JPH07502883A - 新規なシクロフィリン類、関連タンパク質類および用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規なシクロフィリン類、関連タンパク質類および用途本発明は米国政府に援助 された研究の過程でなされたものであり、米国政府は本発明に所定の権利をもっ ている。

発明の背景 免疫抑制薬剤のシクロスポリンＡ　（ＣｓＡ）は、生体内及び生体外においてＴ 細胞の活性化または分化に対して、高度に特異的な阻害作用を有するウンデカペ プチド真菌産物である。ＣｓＡは同種異系移植片に対する拒絶反応を防止するた めに現在広く使用されているが、その治療剤としての利用は各種の自己免疫およ び腫瘍形成の症状についても研究されている。ＣｓＡに対する最も豊富な細胞内 受容体であるシクロフィリンの発見と精製（Ｈａ口ｄｓｃｈｕｍａｃｈｅｒの１ ９８４年の文献）次いで最終的にシクロフィリンをコードする遺伝子のクローン 化（Ｈａｅｎｄｌｅｒの１９８７年の文献）がなされて、ＣｓＡによるＴ細胞阻 害の機序の解明が期待できるようになった。

続いて、シクロフィリンか固有の酵素活性を有し、ペプチジル−プロリルイソメ ラーゼ（ＰＰｌａｓｅ）であり（Ｆｉｓｈｅｒの１９８９年の文献：Ｔａｋａｈ ａｓｈｉの１９８９年の文献）、かつその酵素活性がＣｓＡで遮断されるという ことか発見されて、ＣｓＡの免疫抑制作用についての可能な説明の概略か提供さ れた。このアプローチは、ＦＫ５０６に対する受容体のＦＫ結合タンパク質（Ｆ ＫＢＰ）が、ＰＰＩａｓｅ活性を有しくＨａｒｄｉｎｇの１９８９年の文献；　 ５ｉｅｋｉｅｒｋａの１９８９年の文献）、その活性はＦＫ５０６によって阻害 されるということが見出された（１９９１年８月５日に出願された米国特許願０ ７／１４０．１７５号。なおこの文献は本願に援用するものとする）ときに他の 免疫抑制医薬の受容体系から得た結果で裏付けされた。しかしこの提案に二つの 問題点がでてきた。すなわち（１）シクロフィリンは偏在して発現されるが、生 体内でのその主な作用は高度に組織制限的であり；そして（２）　ＣｓＡの同族 体は、ＰＰＩａｓｅ活性の阻害と免疫抑制とに分離して示す（Ｓｉｇａｌの１９ ９１年の文献）。

発明の要約 マウス骨髄由来の支質（ｓｔｒｏｍａｌ）細胞系ＡＣ６から調製したｃＤＮＡラ イブラリーから単離した第三の哺乳類シクロフィリンｃｒｙＣ（Ｗｈｉｔｌｏｃ ｋの１９８７年の文献）のクローン化が提供される。このｃＤＮＡは、該支質細 胞系をインターロイキン−１（ＩＬ−１）で処理することによって誘発される遺 伝子を含有する一部削減（５ｕｂｔｒａｃｔｅｄ）サブライブラリーから単離し た。ｃｙｐＣについてのメツセージレベルは、ＩＬ−１での処理によって２〜３ 倍の誘発を示し、かつこのｃＤＮＡは公知のシクロフィリン類に対し高レベルの 相同性を示す。

ｃｙｐｃは、腎臓で最も高度に発現され、かつ、骨髄支質細胞系ＡＣ６内のみな らず活性化されたＴ細胞中に検出することができるので、ＣｓＡの免疫抑制作用 と腎毒性作用に対する仲介化合物である。また、ｃｙｐＣは、ＣｓＡが不在の場 合（恐ら＜　ＰＰＸａｓｅに関連している）またはＣｓＡが存在する場合（恐ら くシグナル変換阻害）にその機能に関与する細胞質タンパク質に対するアフイテ イーブローブとして使用することもできる。ＣｓＡか不在の場合、主なパートナ −は７７Ｋｄのタンパク質であり、一方ＣｓＡが存在する場合、ＣｓＡ　：　ｃ ｙｐｃ複合体はもはや該ｐ７７を捕捉しないで新規なｐ５５の種を捕捉する。１ ９９１年８月５日に出願された米国特許願第０７／７４０．１７５号では、ｐ５ ５の種がカルシニューリン（ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ）として同定され、これは 、ＣｓＡおよびＦＫ５０６によって遮断されるシグナル変換に関連する事象に関 与している。

またｃｙｐｃポリペプチドファミリーの同族体および結合フラグメントならびに 所望のペプチドの製造法が提供される。ｃｙｐｃポリペプチドまたはその結合フ ラグメントを特異的に捕捉できる抗体も提供される。その上に本発明には、シク ロフィリンＣポリペプチドおよびＳＤＳ　−ＰＡＧＥて同定される約７７Ｋｄの 分子量を有するタンパク質を含んでなる実質的に純品の複合体が含まれている。

この７７にｄは、シクロスポリンＡが不在の場合、シクロフィリンＣポリペプチ ドに結合し、その結合はカルシウム依存性ではない。

図面の簡単な説明 図ＩはｃｙｐＣｍＲＮＡのヌクレオチドと推定アミノ酸配列を示す。ｃｙｐｃｍ ＲＮＡは、ＩＬ−１による誘発の際に、ＡＣ６細胞系によって発現される遺伝子 を含有する一部削減ｃＤＮＡライブラリーから単離した。このｃＤＮＡの長さく 　＋２８８ｂｐ）はｃｙｐｃメツセージを含有するポリ−Ａの大きさの測定値と よく一致している（〜１４００ｂｐ）。

図２は、二つの形態の酵母シクロフィリンの酵母１　（Ｈａｅｎｄｌｅｒの１９ ８９年の文献）と酵母２　（Ｋｏｓｅｒの１９９０年の文献）を、マウスｃｙｐ Ｃ。

ヒトｃｙｐＢ（Ｐｒｉｃｅの１９９１年の文献）およびマウスｃｙｐＡ（Ｈａｓ ｅｌの１９９０年の文献）と比較して示すアミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａ ｌｉｇｎｍｅｎｔ）である。すべての配列中の絶対的に保存される残基は箱印で 囲み肉太活字で示しである。隣接配列中の相同残基は垂直線で示しである。

図３はｃｙｐｃとシクロフィリンＡのｍＲＮＡのノーザン分析結果を示す。

組織または細胞系のＲＮＡの合計２０μｇを各レーンに負荷し、下記のようにし てｃｙｐＣまたはシクロフィリンへの配列でプローブした。

ｃｙｐＣｍＲＮＡは約１４００個の塩基であり、一方ｃｙｐＡのｍＲＮＡは約１ ０００個の塩基である。肺臓２９の試料は造血再構成（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔ ｉｃ　ｒｅｃｏｎｓｔｉ−ｔｕｔｉｏｎ）を受けている動物の肺臓から調製した ＲＮＡである。この肺臓は多数のコロニー形成単位（ＣＦＵ）（１２日目）を含 有し、迅速に分裂する未熟の骨髄細胞と赤芽球細胞の起源であった。

図４はｃｙｐＣのペプチジル−プロリルイソメラーゼ活性とそのＣｓＡによる阻 害を示す。１００ｍＭのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，８）中にペプチド（最終濃度 ７０μｍ）を含有する原液混合物を、（Ａ）２μｇ／ｍｌのグルタチオン−８− トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）；　（Ｂ）　２μｇ／ｍｌのｃｙｐｃ−ｃｓＴ融 合タンパク質＋　（Ｃ）０．２μｇ／ｍｌのｃｙｐＣ−ＧＳＴ融合タンパク質； 　（Ｄ）２μｇ／ｍｌのｃｙｐｃ　−ＧＳＴ融合融合タンパ土質＋０μｇ／ｍｌ のＣｓＡ　；および（Ｅ）２μｇ／ｍｌのｃｙｐｃ−ＧＳＴ融合タンパク質＋ｌ μｇ／ｍｌのＣｓＡと混合した。反応は、キモトリプシン溶液を添加することに よって開始させた。

図５は、グルタチオンアガロース＋ｌＯμｇのＧＳＴ（対照レーン）；１０μｇ のｃｙｐｃ−ＧＳＴ融合タンパク質（ｃｙｐＣレーン）；または１０μｇのｃｙ ｐｃ−ｃｓｒ融合タンパク質＋１０μｇ／ｍｌのＣ５Ａ（ｃｙｐｃ＋ＣｓＡレー ン）に粘着性の３″Ｓメチオニン／システインで標識をつけたＡＣ６タンパク質 のＳＯＳ　−ＰＡＧＥゲルのオートラジオグラフである。ｃｙｐＣアフィニティ ー反応は下記のようにして行った。記号「＋」は標識付けがサイトカインＩＬ− １の存在下で行われたことを示し、記号「−」は標識付けがＩＬ−１の不在下で 実施されたことを示す。

図６は、ＣｓＡの濃度を増大させた場合の、グルタチオンアガロース＋融合タン パク質に粘着性の０８メチオニン／システインで標識を付けたＡＣ６タンパク質 のＳＤＳ　−ＰＡＧＥゲルのオートラジオグラフである。対照の試料はＧＳＴ　 １０μｇとともにインキュベートした。実験試料は、ＩＯμｇのｃｙｐＣ−ＧＳ Ｔ融合タンパク質十指定薬剤濃度とともにインキュベートした。

図７はヒトおよびマウスのＴ細胞系の関連タンパク質を示す。

ｃｙｐＣアフィニティー反応はヒトジャーカット細胞系ならびにマウスＴ細胞系 ノＣ６ＶＬ、　８．２．１および５Ｍ３Ｌ−４由来ｃｖ　２１　ｓ標識タンパク 質類を用いて実施した。ＡＣ６タンパク質は、７７Ｋｄと５５Ｋｄのタンパク質 の大きさ比較のために用いる。レーン１．（対照）１０μｇのＧＳＴ　。

