる。好ましくは、本発明に係るグルカゴン・レセプタは、100nm 以下、より好ましくは50nM以下、そして最も好ましくは33nM以下のKdをもつグルカゴンに結合することができる。グルカゴン・レセプタによるグルカゴン結合を測定するために使用されることができる代表的な検定を、以下実施例３及び６中に、より詳細に記載する。シグナル変換は、典型的には、応答経路が常にではないが一般的に膜結合レセプタに直接的に結合される外部剌激により活性化されるときに起きる。応答経路は、一般的に、細胞応答、例えば、応答性細胞系からの細胞外マトリックス分泌、ホルモン分泌、化学走性、分化、又は応答性細胞の細胞分裂の開始若しくは阻害を引き起こす。本明細書中で使用するとき、応答経路へのレセプタの結合とは、応答経路の直接的活性化又は第二メッセンジャー、例えば、G-プロテインを介してシグナルを変換しての細胞応答経路の活性化をいう。様々な細胞応答経路が、その細胞にグルカゴン結合シグナルを変換するためにグルカゴン・レセプタにより利用されることができ、それは、例えば、アデニレート・シクラーゼ応答経路、及び細胞内カルシウム応答経路を含む。アデニレート・シクラーゼ活性を測定するための検定は、本分野においてよく知られており、そして例えは、Lin et al.(Biochemistry 14:1559-1563,1975)により記載されたものを包含する。本発明は、細胞内カルシウム濃度に基グルカゴン・レセプタの生物学的活性の測定(Grynkiewics et al., J. Biol. Chem.260 3440-3450,198 5を参照のこと。）、並びに以下より詳細に記載するルシフェラーゼ・リポーター系の使用を通しての測定をも提供する。さらに、イノシトール３燐酸経路を介して生じる生物学的応答を、Subers and Nathanson(J.Mol.Cell.Cardiol.20:131 -140,1988)又はPittner and Fain(Biochem.J.277:371-378,1991)中に一般的に記載されているようなイノシトール・ホスフェート代謝を測定することにより、評価することができる。本発明の文脈中では、すべての応答経路が必ずしもグルカゴン・レセプタがシグナルを細胞に変換するために存在する必要はないということに注目すべきである。例えば、ある細胞応答、例えば、細胞内カルシウム・レベルにおける増加は、cAMPの非存在中そのレセプタへのグルカゴンの結合又はイノシトール・ホスフェート・シグナルにより引き金を引かれることもできる。グルカゴン・レセプタcDNAクローンの単離先に述べたように、本発明は、グルカゴン・レセプタをエンコードしている単離DNA分子を提供する。簡単に言えば、グルカゴン・レセプタをエンコードしているゲノム又はcDNA分子を、以下にそして実施例中に記載するような手順に従って細胞及び組織から調製されたライブラリーから得ることができる。本発明において使用することができる細胞及び組織を、様々な哺乳動物であって、例えば、ヒト、マカーク（ザル）、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ラット、及びマウスを含むものから得ることができる。使用することができる好ましい細胞及び組織は、脂肪、腎臓、膵臓、心臓、及び肝臓を含む。本発明の１つの態様においては、ラット・グルカゴン・レセプタを本明細書中に記載する手順を使用して単離及びクローン化する。簡単に言えば、ポリ(A)⁺RN Aを、Sprague Dawleyラットから単離し、そして完全長cDNAsを生成するためにHo uamed et al(Science252:1318-1321,1991)により本質的に記載されているような cDNA合成のための鋳型として使用した。次に約１×10⁶クローンを含むライブラリーを、800塩基対よりも大きなcDNAsの指向性クローニングにより哺乳類細胞発現プラスミド内で構築した。それぞれに5,000クローンを含むプールから調製したプラスミドDNAsを次に、COS-７細胞内にトランスフェクトし、選択し、そして顕微鏡スライド上で増殖させた。このトランスフェクト細胞を72時間後¹²⁵I-グルカゴンとの結合、その後のエマルジョン・ラジオグラフィー(McNahanet al., EMBO J. 10:2821-2832,1991)により分析した。陽性プールを、単一クローンが単離されるまで、順番に分類した。このクローンから得られたプラスミド、pLJ4と命名したものは、54,962ダルトンの予想分子量をもつ485アミノ酸タンパク質をエンコードしている約2.0キロベースの挿入物を含む（配列番号15参照）。本発明の他の態様においては、ヒト・グルカゴン・レセプタを単離及びクローニングする方法を提供する。本明細書中に提供する開示を与えられた様々な技術を使用することができ、これは、例えば、次にヒト・グルカゴン・レセプタをエンコードしている配列を含むライブラリーの同定においても使用されることができるグルカゴン・レセプタをエンコードしている配列（実施例４）を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応("PCR")の使用、その後のレセプタのクローニング（実施例５）を含む。ヒト・グルカゴン・レセプタのクローニングのために特に好ましい戦略を以下の実施例４及び５中に記す。あるいは、ヒトcDNAsを含む発現ライブラリーを実施例１中に本質的に記載するような好適なRNA源から調製し、そして機能的なヒト・グルカゴン・レセプタを発現するクローンについて実施例３中に記載されているようにスクリーンする。組換えグルカゴン・レセプタの生産本発明は、第一ＤＮＡセグメントの発現に必要な追加のDNAセグメントに作用可能な状態で結合されたグルカゴン・レセプタをエンコードしている第一DNAセグメントを含んで成るDNA構築物を含む宿主細胞を培養することによる組換え体グルカゴン・レセプタの生産を提供する。先に述べたように、本発明の文脈中では、”グルカゴン・レセプタ”は、実質的に同様のそれらの誘導体を含むと理解される。その上、グルカゴン・レセプタは、本明細書中に開示するDNA配列に実質的に同様のDNA配列によりエンコードされることができる。本明細書中で使用するとき、DNA配列は、(a) そのDNA配列が（例えば、以下に開示する配列の対立遺伝子変異体を含む）生来のグルカゴン・レセプタ遺伝子のコーディング領域から得られ；(b)そのDNA配列が、高又は低ストリンジェンシーの下本発明のDNA配列にハイブリダイズすることができる(Sambrook et al.,MolecularCloning: A L aboratory Manual,2d Ed., Cold Spring Harbor L aboratory Press,NY,1989)；又はDNA配列がその遺伝子コードの結果として(a)又は(b)において定義したDNA配列に縮重されている、の場合に”実質的に同様”であるとみなされる。変異体グルカゴン・レセプタの発現のために構築されたヌクレオチド配列における突然変異は、そのコーディング配列の読み取り枠を保存するであろう。さらに、この突然変異は、好ましくは、二次mRNA構造、例えば、ループ又はヘアピンであってそのレセプタmRNAの翻訳に有害に影響を及ぼすであろうものを作り出すためにハイブリダイズすることができる相補的な領域を創出しないであろう。突然変異部位は予測されることができるけれども、その突然変異自体の性質が予測されることは必要でない。例えは、所定の部位における突然変異の最適な特徴について選択するために、ランダム突然変異をその標的コドンにおいて行うことができ、そしてその発現グルカゴン・レセプタ突然変異体を生物学的活性についてスクリーンされる。突然変異を、その生来の配列の断片へのライゲーションを可能にする制限部位に隣接する突然変異体配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより特定の座において導入することができる。ライゲーション後、得られた再構築配列は所望のアミノ酸の挿入、置換、又は欠失をもつ誘導体をエンコードしている。あるいは、オリゴヌクレオチド‐指定部位‐特異的突然変異誘発手順を、要求される置換、欠失、又は挿入に従って変更された特定のコドンをもつ変更遺伝子を提供するために、使用することかできる。先に述べた変更を作るための例示的な方法は、Walder et al.,(Gene 42:133,1986);Bauer et al.(Gene 37:73,1985) ,Craik(Bio Techniques,January 1985, 12-19); Smith et al.(Genetic Enginee ring: Principles and Methods, Ｐlenum Press,1981)；及び Sambrook et al.(前記)により開示されている。グルカゴン・レセプタの一次アミノ酸構造を、他の化学的部分、例えば、グリコシル基、脂質、ホスフェート、アセチル基、又は他のタンパク質若しくはポリペプチドとの共有結合又は集合性の結合体を形成することにより修飾することもできる。さらなる態様においては、グルカゴン・レセプタをグルカゴン・レセプタの精製又は同定を容易にする他のペプチドと融合させることができる。例えば、グルカゴン・レセプタをFLAGポリペプチド配列との融合タンパク質として調製することができる（米国特許第4,851,341号；またHoppet al., Bio/Thchnology 6:1204, 1988を参照のこと。）。このFLAGポリペプチド配列は、高く抗原性であり、そして発現された組換え体タンパク質の速い精製を可能にする特異的モノクロナール抗体による結合のためのエピトープを提供する。また、この配列は、As p-Lys対直後の残基においてウシ粘膜エンテロキナーゼにより特異的に解裂される。先に討議したような生来又は変異体のグルカゴン・レセプタのヌクレオチド配列の全て又は部分を含む多数のDNA構築物を便利なものとして調製することができる。本発明の文脈中では、DNA構築物は、全体として天然において他の方法では存在しないであろうやり方で結合及び並置されたDNAのセグメントを含むためにヒトの介入を通して修飾されたDNA分子、又はこのような分子のクローン（一本‐又は二本鎖のいずれか）をいう。本発明のDNA構造は、第一DNAセグメントの発現に必要な追加のDNAセグメントに作用可能な状態で結合されたグルカゴン・レセプタをエンコードしている第一DNAセグメントを含んで成る。本発明の文脈中では、追加のDNAセクメントは一般的にプロモーター及び転写ターミネーターを含むであろうし、そしてさらにエンハンサー及び他の要素を含むことができる。発現ベクターとしても知られるDNA構築物は、問題のポリペプチドの分泌を指示するのに必要なDNAセグメントを含むこともできる。このようなDNAセグメントは、少なくとも１の分泌シグナル配列を含むことができる。好ましい分泌シグナルは、グルカゴン分泌シグナル（プレ‐プロ配列）、アルファ因子シグナル配列（プレ‐プロ配列;Kurjan and Herskowitz,Cell 30:933-943,1982; Kurjan etal .,米国特許第4,546,082号; Brake,欧州特許第116,201号）、PH05シグナル配列(B eck et al.,WO86/00637)、BAR1分泌シグナル配列(MacKay et al., 米国特許第4, 613,572号; MacKay,WO87/002670)、SUC2シグナル配列(Carlson et al., Mol. Ce ll.Biol.3:439-447, 1983)、α-1-アンチトリプシン・シグナル配列(Kurachi et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:6826-6830,1981)、α-2プラスミン・インヒビター・シグナル配列(Tone et al.,J. Biochem.(Tokyo)102:1033-1042, 1987)、組織プラスミノーゲン・アクチベーター・シグナル配列(Yuan et al., J. Biol. Chem.265:13528-13552,1990)又は例えば、Oliverによりレビューされたバクテリアのシグナル配列のいずれか(Ann.Rev.Microbiol.39:615-649,1985)を含む。あるいは、分泌シグナル配列は、例えば、von Heinjeにより確立されたルールに従って合成されることができる(Eur. J. Biochem.133:17-21,1983: J. Mol.Biol. 184: 99-105, 1985; Nuc.Acids Res.14 4683-4690, 1986)。分泌シグナル配列は、単独で使用されることができ、又は組み合わされることもできる。例えば、第一分泌配列を（米国特許第5,037,243号（これを、その全体として引用により本明細書中に取り込む。）中に記載された）Barrierの第三ドメインをエンコードしている配列との組み合わせにおいて使用することができる。Barrierの第三ドメインをエンコードしている配列を、適当な読み取り枠内に問題のDNA配列の3'又はそのDNAセグメントに対して5'に、そして適当な読み取り枠内にその分泌シグナル配列と問題のDNAセグンメントの両方をもつように配置することができる。発現のために、グルカゴン・レセプタをエンコードしているDNA分子は、好適なDNA構築物内に挿入され、これを次に発現のために適当な宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトするために使用する。本発明の実施における使用のための宿主細胞は、哺乳類、鳥類植物、昆虫、バクテリア及び真菌の細胞を含む。好ましい真核生物細胞は、培養された哺乳類細胞系（例えば、げっ歯類又はヒト細胞系）及び真菌細胞であって酵母の種（例えば、サッカロミセス種(Saccharomyces spp .)、特にサッカロミセス・セレビシエ(S. cerevisiae)、シゾサッカロミセス種(Schizosacchromyces spp.)、又はクルイベロミセス種(kluyveromyces spp. ))又は糸状菌（例えば、アスペルギルス種(Aspergillus spp.)、ニューロスポラ種(Neurospora spp.))を含むものを含む。様々な原核生物及び真核生物宿主細胞内で組換え体タンパク質を生産する方法は一般的に本分野において公知である(" Gene Expression Technology,"Methods in Enzymology,Vol.185,Goeddel(ed.),A cademic Press,San Diego,Calif.,1990；また、"Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,"Methods in Enzymology, Guthrie and Fink(eds.)Academic Press,San Diego,Calif., 1991を参照のこと。）。一般的に、宿主細胞は、高レベルにおいて問題のタンパク質を生産するその能力又はそのタンパク質の生物学的活性に必要なプロセシング段階の少なくとも幾つかを行うためのその能力の基づいて選択されるであろう。この方法において、宿主細胞内にトランスフェクトされなければならないクローン化DNA配列の数が最小化されることができ、そして生物学的に活性なタンパク質の全体的な収率が最大化されることができる。本発明における使用に好適なベクターは、YRp7(Struhl et al.,Proc. Natl. A cad. Sci. USA. 76:1035-1039, 1978)、YEp13(Broach et al.,Gene 8:121-133,1 979)、POTベクター(Kawasaki et al., 米国特許第4,931,373号（これを、引用により本明細書中に取り込む。））、pJDB249及びpJDB219(Beggs,Nature 275:104- 108,1978)及びそれらの誘導体を含む。このようなベクターは、一般的に、形質転換体の選択を可能にするために表現型検定が存在するところの優勢表現型を示すいずれかの数の遺伝子の中の１つであることができる選択マーカーを含むであろう。好ましい選択マーカーは、宿主細胞の独立栄養性を補い、抗生物質耐性を提供し、又は細胞が特定の炭素源を利用することができるようにするものであり、そしてLEU2(Broach et al.,ibid)、URA3(Botstein et al., Gene 8:17,1979) 、HIS3(Struhl et al., ibld)又はPOT1(Kawasakl et al.,ibid.)を含む。他の好適な選択マーカーは、酵母細胞に対してクロラムフェニコール耐性を与えるCAT 遺伝子である。酵母内での使用に好ましいプロモーターは、酵母解糖遺伝子(Hitzeman et al. ,J. Biol. Chem. 255:12073-12080, 1980,Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1:419-434, 1982; Kawasaki,米国特許第4,599,311号）又はアルコール・デヒドロゲナーゼ遺伝子(Young et al., in Genetic Engineering of Microorga nisms for Chemicals, Hollaender et al.(eds.),p.355, Plenum, New YorK,198 2; Ammerer, Meth. Enzymol. 101:192-201, 1983）を含む。これに関して、特に好ましいプロモーターは、TPI1プロモーター(Kawasaki,米国特許第4,599,311号，1986）及びADH2-4^cプロモーター(Russell et al., Nature 304:652-654, 1983 ; Irani and Kilgore, 米国特許出願逐次番号第07/784,653号（これを、引用により本明細書中に取り込む。））である。発現単位は、転写ターミネーターを含むこともできる。好ましい転写ターミネーターは、TPI1ターミネーター(Alber and kawasaki,ibid.）である。酵母に加え、本発明のタンパク質を糸状菌、例えば、アスペルギルス菌の株内で発現させることかできる(McKnight et al., 米国特許第4,935,349号（これを、引用により本明細書中に取り込む。））。有用なプロモーターの例は、アスペルギルス・ニジュランス(Aspergillus nidulans)解糖遺伝子から得られたもの、例えば、ADH3プロモーター(McKnight et al., EMBO J. 4:2093-2099,1985）及び tpiAプロモーターを含む。好適なターミネーターの例は、ADH3ターミネーター(M cKnight et al., ibid., 1985)である。このような成分を使用する発現単位は、アスペルギルスの染色体DNA内に挿入されることができるベクター内にクローン化される。真菌を形質転換するための技術は、文献中によく知られており、そして例えば、Beggs(ibid.)、Ｈinnen et al.( Proc.Natl.Acad.Sci. USA.75 1929-1933,197 8))、Yelton et al.( Proc.Natl.Acad.Sci.USA.81:1740-1747,1984))、及びRuss el(Nature 301:167-169,1983)により記載されている。宿主細胞の遺伝子型は、一般的には、その発現ベクター上に存在する選択マーカーにより補われる遺伝子欠陥を含むであろう。特定の宿主及び選択マーカーの選択は、十分に当業者のレベル内にある。酵母内での異種タンパク質の生産を最適化するために、例えば、宿主株が突然変異、例えば、酵母pep4突然変異(Jones, Genetics 85:23-33, 197 7)であって減少したタンパク質分解活性をもたらすものを担持することが好ましい。真菌細胞に加えて、培養哺乳類細胞を本発明における宿主細胞として使用することができる。本発明における使用に好ましい培養哺乳類細胞は、COS-1(ATCC No. CRL 1650)、COS-7(ATCC No. CRL 1651)、BHK(ATCC No. CRL1632)、及び293(ATCC No. CRL 1573; Graham et al., J.Gen. Virol. 3 6:59-72,1977)細胞系を含む。好ましいBHK細胞系は、（寄託番号CRL 10314の下A merican Type Culture Collectionにより寄託された）BHK570細胞系である。さらに、Rat Hep I(ATCC No. CRL 1600)、Rat Hep II(ATCC No. CRL 1548)、TCMK( ATCC No. CCL 139)、ヒト肺(ATCC No.CCL 75.1)、ヒト肝癌(ATCC No. HTB-52) 、Hep G2((ATCC No. HB 8065)、マウス肝臓(ATCC No. CCL 29.1)、NCTC 1469(AT CC No. CCL 9.1)、SP2/0-Ag14(ATCC No. 1581)、HIT-T15(ATCC No. CRL 1777)、及びRINm 5AHT₂ B(Orskov and Nielson, FEBS 299(1): 175-178, 1988)を含む多数の他の哺乳類細胞系を本発明において使用することができる。本発明の実施における使用のための哺乳類発現ベクターは、クローン化遺伝子又はcDNAの転写を指定することができるプロモーターを含むであろう。好ましいプロモーターは、ウイルス・プロモーター及び細胞のプロモーターを含む。ウイルス・プロモーターは、直初期サイトメガロウイルス・プロモーター(Boshart e t al.,Cell41:521-530, 1985)及びSV40プロモーター(Subramani et al., Mol.Ce ll. Biol. 1:854-864, 1981) を含む。細胞プロモーターは、マウス・メタロチオネイン-１プロモーター(Palmiter et al., 米国特許第4,579,821 号）、マウスV κプロモーター(Bergman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81:7041-7 045, 1983; Grant et al.,Nuc. Acids Res. 15:5496, 1987) 及びマウスV _H プロモーター(Loh et al., cell 33:85-93, 1983) を含む。特に好ましいプロモーターは、アデノウイルス２からの主要な後期プロモーターである(Kaufman and S harp, Mol. Cell. Biol. 2:1304-13199, 1982)。このような発現ベクターは、プロモーターから下流に及びペプチド又は問題のタンパク質をエンコードしているDNA 配列から上流に位置する１セットの RNA スプライス部位を含むこともできる。好ましいRNA スプライス部位は、アデノウイルス及び／又は免疫グロブリン遺伝子から得られることができる。またその発現ベクター内に問題のコーディング配列の下流に位置するポリアデニレーション・シグナルも含まれる。好適なポリアデニレーション・シグナルは、SV40(K aufman and Sharp, ibid.)からの初期及び後期ポリアデニレーシヨン・シグナル、アデノウイルス5 E1B 領域からのポリアデニレーション・シグナル及びヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター(DeNoto et al., Nuc. Acids Res.9:3719-3730 ,1981)を含む。発現ベクターは、非コーディング・ウイルス・リーダー配列、例えば、そのプロモーターとそのRNAスプライス部位との間に位置するアデノウイルス2 トリパルチット・リーダーを含むことができる。好ましいベクターは、エンハンサー配列、例えば、SV40エンハンサー及びマウスμエンハンサー(Gillies ,Cell 33:717-728,1983)を含むこともできる。発現ベクターは、アデノウイルス VA RNAs をエンコードしている配列を含むこともできる。好適なベクターは、商業的な源( 例えは、Stratagene, La Jolla, CA))から得られることができる。クローン化DNA配列を培養哺乳類細胞内に、例えば、燐酸カルシウム仲介トランスフェクション(Wigler et al., Cell 14:725,1978; Corsaro and Pearson, S omatic Cell Genetics 7:603,1981; Graham and van der Eb, Virology 52:456, 1973)、エレクトロポレーション(Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982)、又はDEAE- デキストラン仲介トランスフェクション(Ausubel et al.(eds.),Curr ent Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons,Inc., NY, 1987)( これを、引用により本明細書中に取り込む。)により導入することができる。
クローン化DNAを安定して組み込んだ細胞を同定するために、選択マーカーが一般的にその遺伝子又は問題のcDNAと一緒にその細胞内に導入される。培養哺乳類細胞内での使用に好ましい選択マーカーは、薬物、例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン、及びメトトレキセートに対する耐性を付与する遺伝子を含む。この選択マーカーは、増幅可能な選択マーカーであることができる。好ましい増幅可能な選択マーカーは、DHFR遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子である。選択マーカーは、Thilly(Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA( これを、引用により本明細書中に取り込む。))によりレビューされている。選択マーカーの選択は、十分に当業者のレベル内にある。選択マーカーをグルカゴン・レセプタ配列と同時に別々のベクター上で細胞内に導入することができ、又はそれらを、同一ベクターに導入することもできる。同一ベクター上にある場合、選択マーカー及びグルカゴン・レセプタ配列は、異なるプロモーター又は同一プロモーターの制御下にあることができ、後者の編成が2 シストロン・メッセージを作り出す。このタイプの構築物は本分野において公知である( 例えば、Levinson and Simonsen,米国特許第4,713,339号) 。また、"キャリアーDNA"として知られる追加のDNA を細胞内に導入される混合物に加えることが有利である。トランスフェクト哺乳類細胞は、問題のDNA配列( 単数又は複数) の発現を開始させるために一定の時間、例えば、１-２日間成長に供される。次に薬物選択を。安定した融合において選択マーカーを発現している細胞の成長について選択するために適用する。増幅可能な選択マーカーによりトランスフェクトされた細胞について、その薬物濃度を、そのクローン化配列の増加コピー数について選択するための段階的なやり方で増加させ、これにより発現レベルを増加させる。導入された配列を発現する細胞を、所望の形態での又は所望のレベルにおける問題のタンパク質の生産について選択し、そしてスクリーンする。これらの基準を満足する細胞を次にクローン化し、生産のためにスケール・アップすることができる。本発明の実施における使用に好ましい原核生物宿主細胞は、バクテリア大腸菌(Escherichia coli)の株である。但し、バチルス(Bacillus)及び他の属も有用である。これらの宿主を形質転換し、そしてその中にクローン化された外来DNA 配列を発現させるための技術は、本分野においてよく知られている( 例えば、Mani atis et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLa boratory, 1982( これを、引用により本明細書中に取り込む。); 又はSambrook et al.,前記を参照のこと。) 。バクテリア宿主内でのクローン化DNA配列を発現するために使用されるベクターは、一般的に選択マーカー、例えば、抗生物質耐性のための遺伝子、及び宿主細胞内で機能するプロモーターを含むであろう。適当なプロモーターはtrp(Nichols and Yanofsky, Meth. Enzymol. 101:155-164,1 983) 、lac(Casadaban et al., J.Bacteriol. 143:971-980，1980)、及びλファージ(Queen.J.Mol.Appl.Genet.2:1-10,1983)プロモーター系を含む。バクテリアを形質転換するのに有用なプラスミドは、pBR322(Bolivar et al., Gene 2:95-1 13,1977) 、pUC プラスミド(Messing, Meth. Enzymol. 101:20-78, 1983; Vieri a andMessuing, Gene 19:259-268,1982) 、pCQV2(Queen,ibid.)及びそれらの誘導体を含む。プラスミドは、ウイルス及びバクテリアの要素の両方を含むことができる。本明細書中に提供する教示与える場合、プロモーター、ターミネーター及び本発明のグルカゴン・レセプタをエンコードしている発現ベクターを植物、鳥類及び昆虫細胞内に導入する方法は、当業者には自明であろう。例えば、昆虫細胞内での異種DNA 配列の発現のためのベクターとしてのバキュロウイルスの使用は、Atkinson etal.(Pestic. Sci. 28:215-2 24,1990) によりレビューされている。さらに、植物細胞内での遺伝子発現のためのベクターとしてのアグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizoge nes)の使用は、Sinker et al(J.Biosci.(Bangalore)11:47-58,1987)によりレビューされている。本発明のDNA 構築物を含む宿主細胞を次にグルカゴン・レセプタをエンコードしているDNA セグメントを発現させるために培養する。この細胞を選ばれた宿主細胞の成長に必要な栄養を含む培養基中で標準的な方法に従って培養する。様々なな好適な培地が本分野において公知であり、そして一般的に炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン及びミネラル、並びに他の成分、例えば、成長因子又は結成であってその特定の宿主細胞により要求されることができるものを含む。培養培地は、一般的に、例えば、薬剤選択又はそのDNA 構築物上の又はそのDNA 構築物と同時トランスフェクトされる選択マーカーにより補われる必須栄養における欠陥により、そのDNA 構築物( 単数又は複数) を含む細胞について選択されるであろう。酵母細胞に好適な培養条件は、例えば、化学的に定められた培地であって非アミノ酸窒素源又は酵母エキスであることができる窒素源、無機塩、ビタミン及び必須アミノ酸補給物を含んで成るものの中で4 ℃〜37℃の間の温度において、特に好ましくは30℃において培養することを含む。培地のpHは、好ましくは2を超え、そして8未満のpH、より好ましくはpH 5-6において維持される。安定pHを維持する方法は、緩衝液化及び一定pH制御を含む。pH制御のための好ましい剤は、水酸化ナトリウムである。好ましい緩衝液化剤は、琥珀酸及びBis-Tris(Sigma C hemical Co., St. Louis, MO) を含む。酵母宿主細胞が異種タンパク質を超糖添加する傾向のため、アスパラギン結合糖添加に必要な遺伝子内に欠陥をもつ酵母細胞内で本発明のグルカゴン・レセプタを発現させることが好ましくあるとができる。このような細胞は、好ましくは、浸透圧安定剤を含む培地中で培養される。好ましい浸透圧安定剤は、培地中に0.1M〜1.5Mの間の濃度において、好ましくは0.5M又は1.0Mの濃度において補われたソルビトールである。培養哺乳類細胞は、一般的に商業的に入手可能な血清含有又は血清不含培地中で培養される。使用する特定の細胞系に適当な培地及び培養条件の選択は、当業者のレベル内にある。グルカゴン・レセプタは、非ヒト- トランスジェニック動物、特にトランスジェニックな温血動物内で発現されることもできる。マウス、ウサギ、ヒツジ及びブタを含むトランスジェニック動物を産生する方法は、本分野において公知であり、そして例えば、Hammeret al(Nature 315:680-683,1985) 、Palmiter et al. (Science 222:809-814,1983) 、Brinster et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA8 2:4438-4442, 1985)、Palmiter and Brinster(Cell 41 343-345,1985)及び米国特許第4,736,866 号( これを、引用により本明細書中に取り込む。) により開示されている。簡単に言えば、適当に配置された発現調節配列と一緒に発現されるべきDNA 配列を含む発現単位を、受精卵の前核内に導入する。DNA の導入は一般的にはマイクロインジェクシヨンにより行われる。インジェクトされたDNA の組み込みを組織サンプル、典型的には尾組織のサンプルからのDNAのブロット分析により検出する。導入されたDNA が、その動物の子孫に受け継がれるようにその動物の生殖系に取り込まれることが一般的に好ましい。本発明の好ましい態様においては、トランスジェニック動物、例えば、マウスを、グルカゴン・レセプタ配列を破壊するための突然変異を標的とすることにより開発する(Mansour et al., "Disruption of the protooncogene int-2 in mou se embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes,"nature 336:348-352, 1988) 。このような動物を代謝におけるグルカゴン・レセプタの役割を研究するためのモデルとして容易に使用することができる。グルカゴン・レセプタ・ペプチド先に述べたように、本発明は、グルカゴン・レセプタ・ペプチドをも提供する。本発明の文脈中では、グルカゴン・レセプタ・ペプチドは、トランスメンブラン・ドメインを含まず、そして長さにおいて少なくとも10アミノ酸である先に討議したグルカゴン・レセプタの部分又はそれらの誘導体を含むと理解される。簡単に言えば、グルカゴン・レセプタ並びに推定トランスメンブラン・ドメインの構造は、例えば、P/C Gene or Intelligenetics Suite(Interigenetics, Mt. Vi ew, CA) の疎水性プロット関数を使用して、又はKyteand Doolittle(J. Mol. Bi ol. 157:105-132,1982) により記載された方法に従って、その一次翻訳生成物から予測されることができる。ラット・グルカゴン・レセプタの疎水性プロットを図2 中に示した。図表により結合されるべきことを欲しないけれども、この疎水性分析に基づき、グルカゴン・レセプタは図1 中に示す一般構造をもつと信じられている。特に、これらのレセプタは、それぞれがトランスメンプラン・ドメインにより分けられている、1 つの細胞外アミノ末端ドメイン、3 つの細胞外ループ・ドメイン及び4 つの細胞内ループ・ドメインを含んで成ると信じられている。本発明の1 つの態様においては、グルカゴン・レセプタの細胞外アミノ末端ドメインを含んで成る単離グルカゴン・レセプタ・ペプチドが提供される。好ましい態様においては、配列番号１５のアミノ酸配列、グルタミン、アミノ酸番号28 から、チロシン、アミノ酸番号142 まで、を含んで成る単離グルカゴン・レセプタ・ペプチドが提供される。また、そのグルカゴン・レセプタの細胞外及び細胞内ループ・ドメインから選ばれることができる他の単離グルカゴン・レセプタ・ペプチドも提供される( 図1 及び5 参照) 。1 つの態様においては、グルカゴン・レセプタ・ペプチドは、1ID(配列番号15、リシン、アミノ酸番号169 から、ヒスチジン、アミノ酸番号178まで）、1ELD( 配列番号15、チロシン、アミノ酸番号203 から、イソロイシン、アミノ酸番号231 まで）、2ID(配列番号15、フェニルアラニン、アミノ酸番号259 から、セリン、アミノ酸番号266 まで）、2ELD( 配列番号15、バリン、アミノ酸番号293 から、イソロイシン、アミノ酸番号307 まで) 、3ID(配列番号15、ロイシン、アミノ酸番号334 から、リシン、アミノ酸番号345 まで) 、及び3ELD( 配列番号15、アスパラギン酸、アミノ酸番号371 から、セリン、アミノ酸番号380 まで) から成る群から選ばれる。本発明のグルカゴン・レセプタ・ペプチドを、先に討議した組換え技術を使用して、又は合成法により、生産することができ、そして以下に記載するようにさらに精製することができる。グルカゴン・レセプタ・ペプチドの精製単離グルカゴン・レセプタ・ペプチドを、とりわけ、好適な宿主/ ベクター系を培養し、本発明の組換え翻訳生成物を作り出すことにより生産することができる。このような細胞系からの上清を次に、グルカゴン・レセプタ・ペプチドを単離するための様々な精製手順により処理することができる。例えば、上清を最初に、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、Amicon又はMillip ore Pellicon限外濾過装置を使用して濃縮することができる。濃縮後、その濃縮物を好適な精製マトリックス、例えば、好適な支持体に結合されたグルカゴン又は抗- グルカゴン抗体に適用することができる。あるいは、アニオン又はカチオン交換樹脂を、そのレセプタ又はペプチドを精製するために使用することができる。最後に、1 以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC) 段階を、グルカゴン・レセプタ・ペプチドをさらに精製するために使用することができる。グルカゴン・レセプタ・ペプチドは、たった1 つのバンドがSDSーポリアクリルアミド・ゲル分析、その後のCoomassie Brilliant Blueによる染色の後に検出される場合に本発明の文脈中で" 単離" 又は精製されたとみなす。グルカゴン・レセプタに対する抗体本発明の１つの態様において、それらの誘導体、並びにこれらのタンパク質の部分又は断片、例えば、先に討議ひたグルカゴン・レセプタ・ペプチドを含むグルカゴン・レセプタを、グルカゴン・レセプタに特異的に結合する抗体を調製するために使用することができる。本発明の文脈中、用語" 抗体" は、ポリクロナール抗体、モノクロナール抗体、それらの断片、例えば、F(ab')₂及びFab 断片、並びに組換えにより作られた結合パートナーを含む。これらの結合パートナーは、特異的に結合するモノクロナール抗体をエンコードしている遺伝子からの可変領域を取り込んでいる。抗体は、それらがグルカゴン・レセプタに10⁷ M ^ー1以上のK _a をもって結合する場合に特異的に結合すると定義される。モノクロナール抗体又は結合パートナーのアフィニティーは、当業者により容易に測定されることができる(Scatchard,A nn.Acad.Sci.51:660-672,1949 を参照のこと。) 。ポリクロナール抗体は、様々な温血動物、例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、チキン、ウサギ、マウス、又はラットから当業者により容易に作り出されることができる。簡単に言えば、グルカゴン・レセプタは、腹膜内、筋中、眼内、又は皮下注射を通して動物を免疫感作させるために使用される。グルカゴン・レセプタ又はグルカゴン・レセプタ・ペプチドの免疫原性をアジュバント、例えば、Freund's完全又は不完全アジュバントを通して増加することかできる。幾つかのブースター免疫感作の後、血清の小サンプルを採取し、そのグルカゴン・レセプタに対する反応性についてテストする。様々な検定をグルカゴン・レセプタに特異的に結合する抗体を検出するために使用することができる。例示的な検定は、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spr ing Harbor Laboratory Press, 1988 中に詳細に記載されている。このような検定の代表的な例は：向流免疫電気泳動(CIEP)、ラジオイムノアッセイ、放射免疫沈降、酵素- 結合イムノ- ソルベント検定(ELISA) 、ドット・ブロット検定、阻害又は競合検定、及びサンドイッチ検定( 米国特許第4,376,110 号及び第4,486, 530 号; また Antibodies: A Laboratory Manual,前記を参照のこと。) 。特に好ましいポリクロナール抗血清は、背景よりも少なくとも3 倍大きいシグナルを与えるであろう。一旦、動物の力価がグルカゴン・レセプタに対するその反応性に関してプラトーに達すれば、大量のポリクロナール抗血清をその動物の1 週間に1 回の出血、又は全採血により容易に得ることができる。モノクロナール抗体も、よく知られた技術を使用して容易に作り出すことができる( 米国特許第RE32,011号、第4,902,614 号、第4,543,439 号、及び第4,411, 993 号; またMonoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biolog ical Analyses, Pleneum Press, Kennett, McKearn, and Bechtol(eds.), 1980, and Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.),Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988)を参照こと。) 。簡単に言えば、1 つの態様においては、被検動物、例えば、ラット又はマウスにグルカゴン・レセプタに対して免疫応答を作り出すのに好適なグルカゴン・レセプタの形態を注射する。好適な形態の代表的な例は、とりわけ、そのグルカゴン・レセプタ、又はそのグルカゴン・レセプタに基づくペプチドを発現する細胞を含む。さらに、得られた免疫応答を、例えば、そのレセプタ又はレセプタ・ペプチドを他のタンパク質、卵白アルブミン又はkeyhole limpetヘモシアニン(LLH) と結合させることにより、又はアジュバント、例えば、Freund's完全又は不完全アジュバントの使用を通して増加させるための多くの技術が公知である。最初の免疫感作を腹膜内、筋中、眼内、又は皮下経路を通してのものであることができる。最初の免疫感作の1 〜3 週間の間の後動物を他のブースター免疫感作により再免疫感作させることができる。次に動物をテスト採血し、そしてその血清を先に記載したような検定を使用してグルカゴン・レセプタへの結合についてテストする。追加の免疫感作を、その動物がグルカゴン・レセプタに対するその反応性においてプラトーとなるまで行うこともできる。次に動物にグルカゴン・レセプタ又はグルカゴン・レセプタ・ペプチドの最後のブーストを与え、そして3 〜4 日後に殺すことができる。このとき、その脾臓及びリンパ節を収穫し、そしてその臓器をメッシュ・スクリーンに通過させ、又はその細胞を包み込む脾臓及びリンパ節膜を破砕することにより単一細胞懸濁液まで破壊する。1 つの態様においては、赤血球細胞をその後に低張液の添加、その後に高張液への戻しにより、溶解する。他の態様においては、モノクロナール抗体の調製に好適な細胞をインビトロにおける免疫感作技術の使用を通して獲得する。簡単に言えば、動物を殺し、そしてその脾臓及びリンパ節細胞を先に記載したように取り出す。単一細胞懸濁液を調製し、そして細胞を先に記載したような免疫応答を作り出すのに好適であるグルカゴン・レセプタの形態を含むカルチャー内に入れる。その後、リンパ球を収穫し、そして以下に記載するように融合する。先に記載したようなインビトロにおける免疫感作の使用を通して又は免疫感作された動物から得られた細胞を、ウイルス、例えば、Epstein-Barrウイルス(EBV ) によるトランスフェクシヨンにより不死化することができる(Glasky and Read ing, Hybridoma 8(4):377ー389, 1989)。あるいは、好ましい態様においては、収穫された脾臓及び/ 又はリンパ節細胞を、モノクロナール抗体を分泌する" ハイブリドーマ" を作り出すために、好適なミエローマ細胞と融合させる。好適なミエローマ系は、好ましくは、抗体の構築又は発現において欠陥をもち、そしてさらに、その免疫感作された動物からの細胞と同系である。多数のこのようなミエローマ細胞系は、本分野においてよく知られており、そして源、例えば、American Type Culture Collecti on(ATCC), Rockville, Maryland(Catalogue of CellLines & Hybridomas, 6th e d., ATCC, 1988参照) から獲得されることができる。代表的なミエローマ系は: ヒトについての、UC 729-6(ATCC No.CRL 8061)、MC/CAR-Z2(ATCC No.CRL 8147) 、及びSKOー007(ATCC No.CRL 8033);マウスについての、SP2/0-Ag14(ATCC No.CRL 1581)及びP3X63Ag8(ATCC No.TIB 18); 及びラットについての、Y3-Ag1.2.3(ATC C No.CRL 1631)及びYB2/0(ATCC No.CRL 1662) を含む。特に好ましい融合系はNS -1(ATCC No.TIB 18)及びP3X63-Ag8.653(ATCC No.CRL1580) であってマウス、ラット、又はヒト細胞系のいずれかとの融合のために使用されることができるものを含む。ッミエローマ細胞系と免疫感作動物からの細胞との間の融合を、ポリエチレン・グリコール(PEG)(Antibodies: A Laboratory Manual,Harlow and Lane( eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988参照) 又はエレクトロフュージヨン(Zimmerman and Vienken,J. Membrane Biol. 67:165-182, 1982参照) を含む様々な方法により行うことができる。上記融合の後、細胞を好適な培地、例えば、RPMI 1640 又はDMEM(Dulbecco's Modified Eagles Medium)(JRH Biosciences,Lenexa,Kan.)を含む培養プレート内に置く。この培地は、追加の成分、例えば、Fetal Bovine Serum(FBS、すなわち、Hyclone, Logan, Utah,又はJRH Biosciences)からのもの) 、免疫感作のために使用されるものと同じ種の赤ちゃん動物から収穫された胸腺細胞、又はその培地を固化するための寒天をも含むことができる。さらに、この培地は、融合脾臓及びミエローマ細胞の成長を選択的に許容する試薬を含まなければならない。特に好ましいのは、HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン)(Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri)の使用である。約7 日間の後、得られた融合細胞又はハイブリドーマを、グルカゴン・レセプタを認識する抗体の存在を決定するためにスクリーンすることができる。幾つかのクローンの希釈及び再検定の後、グルカゴン・レセプタに結合する抗体を産生するハイブリドーマを単離することができる。モノクロナール抗体を構築するために他の技術をも使用することができる(Wil liam D. Huse et al.,"Generation of a Large Combinational Library of the Immunogloblin Repertoire in Phage Lambda,"Science 246:1275-1281, Decembe r 1989参照; またL.Sastryet al."Cloning the Immunological Repertoire in E scherichiacoli for Generation of Monoclonal Catalytic Antibodies: Constr uction of a Heavy Chain Variable Region-Specific cDNA Library,"Proc. Nat l. Acad. Sci. USA 86:5728-5732, August 1989参照; またMichelle Alting-Mee s et al.,"Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas, "Strategies in Molecular Biology 3:1-9, january 1990参照; これらの文献は、抗体の産生を組換え技術を通して可能にする、Stratacyte,