レーン２：ｌＯμｇのｃｙｐＣ−ＧＳＴ　；レーン３：１０μｇのｃｙｐＣ−Ｇ ＳＴ　＋５μｇ／ｍｌのＣ５Ａｏ活性化ジヤカツト細胞は、代謝標識化中、ホル ボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）（２０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイ ノン（２μＭ）の存在下でインキュベートすることによって調製した。

図８は、ｃｙｐＣと細胞内タンパク質の観察された相互作用と、ＣｓＡの導入に よるこれらの相互作用の変化の図式モデルを示す。図８Ａには、ＣｓＡが不在時 のｃｙｐＣと７７Ｋｄのタンパク質の相互作用を示す。

図８Ｂには、ＣｓＡ存在下でのｃｙｐＣと５５Ｋｄのタンパク質の相互作用を示 す。

発明の詳細な説明 新しい哺乳動物性シクロフィリンであるｃｙｐＣは支質（Ｓｔｒｏｍａｌ）細胞 系由来の骨髄から単離した。ｃｙｐＣは、配列と発現の組織分布の両方について 哺乳動物のシクロフィリンＡおよびＢとは全く異なっている。ｃｙｐＣはペプチ ジル−プロリルイソメラーゼ（ＰＰＩａｓｅ）活性を有し、そしてこの活性はＣ ｓＡを添加することによって完全に阻止することができる。ｃｙｐＣ−ＧＳＴ融 合タンパク質は、ＣｓＡの不在時または存在下でそれぞれｃｙｐＣに特異的に結 合する７７Ｋｄと５５Ｋｄの細胞タンパク質を同定するためのアフィニティーリ ガンドとして用いた。５５Ｋｄのタンパク質と７７Ｋｄのタンパク質問の正確な 関係はまだ解明されていないが、７７Ｋｄのタンパク質を減損させて（Ｄｅｐｌ ｅｔｅ）得た細胞溶解物は依然として対照試料と同じ量の５５Ｋｄタンパク質を 含有している。さらに、ｐ５５と９７７の間には明らかな機能上の関連は全くな い。

ｃｙｐＣ：　ｐ　７７は一つの機能複合体を示し、かツＣｓＡ　：　ｃｙｐＣ： 　ｐ　５５は他の機能複合体を示すようである。その観点で、ｐ５５単独または ＣｓＡ　：ｃｙｐＣ：　ｐ　５５複合体の機能を理解すればＣｓＡの免疫抑制機 能を明らかにできるであろう。一方ｐ７７の構造と機能を同定すれば、（少なく とも）ｃｙｐＣＰＰＩａｓｅの通常の機能が理解されるに至るであろう。

現在、ＣｓＡおよび機能が類似しているマクロライドのＦＫ５０６の免疫抑制作 用を説明する広く容認されているモデルがない。各薬剤は天然に産生される真菌 産物であり、免疫フィリン類（ｉｍｍｕｎｏｐｈｉｌｌｉｎｓ）と命名される一 クラスのタンパク質に特異的に結合する（Ｂｉｅｒｅｒの１９９０年の文献：　 ５ｃｈｒｅｉｂｅｒの１９９１年の文献）。これまでに単離された免疫フィリン 類はすべて、遊離形の場合はプロリル−イソメラーゼであり、同族の薬剤・免疫 フィリンの複合体（ＣｓＡ　ニジクロフィリン類）；　ＦＫ５０６およびラバマ イシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）　：　ＦＫＢＰ）はその活性がない。免疫フィリ ン類が発現されるＴ細胞などの組織中でＴ細胞シグナル変換を阻害するのは通常 の機能であるが、上記の免疫抑制リガンドがＴ細胞シグナル変換を阻害する機序 は不明である。現在の証拠は、ＣｓＡとＦに５０６がほぼ同一の生物活性を有し 、カルシウムフラックスとホスファチジルイノシトールの加水分解反応の両方に 遠位の細胞内シグナリングイベント（ｓｉｇｎａｌｉ口ｇ　ｅｖｅｎｔ）を阻害 することによってＴ細胞の活性化を遮断することを示唆している（Ｄｕｍｏｎｔ の１９９０年の文献；　Ｔｏｃｃｉの１９８９年の文献）。このシグナリングイ ベントの性質は充分には理解されていないが、ＣｓＡが、Ｔ細胞の活性化に関与 している核タンパク質の機能を特異的に阻害し、特に、ＣｓＡが転写活性化因子 （ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ）と直接に相互に作用 するという証拠は全くないけれども、転写活性化因子ＮＦ−ＡＴを阻害するとい う証拠が提供されている（Ｅｍｍｅｌの１９８９年の文献）。本願では、シクロ フィリンのファミリーの新しいメンバーのｃｙｐｃが、これらの機序に関与しう る細胞タンパク質を特異的に単離するアフィニティー試薬として使用できること を示した。

図８に、ＣｓＡが存在している場合と不在時の、観察されたタンパク質のｃｙｐ Ｃとの相互作用のモデルを示す。相互作用の高いアフィニティーが観察されたこ とから、未変性のｃｙｐｃと接触している７７Ｋｄタンパク質の多くの両分は、 両者が同じ細胞下コンパートメント内に存在していると仮定して、結合された形 態で存在していると提案される。ＣｓＡを細胞溶解物に添加すると、７７Ｋｄの タンパク質がｃｙｐＣ融合タンパク質から溶出される。この現象は無傷の細胞に も起こるようである。ＣｓＡを捕捉すると、ｃｙｐＣは５５Ｋｄタンパク質に対 して高いアフィニティーを有するリガンドになる。無傷の細胞においては、Ｃａ Ａが捕捉されると、恐らく続いて薬剤：受容体の複合体は接近可能な遊離の５５ Ｋｄタンパク質に結合する。５５Ｋｄタンパク質が薬剤：受容体複合体とキレー トを形成し、その通常の機能が潜在的に変化することは、ＣｓＡの作用の機序を 理解する鍵のようであるが、７７Ｋｄタンパク質か通常に結合された形態から放 出されることが、医薬：受容体の界面における生理学的に重要な事象であるとい うことは依然として正式に可能なことである。しかし、滴定実験の試験結果（図 ６）は、ＣｓＡの薬理学的に適切な濃度において、かなりの量の５５Ｋｄタンパ ク質か薬剤：受容体複合体とキレートを形成できるが、７７Ｋｄタンパク質のプ ールは比較的影響を受けないはずであることを示唆している。７７Ｋｄタンパク 質は、ｃｙｐＣの通常の機能おそらくそのイソメラーゼ活性に関連する機能に密 接に関与していることは明らかである。５５Ｋｄタンパク質も、ＦＫ５０６　： 　ＦＫＢＰ複合体によって認識され（米国特許願第０７／７４０．１７５号参照 ）、かつそれ自体、シグナル変換経路の重要ステップに対する可能性のある候補 である。

ｃｙｐＣは、マウス骨髄由来の支質細胞系ＡＣ６から調製されたｃＤＮＡライブ ラリーから単離した。一部削減ハイブリッド形成法（ｓｕｂｔｒａｃ−ｔｉｖｅ 　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｓｔｒａｔｅｇｙ）をｒＬ−１で誘発された遺 伝子を単離するのに用いたが、ｃｙｐｃとｃｙｐＡがこのグループ内に入ってい る（図３　）　、　ｃｙｐｃとｃｙｐＡのｍＲＮＡはともに、ＩＬ−１による誘 発に応答してＡＣ６細胞内で約３倍に増大している。予想とおりに、ＣｓＡの影 響は、ＡＣ６細胞中でのｃｙｐＣの発現に対して検出されなかった。ＡＣ６細胞 のような骨髄支質細胞は、ＩＬ−１による誘発後に、各種の造血増殖因子とレギ ュレーターをともに構成的に分泌することが知られている（Ｌｏｖｈａｕｇの１ ９８６年の文献）。

ｃｙｐＣと他のシクロフィリン顆間の配列を比較すると（図２）、ｃｙｐＣは、 他のシクロフィリン類と、コア相同領域（ｃｙｐＣの残基３６〜２０５）中、５ ０％〜７０％が同一であることを示している。この領域の外側では、アミノ末端 は、配列が独得であるが、その全体の大きさは、ヒトｃｙｐＢ、ドロソフィラ・ ニナＡ　（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｎ１ｎａ　Ａ）、ならびにノイロスポラ（Ｎ ｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属およびサツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏ−ｍｙｃｅ ｓ）属の種から単離されたより大きなシクロフィリン類のアミノ末端に類似して いる。カルボキシル末端も配列が独得のものであるが、ヒトｃｙｐＢと酵母ＣＹ Ｉ）２のカルボキシル末端と明白な相同性がある。

ｃｙｐＡタンパク質はシトシル中で遊離していると考えられるが、ｃｙｐＢ。

ｃｙｐＣおよび酵母ｃｙｐ２の細胞局在性は現在分かっていない。ｃｙｐＡまた は酵母ｃｙｐｌについて、各タンパク質は、非極性残基が多い３３〜３５個のア ミノ酸からなるアミノ末端外延部を含有している。ｃｙｐＢのアミノ末端領域は 、イー・コリ（Ｅ−ｃｏｌｉ）中で発現されるとシグナル配列として作用可能で あり（Ｐｒｉｃｅら１９９１年の文献）、これらのシクロフィリン類が、メンプ ランに結合したオルガネラ内に存在しているかおよび／または原形質膜と結合し ているかまたは分泌されることさえあるという可能性が増大する。最近、ドロソ フィラ属のシクロフィリン相同二すＡが、Ｃ末端アンカーおよび切断可能なシグ ナル配列と一体膜タンパク質になっていることが分かった（Ｓｔａｍｎｅｓの１ ９９１年の文献）。ニナＡ突然変異の表現型は、特異的な光受容体細胞のＲｈｌ ロドプシンの含量が劇的に減少している。このＲｈ１ロドプシンの減少は、恐ら くロドプシン分子のプロセシングにおける転写後の欠陥が原因である。ニナＡシ クロフィリン同族体のもっている機能は、Ｒｈ１ロドプシン中のＸａａ−プロリ ル結合について異性化作用であり、分子の適正なプロセシングを行うことができ る。この相互作用の明確な選択性によって、特定の細胞タンパク質のプロセシン グ、折畳み、トランスロケーションなどの必要条件に合わせて作られる多数のシ クロフィリンが存在する可能性が増大する。

また、ｃｙｐＣと特異的に相互に作用する７７Ｋｄの細胞タンパク質も同定され る。ニナＡ／ロドプシン系から類推して、この７７Ｋｄのタンパク質は、ｃｙｐ ｃ　ＰＰ１ａｓｅ活性に対する主な基質のようであり、その通常の機能てｃｙｐ Ｃを助けて、恐ら＜　ｃｙｐＣの基質として熱シヨツクタンパク質と同種のシャ ブロン分子（ｃｈａｐｅｒｏ口ｅ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）として働くか、またはと りわけｃｙｐＣの活性の天然の阻害剤（内因性のＣｓＡのアゴニストとアンタゴ ニスト）を示す。あるいは、ｃｙｐｃ　：　ＣｓＡ複合体がシグナル変換経路を 分断して遮断するよってあるから、ｃｙｐＣ：　７７Ｋｄ複合体もシダナリング 経路の一部である。

免疫抑制における免疫フィリンのＰＰＩａｓｅ活性の役割については、多数の研 究者か挑戦している。ＣｓＡ類似体についての研究（Ｄｕｒｅｔｔｅの１９８８ 年の文献；　Ｓｉｇａｌの１９９１年の文献）は、いくつかの化合物が、シクロ フィリンＡのＰＰＩａｓｅ活性を阻害する性能をもっているが免疫抑制活性をも っておらず、一方他の化合物はＰＰＩａｓｅの比較的劣った阻害剤であるが免疫 抑制作用を維持していることを示している。類似の結果は、非天然の免疫フィリ ンリガンド５０６ＢＤを用いてＦＫＢＰ／ＦＫ５０６系て得られているが（１９ ９１年８月５日に出願された米国特許願第０７／７４０．１７５号）、この５０ ６ＢＤはＦＫＢＰロタマーゼ（ＦＫＢＰ　ｒｏｔａ−ｍａｓｅ）の有効な阻害剤 であり、Ｔ細胞の活性化には作用せず、かつＦＫ５０６とラバマイシンの両者の 免疫抑制作用を遮断できる（Ｂｉｅｒｅｒの１９９０年の文献）。免疫フィリン ：薬剤複合体の免疫抑制作用がイソメラーゼ機能の阻害に対して無関係であると 仮定すると、シグナル変換の観察された遮断の可能性がある手段は５５Ｋｄタン パク質のカルシニューリン（米国特許願第０７／７４０．１７５号）である。と いうのは特に、カルシニューリンもＦＫＢＰ　：　ＦＫ５０６アフイニテイーマ トリツクスに捕捉されるからである。また免疫フィリン類は、三官能リガンド（ 例えばＣｓＡ、　ＦＫ５０６）がカルシニューリンタンパク質のような第三の分 子を“接合する（ｇｌｕｅ）”便利な基質として働く（米国特許願第０７／７４ ０．１７５号参照）。免疫抑制リガンドのＣｓＡとＦＫ５０６は、シグナル変換 には、免疫フィリンの潜在的な役割を示す。ＣｓＡおよびＦＫ５０６と同種の内 因性分子（米国特許願第０７／７４０．１７５号）が通常、細胞内に存在し、こ れらの分子は、免疫フィリン類と相互に作用することによってシグナル変換経路 を調節すると考えられる。本願に提示されている７７Ｋｄ分子の研究は、シグナ ル変換およびタンパク質のプロセシングにおける免疫フィリンの通常の役割を明 らかにするのに役立っている。

ＣｓＡの類似体についての研究結果に対する可能な説明としては、細胞内に、他 のＣｓＡ受容体で恐らく高いアフィニティーまたは重要な細胞下局在性を有する ものが存在することが含まれる。ノイロスポラ属およびサツカロマイセス属の種 牛に、ＣｓＡは、その受容体および他の未確認の細胞成分と毒性の°複合体′を 形成することによって、その作用を発揮する（Ｔｒｏｐｓｃｈｕｇの１９８９年 の文献）。類推すれば、かような複合体は、Ｔ細胞活性化の阻害および哺乳動物 に観察される腎毒性に関与しているがもじれない。これらの結果は、観察された ＣｓＡの作用をもたらすのはＣｓＡ　：　ｃｙｐＣ複合体と５５Ｋｄタンパク質 との会合であるという考えを裏付けている。

外の哺乳動物のＣｓＡ結合結合タンパ肪質離されると、生理学的に重要なＣｓＡ 結合結合タンパ肪質てのシクロフィリンＡの役割に疑いが生しる。シクロフィリ ンＡは比較的高いレベルで（全細胞質タンパク質の０．０５〜０．４％）で明ら かに偏在して発現されるが（Ｋｏｌｅｔｓｋｙの１９８６年の文献）、ＣｓＡの 作用は、免疫学的作用と臨床毒性によって明らかにさねているようにＴリンパ球 および腎臓と神経の組織に限定されるよってある。ｃｙｐＣの発現の組織分布は 重要である。といのはそのメツセージか腎臓で比較的高いレベル゛Ｃ発せられ、 そして腎臓はＣｓＡによる治療の過程で次第に損傷を受け易いことが知られてい るからである。成熟マウスの腎臓とアンチセンスｃｙｐＣの２ＭＳ標識プローブ とのその場のハイブリッド形成によって、発現が非常に特異な分布を示し、すな わち皮質骨髄接合部（ｃｏｒｔｉｃｏｍｅｄｕｌｌａｒｙｊｕｎｃｔｉｏｎ）に 分布している。またｃｙｐＣｍＲＮＡは、各種のマウスＴ細胞系とマウスＢ細胞 系にも存在しているが、ノーザン分析では全胸腺ＲＮＡ中に検出できない。した がって、リンパ球内でのｃｙｐＣの発現はリンパ球の活性化の状態によって調節 することができる。特定の組織から咽離される７７Ｋｄと５５Ｋｄのタンパク質 とその外の関連タンパク質の機能の役割を理解すれば、Ｔ細胞仲介免疫性に対す るＣｓＡの活性、腎毒性、および肥満細胞の５ね。消失のようなＣａＳの他の組 織特異的作用に関する情報か得られ；アあろう（ｔ（ｕｌｔｓｃｈの１９９０年 の文献）。

要約すると、シクロフィリンＣ１よ：＊乳動物シクロフィリンのファミリーの新 しいメンバーである。シフじフィリンＣは、今までに単離されたすべてのシクロ フィリンと高度に相同性であり、組織特異的な発現パターンを示し、かつ独得の アミノ末端とカルボキシル末端の配列をもっている。ｃｙｐＣはプロリル−イソ メラーゼとして活性であり、ＣｓＡて阻害することができる。ｃｙｐＣは、Ｃｓ Ａが存在しているときと不在時の両方の場合に、細胞タンパク質との高度に特異 的な相互作用を示す。ＣｓＡが不在時、ｃｙｐｃは各種の細胞に見出すことがで きる７７Ｋｄのタンパク質と結合する。ＣｓＡの存在下では、ｃｙｐＣはカルシ ニューリンと同定された５５Ｋｄタンパク質（米国特許願第０７／７４０、１７ ５号）と結合し、この５５Ｋｄタンパク質も各種の細胞中に見出すことができる 。両方のタンパク質相互作用はマウス：ヒトの種間障壁を越えて起こり、タンパ ク質の成分とそれらの相互作用の領域の両者の進化の保存を強化している。５５ Ｋｄのタンパク質もＦＫＢＰ　：ＦＫ５０６アフイニテイーマトリツクスによっ て捕捉されるという観察結果と、それのシグナル変換経路中の可能な候補として の認識によって、ＣｓＡとＦＫ５０６の作用の機序の理解が促進される（米国特 許願第０７／７４０．１７５号）。

本発明には、シクロフィリンＣポリペプチド類の結合タンパク質のクラス、が含 まれる。また本発明には、相同配列、対立遺伝子の変異体、天然の変異体、誘導 された変異体、換言すれば発現された変異体、および高いかまたは低い緊縮条件 下で、天然に産生ずる物質から検索された、ｃｙｐｃをコードする核酸とハイブ リッドを形成するＤＮＡがコードするタンパク質が含まれる。抗血清によって検 索された、ｃｙｐｃに密接に関連するｃｙｐＣ様のポリペプチドまたはタンパク 質も本発明に含まれる。

また本発明は、ｃｙｐＣポリペプチドと実質的に相同の該ポリペプチドの結合フ ラグメントからなる他のポリペプチドを提供するものである。本発明の受容体ペ プチドは一般に天然産の配列と少なくとも約８０％の相同性を示し、天然のｃｙ ｐｃ配列と一般的に少なくとも約８５％の相同性を示し、より一般的に少なくと も約９０％の相同性を示し、普通少なくとも約９５％の相同性を示し、およびよ り普通に少なくとも約９７％の相同性を示す。比較配列の長さは一般に少なくと も約１６個のアミノ酸であり、普通少なくとも約２０個の残基てあり、より普通 に少なくとも約２４個の残基てあり、一般に少なくとも２８個の残基であり、お よび好ましくは約３５個より多い残基である。