L a Jolla, Cliforniaから入手可能な商業システムについて記載している。) 。簡単に言えば、mRNAをB 細胞集団から単離し、そしてλIMMUNOZAP(H)及びλIMMUNO ZAP(L)ベクター内で重鎖及び軽鎖免疫グロブリンcDNA発現ライブラリーを創出するために使用する。これらのベクターを個別にスクリーンし、又はFab 断片又は抗体を作るために同時発現させることができる(Huse et al., 前記; またSastry et al.,前記を参照のこと。) 。陽性プラークを次に、大腸菌(E.coli)からのモノクロナール抗体断片の高レベルの発現を許容する非- 溶解性プラスミドに変換することができる。同様に、結合パートナーを、特異的結合性抗体をエンコードしている遺伝子の可変領域を取り込むための組換えDNA 技術を使用して構築することもできる。これらのタンパク質の構築は、当業者により容易に行われることができる(James W.Larrick et al., "Polymerase Chain Reaction Using Mixed Prim ers: Cloning of Human Monoclonal Antibody Variable Region Genes From Sin gle Hybridoma Cells,"Biotechnology 7:934-938, September 1989; Riechmanne t al., "Reshaping Human Antibody with Enhanced Affinity and Specificity for its Antigen by Protein Enginerring, "Nature 328:731-734, 1987; Verho eyen et al., "Reshaping Human Antibodies: Grafting an Antilysozyme Activ ity,"Science 239:1534-1536, 1988; Chaudhary et al., ”A Recombinant Imm unotoxin Consisting of Two Antibody Variable Domains Fused to Pseudomona s Exotoxin, "Nature 339:394-397, 1989参照; また、米国特許第5,132,405 号名称"Biosynthetic Antibody Binding Sites"参照) 。これらの開示を本明細書中に提供する。簡単に言えば、1 つの態様においては、グルカゴン・レセプタ特異的結合ドメインをエンコードしているDNA セグメントを、特異的結合性モノクロナール抗体を産生するハイブリドーマから増幅し、そしてヒト抗体を産生する細胞のゲノム中に直接的に挿入する(Verhoeyen et al.,前記参照; またReichman n et al., 前記参照) 。この技術は、特異的結合性マウス又はラット・モノクロナール抗体の抗原結合部位がヒト抗体内に転移されることを可能にする。このような抗体は、好ましくは、ヒトにおける治療的用途のためのものである。なぜなら、それらがラット又はマウス抗体と同様な抗原性をもたないからである。あるいは、抗原結合部位( 可変領域) は、他の完全に異なるタンパク質に結合されるか又はその内に挿入されるかのいずれかを行われることができ(Chaudhary et al.,前記参照) 、抗体の抗原結合部位並びに完全に異なるタンパク質の機能的活性をもつ新たなタンパク質をもたらす。当業者が理解するであろうように、抗体の抗原結合部位又はグルカゴン・レセプタ結合ドメインは、抗体の可変領域内にあることができる。さらに、哺乳類グルカゴン・レセプタに特異的に結合する抗体のより小さい部分又は可変領域をエンコードしているDNA 配列も本発明の文脈中で使用することができる。これらの部分は、以下に記載する検定を使用してグルカゴン・レセプタへの特異的結合について容易にテストされることができる。好ましい態様においては、問題のモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマからの可変領域をエンコードしている遺伝子をその可変領域のためのオリゴヌクレオチド・プライマーを使用して増幅することができる。これらのプライマーは当業者により合成されることができ、又は商業的に入手利用できる源から購入されることができる。Stratacyte(La Jolla, Calif.)は、とりわけ、V _Ha、V _Hb ，、V _Hc、V _hd、C _H1、V _L及びC _L 領域のためのプライマーを含むマウス及びヒト可変領域のためのプライマーを販売している。これらのプライマーを、重鎖又は軽鎖可変領域を増幅するために使用することができ、これを次にベクター、例えば、IMMUNOZAP*(H) 又はIMMUNOZAP*(L)(Stratacyte) 内にそれぞれ挿入することができる。これらのベクターを次に発現のために大腸菌(E.coli)内に導入することができる。これらの技術を使用して、V _H 及びV _Lドメインの融合を含む大量の一本鎖タンパク質を作り出すことができる(Birdet al., Science 242:423 -426,1988参照) 。他の態様においては、結合パートナーをその発現ベクター内で他のタンパク質、例えば、毒素に融合させる。この結合パートナーにより結合された細胞は、これ故、その毒素の取り込みにより殺されることができる(Chaudhary et al.,前記参照) 。一旦、好適な抗体又は結合パートナーが得られたならば、それらは、当業者によく知られた多くの技術により単離され又は情製されることができる(Antibodie s: A Laboratory Manual, 前記参照) 。好適な技術は、ペプチド又はタンパク質のアフィニティー・カラム、HPLC又はRP-HPLC、プロテインA 又はプロテインG カラム上での精製、又はこれらの技術のいずれかの組み合わせを含む。本発明の文脈中、抗体又は結合パートナーを定義するために使用するとき、用語" 単離された" とは、" 他の血液成分を実質的に含まない" ことを意味する。本発明に係る抗体及び結合パートナーは、多くの用途をもつ。例えば、抗体をグルカゴン・レセプタ- 担持細胞を分けるためのフロー・サイトメトリーにおいて、又はグルカゴン・レセプタ- 担持組織を組織学的に染色するために、使用することができる。簡単に言えば、細胞上のグルカゴン・レセプタを検出するために、細胞をグルカゴン・レセプタに特異的に結合する標識付けされたモノクロナール抗体とインキュベートし、その後結合した抗体の存在を検出することができる。これらの段階は、追加の段階、例えば、非結合抗体を除去するための洗浄により行われることもできる。本発明における使用に好適な標識は、本分野においてよく知られており、とりわけ、フルオレセイン・イソチオシアネート(FITC) 、フィコエリトリン(PE)、ホス・ラディッシュ・ペルオキシダーゼ(HRP)、及びコロイダル・ゴールド(collidal gold)を含む。フロー・サイトメトリーにおける使用に特に好ましいのは、FITCであり、これは、"Conjugation of Fluorescei n Isothiocyanate to Antibodies. I.Experiments on the Conditions of Conju gation,"Immunology 18:865-873,1970中のKeltkampの方法に従って精製抗体に結合されることができる。( また、KeltRamp, "Conjugation of Fluorescein Isot hi cyanate to Antibodies, II.A Reproducible Methods," Immunology 18:875-881 , 1970; 及びGoding, "Conjugation of Antibodies with Fluorochromes: Modif ication to the Strandard Methods, "J.Immunol. Methods 13:215-226, 1970 を参照のこと。) 。好ましい組織学的染色、HRP を、Nakane and Kawaoi の方法に従って精製抗体と結合させることができる("Peroxidase-Labeled Antibody: A New Method of Conjugation, "J.Histochem.Cytochem.22:1084-1091, 1974;またTijssen and Kurstak, "Highly Efficient and Simple Methods for Preparat ion of Peroxidase and Active Peroxidase Antibody Conjugates for Enzyme I mmunoassays,"Anal.Biochem.136:451-457,1984参照) 。さらに、精製抗体又は結合パートナーを、インビトロ又はインビボにおけるグルカゴン・レセプタへのグルカゴンの結合をブロックするために治療的に使用することもできる。簡単に言えば、ブロッキング抗体は、グルカゴンがそのレセプタに結合するのを防ぎ、又はそのグルカゴンがシグナル変換に影響を及ぼすことを防ぐような方法でグルカゴン・レセプタ・エピトープに結合するような抗体である。先に述べたように、様々な検定を、グルカゴン・レセプタへのグルカゴンの結合をブロックし又は阻害する抗体を検出するために使用することができ、これらは、とりわけ、先に記載したような阻害及び競合検定を含む。1 つの態様においては、( 先に記載したように調製した) モノクロナール抗体を、グルカゴンの非存在中、並びにグルカゴンの変動濃度の存在中でのグルカゴン・レセプタへの結合について検定する。ブロッキング抗体又は結合パートナーは、例えば、グルカゴン・レセプタに結合し、そしてグルカゴンの存在中、そのグルカゴン・レセプタへのグルカゴンの結合をブロックし又は阻害するようなものとして同定される。治療的に使用されるべき抗体又は結合パートナーは、好ましくは、その抗体又は結合パートナー並びに生理学的に許容される担体又は希釈剤を含んで成る治療的組成物中において提供される。好適な担体又は希釈剤は、とりわけ、中性緩衝化生理食塩水又は生理食塩水を含み、そして追加の賦形剤又は安定剤、例えば、バッファー、糖、例えば、グルコース、シュクロース、又はデキストラーゼ、キレート化剤、例えば、EDTA、並びに様々な保存剤を含む。グルカゴン拮抗物質先に述べたように、本発明は、グルカゴン拮抗物質を検出するための方法を提供する。本発明の文脈中、拮抗物質とは、レセプタに結合することができる分子であるが、細胞内の応答経路を剌激せず、又はその刺激を減少させる分子をいうと理解される。特に、グルカゴン拮抗物質は、一般的には、グルカゴン・レセプタに結合し、そしてそれにより細胞内の応答経路の刺激を減少させるそれらの能力により同定される。本発明の1 つの態様においては、(a)化合物がレセプタに結合することを許容するのに十分な条件下及び時間にわたり応答経路並びにその経路を通しての関連応答に結合した組換えグルカゴン・レセプタに、グルカゴン作用物質の存在中、その化合物を晒し、そして(b) そのグルカゴン作用物質によるその応答経路の剌激に比較して、そのグルカゴン・レセプタへのその化合物の結合から生じるその応答経路の剌激における減少を検出し、そしてそれからグルカゴン拮抗物質の存在を検出する、段階を含んで成る方法を、グルカゴン拮抗物質の存在を検出するために提供する。本発明の文脈中、グルカゴン拮抗物質とは、グルカゴン・レセプタに結合することができ( グルカゴンそれ自体を含み) 且つ細胞内の応答経路を刺激する分子を含む。様々な化合物を、このような方法を使用してスクリーンすることができる。代表的な例は、先に討議したようなブロッキング抗体、グルカゴン・レセプタ・ペプチド、及び( ペプチド及び非ペプチド・リガンドの両方を含む) グルカゴン・アナログ含む。米国逐次番号第07/741,931号は、例えば、このようなアナログをエンコードしているDNA 配列のプールを使用して多数のグルカゴン・アナログを作り出す方法を提供している。グルカゴン・アナログをエンコードしているDNA 配列のこのようなプールは、グルカゴンをエンコードしているDNA 配列の飽和突然変異誘発( 例えば、Little, Gene 88:113-115,1990,Hembers et al., Gene 88 143-151,1989)により、セグメント- 指定突然変異誘発( 例えば、Shortle et a l., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 77・5375-5379, 1980) により、強制ヌクレオチド過誤取り込み( 例えば、Liao and Wise Gene 88:107-111,1990) により、又はランダム突然変異誘発オリゴヌクレオチドの使用(Hutchison et al., Proc. Nat l. Acad. Sci. USA. USA 83:710-714,1986)により生成されることができる。グルカゴン・アナログを発現する個々の形質転換体を次に先に討議したようにクローン化し、又はプールすることができる。化合物を、レセプタへのその化合物の結合を許容する条件下及び時間にわたり、応答経路及びその経路を通しての関連応答に結合した組換えグルカゴン・レセプタに、グルカゴン作用物質の存在中で晒す。本発明において使用されるとき、上記グルカゴン拮抗物質がそのレセプタヘ結合するのに十分な条件及び時間は、そのレセプタの源により変化するであろうが、その結合に好適な条件は、一般的には、0 〜2M NaCl の間の、好ましくは0 〜0.9 M NaClの間の、特に好ましくは 0.1M NaCl におけるバッファー溶液中、4 ℃〜55 ℃の間において、そして5 〜9 の間の、好ましくは6.8 〜8 の間のpHレンジ内で生じる。結合及び応答のために十分な時間は、一般的には、露出後5 〜15分間の間であろう。一旦、化合物が、グルカゴン作用物質の存在中、その化合物がそのレセプタヘ結合するのに十分な条件下及び時間にわたり組換えグルカゴン・レセプタに晒されると、その応答経路の刺激における減少を、その化合物がその組換えグルカゴン・レセプタについてそのグルカゴン作用物質と競合する場合に、検出することができる。本発明の1 つの態様においては、この応答経路は、膜結合デニレート・シクラーゼ応答経路であり、そしてこの検出段階は、グルカゴン作用物質単独の存在中サイクリックAMP 生産に比較しての、その膜結合アデニレート・シクラーゼ応答経路によるcAMP生産における減少の測定を含んで成る。本発明の目的のためには、その応答経路の刺激における減少がデス-His^I - グルカゴンに関連する減少に等しい化合物又はそれを上回ることか好ましい。アデニレート・シクラーゼ活性検定を、例えば、Lin et al.(Biochem. 14:1559-1563,1975)により、そして本実施例中に記載された方法を使用して行うことができる。これらの方法は、生来のグルカゴンに対してcAMPの剌激のレベルを測定し、そして一般的には、生物学的に活性な組換えグルカゴン・レセプタを発現する細胞の調製物を、放射標識付けされたATP の存在中グルカゴンとテスト化合物との混合物に、晒すことを含む。あるいは、cAMP生産を、本分野においてよく知られた方法であって、例えば、 Salomon et al.(Anal. Biochem. 58:541-548,1976)又はKrishna et al.(J. Phar macol. Exp. Ther. 163:379, 1968)を含むもの、又は、好ましくは、商業的に入手可能なキット、例えば、Amersham CorporationからのScintillation Proximit y Assay Kit を使用して、容易に測定することもできる。このScintillation Proximity Assa y Kitは、抗- cAMP抗体とのヨウ素化-cAMP の競合によるcAMPの生産を測定する。特に好ましいグルカゴン・レセプタは、1nM 未満のED₅₀(50%応答のための有効投与量) の、より好ましくは0.7nM 未満のED₅₀による、そして最も好ましくは0. 25nM未満のED₅₀による、上記検定における生物学的活性をもつ。本発明のさらなる態様においては、応答経路は、ルシフェラーゼ・リポーター系を含む。簡単に言えば、ルシフェラーゼは、ルシフェリンによる光子の放出を触媒する酵素であり、そしてこれ故、ルシフェリンの存在中発現について容易に検出されることができる(Alam and Cook, Anal. Blochem. 188:245-254, 1990) 。以下により詳細に記載するように、本発明の特に好ましい態様においては、サイクリックAMP 応答要素、例えば、プロエンケファリン・サイクリックAMP 応答要素であって、ルシフェラーゼcDNAに作用可能な状態で結合されているものを含んで成るDNA 構築物を提供する。ルシフェラーゼcDNAを含んで成るDNA 構築物は、安定して宿主細胞内にトランスフェクトされる。次に宿主細胞を、そのレセプタの発現に必要な追加のDNA セグメントに作用可能な状態で結合されたグルカゴン・レセプタをエンコードしている第一DNA セグメントを含む第二DNA 構築物により、トランスフェクトさせる。グルカゴン・レセプタ作用物質の結合の間、上昇したcAMPレベルがルシフェラーゼの発現を誘導する。ルシフェラーゼをルシフェリンに晒し、そしてルシフェラーゼによるルシフェリンの酸化の間に放出される光子を測定する。本発明の他の態様においては、応答経路の活性化が、遊離のカルシウムの細胞内濃度の増加をもたらす。様々な検定を、細胞内カルシウムの濃度を測定するために行うことができ、これらは、例えば、 Charest et al.(J. Biol. Chem. 259:8769-8773,1983) により記載されたcalciu m flour QuinZ 法、又はNakajima-Shimada( Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88:687 8-6882, 1991) により記載されたエクオリン光タンパク質法(aequorin photopro tein method)を含む。特に好ましい方法は、細胞内カルシウム光画像形成法であって実施例6 中により詳細に記載するものである。簡単に言えば、1 つの態様においては、細胞をグルカゴン・レセプタ発現プラスミドにより形質転換させ、そして正常培養条件下で3 日間成長させる。この成長培地を次に除去し、そして10 μM fura-2AMを含む溶液により置き換える(Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem . 260:3440-3450,1985参照) 。次に細胞を30分間暗所でインキュベートし、その後濯ぎ、そして30〜120 分間さらにインキュベートする。光画像形成を、水銀放電ランプを備えたNikon Diaphot 倒立蛍光顕微鏡により行うことができる。細胞を最初に少なくとも60秒間モニターし、ベース・ラインを確立し、その後グルカゴン含有バッファーにより剌激することができる。画像を典型的には剌激後少なくとも3 分間記録する。ソフトウエア、例えば、Inovision(Research Triangle Park, N.C.) をその画像を加工し、そして定量するために使用することができる。先に討議したように検出されたグルカゴン拮抗物質を、例えば、Coy et al.(P eptides Structure and Function, Pierce ChemicalCompany, Rockford IL., pp . 369-372, 1983) により記載たイオン交換及び分配クロマトグラフィーにより、逆相クロマトグラフィー(Andreu and Merrifield. Eur. J. Biochem. 164:585 -590, 1987)により又はHPLC( 例えば、Kofod et al., Int. J. Peptide Protein Res. 32:436-440, 1988)により、精製することができる。追加の精製を慣用の化学的精製手段、とりわけ、例えば、液体クロマトグラフィー、勾配遠心分離、及びゲル電気泳動、により達成することができる。タンパク質精製の方法は、本分野において公知であり(一般的には、Scopes, R., P rotein Purification, Springer-Verlag, NY, 1982を参照のこと。) 、そして本明細書中に記載する組換えグルカゴン桔抗物質の精製に適用することができる。あるいは、グルカゴン拮抗物質を(The Peptides, vol. 2A, Gross and Meienhof er, eds., Academic Press, NY, pp. 1-284, 1979 中の)Barany及びMerrifield の固相法により、又は自動ペプチド合成装置の使用により合成することができる。少なくとも約50% の同質性を有する実質的に純粋な組換えグルカゴン拮抗物質が好ましく、少なくとも約70%-80% の同質性がより好ましく、そして特に医薬用途のためには少なくとも95%-99% 以上の同質性が最も好ましい。一旦、又は所望の同質性まで、精製されると、グルカゴン拮抗物質は、治療的に使用されることができる。一般的には、この拮抗物質は、非経口的に又は輸注により投与されることができる。典型的には、この拮抗物質は、遊離の塩基又は酸塩として存在する。好適な塩は、医薬として許容されなければならない。代表的な例は、金属塩、アルカリ及びアルカリ土類金属塩、例えば、カリウム又はナトリウム塩を含む。他の医薬として許容される塩は、クエン酸、琥珀酸、乳酸、塩化水素酸及び臭化水素酸を含む。医薬組成物をpH 5.6〜7.4 間の水性等張溶液中て配合することができる。好適な等張溶液は、塩化ナトリウム、デキストロース、ホウ素酸ナトリウム4 酒石酸塩、及びポリエチレン・グリコール溶液を含むことができる。拮抗物質の治療的投与量を、同一組成物中又は別個の組成物中のいずれかにおいてインシュリンと同時に投与することができる。グルカゴン・レセプタ・プローブの診断的使用本発明の他の態様においては、プローブ及びプライマーをグルカゴン・レセプタを検出するために提供する。本発明の1 つの態様においては、グルカゴン・レセプタDNA 又はRNA にハイブリダイズすることができるプローブを提供する。本発明の目的のために、プローブは、それらが高又は低ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする場合にグルカゴン・レセプタに" ハイブリダイズすることができる"(Sambrook et al.,前記を参照のこと。) 。好ましくは、プローブを、好適なヌクレオチド配列に、65℃において6x SCC、1xDenhardt's(Sambrook et al.,前記) 、0.1% SDSの存在中、ハイブリダイズするために使用し、そして65 ℃において2x SCC、1x Denhardt's、0.1% SDSの存在中、過剰のプローブを少なくとも1 回洗浄する。プローブ配列は、好ましくは、グルカゴン・レセプタ配列へのハイブリダイゼーションを可能にするが、セクレチン、カルシトニン又は上皮小体ホルモン・レセプタ配列にハイブリダイズしないように設計される。本発明のプローブは、デオキシリボ核酸(DNA) 又はリボ核酸(RNA) のいずれかから成ることができ、そして長さ約12ヌクレオチド程少なく、普通には長さ約14 〜18ヌクレオチドに、そして可能ならばグルカゴン・レセプタの完全配列と同様な大きさにあることができる。プローブ・サイズの選択は、いくぶんそのプローブの用途に依存する。例えば、個体内のグルカゴン・レセプタの様々な多形態の形状の存在を測定するために、グルカゴン・レセプタ・コーディング配列の完全長を実際に含んで成るプローブが好ましい。グルカゴン・レセプタ・プローブを、グルカゴン・レセプタ遺伝子に結合された多形態を同定するために使用することができる( 例えば、Weber, Genomics 7:524-530,1990; 及びWeber and May,Am er.J.Hum.Gen. 44:388-396, 1989を参照のこと。) 。このような多形態は遺伝的疾患、例えば、糖尿病と関連することができる。プローブを、本分野においてよく知られた技術を使用して構築し、そして標識付けすることができる。例えば、１２塩基のより短いプローブを合成により生成することができる。1.5kb 未満の約75塩基のより長いプローブを、好ましくは、標識付けされた前駆体、例えば、³²P-dCTP、ジゴキシゲニン-dUTP、又はビオチン-dATPの存在中PCR 増幅により作り出す。1.5kb を上回るプローブは、一般的には、関連プローブを含むプラスミドにより細胞をトランスフェクトし、そのトランスフェクトされた細胞を大量まで成長させ、そしてそのトランスフェクトされた細胞からその関連配列を精製することにより容易に増幅される(Sambrook et al.,前記参照) 。プローブを、例えば、放射マーカー、蛍光マーカー、酵素マーカー、及び発色マーカーを含む様々なマーカーにより標識付けすることができる。³²P の使用が、特定のプローブをマークし又は標識付けするために特に好ましい。本発明のプローブを、サンプル中のグルカゴン・レセプタmRNA又はDNA の存在を検出するために使用することもできる。しかしながら、グルカゴン・レセプタが限定された数だけで存在する場合、又は限定数だけにおいて存在する選択突然変異体配列を検出することが望ましい場合、又は選択された温血動物からのグルカゴン・レセプタをクローン化することが望ましい場合、それがより容易に検出又は獲得されることができるような関連配列を増幅することが有益であることができる。例えば、RNA 増幅(Lizardi et al., Bio/Technology 6:1197-1202, 1988; Kra mer et al., Nature 339:401-402, 1989; Lomeli etal., Clinical Chem. 35(9) :1826-1831, 1989;米国特許第4,786,600 号を参照のこと。) 及びポリメラーゼ連鎖反応("PCR") を使用するDNA 増幅( 例えば、米国特許第4,683,195 号、第4, 683,202 号及び第4,800,159 号参照)(また米国特許第4,876,187 号及び第5,011, 769 号であって切れやすい結合を含んで成る他の検出/ 増幅系について記載したものを参照のこと。) を含む様々な方法を、選択された配列を増幅するために使用することができる。特に好ましい態様においては、PCR 増幅をグルカゴン・レセプタDNA を検出又は獲得するために使用する。簡単に言えば、以下により詳細に記載するように、 DNA サンプルを、一本鎖DNA を作り出すために95℃において変性させる。以下に記載するような特異的プライマーを次に、そのプライマー内のAT/GC の割合に依存して37℃〜70℃においてアニールする。このプライマーを、その鋳型と反対のストランドを作り出すためにTaq ポリメラーゼにより72℃において伸長させる。これらの段階は、1 サイクルから成り、これを、選択された配列を増幅するために繰り返すことができる。選択配列の増幅のためのプライマーは、高く特異性であり、そしてその標的配列と安定した2 本鎖を形成する配列から選ばれなければならない。このプライマーは、また特にその3'末端において非相補性であり、それ自体又は他のプライマーとダイマーを形成してはならず、そしてDNA の他の領域との二次構造又は２本鎖を形成してはならない。一般的には、約18〜20ヌクレオチドのプライマーが好ましく、そして本分野においてよく知られた技術を使用して容易に合成されることができる。特に好ましいプライマーを、以下に表1中に示し、そしてその縮重オリゴヌクレオチドZC4715及びZC4701(それぞれ配列番号9 と8)並びにオリゴヌクレオチドZC4758及びZC4778( それぞれ配列番号10と11) を含む。グルカゴン・レセプタ・ヌクレオチド配列の追加の用途本発明のさらに他の態様においては、グルカゴン・レセプタ( 又は突然変異体グルカゴン・レセプタ) の過剰発現されるか又はグルカゴン・レセプタが全く発現されない疾患を治療するために使用されることができるウイルス・ベクターを提供する。簡単に言えば、本発明の1 つの態様においては、グルカゴン・レセプタの過剰発現又は突然変異体グルカゴン・レセプタの発現を禁止するために、アンチセンス・グルカゴン・レセプタRNA の生産に向けられるウイルス・ベクターを提供する。他の態様においては、グルカゴン・レセプタcDNAの発現に向けられるウイルス・ベクターを提供する。本発明における使用に好適なウイルス・ベクターは、とりわけ、組換えワクシニア・ベクター( 米国特許第4,603,112 号及び第4,769,330号) 、組換え体水痘ウイルス・ベクター(PCT出願番号W089/01973)、及び好ましくは、組換え体レトロウイルス・ベクター("Recombinant Retrovirus es with Amphotropic and Ecoptropic Host Ranges,"PCT公開番号W090/02806号; "Retroviral Packaging Cell Lines an d Processes of Using Same,"PCT公開番号W089/07150号; 及び"Antisense RNA f or Treatment of Retroviral Disease States, "PCT公開番号W0/03451号) を含む。先に述べたように、本発明のウイルス・ベクターは、グルカゴン・レセプタが過剰発現され、突然変異体グルカゴン・レセプタが発現され、又はグルカゴン・レセプタが全く発現されないかのいずれかの疾患状態の治療において使用されることができる。以下の実施例を説明のにより、そして限定によらず提供する。実施例実施例 1 cDNAの合成及びcDNAライブラリーの調製 A．ラット肝cDNA合成 30グラムの雌Sprague-Dawleyラット(Simonsen Labs, Gilroy, CA) からの肝臓を取り出し、そして直ちに液体窒素中に入れた。全RNA をグアニジン・イソチオシアネート(Chirgwin et al., Biochemistry 18:52-94, 1979)及びCsCl遠心分離を使用してその肝組織から調製した。ポリ(A) ⁺ RNA をオリゴd(T)セルロース・クロマトグラフィー(Aviv and Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408ー14 12, 1972) を使用して単離した。第一ストランドcDNAを2 倍のポリd(T)- 選択肝ポリ(A) ⁺ RNA から合成した。 10μg の肝ポリ(A) ⁺ RNA を含む10マイクロタイターの溶液を20μｌの20p モル / μl 第一ストランド・プライマーZC3747(配列番号7)及び4 μl のジエチルピロカーボネート- 処理水と混合した。混合液を4 分間65℃において加熱し、そして氷上での冷硬により冷却した。第一ストンドcDNA合成を、8 μl の5X SUPERSCRIPTバッファー(G IBCO BRL,Gaitthersburg, Md.)、4 μl の100mM ジチオトレイトール及び2.0 μ l のデオキシヌクレオチド3 燐酸溶液であってそれぞれ10mMのdATP、dGTP、dTTP 及び5-メチル-dCTP(Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, N.J.) を含むものを、そのRNA-プライマー混合物に添加することにより、開始させた。この反応混合物を3 分間42℃においてインキュベートした。インキュベーションの後、6.0 μl の200U/ μl のSUPERSCRIPT逆転写酵素(GIBCO BRL) を添加した。第一ストランド合成の効率を、その反応生成物を標識付けするために10μCiの³² P-αdCTPをその反応溶液の10μl アリコットに添加することにより並列反応において分析した。第一ストランド合成反応混合物を45分間45℃において、その後50 ℃において15分間インキュベートした。反応を100 μl の最終容量までの水の添加により終了させ、その後2 回のフェノール/ クロロホルム(1:1) 抽出及び1 回のクロロホルム/ イソアミルアルコール(24:1)抽出を行った。非取り込みヌクレオチドを、6 μg のグリコーゲン担体、2.5M酢酸アンモニウム及び2.5 容量のエタノールの存在中cDNAを2 回沈殿させることによりそれぞれの反応から取り出した。この非標識付けcDNAを50μl 水中に再懸濁させ、そして第二ストランド合成のために使用した。第一ストランドcDNAの長さをその標識付けcDNAを20μl 水中に再懸濁させ、そしてアガロース・ゲル電気泳動によりそのcDNAサイズを測定することにより評価した。第二ストランド合成を、DNA ヘアピン形式をもたらす第二ストランド合成の第一ストランド・プライミングを促進した条件下でその第一ストランド合成反応からのRNA-DNA ハイブリッド上で行った。反応混合物を20.0μl の5XポリメラーゼＩバッファー(100mM Tris,pH 7.4, 500mM KCl,25mM MgCl ₂ , 50mM(NH ₄ ) ₂ S O₄ , 4.0 μl の100mMジチオトレイトール, 1.0μl の溶液であってそれぞれの10mMのデオキシヌクレオチド3 燐酸を含むもの, 3.0μl のβ-NAD, 15.0μl の3U/ μl 大腸菌(E.coli)DNA リガーゼ(NBL Enzymes Ltd., Cramlington, Nort humbria, England), 5.0μl の10U/μl 大腸菌(E.coli)DNA ポリメラーゼI(GIBC O BRL)) 及び50.0μl の非標識第一ストランドDNAを含むように調製した。第二ストランド合成の10μl アリコットが10μCiの³²P-αdCTPの添加により標識付けされた平行反応を第二ストランド合成の効率をモニターするために使用した。この反応混合物を室温において4 分間インキュベートし、その後、それぞれの反応混合物に1.5μl の2U/ μl RNase H(GBCO BRL) を添加した。この反応物を15℃ において2 時間、その後室温において15分間インキュベートした。この反応をそれぞれ、4μl の500mM EDTAにより終了させ、その後、先に記載したように、順番にフェノール/ クロロホルム及びクロロホルム/ イソアミルアルコール抽出を行った。それぞれの反応からのDNA をエタノール及び2.5M酢酸アンモニウムの存在中で沈殿させた。非標識反応物からのDNA を50μl の水中に再懸濁させた。標識されたDNA を先に記載したように再懸濁させ、そして電気泳動にかけた。ヘアピン構造における一本鎖DNA を緑豆(mung bean) ヌクレアーゼを使用して解裂させた。この反応混合物は、10μl の10X Mung Bean Nuclease Buffer(Stra tagene Cloning Systems, La Jolla, Calif.) 、4 μl の200mM ジチオトレイトール、34μl の水、50μlの第二ストランドcDNA及び2 μl の、Stratagene MB 希釈バッファー(Stratagene Cloning Systems)中のMung Bean ヌクレアーゼ(Pro mega Corp., Madison. Wis.)の1:10希釈物を含んでいた。この反応を37℃において15分間インキュベートし、そしてその反応を20μl のTris-HCl, pH 8.0の添加により終了させ、その後先に記載したように、順番にフェノール/ クロロホルム及びクロロホルム/ イソアミルアルコール抽出を行った。抽出の後、DNA をエタノール中に沈殿させ、そして水中に再懸濁させた。再懸濁したcDNAを192μl の容量の水に再懸濁させ、50μl の5XT4 DNA ポリメラーゼ・バッファー(250mM Tris-HCl, pH 8.0,250mM KCl, 25mM MgCI ₂) 、3 μl の100mMジチオトレイトール10mMのそれぞれのデオキシヌクレオチド3 燐酸を含む3 μl の溶液、及び2 μl の6.7U/ μl のT4 DNAポリメラーゼ(Pharmacia LKB Biotechnology Inc.)と混合した。15℃において30分間のインキュベーションの後、反応を2 μl の500mM EDTAの添加により終了させ、その後先に記載したように順番にフェノール/ クロロホルム及びクロロホルム/ イソアミルアルコール抽出を行った。DNA をエタノール沈殿させ、そして30μl の水に再懸濁させた。³²P-dCTPの取り込みに基づき、cDNAの収量を10μg の出発mRNA鋳型から4 μg であると推定した。 B．ラット肝cDNAライブラリーの調製 Eco RIアダプタ(Invitrogen, San Diego, Calif.)を先に調製したcDNAに添加し、哺乳類発現ベクター中へのcDNAのクローニングを容易にした。このcDNAの10 μl アリコット及び800pモルのアダプタ(12μl )を4.0 μl の10X リガーゼ・バッファー(Stratagene Cloning Systems)、4.0 μl の10mM ATP、6.0 μl の水、及び16ユニットのT4 DNAリガーゼ(4.0μl;Stratagene Cloning Systems) と混合した。この反応を16時間、4 ℃〜15℃の温度グラジエントにおいてインキュベートした。この反応を185 μl の水、25μl のREACT2 バッファー(GIBCO BRL) の添加により終了させ、その後65℃において30〜60分間の間においてインキュベートした。インキュベーション後、反応をフェノール/ クロロホルム抽出し、その後クロロホルム/ イソアミルアルコール抽出し、そして先に記載したようにエタノール沈殿させた。遠心分離後、DNA ペレットを70% エタノールにより洗浄し、そして風乾した。ペレットを180 μl の水中に再懸濁させた。哺乳類発現ベクターへのcDNAの指向性挿入を容易にするために、cDNAをXhoIにより消化し、5'Eco RI付着末端及び3'XhoI付着末端をもつcDNAをもたらした。このcDNAの3'末端におけるXhoI制限部位をZC3747プライマー( 配列番号7)を通して導入した。制限消化を逐次的フェノール/ クロロホルム及びクロロホルム/ イソアミルアルコール抽出により終了させた。このcDNAをエタノール沈殿させ、そして得られたペレットを1Xローディング・バッファー(10mM燐酸塩バッファー, pH 8.8, 5%グリセロール, 0.125%ブロムフェノール・ブルー) 中に再懸濁させた。再懸濁したcDNAを65℃まで10分間加熱し、氷上冷却し、そしてサイズ・マーカーとしてBRL 1kbラダー(GIBCO BRL) 及びPharmacia100塩基対ラダー(Pharmacia LKB Biotechnology Inc.)を使用して0.9%低融点アガロース・ゲル(Seaplaque GT G Low Melt Agarose, FMC Corp., Rockland, Me.)上で電気泳動にかけた。汚染アダプタ及びサイズ800 塩基対未満の副生成物断片をそのゲルから切除した。電極を反対にし、そしてcDNAをそのレーン元近くに濃縮されるまで電気泳動にかけた。濃縮DNA を含むゲルの領域を切除し、マイクロフュージ管内に入れ、そしてそのゲルスライスのだいたいの容量を測定した。そのゲル・スライスの容量の半分に等しいTEのアリコットをその管に添加し、そしてアガロースを15分間65℃まて加熱することにより溶融させた。サンプルを42℃に平衡化した後、約5 ユニットのβ-Agarase I(New England Biolabs, Beverly, Mass)を添加した。サンプルを90分間インキュベートし、アガロースを消化した。インキュベーション後、0.1x容量の3M酢酸ナトリウムをそのサンプルに添加し、そしてその混合物を氷上で15分間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを4 ℃において15分間14,000 xgにおいて遠心分離し、未消化アガロースを除去した。上清中のcDNAをエタノール沈降させた。このcDNAペレットを70% エタノールにより洗浄し、風乾し、そして10μl の水中に再懸濁させた。得られたcDNAを大腸菌(E.coli)ベクターpZCEP、そのM13 複製起点及びそのSup F選択マーカーがpUC18 由来のベータ・ラクタマーゼ・カセットにより置換されているpCDNA1の誘導体(Invitorogen)中にクローン化した。プラスミドpZCEPであってEco RI及びXhoIによる消化により線状化されたものをEco RI-Xho I cDNAとライゲートした。得られたプラスミドを大腸菌(E.coli)株DH10B ELECTROMAX細胞 (GIBCO BRL) 内にエレクトロポレートした。 C．ヒト島細胞cDNAの合成島細胞を、適合した受容体が入手できなかった臓器移植ドナーから得られたヒト膵臓から単離した。冷UW溶液(Du Pont, Boston,Mass) によるその場の灌流の後、それぞれの膵臓を注意して切除し、膵臓管にカニューレ挿入し、そして4mg/ mlのコラゲナーゼ溶液( タイプV, Sigma, St. Louis, MO.) を一定速度で、最初は4 ℃、そして次に39℃において注入した。腺を引き裂き、そして解放断片を遠心分離により洗浄し、減少内径の針を通して粉砕し、そして断続Ficoll密度遠心分離により精製した(Warnock, Diabetes 35(Suppl.l):136-139, 1989)。上部界面から収穫した材料をプールし、そしてジチアゾン染色による島純度の測定の後に計数した。ライブラリー構築において使用した島は65% 純度を上回り、一方、ノーザン・ブロットにおいて使用した島は40% 純度を上回った。平均島直径は、 175 μm であった。さらに、単離された島は、高グルコース又はイソブチルメチルキサンンチン(IBMX)のいずれかによる灌流の後第一期及び第二期の両方のインシュリン分泌機能を示した。ポリ(A) ⁺ RNA を、製造者の指示に従ってFASTTRACK mRNA単離キット(Invitro gen)を使用して単離した。簡単に言えば、30,000精製島を溶解バッファー中に速く溶解させ、減少内径の針を使用して均質化し、そしてプロテイナーゼK 及びRN asinの存在中消化し、次にポリ(A) ⁺ RNA をオリゴ-d(T) セルロース・クロマトグラフィーにより選択した。溶出画分の濃度及び純度を0D_260/280 において測定した。ヒト島からの約2.5μg のポリ(A) ⁺ RNA を、製造者の指示に従ってLIBRARIAN IIcDNAライブラリー構築システム(Invitrogen)及びDH10B ELECTROMAX大腸菌(E. coli)細胞(GIBCO BRL) を使用してcDNAライブラリー構築のために使用した。要約すれば、ヒト島から単離した約2.5 μg のポリ(A) ⁺ RNA を二本鎖cDNAに変換し、その後BstX I非パリンドローム・リンカー(Invitrogen)を添加した。このcD NAをサイズ分画し、そして未反応リンカーをアガロース・ゲル電気泳動及び電気溶出により除去した。600 塩基対よりも大きな相補的DNA ストランドを選択した。実施例 2 ポリメラーゼ練鎖反応増幅によるラット・グルカゴン・レセプタcDNAの単離ラット肝cDNAを、セエクレチン遺伝子ファミリーのメンバー内の高保存の領域に対応する縮重オリゴヌクレオチド(ZC4715 及びZC4701; それぞれ配列番号8 と 9)を使用したグルカゴン・レセプタ配列の増幅のための鋳型として使用した。5n g の鋳型cDNA(実施例１A); 100p モルのそれぞれのオリゴヌクレオチドZC4715( 配列番号9)及びZC4701( 配列番号8); 0.25mMのそれぞれのデオキシヌクレオチド3 燐酸(Cetus, Emeryville , CA); 1x のPromega 10xバッファー(Promega Corp.);及び1.25ユニットのTaq ポリメラーゼ(Promega) を含む、50μl の反応物を設定した。PCR配列を40サイクル(95℃において1 分間、42℃において1 分間、そして72℃において2 分間)走らせ、その後72℃において7 分間インキュベートした。 650 塩基対のPCR生成物をゲル電気泳動により単離し、そしてpCR1000(Stratag ene Cloning Systems)によりライゲートした。得られたブラスミド大腸菌(E.coli)XL -1細胞を形質転換させるために使用した。プラスミドDNA を、選択された形質転換細胞から調製し、、G13/pCR1000 と命名し、そして配列決定した( 配列番号14 ) 。このクローンの配列分析は、その挿入物がセクレチン・レセプタに関連するポリペプチドをエンコードしていたことを示した。実施例 3 完全長ラット・グルカゴン・レセプタcDNAのクローニング完全長ラット・グルカゴン・レセプタcDNAをグルカゴン結合検定において実施例1B中に記載したライブラリーをスクリーニングすることにより獲得した。このレイブラリーをプレートし、百万の独立クローンを得た。それぞれのプレートからの形質転換体クローンを10mlのLB-Amp(Sambrook et al.,前記) 中にスクレープした。細胞を遠心分離により沈降させ、そして培地を廃棄した。細胞ペレットを4mlのLB-Amp、15% グリセロール中に再懸濁させ、そして4 つの1ml アリコットを-80 ℃において保存した。最初のグリセロール・ストックを滴定し、そしてプレート当たり5000コロニーの100プールっをプレートした。コロニーを成長させた後、それぞれのプレートを10mlのLB-amp中にスクレープした。それぞれのプールからの細胞のアリコットをプラスミドDNA の調製における使用のために取り出した。残りの細胞混合物を15% グリセロールの最終濃度にもっていき、等分し、そして-80 ℃において凍結させた。プラスミドDNAを細胞のそれぞれのプールから調製し、そしてそのDNA を製造者の指示に従ってRNAse(Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.）