ポリペプチドについての相同性は、一般に配列分析用ソフトウェアを使って測定 される（例えば、米国、ウィスコンシン州５３７１１゜マディノン、５７５サイ エンスドライブ所在のＧｅｎｅｔｉｃｓ　ＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐの５ｅｑ ｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｐａｃｋａｇｅ参照）。タ ンパク質分析用ソフトウェアは、種々の置換、欠失および他の修飾に割当てられ た相同性の尺度を用いて類似の配列を突合わせる。同類置換には一般に以下のグ ループ内の置換が含まれる。すなわちグリシン、アラニン、バリン、イソロイシ ン、ロイシン：アスパラギン酸、グルタミン酸：アスパラギン、グルタミン：セ リン、トレオニン；リンン、アルギニン：およびフェニルアラニン、チロシンの グループである。

“実質的に純粋で均一の”という用語は本願で用いる場合、天然に付随する成分 から分離されたタンパク質またはポリペプチドを意味する。一般に、モノマーの タンパク質は、試料の少なくとも約６０〜７５％かルーのポリペプチド骨格を示 す場合、実質的に純粋である。

僅かに変異させた変異体または僅かに化学的に修飾されたものは一般に同しポリ ペプチド配列を共有している。実質的に純粋なタンパク質は一般にタンパク質試 料の約８５〜９０％以上を構成し、より普通に少なくとも約９５％を構成し、お よび好ましくは約９９％を越える。

通常純度は、染色によって決定される等質性によって、ポリアクリルアミドゲル 上で測定される。ある種の目的のためには、高分解能か利用され、かつ精製用の １（ＰＬＣまたは類似の手段が利用される。大部分の目的のためには、純度を測 定するため、簡単なりロマトグラフィーのカラムまたはポリアクリルアミドゲル が利用される。

タンパク質は、それの天然の状態のときに付随している天然の汚染物から分離さ れると、天然に付随している成分を実質的に含有していない。したがって、化学 的に合成されるか、またはそれが天然に生じる細胞とは異なる細胞系内で合成さ れるタンパク質は、その天然に付随する成分を実質的に含有していない。非相同 の哺乳動物の細胞、昆虫の細胞、他の動物もしくは植物の細胞、イー・コリなと の原核細胞中で合成されたポリペプチドおよび核酸を記載するのに用語が用いら れる。

本発明は実質的に純粋な製剤を提供するものである。生物学的原料からそれらを 単離する各種の方法は、本願に含まれている構成および機能の説明に一部基いて 考案することができる。本願に提供されているような特異的抗体の有用性によっ て、特異的なｃｙｐｃポリペプチドは、免疫アフィニティークロマトグラフィー を用いて精製することもできる。以下に述へるようにして調製した抗体は、不活 性な物質に固定化して高度に特異的なアフィニティーカラムを作ることかできる 。各種の細胞または組織の起源は、後述の実施例に記載されているような所望の タンパク質の存在量のために通常選択される出発物質として選択することができ る。

ｃｙｐｃのアミノ酸配列を決定するため、またはｃｙｐｃのポリペプチドフラグ メントを得るため、そのタンパク質はトリプシンで消化される。ペプチドフラグ メントは、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分離し、気 相配列決定法によって分析できる。当該技術分野で知られている配列決定法も使 用することができる。

ｃｙｐＣポリペプチドまたはｃｙｐＣファミリーの特定領域は、それぞれのメン バーのアフィニティー精製を行うのに使用することができる。

ソゲナル配列またはリーダー配列によって、ｃｙｐｃタンパク質は、細胞膜を通 過することができる。それ故に、適切なシグナル配列がこのタンパク質とともに 使用される。

また本発明はｃｙｐＣポリペプチド類の類似体を提供するものである。

このような類似体には、ポリペプチドの骨格と変種を修飾したものおよび該ポリ ペプチドの突然変異体の両方が含まれる。修飾体には、ポリペプチドを化学的に 誘導体化したちの例えばアセチル化またはカルボキシル化などによるものが含ま れる。また修飾体には、グリコジル化修飾体および一般的なポリペプチドのプロ セシング変形体が含まれる。これらのプロセシングのステップには具体的に述べ ると、ユビキナイゼーション（ｕｂｉｑ旧旧ｚａｔｉｏｎ）のような酵素修飾法 が含まれる（例えばＨｅｒｓｈｋｏおよびＣ１ｅｃｈａｎｏｖｅｒ″Ｍｅｃｈａ ｎｉｓｍｓ　ｏｆＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｂｒｅａｋｄ ｏｗｎ＋、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈ、、　５１巻、３３５〜３６４頁、１ ９８２年参照）。

特にその合成およびプロセシング中またはその後のプロセシングのステップ中、 ポリペプチドのグリコジル化パターンを修正するか、または酵素による脱グリコ ジル化（部分もしくは完全な）によってなされるグリコジル化反応の変形も含ま れる。これを達成するのに好ましい方法は、好ましくは精製された犬のすい臓ミ クロソームのようなグリコジル化系内で、かようなプロセシングを通常行う細胞 から誘導されたグリコジル化酵素例えば哺乳類のグリコジル化酵素にポリペプチ ドを暴露する方法である（ＭｕｅｃｋｌｅｒおよびＬｏｄｉｓｈ。

Ｃｅ１ｌ、　４４巻、　６２９頁、１９８６年ならびにＷａｉｔｅｒ、　Ｐ、、 　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、。

９６巻、８４頁、１９８３年。これらの文献は本願に援用するものとする）。

リン酸化されたアミノ酸残基、例えばホスホトリプシン、ホスホセリンまたはホ スホトレオニンを有する同じプライマリ−アミノ酸配列の変形も含まれる。

他の類似体としては、天然のおよび誘発された両者の遺伝的変異体がある。誘発 突然変異体は、放射線照射またはＥＭＳ（メタンスルホン酸エチル）への暴露を 利用してコードしている核酸のランダム突然変異誘発を行うことを含む各種の方 法で誘導することができ、または部位特異的突然変異誘発法などの最新の分子生 物学の他の方法によって処理して変形させた形態のものでもよい（Ｓａｍｂｒｏ ｏｋ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ ｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（第２版）　、　１ ９８９年、Ｃ３ＨＰｒｅｓｓ社参照）。

実質的に全長のポリペプチドの代わりに、本発明は、ポリペプチドの生物学的に 活性のフラグメントを提供するものである。重要な生物学的活性としては、ｃｙ ｐｃポリペプチドに特徴的なリガンド結合免疫活性などの生物学的活性がある。

免疫学的活性には、標的免疫系中の免疫原性機能、ならびに結合のための免疫学 的エピトープの共有が含まれ、後者はｃｙｐＣエピトープに対する競合体もしく は置換抗原として働く。ポリペプチドに適用される用語のフラグメントまたはセ グメントは、本願で用いられる場合、通常少なくとも約５個の連続したアミノ酸 であり、一般に少なくとも約７個の連続アミノ酸であり、より一般的に少なくと も約９個の連続アミノ酸であり、普通少なくとも約１１個の連続アミノ酸であり 、好ましくは少なくとも約１３個の連続アミノ酸であり、より好ましくは少なく とも約１６個の連続アミノ酸であり、および最も好ましくは少なくとも約２０〜 ３０個またそれ以上の連続したアミノ酸である。特定の領域のセグメントは、対 応する領域の範囲内の適当な大きさのセグメントである。

免疫学的目的のために、ポリペプチドセグメントを縦方向に並べて繰返して高度 に抗原性のタンパク質を産生ずる免疫原が製造される。あるいはかようなポリペ プチドは、特異的な結合に対する高度に効率的な競合体として働く。ｃｙｐｃの ポリペプチドまたはフラグメントに対する抗体の製造について以下に述べる。

また本発明は、ｃｙｐｃポリペプチドのフラグメントからなる他のポリペプチド を提供するものである。したがって、ｃｙｐＣポリペプチドと、他の相同もしく は非相同のタンパク質との融合ポリペプチドが提供される。相同ポリペプチドは 異なるシクロフィリン顆間の融合体であり、例えばハイブリッドタンパク質、ま たは結合の特異性が広げられたかまたは弱められた融合タンパク質が得られる。

同様に、誘導体タンパク質類の特性または活性の組合せを示す非相同融合体か構 築される。例えば、リガンド結合などの領域は、異なる新しい融合ポリペプチド もしくはフラグメント間で“変換（ｓｗａｐ）”することかできる。したがって 、特異性の新しい組合わせを示す新しいキメラポリペプチドが、リガンド結合の 特異性と細胞内領域の機能的連結から得られる。例えば、１ｇ領域は、他の類縁 ポリペプチド由来の１ｇ領域で代替することがてきる。他の遺伝子融合パートナ −としては、細菌のβ−ガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥプロティンＡ、β−゛ラク タマーゼ、α−アミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼおよび酵母α結合因子 がある（例えば、Ｇｏｄｏｗｓｋｉら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２４１巻、８１２〜 ８１６頁、１９８８年参照）。

融合タンパク質は、一般に、組換え核酸法または合成ポリペプチド法によって製 造される。核酸の操作法は、一般的に、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、　Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　＋　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（ 第２版）。

１〜３巻、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１ ９８９年）に記載されている。ポリペプチドの合成法は、例えばＭｅｒｒｉｆｉ ｅｌｄ、　Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、、　８５巻、２１４９〜２１５６頁、１９６３年に記載されている。本 発明の融合タンパク質を製造するのに用いられる組換え核酸配列は、天然または 合成の配列から誘導することができる。多くの天然の遺伝子配列か、適切なプロ ーブを用いて、種々のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーから得ることができる （ＧｅｎＢａｎｋ（登録商ｆｌｌｌｌｉ）、米国国立衛生研究所参照〕。適切な 合成りＮＡフラグメントは、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ、　 Ｔｅｔｒａ　Ｌｅｔｔｓ、、　２１巻、１８５９〜１８６２頁、１９８１年に記 載されているホスホルアミデート法によって調製することができる。二本鎖のフ ラグメントは、相補的なストランドを合成し次いてそのストランドを適当な条件 下でアニールするか、または適切なプライマー配列とともにＤＮＡポリメラーゼ を用いて相補的ストランドを付加することによって得ることができる。