により消化した。このRNAse 反応をフェノール/ クロロホルム/ イソアミルアルコール(24:24:1) 抽出により終了させ、そしてそのDNAをエタノール沈降させた。それぞれのプールからのプラスミドDNA をCOS-7 細胞(ATCC CRL1651) にトランスフェクトし、そしてそのトランスフェクト体を¹²⁵ I-グルカゴン結合検定によりグルカゴン・レセプタの存在についてスクリーンした。要約すれば、トランスフェクションの1 日前に、約2 x 10⁵ のCOS-7 細胞を、室温において30分間10 μg/mlのヒト・フィブロネクチン( 表1)によりコートされた滅菌単一チャンバー・スライド(Nunc AS, RosKilde, Denmark)上にプレートし、燐酸塩バッファー生理食塩水(PBS, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)により洗浄した。2 μg の、それぞれのプールからのプラスミドDNA を、McMahan et al.により本質的に記載された方法(EMBO J. 10:2821-2832, 1991;( これを、全体として引用により本明細書中に取り込む。))を使用して個々のチャンバー・スライド上で培養された細胞をトランスフェクトするために使用した。トランスフェクション後、細胞を5%CO₂ 中37℃において72時間培養した。上記凍結乾燥粉末を上記バッファー溶液中に溶解させる。次に硫酸アンモニウムを25% の濃度まで添加し、そしてその溶液を4 ℃において2 時間沈降に供させる。フィブロネクチンをBench Top 遠心分離機(Beckman Instruments, Inc., Ir vine, Calif.) 内で1,000rpmにおいて15分間遠心分離することによりペレット化する。上清を廃棄し、そしてそのペレットを10mlのNaP0₄ バッファー溶液( 上記 ) 中に溶解させる。 16.9mlの最終容量におけるフィブロネクチンを1 リッターの( 先に記載した) NaPO ₄ バッファー溶液に対して一夜透析する。透析された材料を1mM NaPO ₄ , pH 7.4により3 倍に希釈し、1mM NaPO ₄ ,pH 7.4, 100mM NaClの溶液を作る。次にフィブロネクチンを蒸留水により2 倍に希釈する。糸のような不溶性沈殿物をガラス捧により取り出す。フィブロネクチンを、3 容量の10mM Tris, pH 8.1, 50mM NaClにより平衡化した50ml DEAE FF Sepharoseカラム(Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscata way, N.J.)を横切るFPLCに供する。ベースライン・サンプルが生成されるまでそのカラムを10mM Tris, PH8.1, 50mM NaClにより洗浄した後、フィブロネクチンを10mM Tris,pH 8.1, 300mM NaCl までの塩グラジエントにより溶出させる。画分を集め、その画分のアリコットをアクリルアミド・ゲル上で電気泳動にかけ、そしてそのゲルをCoomasie Blue 染色及びウェスタン分析により分析する。ピーク画分をプールし、そして10mM CAPS(3ー( シクロヘキシルアミン)- 1 プロパン- スルホン酸, Sigma), pH 11.0 、10mM CaCl ₂ 、150mM NaClに対して透析する。この溶液を-80 ℃において保存する。 ¹²⁵I-グルカゴン結合検定のためのトランスフェクト体を調製するために、消費培地を細胞から吸引し、そして細胞を冷(4℃)PBSにより3 回洗浄した。最終洗浄の後、細胞を結合培地( 表2)によりカバーし、そして室温において10分間インキュベートした。培地を、0.5ml の、0.5nM ¹²⁵ I-グルカゴン(Amersham レセプタ・グレード、比活性2000 Ci/m モル; Amersham) を含む結合培地により置換した。次に細胞を1 時間30℃において揺すった。培地を細胞から吸引し、グルカゴンを含まない冷(4℃) 結合培地を添加し、そして細胞を室温において5 分間インキュベートした。培地を細胞から吸引し、そして細胞を冷(4℃) PBS により3 回洗浄した。最終洗浄後、細胞を20分間室温において1ml の、PBS 中の2.5%グルタルアルデヒドにより固定した。グルタルアルデヒドを除去し、そして細胞をPBS により3 回濯いだ。スライドを室温において1 時間風乾し、製造者の指示に従って液体写真エマルジョン(eastman Kodak Co., Rochester,N.Y.) 中に浸し、そして少なくとも30分間暗所において室温で乾燥させた。グルカゴンに結合することができる細胞を、明視野照明下2.5 X 倍率において検出した。1 つのプール、#5 7 は、グルカゴンに結合することができる細胞を含むと同定された。 1M重炭酸ナトリウム 8.4 グラムの固体NaCO₃ 重炭酸ナトリウムを100ml の栓付き度盛り器内に注ぎ、そして80mlの蒸留水を添加した。溶液を固体が溶解するまで混合する。蒸留水を100ml まで添加する。溶液を再び混合し、そして栓付きボトル内に4 ℃において保存する。培地 1 ミリリッターの1M重炭酸ナトリウムを蒸留水の1 リッター当たりに添加する。4 リッターを、前もって且つ一夜冷却した上記溶液により調製するか又は冷却した蒸留水により調製するかのいずれかとする。69% シュクロース溶液 69グラムのシュクロースシュクロースを31mlの蒸留水に加熱しながら溶解する。この溶液の濃度を屈折計により測定する。固体シュクロースを適宜添加し、 69+/-0.5% までの濃度に調整する。42.3% シュクロース 42グラムのシュクロースシュクロースを57mlの蒸留水に加熱しながら溶解する。この溶液の濃度を屈折計により測定する。69% シュクロース溶液又は水を適宜添加し、42.3+/-1% までの濃度に調整する。2x結合バッファー 100mM HEPES, pH 7.3 300mM NaCl 2mM EDTA 2%ウシ血清アルブミン 1.6 mg/ml バシトラシン画像形成バッファー 140mM NaCl 10mM HEPES 5.6mM グルコース 5mM KCl 1mM MgSO₄ 1mM CaCl₂ Fura-2 AM 溶液 50mg fura-2 AM(Molecular Probes) 50ml DMSO 5ml 画像形成バッファー 50mgのfura-2 AM を50mlのDMSOに溶解させる。固体が溶解した後、溶液を5ml の画像形成バッファーと混合する。 #57 プールからのプラスミドDNA のアリコットをオリゴヌクレオチドZC4701及びZC4715( それぞれ配列番号8 と9)を使用するPCR 増幅に供した。#57 プールからの200ng 〜400ng の間のプラスミドDNA; 100pモルのそれぞれのオリゴヌクレオチドZC4701及びZC4715(それぞれ配列番号8 と9); 50mM KCl; 10mM Tris-HCl, pH 9.0(20℃); 1.5mM MgCl ₂ ; 0.01% ゼラチン; 0.1%Triton X-100; 0.2mMのそれぞれのデオキシヌクレオチド3 燐酸(Pharmacia LKB Biotechnology Inc) 及び 1 ユニットのTaq ポリメラーゼ(Promega) を含む50μl の反応混合物を調製した。PCR 反応を30サイクル(95 ℃において2 分間、45℃において2 分間、そして72 ℃において2 分間) 走らせ、その後72℃において7 分間インキュベートした。反応混合物を4 ℃において保存した。ゲル電気泳動によるPCR 生成物の分析は、70 0 塩基対バンドの存在を示し、これは、実施例2 中に記載した生成物とほとんど同じサイズであった。プール#57 からのグリセロール・ストックを滴定し、そして500コロニーの20 プレートをプレートした。コロニーをプールし、そしてグリセロール・ストック及びプラスミドDNA を先に記載したように調製した。プラスミドDNA をCOS-7 細胞内にトランスフェクトし、そしてトランスフェクト体を先に記載したようなグルカゴン結合検定を使用してスクリーンした。1 つのプール、#57-18は、グルカゴンに結合することができる細胞を含むと同定された。プール#57-18からのプラスミドDNA のアリコットを先に記載したようなオリゴヌクレオチドZC4701及びZC4715(それぞれ配列番号8と9)を使用するPCR 増幅に供した。ゲル電気泳動によるPCR 生成物の分析は、700 塩基対バンドの存在を示し、グルカゴン・レセプタDNA 配列の存在を確認させた。プール#57-18からのグリセロール・ストックを滴定し、そして500 コロニーの 6 プレート及び20コロニーの47プレートをプレートした。コロニーをプールし、そしてグリセロール・ストック及びプラスミドDNA を先に記載したように調製した。プラスミドDNA のそれぞれのプールからのアリコットをCOS-7 細胞内にトランスフェクトし、そしてトランスフェクト体を先に記載したようなグルカゴン結合検定を使用してスクリーンした。さらに、プラスミドDNA のそれぞれのプールからのアリコットを、先に記載したようなオリゴヌクレオチドZC4701及びZC4715 ( それぞれ配列番号8 と9)を使用するPCR 増幅に供した。4 つの陽性プール(#57 -18-16, #57-18-18, #57-18-36及び#57-18-48)は、グルカゴンに結合することができる細胞を含むと同定され、そして確証的な700 塩基対バンドを含むことがPC R 増幅により示された。このcDNAを単離するために、2 つの150mm プレートを#57-18プールの2,500 コロニーによりそれぞれプレートした。フィルター・リフトをHanahan and Mesels on(Gene 10:63, 1980)及びSambrook etal.(ibid.)(これらを、全体として引用により本明細書中に取り込む。) により本質的に記載された方法を使用して調製した。ハイブリダイゼーション・プローブを先に記載したようなオリゴヌクレオチド及び方法を使用する#57プールからのプラスミドDNA のPCR 増幅により獲得した。PCR 生成物を低融点アガロース・ゲルからゲル精製し、そして製造者の指示に従ってMEGAPRIME キット(AmerSham,Arlington Heights, III.) を使用してランダム- プライムした。フィルターを6x SCC, 5x Denhardt's, 5% SDS, 200 μg /mlの音波処理サケ精子DNA及び2 x 10⁵ cpm/mlの³²P-標識付けPCR 断片を含む溶液中でハイブリダイズした。フィルターを65℃において一夜ハイブリダイズした。過剰の標識を2x SCC, 1% SDSにより65℃における3 回洗浄により除去した。フィルターを2 つのスクリーンにより-80 ℃において4 時間フィルムに露出させた。プラスミドpLJ4を含む陽性クローンを同定し、そしてスクリーンした。プラスミドpLJ4は、1992年8 月21日に寄託番号69056号の下大腸菌(E.coli)形質転換体としてAmerican Type Culture Coollection(12301 Parklawn Dr., Rockvill e, MD 20852)により寄託されている。制限エンドヌクレアーゼ分析及び配列分析は、pLJ4が、54,962ダルトンの予想分子量をもつ485 アミノ酸タンパク質をエンコードしている約2kb の挿入物を含むことを、示した。この核酸配列及び演繹アミノ酸配列を配列番号14と15中に示す。Kyte and Doolittleの方法(J. Mol.Biol . 157:105-132, 1982; ( これを、引用により本明細書中に取り込む。) を使用した水療法(Hydropathy)分析は、アミノ- 末端シグナル配列に対応する疎水性アミノ酸の8 つのクラスター及び7 つのトランスメンブラン・ドメインを現した( 図２)。さらに、この演繹アミノ酸配列の分析は、伸長親水性配列内に位置する4 つの潜在的N-結合糖添加部位の存在及び同一領域内の6 つのシステインの存在を示した。実施例4 ポリメラーゼ連鎖反応増幅によるヒト・グルカゴン・レセプタcDNAの単離ヒト島細胞cDNA( 実施例1C) を、縮重オリゴヌクレオチドZC4715及びZC4701( それぞれ配列番号8 と9)を使用したヒト・クルカゴン・レセプタ配列の増幅のための鋳型として使用した。5ng の鋳型cDNA( 実施例1C)； 100p モルのそれぞれのオリゴヌクレオチドZC4715 ( 配列番号9)及びZC4701( 配列番号8); 0.25mMのそれぞれのデオキシヌクレオチド3 燐酸(Cetus, Emeryville, Calif.); 1x のPromega 10x バッファー(Promega Corp.);及び1.25ユニットのTaq ポリメラーゼ(Promega) を含む、50μl の反応物を設定した。PCR 反応を40サイクル(95 ℃において1 分間、42℃において1 分間、そして72℃において2 分間) 走らせ、その後72℃において7 分間インキュベートした。約750 塩基対のPCR 生成物をゲル電気泳動により単離した。単離したPCR 生成物の中の1/10を、オリゴヌクレオチドZC4758及びZC4778( 配列番号10と11) を使用した他のPCR 反応のための鋳型として使用した。これを、サブクローニングのためにそのPCR 生成物の、3'末端においてBamHI制限部位を挿入し、そしてその5 '末端においてEco RI制限部位を挿入するように設計した。50μｌの反応混合物を先に記載したように設定した。PCR 反応を40サイクル（95 ℃において１分間、50℃において１分間、そして72℃において1.5 分間）走らせ、その後72℃において７分間インキュベートした。ヒト・グルカゴン・レセプタ配列のための形質転換体をスクリーンするために、それぞれの形質転換体内に存在する挿入DNA を、汎用pUC 配列決定プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチドZC447 及びZC976（それぞれ配列番号１と２）を使用して増幅し、そしてそのPCR生成挿入物に隣接するpUC配列にプライムした。形質転換体の48を、20pモルのそれぞれのオリゴヌクレオチド；0.125mMのそれぞれのデオキシヌクレオチド３燐酸（Cetus, Emeryville, Calif.）；１xの Promega 10xバッファー（Promega）；及び1.25ユニットのTaqポリメラーゼ（Pro mega）を含む、25μｌの反応混合物中にそれぞれ拾い上げた。PCR反応を30サイクル（95℃において１分間、45℃において１分間、そして72℃において1.5分間）走らせ、その後72℃において７分間インキュベートした。このPCR生成物を、その後、プローブとしてAmersham MEGAPRIMEキット（Amers ham）を使用したランダム・プライミングにより標識付けされたpLJ4の1.9kbのEc o RI-Xho I断片を使用したサザン・ハイブリダイゼーション（Southern, J. Mol . Biol. 98:503, 1975；及びSambrook et al., ibid.；（これらを、全体として引用により本明細書中に取り込む。））により分析した。１つのクローン、G30 は、完全長ラットcDNAプローブとハイブリダイズすることが示された。G30のヌクレオチド配列を配列番号16中に示す。実施例５完全長ヒト・グルカゴンcDNAのクローニングヒト・グルカゴン・レセプタをエンコードしている配列を含むライブラリーを同定するために、先に討議したようなクローンG30からの配列を含むように設計されたオリゴヌクレオチド・プライマーZC5433及びZC5432（それぞれ配列番号13 と12）を使用したPCRにより一連のライブラリーをスクリーンした。購入及び調製したヒト肝臓、島細胞、 HepG2細胞、脳及び胎盤からのヒト・ゲノム及びcDNAライブラリーをスクリーンした（表３）。個々の50μｌのPCR反応を表４中に列記した容量においてそれぞれのライブラリーからのDNAを使用して設定した。20pモルのそれぞれのZC5433及びZC5432（それぞれ配列番号13と12）、0.25mMのそれぞれのデオキシヌクレオチド３燐酸、５μｌの10x Taq I バッファー（Promega）、15mM MgCl₂、19.5μｌの蒸留水及び0.5μｌの5U/ μｌ Taq I ポリメラーゼ（Promega）。さらに、反応物を、陽性対照としてpLJ4を含み、そして陰性対照としてDNAを含まないように設定した。 PCR反応を30サイクル（94℃において１分間、50℃において１分間、そして72 ℃において1.5分間）走らせ、その後72℃において10分間インキュベートした。このPCR生成物をその後アガロース・ゲル電気泳動により分析した。NIH肝臓ライブラリーだけがpLJ4陽性対照により見られたものに等しいサイズの320-410塩基対のバンドを作り出した。 Dr. Roger Bertolloti（National Institute of Health, Bethesda, Md.）から得たプラスミドpcD2（Chen and Okayama, Mol. Cell.Biol. 7:2745-2752, 198 7）内ヘクローン化されたヒト肝臓ライブラリーを、ヒト・グルカゴン・レセプタをエンコードしている完全長cDNAクローンを得るために使用した。このライブラリーを１百万の独立クローンを得るためにプレートした。それぞれのプレートからの形質転換体コロニーを10mlのLB-Amp（Sambrook et al.,ibid.）中にスクレープした。細胞を遠心分離により沈降させ、そして培地を廃棄した。細胞ペレットを４ml のLB- Amp、15%グリセロール中に再懸濁させ、そして４つの１mlアリコットを-80℃において保存した。最初のグリセロール・ストックを滴定し、そしてプレート当たり5000コロニーの100プールをプレートした。コロニーを成長させた後、それぞれのプレートを10mlのLB-amp中にスクレープした。それぞれのプールからの細胞のアリコットをプラスミドDNAの調製における使用のために取り出した。残りの細胞混合物を15%グリセロールの最終濃度にもっていき、等分し、そして-80℃において凍結させた。プラスミドDNAを細胞のそれぞれのプールから調製し、そしてそのDNAを製造者の指示に従ってRNAse（Boehringer Mannheim, Indianapolis, In.）により消化した。このRNAse反応をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（24:24:1）抽出により終了させ、そしてそのDNAをエタノール沈降させた。それぞれのプールからの再懸濁プラスミドDNAのアリコットを10の群（すなわち、1-10、11-20、21-30、31-40、等）に組み合わせた。プラスミドDNAを1:20に希釈し、そしてそれぞれのプールからの１μｌのDNAを先に記載した反応混合物と同一のPCR反応混合物中で使用した。この反応混合物を先に述べた条件下で増幅に供した。アガロース・ゲル電気泳動によるPCR生成物の分析は、上記プール3 1-40が陽性対照と同じサイズの320-410塩基対のバンドを含でいたことを示した。元のプール31〜40から調製されたプラスミドDNAを1:20に希釈し、そして１μ ｌのそれぞれのプールを先に記載したものと同一の反応混合物中で使用した。先に記載した条件を使用した反応混合物の PCR増幅を行った。アガロース・ゲル電気泳動によるPCR生成物の分析は、上記プール#40が約310-420塩基対のバンド・サイズを与えたことを示した。プラスミドDNAの濃度は、１:10に希釈されたプール#40の１μｌのアガロース・ゲル電気泳動により約70ng／μｌであると凡そ定量された。70ngのプール#40 プラスミドDNAを2.3 kV，400Ω，25μFにおいて大腸菌（E.coli）株DH10B内にエレクトロポレートし、そして１ml SOC（Sambrook et al., ibid.）中に再懸濁した。細胞の３つの希釈物を10^-2、10^-3及び10^-4において調製した。100μｌのそれぞれの希釈物を４つのプレートにプレートした。コロニー数を、10^-2希釈物からの細胞を含む４つのプレートについて１プレート当たり約10,000コロニーであると、そして10^-3希釈物からの細胞を含む４つのプレートについて１プレート当たり約1000コロニーであると推定した。２連のフィルター・リフトを、４つの10^-3 プレートのそれぞれから、そして10^-2プレートの中の１つから調製し、プール #１〜プール#５と命名した。それぞれの２連セットからの１フィルターを固体培地上に横たえ、そしてコロニーが形成されるまで成長させた。次にコロニーをスクレープし、そしてPCR増幅のためのプラスミドDNAを調製するために使用した。さらに、10^-2プレートの３つの残りのプレートをスクレープし、そしてプラスミドDNAを細胞から調製した。残りのフィルターを12時間撹拌しなから65℃における３x SSC + 0.5%SDSにより前洗浄した。次にフィルターをUllrich's Buffer（Ulllrich, EMBO J. 3:361- 364, 1984） + 50%ホルムアルデヒド、１%SDS中で一夜37℃において前ハイブリダイズした。製造者の示唆する条件に従ってAmersham MEGAPRIMEキット（Amersh am）を使用して標識されたクローンG30 DNAを煮沸し、そして６ x 10⁵ cpm/mlの最終濃度までハイブリダイゼーション溶液（Ullrich's Buffer + 50% ホルムアミド）に添加した。一夜のインキュベーションの後、プローブ溶液を除去し、そしてフィルターを２x SSC + 0.1% SDS中で65℃において５分間洗浄した。最初の洗浄後、フィルターを同一溶液中で15分間65℃においてその後室温において振とうしながら５分間洗浄した。最後の洗浄プロトコールをさらに２回繰り返した。フィルターを室温において一夜フィルムに露出させた。プール#２に対応するプレート# ２上の単一コロニーはG30へのハイブリダイゼーションにより陽性であった。このコロニーを拾い上げ、そして独立コロニーを得るために塗抹した。幾つかの独立コロニーから調製されたプラスミドDNAをDNA配列分析に供した。１つのクローン40-2-2をさらなる配列分析に供し、そして1992年８月21日に寄託番号69055の下大腸菌（E.coli）形質転換体としてAmerican Type Culture Collection（1230 1 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852）により寄託した。クローン40-2-2の部分的DNA 配列及びその演繹アミノ酸配列を配列番号17と18として示す。フィルター・ハイブリダイゼーションにおけるグルカゴン・レセプタ配列の存在を確認するために、PCR 増幅配列をそれぞれのプラスミドDNA調製物（それぞれの２連フィルターから調製されたプラスミドDNA及び３つの10^-2プレートのそれぞれから調製されたプラスミドDNA）について行った。プールされたプラスミドDNAをそれぞれ1:20に希釈し、そして１μｌのそれぞれのDNAを、先に記載したようなPCR設定及びランにおける鋳型として使用した。得られたPCR生成物のアガロース・ゲル電気泳動は、プール#２及び10,000の４つのプールの中の３つが310 〜420塩基対間のためのPCR生成バンドを含んでいたことを示した。プレート#２に対応するプール#２内のPCR生成バンドの存在は、グルカゴン・レセプタDNA配列の存在を確かなものとした。Ｆ．ヒト・グルカゴン・レセプタの5'配列のクローニングのための戦略クローン40-2-2の部分的cDNA配列及び完全長ラット・グルカゴン・レセプタcD NA配列の分析は、その40-2-2クローンが約25アミノ酸に対応するアミノ末端配列を欠いていることを示した。この5'ヒト・グルカゴン・レセプタcDNA配列をFroh man et al.により記載された方法（Proc. Natl. Acad. Scl. USA 85:8998-9002, 1988）の適用を使用して得た。簡単に言えば、オリゴヌクレオチド・プライマーを、その配列が40-2-2コーディング配列の5'末端近くの配列にハイブリダイズするように設計した。プライマーをG-尾ヒト肝臓第一ストランドcDNA鋳型にハイブリダイズさせ、そしてそのプライマーをTaq I DNA ポリメラーゼを使用してその5'末端の方向に伸長させた。