本発明は、上記の、ｃｙｐＣポリペプチド配列をコードする核酸配列を提供する ものである。本発明による核酸は、天然起源の遺伝子から誘導されるか、または 天然のｃｙｐｃ遺伝子またはその一部分と実質的に相同の遺伝子である配列をも っている。

核酸配列の状態が実質的に相同ということは、そのセグメントまたはその相補的 ストランドか、最適に並べられて比較されたときに、適切なヌクレオチドを挿入 または欠失させることにより、ヌクレオチドの、少なくとも約８０％の残基、通 常は少なくとも約９０％、より普通に少なくとも約９５％、好ましくは少なくと も約９７％およびより好ましくは少なくとも約９８〜９９．５％が同一であるこ とを意味する。

あるいは、実質的な相同性は、そのセグメントが選択的なハイブリッド形成条件 下でストランドまたはその補体とハイブリッドを形成する場合に存在する。ハイ ブリッド形成の選択性は、特異性が全く欠如している以上に選択的であるハイブ リッド形成か起こるときに存在する。一般に選択的ハイブリッド形成は、少なく とも約１４／２５のヌクレオチドのストレッチにわたって少なくとも約５５％の 相同性、好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％、 および最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性があるときに起こる（Ｋａｎ ｅｈｉｓａ、　Ｍ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１２巻、２ ０３〜２１３頁、１９８４年参照。なお、この文献は本願に援用するものである ）。緊縮ハイブリッド形成条件としては一般に、約ＩＭより低い塩濃度、より普 通に約５００ｍＭより低い塩濃度および好ましくは約２００ｍＭより低い塩濃度 が含まれる。温度条件は一般に２０°Ｃより高く、より一般的に約３０°Ｃより 高く、および好ましくは約３７°Ｃより高い。他の因子としては、ハイブリッド 形成の緊縮性が有意に影響し、とりわけ、相補的ストランドの塩基組成と大きさ 、有機溶媒の存在、および塩基の誤対合の程度があり、パラメータの組合わせは いずれか一つのパラメータの絶対値より重要である。

“嚇離された”核酸は、例えばＲＮＡ、　ＤＮＡまたは混合ポリマーのような核 酸であり、天然のヒト配列に天然に付随する他のＤＮＡ配列、例えばリポソーム 類、ポリメラーゼ類および他の多くのヒトゲノム配列から実質的に分離されてい る。この用語には、その天然産の環境から取出された核酸配列か含まれ、組換え もしくはクローン化のＤＮＡ単離体および化学的に合成された類似体もしくは非 相同系によって生物学的に合成された類似体か含まれる。実質的に純粋な分子と しては単離された形態の分子かある。

１ｖ−離された核酸は一般に分子の均一な組成物であるが、いくつかの実施態様 ではわずかな異質性をもっている。この異質性は一般に、所望の生物学的機能ま たは活性に対して重要でないポリマーの末端もしくは一部分に見られる。

“コードしている”という用語は、一般に、翻訳可能な形態で存在し、通常プロ モーターに動作可能に連結されている配列情報を意味する。機能プロモーターが 、配列の転写または発現を増大する場合、その配列は該プロモーターに動作可能 に連結されている。アンチセンスストランドも、配列をコードすると考えられる 。というのは、同じ情報内容が、特にセンスストランドの発現を促進する配列に 連結されている場合に、容易にアクセス可能な（ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）形態で 存在しているからである。その情報は、標準のまたは修飾した遺伝コードを用い て変換することができる（例えば、Ｗａｔｓｏｎら、ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒ 　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ（第４版）１および２巻１９８７年 、米国、カリフォルニア州、ミラノ・パーク、ベンジャミン参照）。

“組換え体”という用語は、天然には生じないか、または二つの別の方法で分離 された配列のセグメントを人工的に結合させることによって製造される核酸配列 を意味する。この人工的な結合は、化学的合成法、または核酸の単離されたセグ メントの人工的操作、例えば遺伝子工学の方法によって実施することが多い。上 記の方法は通常、同じアミノ酸かまたは保存アミノ酸をコードする重複コドンて 、コドンを置換することによって通常行われ、一方、配列認識部位が一般に導入 または除去される。あるいは、所望の機能の核酸セグメントを連結して、普通の 天然形態にはみられない機能の所望の組合わせを有する単一の遺伝要素を生成さ せる。制限酵素認識部位はかような人工操作の標的である場合が多いが、他の部 位特異的標的、例えばプロモーター類、ＤＮＡ複製部位類、調節配列類、制御配 列類、または他の有用な特徴部分を意図的に組込むことができる。

同様の概念が組換え体例えば融合体、ポリペプチドに提供される。

相同の配列は比較すると類似性を示す。核酸における相同性の標準は、当該技術 分野で一般に使用される相同性の尺度かまたはハイブリッド形成の条件である。

核酸の状態における実質的な相同性は、そのセグメントまたはその相補的ストラ ンドは、比較したとき、適切なヌクレオチドを挿入または欠失させることによっ て最適に並べた場合に、ヌクレオチドの、少なくとも約６０％の残基、普通は少 なくとも約７０％、より普通に少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９ ０９６、およびより好ましくは少なくとも約９５〜９８％が同一であることを意 味する。あるいは、充分な相同性は、セグメントが選択的ハイブリッド形成条件 下で、ストランドまたはその補体とハイブリッドを形成するときに存在する。ハ イブリッド形成の選択性は、特異性が全く欠如している以上に選択的であるハイ ブリッド形成が起こるときに存在する。一般に選択的ハイブリッド形成は、少な くとも約１４個のヌクレオチドのストレッチにわたって少なくとも約５５％の相 同性が存在するとき、好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくと も約７５％、および最も好ましくは少なくとも約９０９６の相同性が存在すると きに起こる（Ｋａｎｅｈｉｓａ、　Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、。

１２巻、２０３〜２１３頁、１９８４年参照。なおこの文献は本願に援用するも のとする）。上記のような相同性を比較する長さは、より長いストレッチにわた っていることが多く、ある種の実施態様では少なくとも約１７個のヌクレオチド 、通常は少なくとも約２０個のヌクレオチド、より普通には少なくとも約２４個 のヌクレオチド、一般に少なくとも約２８個のヌクレオチド、より一般的には少 なくとも約３２個のヌクレオチド、および好ましくは少なくとも約３６個以上の ヌクレオチドのストレッチにわたって比較される。

相同性に関する緊縮条件は、ハイブリッド形成反応で一般に制御される塩、温度 、有機溶媒などのパラメータの条件を組合せた緊縮条件である。緊縮温度条件と しては、一般に３０°Ｃを越える温度、一般的に３７°Ｃを越える温度および好 ましくは４５°Ｃを越える温度か含まれる。緊縮塩条件は、通常１０００ｍＭよ り低く、一般に５００ｍＭより低く、および好ましくは２００ｍＭより低い。し かしパラメータの組合せは、単一パラメータの値より重要である（例えば、Ｗｅ ｔｍｕｒとＤａｖｉｄｓｏｎ。

Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、　３１巻、３４９〜３７０頁、１９６８年参照。この 文献は本願に援用するものとする）。

プローブは、提供されるｃｙｐＣのｃＤＮＡの配列に基づいて作ることができる 。プローブとしては、標識分子またはリポータ−分子に連結された単離核酸があ り、標準の方法で他のｃｙｐＣ核酸配列を単離するのに用いることができる（例 えばＪ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋら、）Ｊｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、１〜３巻、ＣＳＨＰｒｅｓｓ社、ニュー ヨーク、１９８９年参照。この文献は本願に援用する）。他の類似の核酸は相同 核酸を用いることによって選択することができる。あるいは、これらの同一また は類似のポリペプチドをコードする核酸は、遺伝コードの重複性を利用すること によって合成または選択することができる。各種のコドン置換を導入してもよい 。例えば種々の制限部位を生成させるかまたは特定の系に対する発現を最適化す るためのサイレントチェンジ（ｓｉｌｅｎｔ　ｃｈａｎｇｅ）がある。突然変異 を導入して、ポリペプチドの受容体の特性を修飾し、おそらく、リガンド結合ア フィニティー、連鎖間アフィニティー、またはポリペプチドの劣化速度もしくは 代謝回転速度を変化させることができる。

本発明のＤＮＡ組成物は、合成によって製造されたゲノムのＤＮＡもしくはｃＤ ＮＡ由来のものでもよく、または種々の組合わせのハイブリッドでもよい。さも なければ天然には生じない配列からなる組換え核酸も本発明によって提供される 。単離されるＤＮＡ配列としては、プライマーまたはハイブリッド形成反応によ って得られたかまたは制限酵素などによる処理を受けた配列がある。

合成のオリゴヌクレオチド類は、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅ ｍ、　Ｓｏｃ、　。

１０３巻、３１８５頁、１９８１年によるトリエステル法または市販の自動オリ ゴヌクレオチド合成器のような他の方法によって作ることができる。またプロー ブは、ニックトランスレーション、フレノウ・フィルイン反応または当該技術分 野で公知の他の方法で調製することができる。種々のタイプのｃＤＮＡもしくは ゲノムのライブラリーはスクリーニングすることができる。ｃＤＮＡライブラリ ーの選択は、通常、所望の受容体に対し、ｍＲＮＡが豊富な組織起源に対応して いる。ファージのライブラリーが通常好ましいが、プラスミドのライブラリーも 使用することができる。ライブラリーのクローンをプレート上に広げ、スクリー ニング用の基質に転移させ、変性し次いで所望の配列の存在についてプローブす る。

本発明によって、ｃｙｐｃの構造配列をコードする単離ＤＮＡ配列がプローブと して用いることができる。ｃｙｐＣ活性をコードする単離部分ＤＮＡ配列もこの 発明の一部である。

本発明に用いられるＤＮＡ配列は、通常少なくとも約５個のコドン（１５個のヌ クレオチド）からなり、より普通に少なくとも約７個のコドンからなり、一般に 少なくとも約１０個のコドンからなり、好ましくは少なくとも約１５個のコドン からなり、より好ましくは少なくとも約２５個のコドンからなり、最も好ましく は少なくとも約３５個のコドンて構成されている。１個以上のイントロンも存在 している。