第二ポリd(C)プライマーをそのG-尾cDNA鋳型にアニールし、ポリメラーゼ連鎖配列増幅、その後のクローニング、配列決定及びクローン40-2-2内に存在するコーディング配列へのスプライシングに供した。３つのcDNA鋳型を調製した。第一鋳型は商業的に入手可能なヒト肝臓第一ストランドcDNAであった。第二及び第三のcDNA鋳型を、ヒト・グルカゴン・レセプタに特異的な配列を含むオリゴヌクレオチド又は伝統的なオリゴd(T)プライミングのいずれかを使用して、商業的に入手可能なヒト肝臓mRNA（Clontech）から第一ストランドcDNAを合成することにより、それぞれ調製した。第二cDNA鋳型を、ヒト・グルカゴン・レセプタ・コーディング配列に特異的であるオリゴヌクレオチドZC5433（配列番号13）を使用してヒト肝臓mRNAから合成することにより調製した。２μｌの１μ g/μｌのヒト肝臓mRNA、８μg/mlの20pモル/μｌのZC5433（配列番号13）及び0. 5μｌの10mM Trls, pH 7.4、0.1mM EDTAを含む反応混合物を７分間68℃においてその後氷上で２分間インキュベートした。インキュベーション後、その反応混合物は、４μｌの５X SUPERSCRIPTバッファー（GIBCO-BRL）、１μｌの200mMジチオトレイトール、10mMのそれぞれのdNTPを含む１μｌの溶液、１μｌの0.25μCi /μｌのα³²P-dCTP及び５μｌのSUPERSCRIPT逆転写酵素を受容した。インキュベーション後、反応物を45℃において１時間インキュベートした。反応を80μｌの TEの添加により終了させた。RNAを１μｌの0.5M EDTA及び１μｌのKOHの添加により加水分解した。この加水分解反応物を65℃において５分間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを50mM KOH, 0.1mM EDTAにより１mlに希釈し、そしてそのサンプルをCENTRICON 100濃縮装置（Amicon,Danvers, Mass.）上を通過させた。このカラムを１mlの50mM KOH,0.1mM EDTAにより洗浄した。濃縮されたcDNAを集め、そして100mMHClの半分の容量により中和した。中和したcDNA サンプルをエタノール沈降させ、そしてその沈殿物を26μｌの蒸留水により再懸濁させた。第三cDNA鋳型を購入したオリゴd(T)プライマーを使用してヒト肝臓mRNAを合成することにより調製した。反応混合物を２μｌの１μg/μｌのヒト肝臓mRNA、１ μｌの１μg/μｌオリゴd(T)18（New England Biolabs, Beverly, Mass.）及び５μｌの10mM Tris, pH 7.4,0.1mM EDTAを含むように調製した。このcDNA合成を先に記載した合成のために述べた条件を使用して行った。次に第一ストランドcDNAをG-尾付加した。反応管を４μｌのヒト肝臓第一ストランドcDNA（QUICK CLONE; Clontech, Palo Alto, Calif.）、ZC5433（配列番号 13）からの４μｌのヒト肝臓第一ストランドcDNA又はオリゴd(T)プライマーからの４μｌのヒト肝臓第一ストランドcDNAを含むように設定した。それぞれの反応混合物は、22μｌの水、８μｌの５Xバッファー（Promega）、４μｌの10mM dGTP及び２μｌの15U/μｌのターミナル・トランスフェラーゼを受容し、そしてその反応物を37℃において３０分間インキュベートし、その後65℃において１０分間インキュベートした。次にこの反応物を 10mM Tris, pH 7.4, １mM EDTAにより90μｌまで希釈し、そしてエタノール沈降させた。すべてのG-尾cDNAの第二ストランド合成を同一に行った。それぞれのcDNAを５０μｌの蒸留水中に最初に懸濁した。次にそれぞれのcDNAは、５μｌ中の100pモルのZC4814（配列番号20）を受容した。このcDNAを、それぞれの混合物を５分間 68℃まで加熱し、その後氷上で２分間インキュベートすることによりアニールした。プライマーをcDNAにアニールした後、それぞれの混合物は、20μｌの５x Po lymerase I バッファアー（実施例１）、１μｌの100mMジチオトレイトール、10 mMのそれぞれのdNTPを含む２μｌの溶液、２μｌの0.5μCi/μｌ α³²P-dCTP、１μｌの３U/μｌ大腸菌（E.coli）DNAリガーゼ（New England Biolabs）、５μ ｌの７U/μｌ大腸菌（E.coli）DNAポリメラーゼＩ（Amersham）を受容した。この反応物を22℃において５分間インキュベートし、その後1.5μｌの２U/μｌのR Nase H（GIBCO-BRL）を添加し、その後インキュベーションを16℃において２時間再開した。反応を200μｌの10mM Tris（pH 8.0）、１mM EDTAその後150μｌの水飽和フェノール及び150μｌのクロロホルムの添加により終了させた。混合物を回転させ、そして次に22℃において３分間遠心分離し、相分離させた。水相を取り出し、そして先に記載したようにフェノール及びクロロホルムにより再抽出した。２番目のフェノール−クロロホルム抽出の後、水相をクロロホルムにより抽出した。水相中のcDNAを５μgのムラサキガイ（mussel）グリコーゲン、１００μlの８M酢酸アンモニウム及び300μlのイソプロパノールの添加により沈降させ、上清中に非取り込みオリゴヌクレオチドを残しながらより大きな核酸を選択的に沈降させた。このcDNAを遠心分離によりペレット化し、そしてこのペレットを70%エタノールにより洗浄し、その後風乾した。このcDNAペレットを15μlの２回蒸留水中に再懸濁させた。二本鎖cDNAを５並列反応において、ZC4814（配列番号20）の5'末端に相同的であり且つサブクローニングを容易にする制限エンドヌクレーゼ部位を含むオリゴヌクレオチド・プライマー、並びに40-2-2クローン内に存在するコーディング配列のまさに5'末端に特異的なオリゴヌクレオチド・プライマーを使用して増幅した。それぞれの反応混合物は、５μlの10X Taq I バッファー、３μlの25mM MgC l₂、2.5mMのそれぞれのdNTPを含む５μlの溶液、１μlの二本鎖cDNA、及び0.5μ lのTaq I ポリメラーゼ（Promega）を含んでいた。この反応物を、10pモル/μl のZC5624（配列番号21）及び20pモル/μlのZC4812（配列番号19）のそれぞれの１μlの添加前に98℃において５分間変性させた。それぞれのサンプルを、90℃ において保持した鉱物油の70μlにより重層した。この反応物を30サイクル（95 ℃60秒間、57℃40秒間、72℃60秒間）にわたり増幅し、その後72℃において７分間伸長させた。それぞれのPCR生成物をアガロース・ゲル電気泳動に供し、そして増幅された断片をそれぞれ切除し、そしてTAクローニング・キット（Invitrogen）を使用してpCR1000内にサブクローン化した。それぞれのライゲーションからの３つのクローンを、その中のそれぞれが鋳型DNAの源としてクローンからの接種物を含む独立PCR反応混合物中でオリゴヌクレオチド・プライマーZC5624（配列番号21）及びZC4812（配列番号19）を使用することにより挿入物の存在について選択及び分析した。このPCR反応を先に記載したように行った。但し、30サイクロの増幅だけを行った。それぞれの元のPCR反応からの単一挿入物-陽性クローンをDNA配列分析に供した。誤りのない5'ヒト・グルカゴン・レセプタ・コーディング配列を含むことが示された２つのクローンの中で、１つのクローンを5'ヒト・グルカゴン・レセプタ・コーディング配列を提供するために選択した。クローン9AをEco RI及びKpn I により消化し、グルカゴン・レセプタの5'コーディング配列を含む 551塩基対断片を得た。3'グルカゴン・レセプタ・コーディング配列を40-2-2からの561塩基対のKpn I-Bam HI断片として得た。このEco RI及びKpn I 断片とこの561塩基対のKpn I-Bam HI断片とを、コンカテマー化を防ぐためにEco RI及びB am HIの存在中でライゲートした。ライゲーションの生成物、1112塩基対断片をゲル精製し、そして9Alと命名した。便利には、断片9Alを、Eco RI及びBam HI消化pUC18内にライゲートした。このライゲーション混合物を大腸菌（E.coli）株D H10b細胞に形質転換し、そして選択されたクローンを挿入物の存在について分析した。１つのクローン9A11は、その挿入物を含んでいた。グルカゴン・レセプタ・コーディング配列を、プラスミドp9A11及びクローン4 0-2-2を使用する哺乳類発現ベクター内で構築し、完全なグルカゴン・レセプタ・コディング配列を得た。プラスミドp9A11をPvu II及びBam HIにより消化し、9 67塩基対断片を単離した。クローン40-2-2をBam HI及びSac I により消化し、3' ヒト・グルカゴン・レセプタ・コーディング配列を含む828塩基対断片を単離した。哺乳類発現ベクターpHZ1をEco RIによる消化により線状化し、そしてその末端を次にT4 DNAポリメラーゼを使用してブラント末端にした。このブラント末端線状ベクターを次にSac Iにより消化した。967塩基対のPvu II-Bam HI断片及び828塩基対のBam HI-Sac I断片を、ブラント-Sac I消化pHZ1ベクターによりライゲートした。プラスミドpHZ1は、インビトロにおいて転写されたmRNAsから哺乳類細胞内で又はカエル卵母細胞翻訳系内でタンパク質を発現させるために使用されることができる発現ベクターである。このpHZ1発現系は、マウスのメタロチオネイン-１プロモーター、バクテリオファージT7プロモーターであってコーディング配列の挿入のためのユニーク制限部位を含む多クローニング・バンクに隣接するもの、ヒト成長ホルモン・ターミネーター及びバクテリオファージT7ターミネーターを含んで成る。さらに、pHZ1は、大腸菌（E.coli）の複製起点；バクテリアのベータ・ラクタマーゼ遺伝子；SV4Oのプロモーター及び起点、ネオマイシン耐性遺伝子並びにSV40転写ターミネーターを含んで成る哺乳類選択マーカー発現ユニット、を含む。そのプロモーターに対して正しい方向においてグルカゴン・レセプタcDNA配列を含むpHZ1プラスミドをpLJ6'と命名した。挿入物とベクターとの接合物を正しい配列の存在を確認するために配列決定した。プラスミドpLJ6'を1993年１月15 日の寄託番号69183の下American Type Culture Collection（12301 ParkLawn Dr ive, Rockville, MD 20852）により寄託した。pLJ6'内に存在するグルカゴン・レセプタcDNAのDNA配列及び演繹アミノ酸配列を配列番号24と配列番号25中に示す。実施例６ヒト島細胞からのグルカゴン・レセプタcDNAのクローニングヒト肝臓細胞からのグルカゴン・レセプタのクローニングに加え、グルカゴン・レセプタcDNAをヒト島細胞ライブラリーから得た。ヒト島細胞cDNAライブラリー（実施例1C）のアリコットを、ヒト・グルカゴン・レセプタcDNAの5'未翻訳配列からの配列に隣接するEco RI部位を含むセンス・オリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドZC5763（配列番号22）並びにヒト・グルカゴン・レセプタcDNAの3'未翻訳配列からの配列に隣接するXho I 部位を含むアンチセンス・オリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドZC5849（配列番号23）を使用したPCR増幅に供した。このオリゴヌクレオチド・プライマー内に制限部位を含むことは、好適なプラスミド・ベクター内への得られたPCR生成物の指向性クローニングを容易にする。ＰＣＲ反応混合物を、４μｌの島細胞cDNA ライブラリー（実施例１Ｃ）、８μlの10X Promega PCR Buffer（Promega）、20 pモルのZC5763（配列番号22）、２０ｐモルのZC5849（配列番号23）、20mMのそれぞれのデオキシリボヌクレオチドを含む１μlの溶液、及び46.5μlの水を含むように設定した。混合物を３分間95℃まで加熱し、次に熱を３分間80℃まで減少させた。この混合物を使用準備まで80℃において保った。反応を開始させるために、２μlの10X Promega PCRBuffer（Promega）、２μlの５U/μl Taq I ポリメラーゼ（Cetus）及び16μlの水を含んで成る20μlの酵素混合物を上記反応混合物に添加した。この反応物を50μlの鉱物油（Sigma）により重層し、そしてその反応を30サイクル（95℃１分間、55℃１分間、72℃２分と15秒間、ここで72℃インキュベーションをサイクル毎に３秒間増加させた。）に供し、その後72℃における10分間のインキュベーションを行った。最後の72℃のインキュベーションの後、この反応物を４℃に保った。このPCR生成物の10μlアリコットのアガロース・ゲル電気泳動は、約1.8〜1.9kb断片の存在を証明した。pLJ6'内に存在するヒト・グルカゴン・レセプタcDNAに基づき、約1846塩基対の断片を予測した。 PCR反応物をクロロホルムにより抽出し、その後フェノール：クロロホルム抽出及び最後のクロロホルム抽出を行った。最後の抽出の後、５μlの４μg/μlのグリコーゲン担体（Boerhinger Mannheim Corporation）を添加し、そしてその混合物を酢酸アンモニウム及びエタノールの存在中で沈降させた。DNAを遠心分離によりペレット化し、そしてそのペレットを70%エタノールにより洗浄した。このDNAペレットを水中で再構築し、そしてXho I 及びEco RIにより消化した。D NAをゲル精製し、そしてXho I 及びEco RIにより線状化されたプラスミドpBLUES CRIPT SK⁺（Stratagene Clonig Systems）内にサブクローン化した。ライゲーション混合物を大腸菌（E.coli）株DH10B細胞（GIBCO-BRL）内に形質転換した。プラスミドDNAを選択された形質転換体から調製し、そしてそのDNAを制限酵素及びサザン・ブロット分析に供した。これらのクローンをpLJ6'内に存在するヒト・グルカゴン・レセプタcDNA挿入物と比較した。診断的制限酵素消化に基づき、選択されたクローンを配列分析に供した。配列分析は、１つのクローン、pSLIGR-1 がグルカゴン・レセプタ・コーディング配列を含んでいたことを示した。pSLIGR -1のコーディング領域は、pLJ6'内に存在する肝臓cDNAと比べたときグルカゴン・レセプタ・コーディング領域内に３ヌクレオチドの変更を含んでいた。これらのヌクレオチド変更の中の１つは、無表現突然変異であり、残りの２つは、表５中に示すような保存的アミノ酸の変更をもたらした。これらの変更の分析は、それらが対立遺伝子変動を提示する多形態的差異の結果であることができるであろうということを示唆している。実施例７ヒト・グルカゴン・レセプタ遺伝子のクローニングヒト・グルカゴン・レセプタ・ゲノム・クローンを得るために、ゲノムDNAの２つのライブラリーを、プローブとしてヒト・グルカゴン・レセプタcDNAを使用してスクリーンした。増幅されたヒトλFIX II白色人種男性胎盤ゲノム・ライブラリー及び増幅されたヒト肺λFIX ゲノム・ライブラリー（両方のライブラリーをStratageneCloning Systemsから得た。それぞれCatalog番号946203及び944201 。）をヒト・グルカゴン・レセプタ遺伝子についてスクリーンした。増幅されたヒト肺ゲノム・ライブラリーを滴定し、そして約４ x 10⁴ プラーク形成ユニット（pfu）を150mm直径プレートのそれぞれの上の大腸菌（E.coli）株LE392細胞（Stratagene Cloning Systems）と共にプレートした。追加の10プレートを大腸菌（E.coli）株LE392細胞と共に、そしてプレート当たり約６ x 10⁴ pfuによりプレートした。これらのプレートを37℃において一夜インキュベートに供し、そして30プレートをスクリーニングのために選択した。２連フィルターを30プレートのそれぞれのために調製した。それぞれのフィルターを製造者により推奨された手順に従ってHYBONDナイロン膜８Amersham）によりプレートを重層することにより調製した。フィルターをプレートから持ち上げ、そして細胞を室温において５分間1.5M N aCl, 0.5M NaOH中で溶解させた。フィルターを１M Tris-HCl（pH 7.5）, 1.5M N aCl中で５分間中和し、そしてそのフィルターをSTRATALINKER（Stratagene Clon ing Systems）内の1200μジュールのUVエネルギーにより固定した。前洗浄後、フィルターを、0.45μmフィルターを通して濾過され、そして使用直前に最終濃度100μg/mlの熱変性サケ精子DNAを添加された前ハイブリダイゼーション溶液（５x SSC, 5x Denhardt's溶液，0.2%SDS, １mM EDTA）中で前ハイブリダイズされた10フィルターの中の６バッチに分けた。これらのフィルターを65℃において一夜前ハイブリダイズした。 p40-2-2からのヒト・グルカゴン・レセプタcDNAを製造者により推奨された方法を使用してAmersham MEGAPRIME キット（Amersham）を使用してランダム-プライムした。フィルターのそれぞれのバッチからの前ハイブリダイゼーション溶液を28.5 x 10⁶ cpmのプローブを含む新たな前ハイブリダイゼーション溶液により置換した。これらのフィルターを24時間65℃においてハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーション溶液を除去し、そしてこれらのフィルターを室温において0.25x SSC, 0.2%SDS, １mMEDTAを含む洗浄溶液中でしれぞれ４又は５回濯いだ。濯ぎ後、これらのフィルターを洗浄溶液中65℃における８連続洗浄において洗浄し、この後70℃において最終洗浄を行った。この70 ℃洗浄後、これらのフィルターを増感スクリーンを伴って-70℃において４日間オートラジオグラフ・フィルム（XAR-5: Eastman Kodak Co.; Rochester, NY）に露出させた。オートラジオグラフの検査は、放射標識付けされたプローブとのハイブリダイゼーションの４つの領域の存在を現した。この４つの領域のそれぞれからの寒天のプラグを精製のために拾い上けた。それぞれの寒天プラグを１mlのSM（Maniatis et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1982；（これを、引用により本明細書中に取り込む。）），１%クロロホルム中に一夜浸漬した。一夜のインキュベーション後、それぞれのプラグからのファージを1:1,000 SMに希釈した。５、25及び50μlのアリコットを大腸菌（E.coli）株LE392細胞と共にプレートした。これらのプレートをインキュベートし、そして単一リフトを５及び25μlプレーティングからのプレートから調製した。これらのフィルターを先に記載したように調製し、前ハイブリダイズし、そして洗浄した。これらのフィルターをオートラジオグラフ・フィルムに露出させた。オートラジオグラフの検査は、上記４つのクローンのそれぞれからの陽性に標識付けされた領域を現した。全部で10寒天プラグを、その元のクローンのそれぞれについて少なくとも２つの陽性領域を提示する陽性領域から拾い上げた。それぞれの寒天プラグを先に記載したように処理した。それぞれのプラグからのファージをSM中1:10,000に希釈した。2.5及び10μlのアリコットを大腸菌（E.coli）株LE392細胞と共にプレートした。これらのプレートをインキュベートし、そして単一リフトを好適に分離したプラークをもつプレートからのプレートから調製した。これらのフィルターのオートラジオグラフは、別個のプラークに対応する露出の領域を現した。上記４つの元の陽性のそれぞれからの少なくとも１のクローンを提示する12の陽性プラークを拾い上げた。それぞれのプレートからの１つのプラークをさらなる分析のために選択した。ファージ・クローン2-2-1、3-1-1、14-2-1及び11-2-1からの寒天プラグを先に記載したように処理した。ファージをSM中1:1000に希釈し、大腸菌（E.coli）株 LE392細胞のカルチャー内に接種した。二本鎖DNAをGrossberger（Nuc. Acids Res. 15:6737, 1987；（これを、全体として引用により本明細書中に取り込む。））により本質的に記載されたように調製した。この二本鎖DNAをXba Iにより消化し、そのゲノム挿入物を解放させた。アガロース・ゲル電気泳動は、クローン2-2-1及び11-2-1が９kbのXba I挿入物を含み、クローン14-2-1が15kbの挿入物を含み、そして3-3-1が13kbの挿入物を含んでいたことを、証明した。Xba I消化及びXba I-Bam HI消化クローンのサザン・ブロット分析は、ヒト・グルカゴン・レセプタcDNAが表６中に示す断片にハイブリダイズしたことを示した。クローン11-2-1及び14-2-1をさらなる分析のために選択した。クローン2-2-1 はクローン11-2-1と同一であるようであり、そしてさらなる分析に供さなかった。便利には、クローン名称を表６中に反映するように変更した。二本鎖DNAをMan iatisにより本質的に記載された方法を使用してプラスミド・ベクター内にサブクローニングするためにそれぞれのファージ・クローンから調製した。このDNA をXba Iにより消化し、ゲル精製し、そしてXba Iによる消化により線状化され且つ再環化を防ぐためにウシ・アルカリ性ホスファターゼにより処理されたプラスミドpBLUESCRIPT SK⁺（Stratagene Cl oning Systems）内にサブクローン化した。このライゲーション混合物をBioRad GENEPULSER（Bio-Rad Laboratories; Richmond, CA）内のELECTROMAX DH10B細胞（GIBCO-BRL）内に400オーム、25μファラッド及び2.3kボルトにおいてエレクトロポレートした。プラスミドDNAを選択された形質転換体から調製した。クローン６及び２からあのゲノム挿入物を含むクローンをそれぞれpSLHGR6及びpSLHGR2 と名付けた。クローンpSLHGR6及びpSLHGR2を配列決定した。配列分析及びヒト・グルカゴン・レセプタcDNAのコーディング領域との比較は、このコーディング領域を含む１２エクソンの存在を現した。染色体位置分析をDurnam et al.（Mol. Cell. Biol. 8:1863-1867,1988（これを全体として、引用により本明細書中に取り込む。））により本質的に記載されているように、ビオチン化ヒト・グルカゴン・レセプタ遺伝子プローブ及び染色体17−特異的セントロメア・プローブを使用して調製した中期染色体スプレッド上で行った。染色体の変性、ハイブリダイゼーション及び単一色検出をPinkel etal.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:29 34-2938, 1986（これを全体として、引用により本明細書中に取り込む。））により本質的に記載されているように、行い、そしてKievits et al.（Cytogenet. Cell Genet. 53:134-136,1990,（これを全体として、引用により本明細書中に取り込む。））により修飾した。但し、ハイブリダイゼーションを、65%（vol/vol ）ホルムアミド/10%硫酸デキストラン／２x SCC中で行い、そしてハイブリダイゼーション後洗浄はPalmiter et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6333-63 37, 1992（これを全体として、引用により本明細書中に取り込む。））