ヌクレオチドの上記の数は、通常、ｃｙｐｃポリペプチドと特異的にハイブリッ ドを形成するのに成功するプローブに対して要求されるは望最小の長さである。

例えば、ｃｙｐＣの特徴的なエピトープは短かいペプチドにコードさせることが できる。通常野生型配列が採用され、場合によっては、欠失、置換、挿入または 反転のような１つ以上の突然変異を導入してアミノ酸配列を変化させて、サイレ ント突然変異を行わせ、制限部位を修飾し、または特定の突然変異を起こさせて もよい。ゲノム配列は、通常約２００Ｋｂを越えず、より普通に約＋００Ｋｂを 越えず、好ましくは５．　ＯＫｂより大きくない。

ｃｙｐＣをコードするＤＮＡ配列由来の、少なくとも約１５個のヌクレオチドを 含有するＤＮＡ配列の部分、通常は少なくとも約２５個のヌクレオチドををし、 かつ約６Ｋｂより少なく、通常は約１．　ＯＫｂより少ないＤＮＡ配列の部分が プローブとして好ましい。そのプローブは、特定のｃｙｐＣをコードするｍＲＮ Ａが細胞または異なる組織中に存在しているか否かを決定するのにも使用できる 。

所望のフラグメントをコードする天然のまたは合成のＤＮＡフラグメントが、生 体外の細胞培養物中に導入し発現させることができるＤＮＡ構造体中に組込まれ る。通常このＤＮＡ構造体は、酵母もしくは細菌のような単細胞宿主中で複製さ せるのに適しているが、ゲノム中への組込みを行う場合と行わない場合に、培養 された、哺乳動物、昆虫、植物などの真核細胞系に導入することができる。細菌 また酵母に導入するために製造されるＤＮＡの構造体は、一般に、宿主によって 認識される複製系、所望の受容体ポリペプチドをコードする目的のＤＮＡフラグ メント、該ポリペプチドをコードするセグメントに作動可能に連結された転写お よび翻訳の開始を調節する配列、および該ポリペプチドをコードするセグメント に作動可能に連結された転写および翻訳の終止を調節する配列を含有している。

上記の転写調節配列は、一般に、宿主によって認識される非相同のエンハンザ− またはプロモーターを含有している。適切なプロモーターの選択は宿主に依存し ているが、ｔｒｐ、　ｌａｃおよびファージのプロモーターのようなプロモータ ー、ｔＲＮＡプロモーター類、および解糖酵素プロモーター類か知られているＣ ３ａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　ＡＬａｂｏｒ ａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（第２版）、　Ｃ３ＨＰｒｅｓｓ社、１９８９年参照 〕。便利に利用できる発現ベクターとしては、複製系および転写と翻訳の調節配 列を、ｃｙｐｃポリペプチドのＤＮＡ配列の挿入部位とともに含有するベクター か採用される。細胞系と発現ベクターとの作動可能な組合せの例はＳａｍｂｒｏ ｏｋらの１９８９年の文献に記載されている（またＭｅｔｚｇｅｒら、　Ｎａｔ ｕｒｅ、　３３４巻、３１〜３６頁、１９８８年も参照）。

これらの細胞の発現ベクターには、複製開始点、プロモーター、エンハンサ−１ ならびにリポソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位およ び転写ターミネータ−配列のような必要なプロセシング情報部位のごとき発現制 御配列が含まれている。好ましくはエンハンサ−またはプロモーターは、ｃｙｐ ｃポリペプチドをコードする遺伝子に天然に付随しているものであるが、多くの 場合、他のものが同等であるかまたはより適切であることは理解されるであろう 。

重要なりＮＡ上セグメント含有するベクターは、公知の方法によって宿主細胞に 転移させることがてきる。そしてその方法は細胞宿主の種類によって変わる。例 えば塩化カルシウムトランスフェクション法またはエレクトロポレーション法が 真核細胞に普通用いられ、一方リン酸カルシウム処理法、エレクトロポレーショ ン法、リボフエクチン法、バイオリスティックス（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）　、 微量注射法および他のポリヌクレオチド転移法が他の細胞宿主に一般に用いられ る（一般的にＳａｍｂｒｏｏｋらの１９８９年の文献参照）。“形質転換細胞” という用語は、形質転換された細胞の子孫も含むものとする。

またＤＮＡ配列はｃｙｐＣ活性を示すかまたは阻害するポリペプチドを発現する のに用いられる。

大腸菌、酵母、哺乳類細胞、昆虫の細胞またはカエルの卵母細胞のような適合性 の宿主内で、ベクターなとの発現伝達体中にｃｙｐｃの全ＤＮＡまたはこのＤＮ Ａの一部分を発現させることによって、大量の上記ペプチドを製造することかで きる。発現伝達体は、当該技術分野で公知の方法、例えばリン酸カルシウム沈澱 法１、リポフエクチン（Ｉｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）　、エレクトロポレーション法 またはＤＥＡＥデキストラン法を用いて細胞に導入することができる。

ｃｙｐＣポリペプチドの特性を研究するために、シグナル配列がペプチドを細胞 下のコンパートメントに誘導する場合、ｃｙｐＣ活性が欠如しているかまたは低 レベルである哺乳類細胞をトランスフェクトすることが有用である。形質転換ま たはトランスフェクトがなされた細胞によって、各種のｃｙｐＣポリペプチドの 結合特性を分析することができる。またトランスフェクトされた細胞は、組成物 または医薬の効力を評価するのに、アンタゴニストもしくはアゴニストとして使 用することができる。

宿主として使用される最も普通の原核細胞は大腸菌の菌株であるか、バシラス・ サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）またはシュードモナス（Ｐｓ ｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の種のような他の原核細胞も使用できる。ｃｙｐＣポリ ペプチド、その一部分またはｃｙｐｃの活性を有するポリペプチドをコードする 配列のフラグメントまたは一部分を含む本発明のＤＮＡ配列は、発現伝達体また は構造体を製造するのに使用できる。通常制御配列は、哺乳動物細胞内での発現 のための真核プロモーターである。大腸菌を形質転換するのに用いる通常の原核 プラスミドベクターは、ｐＢＲ３２２またはその誘導体〔例えばプラスミドｐｋ ｔ２７９　（ＣＩｏｎ−ｔｅｃｈ社）〕である（Ｂｏｌａｖａｒら、Ｇｅｎｅ、 ２巻、９５頁、１９７７年）。原核ベクターも、転写開始のための原核プロモー ターを、任意にオペレーターとともに含有している。最も普通に用いられる原核 プロモーターの例としては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）とラクタマー ゼ（Ｉａｃ）のプロモーター（Ｃｈｅｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、　１９８巻、１０ ５６頁、１９７７年）、トリプトファンのプロモーター（ｔｒｉ））　（Ｇｏｅ ｄｄｅｌｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、、　８巻、　４５７頁、１ ９８０年）、ＰＬプロモーターおよびＮ−遺伝子リポソーム結合部位（Ｓｈｉｍ ａｔａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ、　２９２巻、１２８頁、１９８１年）かある。

酵母とともに用いられるプロモーター類としては、エノラーゼ遺伝子から誘導さ れるプロモーター（Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２５６巻 、１３８５頁、１９８１年）、または３−ホスホグリセリン類キナーゼのような 解糖酵素の合成のためのプロモーター（旧ｔｚｅｍａｎら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、　２５５巻、１９８０年）がある。

適切な非未変性の哺乳類のプロモーターとしては、ＳＶ４０由来の初期プロモー ターと後期プロモーター（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ、　２７３巻、１１３頁 、１９７８年）、またはマウスＭｏ１ｏｎｅｙ白血病ウイルス、マウス乳房腫瘍 ウィルス、鳥類肉腫ウィルス、アデノウィルス■、ウシ乳頭腫ウィルスもしくは ポリオーマウィルス由来のプロモーターが挙げられる。さらに構造体は、遺伝子 の多数のコピーを作ることができるように増幅可能な遺伝子（例えば、ＤＨＰＲ ）に結合させることができる。

原核細胞は、ＣａＣ１ｚを用いる方法（Ｃ６°ｈｅｎ、　Ｓ、Ｎ、、　Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、［ＪＳＡ、６９巻、２＋１０頁、１９７２年）またはＲｂＣ１法（Ｍａ ｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｔ（ａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ 　１９８２年）を含む種々の方法で形質転換することができる。酵母は、Ｖａｎ 　Ｓｏｌｉｎｇｅｎら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ、、　１３０巻、９４６頁、１９７７ 年およびＣ，Ｌ、　Ｈｓｉａｏ　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、　７６巻、３８２９頁、１９７９年に記載されている方法を用いて形質 転換することかできる。真核細胞については、哺乳類の細胞が、Ｇｒａｈａｍお よびＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ。

５２巻、　５４６頁、１９７８年に記載されているリン酸カルシウム沈澱法、ま たはりポフエクチン（ＢＲＬ社）もしくはレトロウィルス感染法（Ｅ。

Ｇ１１ｂｏａ、　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ 　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、９章、１７５頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ ｅｓｓ社、１９８３年）によってトランスフェクトすることができる。適当な配 列を含有する実際の発現ベクターは、連結および制限酵素を含む標準法（例えば 、Ｍａｎｉａｔｉｓの上記文献参照）によって製造することかできる。ＤＮＡの 特定の部位を切断するのに用いる市販の制限酵素は、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂ ｉｏＬａｂｓ社（米国、マサチューセッッ州、ウォルサム）から入手することが できる。

クローンは、ベクター構築のモードによって遺伝標識（ｍａｒｋｅｒ）を使って 選択される。遺伝標識は、同一もしくは異なるＤＮＡ分子上にあってもよいが同 じＤＮＡ分子上が好ましい。哺乳類細胞については、ｃｙｐＣ遺伝子自体が最高 の遺伝標識である。原核宿主においては、形質転換体は、アンピシリン、テトラ サイクリンなどの抗生物質に対する耐性によって選択することができる。温度感 受性に基づいて特定の産物を産生ずることも、適切な遺伝標識として役に立つ。