により記載されているように42℃における65%ホルムアミド/２x SSC及びその後の55℃における0.1x SSCによった。ｑ²⁵位置をTesta et al.（Cytogenet.Cell Genet. 60 :247-249, 1992,（これを全体として、引用により本明細書中に取り込む。））により記載されているように幾つかのハイブリダイズした中期スプレッドをDAPI染色することにより確認した。このDAPI染色はQ-バンド様パターンを作り出した。増幅されたヒト胎盤ゲノム・ライブラリー（Stratagene）を本質的に先に記載した方法を使用してグルカゴン・レセプタ遺伝子について失敗してスクリーンした。簡単に言えば、ライブラリーを滴定し、そして大腸菌（E.coli）株LE392細胞及び約５ x 10⁴ pfuを30の150mmプレートのそれぞれの上にプレートした。さらに、11の150mmプレートを約105 pfu及び大腸菌（E.coli）株LE392細胞と共にそれぞれプレートした。これらのプレートを37℃において一夜インキュベートし、そして38のプレートをスクリーニングについて選択した。ナイロン・フィルター・リフトを調製し、洗浄し、そして先に記載したように前ハイブリダイズした。ヒト島グルカゴン・レセプタcDNA断片、G30（実施例４）を製造者により推奨された方法を使用してAmersham MEGAPRIMEキット（Amersh am）を使用してランダム-プライムした。フィルターのそれぞれのバッチからの前ハイブリダイゼーション溶液を1.1 x 10⁶ cpmのプローブを含む新たな前ハイブリダイゼーション溶液により置換した。フィルターを65℃において一夜ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーション溶液を除去し、そしてフィルターを0.25x SSC, 0.25% SDSを含む洗浄溶液中で65℃における８連続洗浄において洗浄した。70℃洗浄後、フィルターを増感スクリーンを伴って-70℃において４時間オートラジオグラフ・フィルム（XAR-5; Eastman Kodak Co.）に露出させた。このオートラジオグラフの検査は、納得のゆく陽性シグナルを全く現さなかった；しかしなが、弱く標識付けされた領域に対応する７つの領域をさらなる分析のために拾い上げた。クローンを先に記載したような第二のスクリーンに供したが、この第二のスクリーンのオートラジオグラフは、標識付けされた領域を全く示さなかった。これらのクローンを追跡しなかった。実施例８哺乳類細胞内でのグルカゴン・レセプタcDNAの発現Ａ． BHK570細胞内でのラット・グルカゴン・レセプタの発現プラスミドpLJ4をプラスミドpLJ1により（寄託番号10314下American Type Cul ture Collectionに寄託されている）BHK570細胞中にGraham and Van der Eb（Vi rology 52:456, 1973（これを全体として、引用により本明細書中に取り込む。））により本質的に記載されているような燐酸カルシウム法を使用して同時トランスフェクトした。プラスミドpLJ1をプラスミドp416から誘導した。これは、アデノウイルス５ ori、SV40エンハンサー、アデノウイルス２主要後期プロモーター、アデノウイルス２トリパルチット・リーダー、5'及び3'スプライス部位、D HFR^r cDNA、SV40ポリアデニレーション・シグナル及びpML-1ベクター配列（Lusk y and Botchan, Nature 293:79-81, 1981）を含んで成る。p416からのEco RI-Xb a I DHFR発現ユニットを、Eco RI及びXba Iによる消化により線状化されたpUC18 にライゲートし、プラスミドpLJ1を構築した。トランスフェクトされた細胞を増殖培地（10%ウシ胎児血清、１x PSN抗生物質混合物（GIBCO BRL 600-5640）、及び2.0mM L-グルタミンを含むDulbecco's修飾Eagle's培地（DMEM））中で増殖させた。非選択増殖培地中で数日間の後、その増殖培地を選択培地（250mMメトトレキサート（MTX）を含む増殖培地）により置換した。細胞を分け、そして選択培地中で1:20及び1:50 に、10cmプレート内に希釈した。250mM MTX中での7-10日間の選択の後、コロニーをクローニング・シリンダーを使用して24-ウェル・プレートのウェル内に拾い上げた。得られたコロニーを先に記載したような（実施例３）グルカゴンに結合する能力についてテストした。また、グルカゴン結合を24-ウェル・プレートのウェル内にそれぞれのクローンの２ x 10⁵細胞をプレーティングすることにより全部の細胞について行った。プレートを5%CO₂中37℃において72時間インキュベートした。グルカゴン結合を実施例３中に記載したように行った。但し、最後のPBS洗浄の後、細胞を、トリプシン化によりそのウェルから管内へ取り出した。管をガンマ・カウンター内でカウントした。カウントの最高数をもち、そしてそれ故最もよくグルカゴンに結合することができるような細胞をさらなる特徴付けのために選択した。また、選択された形質転換体を実施例8D中に記載するようなグルカゴン-仲介cAMP応答及び実施例8E中に記載するようなグルカゴン-仲介細胞内カルシウム応答について検定した。また、グルカゴン結合検定を以下に記載するような形質転換体からの膜調製物上で行った。Ｂ．膜調製物を使用したグルカゴン結合 pLJ4 BHK形質転換体からの膜を¹²⁵Ｉ-グルカゴンへの結合能力についてラット肝臓膜調製物と比較した。膜をRodbell et al.（J.Biol. Chem. 246:1861-1871, 1971（これを全体として、引用により本明細書中に取り込む。））により本質的に記載されたように調製した。肝臓膜の２バッチをそれぞれ、約80グラムの12 〜16の断頭幼弱雌ラットから調製した。肝臓を速く取り出し、そして氷を入れたビーカー内に置いた。肝臓を10グラム部分に分けた。これらの部分をハサミでこまぎれにし、そして結合組織をこのこまぎれ手順の間に除去した。これらの部分をDounceホモゲナイザー内で別々に均質化した。それぞれの部分に、 25mlの培地（表２）をそのホモゲナイサー内のこまぎれ組織に添加し、そしての組織を、ルース乳棒の８回の激しいストロークにより氷バケツ内で均質化した。均質化の後、均質化物を450mlの冷培地（表２）内にプールした。プールした均質化物を３分間攪拌し、そしてチーズクロスの２層を通して濾過し、その後チーズクロスの４層を通して濾過した。次に均質化物を４℃において1500 xgにおいて30分間遠心分離した。上清を廃棄し、そしてペレットをきれいなDounceホモゲナイザー内にプールした。ペレットを上記ルース乳棒の３回の穏やかなストロークにより再懸濁させた。再懸濁したペレットを62mlの69% シュクロース溶液（表２）を含む250mlの勾配中にデカントした。蒸留水を110mlの最終容量まで添加し、そしてその混合物を十分に混合し、そして冷却維持した。溶液の濃度を屈折計（Bausch & Lomb, Rochester, N.Y.）により測定するように69%シュクロース又は水を使用して44.0%+/-0.1%に調整した。シュクロース懸濁液を25 x 89mmの超遠心分離管内に均等に分配した。それぞれの懸濁液を注意して20mlの42.3%シュクロース溶液（表２）により重層し、そしてその懸濁液をSW28ローター（Sorval l, Dupont Company, Wilmington, Del.）内で４℃において24,000rpmにおいて15 0分間遠心分離した。遠心分離後、それぞれの管からの浮遊物を18-ゲージ針を通して10mlシリンジ内への吸引により除去した。それぞれの管からの材料をプールし、そして遠心分離管への上記針を通しての混合物の吸引及び除去により約10mlの培地（表２）中へ再懸濁させた。この管を培地（表２）により満たし、、そしてSS-34ローター（Sorvall）内で15,000RPMにおいて15分間遠心分離した。上清を注意してデカントし、そして廃棄した。ペレットを培地（表２）中に再懸濁させ、そして蒸留水により1:1000に希釈した。吸光度を、タンパク質濃度を測定するために１cmキュベット内で読んだ。タンパク質を以下の式：を使用して測定した。膜調製物を等分し、ドライ・アイス/エタノール浴内で急速冷凍し、そして-80 ℃において保存した。膜を、選択培地中で150mmプレート内の集密まで増殖させたBHKトランスフェクト体から調製した。集密トランスフェクト体の２つのプレートを冷燐酸塩バッファー生理食塩水（PBS:Sigma ChemicalCo., St. Louis, Mo.）により２回濯ぎ、そして１mM PMSFを含む10mlのPBSをそれぞれのプレートに添加した。それぞれのプレートからの細胞をPBS溶液中にスクレープし、そしてそれぞれのプレートからの細胞を新たな管内にそれぞれ移した。それぞれのプレートを１mM PMSFを含む５ml PBSにより濯ぎ、そしてその濯ぎ液をそれらのそれぞれの細胞と共にプールした。細胞を４℃において卓上遠心分離機内で2,000rpmにおいて遠心分離した。上清を廃棄し、そしてその細胞を30mlの５mM Hepes, １mM PMSF, pH 7.5中に再懸濁させた。細胞を15分間氷上でインキュベートし、その後４℃において47,8 00xgにおいて遠心分離した。それぞれのペレットを１M PMSFを含むPBS中の溶液中に再懸濁させ、等分し、そして-80℃において冷凍した。グルカゴン結合検定を使用した競合分析をラット肝臓及びBHK形質転換体膜調製物上で行った。簡単に言えば、10mM HOAc中に希釈された10^-11M 〜10^-6Mの20μlのグルカゴン又は20μlのBSAを含む反応管を設定した。それぞれの管に、100μlの２x結合バッファー；20μlの¹²⁵Ｉ-グルカゴン（Amersham）； 20μlの１mM NaHCO₃；20μlの10mM HOAc, 0.5% BSA（Novo Nordisk N/A, Bagsva erd,Denmark）；及び40μlの蒸留水を添加した。結合反応をその反応管に20μl の膜調製物を添加することにより開始させた。反応物を30℃において30分間インキュベートした。膜を４℃において10分間高速におけるマイクロフュージ内で遠心分離した。それぞれのサンプルからの上清を吸引し、そしてペレットをカウントした。非標識付けグルカゴンとの競合は、グルカゴン結合についての殆ど同一のシグモイド曲線（図３）を作り出した。Scatchard分析（Scatchard, Ann. N.Y . Acad. Sci. 51:660-672, 1949（これを全体として、引用により本明細書中に取り込む。））により、見かけのKdが、クローン化されたレセプタについて50nM であり、そしてラット肝臓膜について49nMである（図４）。 pLJ4によりエンコードされているレセプタの特異性を、¹²⁵Ｉ−グルカゴン結合について競合する関連ペプチド・ホルモンの能力についてテストした。クルカゴン及び関連ペプチドのマイクロモル量（表７）をそれぞれ¹²⁵Ｉ-グルカゴンと共に、先に記載した結合検定におけるpLJ4ランスフェクト体の膜調製物に添加した。生来のグルカゴン及び拮抗物質des-His¹［Glu⁹］グルカゴン・アミドだけが、その膜への結合について¹²⁵Ｉ−グルカゴンと競合することができた。Ｃ．COS-7細胞内でのラット・グルカゴン・レセプタの発現グルカゴンにより剌激されるべきpLJ4によりトランスフェクトされたCOS-7細胞がcAMPレベルを増加させる能力を以下に記載するようなAmersham SPAキット（ Amersham）を使用して評価した。この検定は、グルカゴン−剌激pLJ4トランスフェクト体が対照ベクターだけでトランスフェクトされたCOS-7細胞よりも約５倍多くcAMPを蓄積したことを示した。関連ペプチド・セクレチン、VIP、PTH、GLP 及びカルシトニンを100nM〜1000nMの濃度において形質転換体にそれぞれ添加し、そしてcAMPレベルを誘導するそれらの能力について検定した。検定の結果は、関連ペプチドのいずれもcAMPレベルにおける有意な増加を誘導することができなかったということを示した。Ｄ．全細胞についてのルシフェラーゼ及びアデニレート・シクラーゼ活性検定ラット・グルカゴン・レセプタcDNAを、ZK6、すなわち、少なくとも１のサイクリックAMP応答要素を含むプロモーター、ルシフェラーゼcDNA及びhGHターミネーターを含んで成る発現ユニットにより安定してトランスフェクトされたBHK570 細胞系内で、発現させた。この細胞系は、グルカゴンのそのレセプタへの結合に応答するルシフェラーゼ活性、アデニレート・シクラーゼ活性及び細胞内カルシウム濃度の測定を許容する。プラスミドZK6内のプロエンケファリン・サイクリックAMP応答要素（CRE）をZ em233から得た。Zem233を、Zem67及びZem106から得た。プラスミドZem106を前駆体Zem93から構築した。Zem93を構築するために、MT-1プロモーターを含んで成る Kpn I-Bam HI断片をMThGH111（Palmiter et al., Science 222:809-814, 1983）から単離し、そしてpUC18中に挿入した。プラスミドZem93を次にSst Iにより消化し、そして再ライゲートし、プラスミドZem106を作り出した。ここでは、MT-1 プロモーターに対して5'側の600塩基対の配列が取り除かれていた。プロエンケファリンCREを、Eco RI及びSst IによるZem106の最初の消化により Zem106内のSV40プロモーターの5'末端に挿入し、ベクター含有断片を単離した。オリゴヌクレオチドZC982及びZC983（それぞれ配列番号３と４）を、アニールされるとき、5'Eco RI部位及び3'Sst I部位に隣接するヌクレオチド-71〜-133（Co mb et al.,Nature 323:353-356, 1986）からのプロエンケファリンCREをエンコードするように設計した。オリゴヌクレオチドZC982及びZC983（それぞれ配列番号３と４）をライゲートし、アニールし、そして線状化Zem106によりライゲートし、プラスミドZem224を得た。プラスミドZem67をSma I及びHind IIIによりpIC19R（Marsh etal., Gene 32:4 81-486, 1984）を消化することにより得た。マップ位置270（PvuII）から位置51 71（Hind III）までのSV40のori領域を次に線状pIC19Rにライゲートし、プラスミドZem67を作り出した。プラスミドpSV2-neo（American Type Culture Collect ion AccessionNO.37149）からのHind III-Bam HIネオマイシン耐性遺伝子-SV40 ターミネーター断片をHind III-Bgl II消化Zem67にライケートし、Zem220を得た。プラスミドZem220らのSV40プモーター−ネオマイシン耐性遺伝子SV40ターミネーター発現ユニットをEco RI断片として単離した。プラスミドZem224をEco RIにより消化し、そして再環化を防ぐためにウシ・アルカリ性ホスファターゼにより処理した。このネオマイシン発現ユニット及び線状Zem224をライゲートした。CR E近傍のSV40プローターを含むプラスミドをZem233と命名した。プラスミドZem233を、得られた発現ユニットがZem233内に存在するネオマイシン耐性ユニットに対して反対の方向にあるように、追加のCRE配列、TATAボックス、並びにそのプロエンケファリンCRE配列に対してまさに３’側のlac Zコーディング及びポリ（Ａ）配列の一部を挿入するように修飾した。プラスミドZem233 をSstI及びBamHIによる消化により線状化した。オリゴヌクレオチドZC3509及びZ C3510（それぞれ配列番号５と６）を、アニールされるとき、得られた二本鎖が5 'Sst I付着末端及び3'Eco RI付着末端をもつα糖タンパク質CRE(Delegean et al .,Mol.Cell.Biol.7:3994-4002,1987）をエンコードするように、設計した。オリゴヌクレオチドを標準的な手順に従ってアニールした。チミジン・キナーゼTATA ボックスをチミジン・キナーゼ遺伝子のEco RI-Pst I断片スパニング・ヌクレオチド-79〜+18として得た（McKnight,Cell31:355-366,1982）。lac Z遺伝子の３ ’配列及びその関連ポリ（Ａ）配列を（Jaques Peschon, Immunex Corp.,Seattl e,Wash.から得た）プラスミドpLacFからのPst I-Bam HI断片として得た。これは、lacZコーディング領域及びpUC18ベクター内にクローン化されたマウス・プロタミン・ターミネーター配列を含む。Sst I-Bam HI線状化Zem233、SstI-Eco RI Z C3509/ZC3510アダプター、Eco RI-pstITATAボックス断片及びPst I-Bam HI lac Z配列をライゲートした。Zem233のネオマイシン耐性遺伝子発現ユニットに対する正しい方向における発現ユニットを含むプラスミドをKZ5と命名した。ルシフェラーゼ遺伝子及びヒト成長ホルモン（hGH）ターミネーター配列をKZ5 内に存在する lac Zコーディング及びポリ（Ａ）配列を置き換えるために使用した。このルシフェラーゼ遺伝子はプラスミドα-1681uc（Delegean et al.,mol.C ell.Biol.7:3994-4002,1987;及びdeWet et al.,mol.Cell.Biol.7:725-737,1987 ）から1.7kbのXhoI-XbaI断片として最初に得られた。hGHターミネーターを、（A merican Type Culture Collection(Rockville，Ｍｄ．）と大腸菌（E.coli）形質転換体として寄託番号ATCC 68979下寄託された）Zem219bからのXbaI-SalI断片として得た。ルシフェラーゼ遺伝子及びｈＧＨターミネーター配列を便利のためにXhoI-SalI線状化pIC19H（Marsh et al.,ibid.）内にサブクローンした。得られたプラスミド、KZ8をXhoI及びSal Iにより消化し、ルシフェラーゼ-hGHターミネーター配列を単離した。プラスミドKZ5をSalIにより消化し、ベクター含有断片を単離し、そして再環化を防ぐためにウシ・アルカリ性ホスファターゼにより処理した。このXhoI-SalIルシフェラーゼ-hGHターミネーター断片を上記Sal I- 消化KZ5とライゲートした。上記プロモーターに対して適切な方向におけるルシフェラーゼ-hGHターミネーターを含むプラッスミドをKZ6と命名した。プラスミドKZ6を、Graham and Van der Eb（Virology 52:456, 1973,（これを全体として、引用により本明細書中に取り込む。））により本質的に記載されているような燐酸カルシウム沈降法を使用して（寄託番号10314の下American Type Culture Collectionに寄託された）BHK570細胞内にトランスフェクトした。このトランスフェクトされた細胞を増殖培地（10％ウシ胎児血清、lx PSN抗生物質混合物（GIBCO-BRL）、及び2.0mML-ク゛ルタミンを含むDuIbecco's修飾Ea gle's培地（DEME））中で増殖させた。非選択増殖培地中で数日間の後、その増殖培地を選択培地（500μg/mlのG418を含む増殖培地）により置換した。次に細胞を集密迄増殖に供し、その後、それらをトリプシン化し、96-ウェル・プレートのウェル内に限界希釈においてプレートした。細胞を１〜２週間G418選択培地中で増殖させた。単一コロニーを含むウェルからのクローンを以下に記載するルシフェラーゼ検定においてフォルスコリン（forskolin）に応答する能力について検定した。フォルスコリンは、細胞内cAMPレベルを上昇させ、そしてそれ故、レセプタ-非依存性のやり方で関連cAMP-依存性生物学的応答経路を上昇させる。フォルスキンに応答することができるクローンをBHK/KZ6-19-46と命名した。 BHK/KZ6-19-46細胞をpLJ4及びpLJ1と又はpZCEP及びpLJ1（pZCEPトランスフェクト体を陰性対照として使用した。）と先に記載したように燐酸カルシウム-仲介トランスフェクションを使用して同時トランスフェクトした。トランスフェクト体を先に記載したように250nMメトトレキサート中で選択した。トランスフェクト体を選択された作用物質によるCRE-ルシフェラーゼ応答の誘導について３連で検定した。６つのランダムなpLJ4トランスフェクト体を検定し、そしてランダムなpZCEP トランスフェクト体を検定した（陰性対照）。マイクロタイター検定プレートをそれぞれのウェルが100μｌの選択培地中に2 x 10 ⁴ 細胞を含むように設定し、そして細胞を一夜増殖させた。作用物質を選択培地中で以下に列記する２ｘ最終検定濃度において調整した：１μｌグルカゴン 200nMグルカゴン様ペプチド（GLP） 20nM血管作用性腸内ペプチド（VIP） 100nMカルシトニン（CT） 20μMフォルスコリン（CalBiochem,San Diego,Calif.）誘導を、３連のサンプル・ウェル内のそれぞれの２ｘ溶液について100μｌを添加することにより開始させた。非誘導レベルを３連ウェル内で測定し、これに１０％ウシ胎児血清を含む100μｌのＤＭＥＭを添加した。プレートを３７℃，5 %CO₂において４時間インキュベートし、ルシフェラーゼ生産の誘導を可能にさせた。誘導後、培地を除去し、そして200μｌ／ウェルのPBSにより１回洗浄した。洗浄後、25μｌの１Ｘ Cell Culture Lysis Reagent（Ｌｕｃｉferase Assay Syst em,Promega Corp.,Madison,Wis.）をそれぞれのウェルに添加し、プレートを室温において１５分間インキュベートした。プレートをLabsystems Luminoskanマイクロタイター光度計（Labsystems Inc.,Morton Grove, III.）に移し、これに 40μｌのLuciferse Assay Substrate（Luciferase Assay System,Promega）を添加し、その反応物を混合し、そしてウェル当たり２秒間ルシフェラーゼ・シグナルを積分した。それぞれの作用物質についてのルシフェラーゼの倍誘導を以下のように計算した：１つのpLJ4トランスフェクト体クローン、KZ6/rGR-DHFR-2は、グルカゴンによるルシフェラーゼの6-10倍に誘導示すが、GLP、VIP又はCTにより誘導されなかった。トランスフェクト体クローンKZ6/rGR-DHFR-2のグルカゴン及びフォルスコリンへのcAMP応答を製造者の指示を使用してcAMP ［¹²⁵］シンチレーション近傍検定装置（Amersham）を使用したラジオイムノアッセイによっても検定した。簡単に言えば、１ｍｌのKZ6/rGR-DHFR-2細胞当たり2 x 10⁵細胞の100μｌを多ウェル培養皿のウェル内にプレートし、そして選択培地内で一夜増殖させた。グルカゴン及びフォルスコリンをDMEM,10％ウシ胎児血清10μＭ、それぞれ0.0001-1000nM 及び25μMにおけるIBMX中で調製した。増殖培地を50μｌ／ウェルの作用物質（グルカゴン又はフォルスコリンのいずれか）により置換した。細胞を３７℃，5%C0₂において１０分間作用物質と共にインキュベートした。インキュベーション後、細胞を、それぞれのウェルへの20 0μｌの沸騰水の添加により溶解させた。１５分後、上清を集め、そしてアセテート・バッファー（ｃＡＭP［¹²⁵Ｉ］Scintillation Proximity Assay System（ Amersham））中で１：５又は１：４０に希釈した。サンプルを製造者により提供されたプロトコールに従ってトリエチルアミン及び無水酢酸を使用してアセチル化した。それぞれのアセチル化サンプルの100μｌアリコットを、LKB T-トレーのウェル内で７５μｌの¹²⁵I-cAMP、７５μｌの抗−スクシニルcAMP抗血清及び７５μ ｌのロバ抗ウサギIgG結合SPAビーズ（すべてcAMP ［¹²⁵I］Scintillation Proxi mity Assay System（Amersham）内に提供される検定溶液）と組み合わせた。トレーをシールし、そして200rpmにおける回転プラット振とう機上での連続振とうにより一夜インキュベートした。サンプルを1205 BETAPLATE液体シンチレーション・カウンター（Pharmacia LKB Instruments Inc.,Gaithersb urg,Md.）内でカウントした。2-128fモルのアセチル化cAMPの標準曲線をも走らせた。全¹²⁵I-cAMP結合及び非特異的結合をも測定した。KZ6/rGR-DHFR-2は、飽和グルカゴン（10-100nM）におけるcAMPレベルの140倍の誘導、及び0.25nMのED₅ ₀ を示した。Ｅ．細胞内カルシウム濃度の測定グルカゴンに対するplJ4トランスフェクト体の細胞内カルシウム応答をGrynki ewicz et al.（J.Biol.Chem.260:3440-3450, 1985（これを全体として、引用により本明細書中に取り込む。））により本質的に記載されているような方法を使用して検定した。プラスミドpLJ4 BHKトランスフェクト体をチャンバー当たり5 x 10⁴細胞において２ウェルのカバーグラス・チャンバー（NUNC）内に接種した。細胞を１〜３の間にわたり正常培養条件下メトトレキサート選択培地中で増殖させた。培地を吸引により除去し、そしてそのチャンバーを１ｍｌの画像形成バッファー（表３）により２回濯いだ。細胞を３０分間室温において暗所にて0.5m lのFura-2 AM溶液（表３）と共にインキュベートした。インキュベーション後、 Fura-2 AM溶液を除去し、そして細胞を１ｍｌの画像形成バッファーにより３回濯いだ。最後の濯ぎの後、0.5mlのバッファーをそれぞれのチャンバー内に残した。細胞を室温において30〜120分間暗所にて保持した。画像形成を、水銀放電ランプ並びに10X及び40X Nikon Flour乾燥対象レンズを装備したNikon Diaphot倒立蛍光顕微鏡上で行った。実験を、Sun SPARC I［ワークステーシヨン及びInovision（Research Triangle Park,N.C.）PATIOTOOLソフトウェアを使用して制御し、そして分析した。放射画像が、二色性の鏡（380nm カットオフ）によりGenesisII画像形成増感装置を装備したDage-MTI72 CCDカメラに投影され、そして上記ソフトウェアによりデジタル記録される。細胞内カルシウム濃度を、デジタル顕微鏡画像視野（512 x 480画素）のそれぞれの画素について２つの励起波長（340/380）のそれぞれにおける放射強度の比を計算することによりモニターする。Grynkiewicz et al.（ibid.）は、この比が、細胞を負荷をかけるために使用されるアセチルメトキシ誘導体（fura-2 A M）を取り込み且つ脱エステル化した細胞内のfura-2染料により見られるカルシウム濃度に関係することを、示している。RATIOTOOLソフトウェアは、カルシウム濃度に換算されることができる偽色画像として上記情報を示す。画像を獲得し、そしてこの計算をそれぞれの実験の間に５秒間隔において行った。細胞を、剌激前のベースラインを確立するために少なくとも６０秒間（１２画像）についてモニターし、刺激を、カバーグラス・チャンバー内の0.5mlの画像形成バッファーに200nMグルカゴンを含む0.5mlの画像形成バッファーを添加し、このように100nM最終濃度を達成することにより行った。細胞をモニターし、そして画像を剌激後少なくとも３分間記録した。それぞれの視野内の細胞数に対応する比画像は、グルカゴンの添加後短時間で劇的に変化することが観察された。これを、応答細胞のそれぞれに対応する比画像の特定領域について平均値を計算するためのRATIOTOOLソフトウェアを使用して定量した。約1.4の平均休止比をもつ細胞は速やかに３〜４の値に上昇した。それらは、４０〜５０秒間高い値において残り、そしてその後段々にベースラインに減衰した。独立換算実験は、この反射が、細胞内カルシウム濃度において約 150nMの休止値から約400nMのピークまで変化させたことを示した。Ｆ．イノシトール・ホスフェート測定 pLJ4からのグルカゴン・レセプタを発現するBHK 570細胞又は模擬-トランスフェクトBHK 570細胞を、ウェル当たり約200,000細胞において24-ウェル組織培養皿内にプレートした。２４時間後、それぞれのウェル内の細胞を2.0μCimyo-（2 -³ H）イノシトールを含む０．５ｍｌのMTX選択培地（比活性−20Ci/mモル；Ame rsham）中でインキュベーションすることにより標識付けした。２４時間のインキュベーションの後、細胞を、10mM LiClを含む20mM Hepes,pH 7.0バッファー（ Sigma Chemical Co.）により緩衝液化した１ｍｌの予熱したＤＭEM（Dulbecco's Modified Eagles Medium; JRH Biosciences,Lenexa,Kan.）により洗浄した。この洗浄培地を吸引により除去し、そして900μｌの新たな緩衝化培地により置換した。細胞を３７℃において５分間インキュベートした。インキュベーション後、それぞれの作用物質又は拮抗物質を３連ウェルに添加し、そして表８中に述べる容量及び条件に従ってインキュベートした。反応を氷上に細胞を置くことにより終了させた。培地の吸引後、細胞を１ｍｌの冷DMEM及び１ｍｌの氷冷１０％ペルクロロ酸の添加により溶解させた。１０分後、細胞溶解物を氷上の管に移し、そのそれぞれが500μｌの10mM EDTA,pH 7.0 を含んでいた。７〜７．５の間のｐＨか達成されるまで、サンプルを900μｌの、60mM Hepes Buffer中の1.5M KOHの添加及KOH-HEPES溶液の滴下により中和した。冷凍サンプルを解凍し、そして沈殿をサンプルから静置させた。上清を、それぞれ５ｍｌのメタノール及び1M KHCO₃により順番に洗浄し、その後１５ｍｌの水により洗浄したAMPREPミニカラム（Amicon）に適用した。サンプルを適用した後、溶出液を集めた。カラムを１ｍｌの水により４回洗浄し、そして１ｍｌのサンプルをそれぞれの洗浄後に集めた。イノシトール・ホスフェートを４連続の0.25 M KHCO₃の１ｍｌ適用によりカラムから溶離させ、１ｍｌのサンプルをそれぞれの適用後に集めた。１０ｍｌのOPTIFLUOR（Packard Instrument Co.,Menden,Con n．）をそれぞれのサンプルに添加し、そしてサンプルをカウントした。イノシトール・ホスフェート経路の刺激を放射標識付けしたイノシトール・ホスフェート・レベルにおける増加により示した。イノシトール・ホスフェート生産における剌激はいずれのサンプルにおいても全く観察されなかった。Ｇ．COS 7細胞内でのヒト・グルカゴン・レセプタの発現プラスミドpLJ6' を、先に記載したようなDEAE-デキストラン手順を使用して COS 7細胞中にトランスフェクトした。細胞をトランスフェクション後７２時間（実施例３中に記載したような）ガラス・チャンバー・スライド上で増殖させた。¹²⁵ I-グルカゴンを使用したその場のグルカゴン結合検定その後のエマルジョン・オートラジオグラフィーを実施例３中に記載したように行った。pLJ6' によりトランスフェクトされた細胞の５０％以上が特異的なやり方でグルカゴンに結合した。Ｈ．BHK570細胞内でのヒト・グルカゴン・レセプタの発現（寄託番号10314の下American Type Culture Collectionに寄託された）BHK57 0細胞を燐酸カルシウム・トランスフェクション法（実施例８）を使用してプラスミドpLJ6' によりトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、単一コロニーが見えるようになるまでＧ４１８の存在中で選択した。好適なコロニーをクローニング・シリンダーを使用してクローン化した。クローンは、先に記載したように行われたヨウ素化グルカゴンへのその場の結合を使用してグルカゴンに結合することが示された。 PLJ6'-トランスフェクト細胞を、実施例８．Ｃ中に本質的に記載したようにcA MP蓄積について検定した。トランスフェクト体をグルカゴン、セクレチン、VIP 又はGLP-Iによる剌激の後に検定した。検定は、ｐＬＪ６’−トランスフェクト細胞が対照細胞よりもグルカゴン剌激後の増加したｃＡＭＰ濃度を蓄積したことを示した。セクレチン、ＶＩＰ又はＧＬＰ−Ｉによるトランスフェクト体の刺激は、増加したｃＡＭＰの蓄積を全く示さなかった。細胞内カルシウム応答を実施例８．Ｅ中に本質的に記載したように測定した。グルカゴン−剌激ｐＬＪ６’− トランスフェクト細胞は、カルシウム指示薬Ｆｕｒａ−２の蛍光における急速上昇により示されるような細胞内カルシウム・レベルにおける増加を証明した。これらの結果は、ｐＬＪ６’ がグルカゴンに結合し且つシグナル形質導入を容易にすることができる機能的ヒト・グルカゴン・レセプタをエンコードしていることを、示している。これまで述べてきたことから、本発明の特定の態様を説明の目的のために本明細書中に記載してきたけれども、様々な変更を本発明の本質及び範囲から外れることなく行うことができるということが、理解されるであろう。従って、本発明は、添付のクレーム以外によっては限定されない。配列表（１）一般情報：（ｉ）出願人：名称：ZymoGynetics,Inc. 番地：4225 Roosevelt Way North East 市：Seattle,Washington 国：アメリカ合衆国郵便番号：98105 電話：（206）547-80808 （ii）発明の名称：グルカゴン・レセプタ (iii）配列数：２５（iv）通信先：（A）名宛人：SEED AND BERRY （B）番地：6300 COLUMBIA CENTER （C）市：SEATTLE （D）州：WA （E）国：USA （F）郵便番号：99104-7092 （Ｖ）コンピュータ読み込み形態：（A）媒体型：プロッピー・ディスク（B）コンピュータ：IBM PC互換性（C）オペレーティング・システム：PC-DOS/MS-DOS （D）ソフトウェア：PatentIn Release #1.0, Version #1．（Vi）最新出願データ：（A）出願人番号：08/086,631 （B）出願日：1993年7月1日（C）分類：（vii）先の出願データ（A）出願人番号：US 07/938,331 （B）出願日：1992年8月28日（viii）アトーニー／エージェント情報（A）氏名：McMasters, David d. （B）登録番号：33,963 （C）参照／書類番号：990008.424C1 （ix）遠距離通信情報：（A）電話：206-622-4900 （B）テレファックス：206-682-6031 （2）配列番号１についての情報：（ｉ）配列の特徴：（A）長さ：17塩基対（B）配列のタイプ：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（vii）直接源：（B）クローン：ZC447 （xi）配列：配列番号１：（2）配列番号2についての情報：（ｉ）配列の特徴：（A）長さ：18塩基対（B）配列のタイプ：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（vii）直接源：（B）クローン：ZC976 （xi）配列：配列番号2：（2）配列番号3についての情報：（ｉ）配列の特徴：（A）長さ：71塩基対（B）配列のタイプ：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（vii）直接源：（B）クローン：ZC982 （xi）配列：配列番号3：（2）配列番号4についての情報：（ｉ）配列の特徴：（A）長さ：63塩基対（B）配列のタイプ：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（vii）直接源：（B）クローン：ZC983 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【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年８月１１日【補正内容】請求の範囲１．グルカゴン・レセプタをエンコードしている単離されたDNA分子。２．グルカゴン・レセプタがラット及びヒトのグルカゴン・レセプタから成る群から選ばれている、請求項１に記載のDNA分子。３．分子が、ヌクレオチド１４５からヌクレオチド１５９９までの配列番号１４のヌクレオチドの配列、又はヌクレオチド５３からヌクレオチド１４８６までの配列番号２４のヌクレオチドの配列を含んで成る、請求項１に記載のDNA分子。４．グルカゴン・レセプタが、メチオニン、アミノ酸番号１から、トレオニン、アミノ酸番号４８５までの配列番号１５のアミノ酸配列、又はメチオニン、アミノ酸番号１から、フェニルアラニン、アミノ酸番号４７７までの配列番号２５のアミノ酸配列を含んで成る、請求項１に記載のDNA分子。５．グルカゴン・レセプタをエンコードしている第一DNAセグメントであってその第一DNAセグメントの発現に必要な追加のDNAセグメントに作用可能な状態で結合されものを含んで成るDNA構築物。６．グルカゴン・レセプタがラット及びヒトのグルカゴン・レセプタから成る群から選ばれている、請求項５に記載のDNA構築物。７第一DNAセグメントか、ヌクレオチド145からヌクレオチド1599までの配列番号１４のヌクレオチドの配列、又はヌクレオチド５３からヌクレオチド1486までの配列番号２４のヌクレオチドの配列を含んで成る、請求項５に記載のDNA構築物。８．グルカゴン・レセプタが、メチオニン、アミノ酸番号１から、トレオニン、アミノ酸番号485までの配列番号１５のアミノ酸配列、又はメチオニン、アミノ酸番号１から、フェニルアラニン、アミノ酸番号477までの配列番号２５のアミノ酸配列を含んで成る、請求項５に記載のDNA構築物。９．請求項５〜８の中のいずれか１項に記載のDNA構築物を含む宿主細胞。１０．グルカゴン・レセプタの生産方法であって、前記第一DNAセグメントの発現を促進する条件下で請求項９に記載の宿主細胞を培養することを含んで成る方法。１１．グルカゴン・レセプタ・ペプチドをエンコードしている単離されたDNA分子。１２．グルカゴン・レセプタ・ペプチドがラット及びヒトのグルカゴン・レセプタ・ペプチドから成る群から選ばれている、請求項１１に記載のDNA分子。１３．分子が、ヌクレチド226からヌクレオチド570までの配列番号１４のヌクレオチドの配列を含んで成る、請求項１１に記載のDNA分子。１５．グルカゴン・レセプタ・ペプチドをエンコードしている第一DNAセグメントであってその第一DNAセグメントの発現に必要な追加のDNAセグメントに作用可能な状態で結合されものを含んで成るDNA構築物。１６．グルカゴン・レセプタ・ペプチドがラット及びヒトのグルカゴン・レセプタ・ペプチドから成る群から選ばれている、請求項１５に記載のDNA構築物。１７．第一DNAセグメントが、ヌクレチド226からヌクレオチド５７０までの配列番号１４のヌクレオチドの配列を含んで成る、請求項１５に記載のDNA構築物。１８．グルカゴン・レセプタ・ペプチドが、グルタミン、アミノ酸番号２８から、チロシン、アミノ酸番号142までの配列番号１５のアミノ酸配列を含んで成る、請求項１５に記載のDNA構築物。１９．請求項１５〜１８の中のいずれか１項に記載のDNA構築物を含む宿主細胞。２０．グルカゴン・レセプタ・ペプチドの生産方法であって、第一DNAセグメントの発現を促進する条件下で請求項１９に記載の宿主細胞を培養することを含んで成る方法。２１．単離されたグルカゴン・レセプタ・ペプチド。２２．グルタミン、アミノ酸番号２８から、チロシン、アミノ酸番号150までの配列番号１５のアミノ酸配列を含んで成る、請求項２０に記載のグルカゴン・レセプタ・ペプチド。２３．グルカゴン・レセプタに特異的に結合する単離された抗体であって、モノクロナール抗体であり且つグルカゴン・レセプタへのグルカゴンの結合をブロックするような抗体。２４．請求項２３に記載のモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマ。２５．少なくとも１２ヌクレオチドのプローブであって、グルカゴン・レセプタをエンコードしている核酸とハイブリダイズすることができるプローブ。２６グルカゴン拮抗物質の存在を検出する方法であって、以下の段階：（ａ）グルカゴン作用物質の存在中、化合物を、レセプタへのその化合物の結合を許容するのに十分な条件及び時間にわたり、応答経路及びその経路を通しての関連応答に結合した組換え体グルカゴン・レセプタに、晒し；そして（ｂ）そのグルカゴン作用物質単独によるその応答経路の剌激に対して、そのグルカゴン・レセプタへのその化合物の結合から生じる応答経路の剌激における減少を検出し、そしてそれからグルカゴン拮抗物質の存在を検出する、を含んで成る方法。２７．応答経路が膜結合アデニレート・シクラーゼ応答経路である、請求項２６に記載の方法。２８．検出の段階が、膜結合アデニレート・シクラーゼ応答経路によるサイクリックＡＭＰ生産における減少を測定することを含んで成る、請求項２７に記載の方法。２９．応答経路がルシフェラーゼ・リポーター系を含む、請求項２６に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 16/28 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 21/08 9358−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4ＢＧ０１Ｎ 33/566 8310−2Ｊ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ (72)発明者ジェリネク，ローラジェイ. アメリカ合衆国，ワシントン 98115，シアトル，ノースイーストナインティース 2518 (72)発明者シェパード，ポールオー. アメリカ合衆国，ワシントン 98053，レッドモンド，ノースイーストセカンド 20717 (72)発明者グラント，フランシスジェイ. アメリカ合衆国，ワシントン 98115，シアトル，サーティーセブンスアベニュノースイースト 7714 (72)発明者カイパー，ジョセフエル. アメリカ合衆国，ワシントン 98011，ボセル，ノースイーストワンハンドレッドフィフティーフォース 6640 (72)発明者フォスター，ドナルドシー. アメリカ合衆国，ワシントン 98155，シアトルノースイーストワンハンドレッドエイティーファーストストリート 3002 (72)発明者ロク，シアメリカ合衆国，ワシントン 98107，シアトル，ノースウエストフィフティーセカンドストリート 806 (72)発明者オハラ，パトリックジェイ. アメリカ合衆国，ワシントン 98103，シアトル，ノースシックスティーフォースストリート 515

Claims

【特許請求の範囲】１．グルカゴン・レセプタをエンコードしている単離されたDNA 分子。２．グルカゴン・レセプタがラット及びヒトのグルカゴン・レセプタから成る群から選ばれている、請求項１に記載のDNA 分子。３．分子が、ヌクレオチド145からヌクレオチド1599までの配列番号14のヌクレオチドの配列、又はヌクレオチド53からヌクレオチド1486までの配列番号24のヌクレオチドの配列を含んで成る、請求項１に記載のＤＮＡ分子。４．グルカゴン・レセプタが、メチオニン、アミノ酸番号１から、トレオニン、アミノ酸番号485までの配列番号15のアミノ酸配列、又はメチオニン、アミノ酸番号１から、フェニルアラニン、アミノ酸番号477までの配列番号25のアミノ酸配列を含んで成る、請求項１に記載のDNA 分子。５．グルカゴン・レセプタをエンコードしている第一DNA セグメントであってその第一DNA セグメントの発現に必要な追加のDNAセグメントに作用可能な状態で結合されものを含んで成るDNA構築物。６．グルカゴン・レセプタがラット及びヒトのグルカゴン・レセプら成る群から選ばれている、請求項５に記載のDNA構築物。７．第一DNAセグメントが、ヌクレオチド145からヌクレオチド1599までの配列番号14のヌクレオチドの配列、又はヌクレオチド53かクレオチド1486までの配列番号24のヌクレオチドの配列を含んで成る、請求項５に記載のDNA構築物。８．グルカゴン・レセプタが、メチオニン、アミノ酸番号１から、トレオニン、アミノ酸番号485までの配列番号15のアミノ酸配列、又はメチオニン、アミノ酸番号１から、フェニルアラニン、アミノ酸番号477までの配列番号25のアミノ酸配列を含んで成る、請求項５に記載のDNA構築物。９．請求項５〜８の中のいずれか１項に記載のDNA構築物を含む宿主細胞。１０．グルカゴン・レセプタの生産方法であって、前記第一DNAセグメントの発現を促進する条件下で請求項９に記載の宿主細胞を培養することを含んで成る方法。１１．グルカゴン・レセプタ・ペプチドをエンコードしている単離されたDNA分子。１２．グルカゴン・レセプタ・ペプチドがラット及びヒトのグルカゴン・レセプタ・ペプチドから成る群から選ばれている、請求項１１に記載のDNA分子。１３．分子か、ヌクレチド226からヌクレオチド570までの配列番号14のヌクレオチドの配列を含んで成る、請求項１１に記載のDNA分子。１５．グルカゴン・レセプタ・ペプチドをエンコードしている第一DNAセグメントであってその第一DNAセグメントの発現に必要な追加のDNAセグメントに作用可能な状態で結合されものを含んで成るDNA構築物。１６．グルカゴン・レセプタ・ペプチドがラット及びヒトのグルカゴン・レセプタ・ペプチドから成る群から選ばれている、請求項１５に記載のDNA構築物。１７．第一DNAセグメントが、ヌクレチド226からヌクレオチド570までの配列番号14のヌクレオチドの配列を含んで成る、請求項１５に記載のＤＮＡ構築物。１８．グルカゴン・レセプタ・ペプチドが、グルタミン、アミノ酸番号28から、チロシン、アミノ酸番号142までの配列番号15のアミノ酸配列を含んで成る、請求項１５に記載のＤＮＡ構築物。１９．請求項１５〜１８の中のいずれか１項に記載のDNA構築物を含む宿主細胞。２０．グルカゴン・レセプタ・ペプチドの生産方法であって、第一DNAセグメントの発現を促進する条件下で請求項１９に記載の宿主細胞を培養することを含んで成る方法。２１．単離されたグルカゴン・レセプタ・ペプチド。２２．グルタミン、アミノ酸番号28から、チロシン、アミノ酸番号150までの配列番号15のアミノ酸配列を含んで成る、請求項２０に記載のグルカゴン・レセプタ・ペプチド。２３．グルカゴン・レセプタに特異的に結合する単離された抗体。２４．抗体がモノクロナール抗体である、請求項２３に記載の単離された抗体。２５．グルカゴン・レセプタへのグルカゴンの結合をブロックする、請求項２４に記載の単離された抗体。２６．請求項２３〜２５の中のいずれか１項に記載のモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマ。２７．少なくとも12ヌクレオチドのプローブであって、グルカゴン・レセプタをエンコードしている核酸とハイブリダイズすることができるプローブ。２８．グルカゴン拮抗物質の存在を検出する方法であって、以下の段階： (a)グルカゴン作用物質の存在中、化合物を、レセプタへのその化合物の結合を許容するのに十分な条件及び時間にわたり、応答経路及びその経路を通しての関連応答に結合した組換え体グルカゴン・レセプタに、晒し；そして (b)そのグルカゴン作用物質単独によるその応答経路の剌激に対して、そのグルカゴン・レセプタへのその化合物の結合から生じる応答経路の刺激における減少を検出し、そしてそれからグルカゴン桔抗物質の存在を検出する、を含んで成る方法。２９．応答経路が膜結合アデニレート・シクラーゼ応答経路である、請求項２８に記載の方法。３０．検出の段階が、膜結合アデニレート・シクラーゼ応答経路によるサイクリックAMP生産における減少を測定することを含んで成る、請求項２９に記載の方法。３１．応答経路がルシフェラーゼ・リポーター系を含む、請求項２８に記載の方法。