ｃｙｐｃのポリペプチドまたはペプチドフラグメントを収穫し精製するのに各種 の方法を使用することができる。ペプチドは宿主の溶解物から単離することがで きる。ペプチドは、分泌される場合、細胞上澄み液から単離することができる。

次いでｃｙｐＣは、ＨＰＬＣ，電気泳動法、アフィニティークロマトグラフィー （好ましくは免疫アフィニティーまたはりガントアフィニティーのクロマトグラ フィー）を用いてさらに精製される。

ｃｙｐＣに関連する種のｃＤＮＡクローンを単離するのに用いることができる他 の方法としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する方法がある（Ｓａｉｋ ｉ、　Ｒ，に、ら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３０巻、１０００頁、１９８５年）。

この方法では、ｃｙｐＣポリペプチドの異なる領域に対応する二つのオリゴヌク レオチド（２７量体）が合成され、次いでＰＣＲ反応に用いられ、ｍＲＮＡ源か らの受容体関連ｍＲＮＡの転写物が増幅される。オリゴヌクレオチドのアニーリ ングとＰＣＲ反応の条件は、緊縮度を下げた条件下で行われる。得られた増幅フ ラグメントをサブクローン化し、生成した組換えコロニーを、緊縮度が高い条件 と低い条件の両方を用いてｆｆ２ｐで標識をつけた全長のｃｙｐＣｃＤＮＡでプ ローブした。緊縮度が低くて高くない条件下でハイブリッドを形成するクローン は、関連ｍＲＮＡの転写物を示す。その上にこの方法は、別のスプライシングの ために生成する変形ｃＤＮＡの種を単離するのに用いることができる（Ｆｒｏｈ ｍａｎ、　Ｍ、Ａ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８ ５巻、８９９８頁、１９８８年参照）。

各種のｃｙｐｃポリペプチドおよび結合フラグメントに対するポリクローナルお よび／またはモノクローナルの抗体を製造することができる。抗体という用詔は 、均一な分子要素、または複数の異なる分子要素で作られた血清製品のような混 合物の両方を意味して用いられる。ペプチドフラグメントは、ペプチド合成器内 で合成され次いで担体分子（すなわちキーホール・リンベット・ヘモシアニン） に連結され次いてウサギに数ケ月にわたって注射される。そのウサギの血清を、 ｃｙｐＣタンパク質またはフラグメントに対する免疫反応性について試験する。

モノクローナル抗体は、タンパク質ポリペプチド、融合タンパク質またはそのフ ラグメントをマウスに注射することによって作ることができる。モノクローナル 抗体はＥＬＩＳＡ法でスクリーニングし、次にｃｙｐＣタンパク質、ポリペプチ ドまたはそのフラグメントによって特異的免疫反応性について試験した（Ｅ、ｔ ｌａｒｌｏｗおよびり、Ｌａｎｅ、　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ａ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃ３ＨＬａｂｏｒａｔｏ−ｒｉｅｓ、　１９８ ８年参照。なおこの文献は本願に援用する）。これらの抗体は検定法ならびに医 薬に有用である。

所望のポリペプチドの充分な量が得られたならば、種々の目的のために使用する ことができる。代表的な用途は結合に対して特異的な抗体を製造する用途である 。これらの抗体はポリクローナルもしくはモノクローナルでもよく、生体外また は生体内の方法で製造することができる。

ポリクローナル抗体を製造するために、適当な標的免疫系が選択され、それは一 般にマウスまたはウサギである。充分に精製された抗原か、動物および免疫学者 にとって公知の他のパラメータに対して適切な方法によって決定される方式で該 免疫系に与えられる。注射される代表的な部位は肉腫、筋肉内、腹腔内または皮 内である。

勿論、マウスまたはウサギの代わりに他の種も使用することができる。

免疫応答は通常、免疫検定法で検定される。通常、かような免疫検定法では、抗 原の起源の精製が行われ、例えば抗原は、抗原が産生されたのと同じ細胞と同じ 態様によって生産される。免疫検定法としては、放射線免疫検定法、酵素結合イ ムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）　、蛍光検定法または他の多くの選択され た検定法があるが、これらの検定法の大部分は機能は同じであるが、特定の条件 下で利点を示す。

１０”Ｍ−’、好ましくは１０’〜ｔｏｔａＭ−１もしくはそれ以上に強いアフ ィニティーを有するモノクローナル抗体は一般に、例えばＨａｒｌｏｗおよびＬ ａｎｅ、　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ ｌ、　Ｃ３ＨＬａｂｏｒａｔｏｒｙ。

１９８８年；またはＧｏｄｉｎｇ、　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉ ｅｓ　：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ　（第２版）　Ａｃ ａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ社、米国、ニューヨーク、１９８６年に記載されてい るような標準の方法で作られる。なおこれらの文献は本願に援用するものである 。簡単に述べると、適当な動物が選択され、次に所望の免疫化のプロトコルが行 われる。適当な期間が経過した後、このような動物の肺臓を切取り、次いで、一 般に９個々の肺臓細胞は、適当な選択条件下で不死化骨髄腫細胞に融合される。

その後、該細胞をクローンで分離し、各クローンの上澄み液は、抗原の所望の領 域に対して特異的な適当な抗体を該クローンが産生じていることについて試験さ れる。

他の適切な方法では、リンパ球を、抗原のポリペプチドに生体外で暴露するか、 またはリンパ球を、生体外で、ファージもしくは類似のベクター内で抗体のライ ブラリーの選択にかける（Ｈｕｓｅら、”Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｌ ａｒｇｅ　Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　Ｌｉｂｒａｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｍ ｍｕｎｏ−ｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　ｉｎ　Ｐｈａｇｅ　Ｌａ ｍｂｄａ”、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４６巻、１２７５〜１２８１頁、１９８９ 年参照。この文献は本願に援用するものである）。本発明のポリペプチドと抗体 は、修飾するかまたは修飾しないで用いることができる。本発明のポリペプチド と抗体は、検出可能なシグナルを提供する物質を共有結合または非共有結合で結 合させることによって標識を付けることが多い。広範囲の標識と接合法が公知で あり、かつ科学文献と特許文献の両方に広く報告されている。適切な標識として は、放射性核種類、酵素類、基質類、補因子類、阻害剤類、蛍光剤類、化学発光 剤類、磁気粒子類などが含まれる。このような標識の使用法を教示する特許とし ては、米国特許第３．８１７．８３７号；同第３．８５０．７５２号：同第３． ９３９．３５０号：同第３．９９６．３４５号：同第４．２７７、４３７号：同 第４．２７５．１４９号；および同第４．３６６、２４１号がある。また組換え 免疫グロブリン類も製造することができる（Ｃａｂｉｌｌｙの米国特許第４．８ １６．５６７号参照）。

本発明は、各種の薬剤スクリーニング法のいずれかにおいて、シクロフィリンＣ ポリペプチドまたはその結合フラグメントを用いて化合物をスクリーニングする のに特に有用である。シクロフィリンＣ反応性の薬剤をスクリーニングする際に 組換え形のポリペプチドを用いる利点としては次のものがある。すなわち（ａ） 特定の起源由来のポリペプチドの改良された更新可能な起源；および（ｂ）サブ タイプ（ｓｕｂｔｙｐｅ）の特異性（理論的に大きい生物学的および疾患の特異 性を与える）。

薬剤をスクリーニングする一方法では、前記のポリペプチドまたはフラグメント を発現する組換えＤＮＡ分子で安定して形質転換される真核もしくは原核の宿主 細胞が使用される。このような細胞は、生存可能な形態または固定された形態で 、標準の受容体／リガンド結合検定法に用いることができる。競合検定法は特に 有用である。

この場合、細胞（シクロフィリンＣの起源）を、該ポリペプチドに公知の結合ア フィニティーを有する標識したリガンドおよび該ポリペプチドに対する結合アフ ィニティーが測定される試験化合物に接触させてインキュベートする。次に、捕 捉されたリガンドと遊離のリガンドを分離し、リガンド結合度を測定する。捕捉 された試験化合物の量は、測定された、標識リガンドの結合量に反比例している 。

多数の方法のうちのどれでも、捕捉されたリガンドを遊離リガンドから分離して 、リガンド結合度を測定するのに用いることができる。

この分離ステップは一般に、フィルターに対する接着、続いて洗浄、プラスチッ クへの接着、続いて洗浄もしくは細胞膜の遠心分離のような方法で行われる。ま た生存可能な細胞は、ｃｙｐｃで仲介される機能例えば第二のメツセンジャーレ ベル（Ｃａ）　、増殖などに対する薬剤の作用についてスクリーニングするのに 使用できる。

薬剤のスクリーニングに用いる他の方法としては、シクロフィリンＣポリペプチ ドに対して適切な結合アフィニティーを有する化合物を高処理量でスクリーニン グする方法があり、１９８４年９月１３日に公開されたヨーロッパ特許願公開第 ８４１０３５６４号に詳細に記載されている。第一に、異なる小ペプチドの試験 化合物を多数、プラスチック製のピンまたは何かの他の表面のような固体基質上 に合成する。

次にこれらのすべてのピンをポリペプチドと反応させ、次いで洗浄する。次のス テップで捕捉されたポリペプチドが検出される。

精製されたシクロフィリンＣは、上記の薬剤スクリーニング法で使用するためプ レートを直接コートさせてもよい。しかし、該ポリペプチドに対する非中和抗体 は、抗体を捕捉して、固体用上にシクロフィリンＣポリペプチドを固定化するの に利用することができる。

また本発明は、薬剤スクリーニング競合検定法を提供するものであり、この検定 法では、ポリペプチドフラグメントに対する中和抗体が、シクロフィリンＣポリ ペプチドに結合する試験化合物と競合する。この方式で、上記抗体は、シクロフ ィリンＣの一つ以上の結合部位を共有するあらゆるペプチドの存在を検出するの に使用することかできる。

本発明は下記の例示実施例によって一層よく理解されるであろう。

下記の実施例は例示の手段として提供されるもので本発明を限定するものではな い。

実施例Ｉ：ｃＤＮＡのクローニングおよびライブラリーの構成ＡＣ６の全ＲＮＡ を酸性グアニジニウムチオシアネート−クロロホルム方法（Ｃｈｏｍｅｚｙｎｓ ｋｉ、　１９７８）により調製し、そしてオリゴ−ｄＴセルロース■型（Ｃｏｌ ｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）で２回クロマトグラフィー処理した 。ｃＤＮＡの合成はアダプター−プライマー法（Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ。

＋９９０）によりこの方法をわずかに変更して実施した。次の配列：５　’　− ｄ（ＧＣＡＴＧＣＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ ＴＴＴＴＴＴＴ）−３’を有する４１塩基のアダプター−プライマーは、Ｄａｎ 　Ｄｅｎｎｅｙ博士により提供された。合成したｃＤＮＡをＮｏｔ　ｒ　（Ｎｅ ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、次いて１．２％の低融点アガ ロース（ＦＭＣ）　ミニゲルで分離した。マーカーを臭化エチジウムの染色によ り可視化し、そして−５５０塩基対より大きいｃＤＮＡを含有するゲルの領域を 単離した。ゲルのスライスを６５°Ｃにおいて溶融し、そして試料を製造業者の 使用説明書に従いエルチップ（Ｅｌｕｔｉｐ）−Ｄカラム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅ ｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ）のクロマトグラフィーにかけることによって核酸を回 収した。ｃＤＮＡをエタノール沈澱により濃縮し、そして記載されているように （Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ。

１９９０）　Ｎｏｔ　ＩおよびＥｃｏＲＶて消化して調製した修飾ファージミド ベクターの中への結合のために調製した。未精製の組換えヒトＩＬ−１アルフｙ 　（Ｓｔｅｖｅ　Ｙａｎｏｆｓｋｙ博士ＤＮＡＸ、　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ ｔｉｔｕｔｅ、　Ｐａｌ。

ＡＩｔｏ、　カリフォルニア州）の１０−’希釈物の存在および不存在下に成長 させたＡＣ６細胞から調製したポリＡ″″ＲＮＡから、この融合において方向の ライブラリーを構成した。ライブラリー間のサブトラクション（Ｓｕｂｔｒａｃ ｔｉｏｎ）反応を記載されているように実施した（Ｒｕｂｅｎ−ｓｔｅｉｎ、　 １９９０　；Ｐｏｒｔｅｕｓ、　１９９１）。特定のクローンの分析前に、２ラ ウンドのサブトラクション反応を実施した。

２ラウンドのサブトラクションを実施したファージミドベクターを含有する個々 の細菌のコロニーを培養し、そしてそれらからＮａＯＨ／ＳＤＳ、　Ｎａアセテ ート法によりプラスミドミニブレブ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）ＤＮＡを調製した。プ ラスミドＤＮＡをＳｔｕ　ＩおよびＨｉｎｄＩ［で消化し、引き続いて低融点ア ガロースゲルの電気泳動にかけることによって、ｃＤＮＡインサートを単離した 。インサートを紫外線で可視化し、切り出し、そして３２ｐプロ一ブ合成のため の鋳型として使用するために有機抽出および沈澱により精製した。精製したイン サートを５０μＣｉ〔アルフ−ｒ　−”　Ｐ　）　ｄＣＴＰ　（Ａｍｅｒｓｈａ ｍ）の存在下のランダムブライミングにより標識化し、そしてセファデックス（ Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ−５０カラムのクロマトグラフィーにより精製した。Ｉ Ｌ−１から調製したＡＣ６のＭＲＮＡて誘発したおよび誘発しない培養物を、記 載されているように（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　１９８９）、ｏ、５μｇのＲＮＡ／ レーンを使用して１．０％ホルムアルデヒド−アガロースゲルの電気泳動にかけ た。ＲＮＡをニトロセルロースのフィルター上にプロットし、プレハイブリダイ ゼーションし、そして５０％ホルムアミド、６ＸＳＳＣ，５Ｘデンハルト溶液、 ５ｍＭＮａＰＯ４，１００μｇ／ｍｌ剪断変性サケ精子ＤＮＡおよび５０μｇ／ ｍｌ酵母ｔ　ＲＮＡを含有する溶液中でハイブリダイゼーションした。

前述したように調製した標識化ｃＤＮＡプローブを１６時間ハイブリダイゼーシ ョンし、４５°Ｃにおいて３０分間ハイブリダイゼーションし、次いで０．２Ｘ ＳＳＣ＋　０．１％ＳＤＳ中で６５℃において３０分間洗浄した。次いで、フィ ルターをオートラジオグラフィーの可視化のためにフィル１４上に配置した。Ｉ Ｌ−１で刺激したとき明瞭な誘発を示したクローンを、配列決定により仕上げた 。ジデオキシ連鎖停止法（Ｓａｎｇｅｒ。

１９７７）によりセクエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）（ＵＳ　Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、）を使用して、二本Ｉ　ＤＮＡの配列決定を精製したプラ スミドＤＮＡについて実施した。ｃｙｐＣのｃＤＮＡは配列決定した最初の５つ の異なるクローンの中に存在した。

初期のｃｙｐＣクローンはポリーＡテイルを含有し、そして図１の配列の中の位 置９６に対して５′に伸長した。標準的３０サイクルのポリメラーゼ連鎖反応（ ＰＣＲ）（Ｓａｉｋ、　１９８５）、ｃｙｐＣのヌクレオチド４７０−４８７（ ５’　−ＣＴＧＧＧＡＴＣＣＧＴＴＧＧＴＧＴＣ−３’　）に対して相補的なオ リゴヌクレオチドおよびｃＤＮＡ挿入部位のちょうと５′のベクターに対して相 補的なオリゴヌクレオチド（５’　−ＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＡＧ− ３”）を使用して、ｃｙｐＣの５′末端を得た。サブトラクションしないライブ ラリーのプラスミド（コンプレキシティー２Ｘ１０７クローン）を鋳型として使 用して、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ生産物をＢａｍＨＴおよびＨｉｎｄｌＩＩで 消化し、そして適当なベクターの中に結合した。クローンを、それらのＢａｍ１ ｌ　Ｉ　−ｔ（ｉｎｄｎ［断片の長さおよびもとのｃＤＮＡの５′末端をハイブ リダイゼーションするそれらの能力に基づいて、配列決定について選択した。４ つのクローンが得られ、そして配列決定した。すべてのクローンはオーバーラツ プ領域においてもとのｃＤＮＡと同一であり、そしてそれらの５′末端まで互い に同一であった。

配列の整合をインテリジェネテイクス（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）ソフ トウェアのゲナリン（Ｇｅｎａｌｉｇｎ）プログラムを使用して発生させ、そし てスタッフォード大学の分子および遺伝学的薬物についてベックマン０センター （Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｇｅ ｎｅｔｉｃＭｅｄｉａｉｎｓ）のコンピューターシステムを介してアクセスした 。

実施例３：ｃｙｐＣおよびｃｙｐＡの発現のノーザン分析各源からの２０μｇの 全体のＲＮＡを１．２％アガロースホルムアルデヒドゲル上で展開し、そしてジ ェネスクリーン（Ｇｅｎｅｓｃｒｅｅｎ）（ＤｕＰｏｎｔ）膜上にプロットした 。フィルターを前述したように１８時間ハイブリダイゼーションした。最終の洗 浄条件は６５°Ｃにおいて０．２ＸＳＳＣ。

０．１％ＳＤＳであった。ｃｙｐＣのヌクレオチド８５−１２８８を含有する５ ａｃｌＩ断片、および全体のラットのシクロフィリンＡのｃｌ）ＮＡ　（ネズミ ｃｙｐＡに対して９８％同一）を含有するＢａｍＨＩ断片を、前述したように、 標識化しそして精製した。図面に示されているオートラジオグラムは、ｃｙｐＡ およびｃｙｐＣの両者のプローブについて増強スクリーンを使用する一７０°Ｃ において３日間の露出を表す。

実施例４　：　ｃｙｐｃ−ＧＳＴ融合タンパク質の調製および精製もともと単離 されたｃｙｐＣのクローンは図１の配列においてヌクレオチド９６に対して５′ に伸長した。ベクターとクローンとの間のもとの接合は、次のようにインフレー ムであることが示されている５′−ＡＴＡ　Ｉ　ＡＧＣＩ　ＴＴＣＩ　ＡＴＧ　 Ｉ　ＧＧＧなど−３’　、　）ｌｉｎｄＩ［ｒ部位はベクターの中に（肉太の文 字）およびｃｙｐｃ配列の中に（イタリック体）存在する。このクローンを旧ｎ ｄＩＩ［および５ｔｕＩ　（これはポリーＡテイルのちょうど３′を切断する） で消化し、そして）ＩｉｎｄＩＩＩのオーバーハングをフィルインした。生ずる １２００ｂｐの断片を低融点のアガロースゲルの電気泳動により単離した。細菌 の発現ベクターｐＧＥＸ　−２Ｔを、ＥｃｏＲＩによる消化および引き続くオー バーハングのフィルインおよびホスファターゼ処理により調製した。ｃＤＮＡ断 片およびベクターを７４　ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌ ａｂｓ）を使用して一緒に結合し、そして大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＭＣ１０６ １の中にエレクトロボレイションにより形質転換した。個々の細菌のクローンを 、１ｍＭＩＰＴＧの存在下に４時間培養することによって、融合タンパク質の生 産について試験した。２０μｍの細菌の培養物をマイクロフージ（ｍｉｃｒｏｆ ｕｇｅ）管の中で沈澱させ、そして２５μｌのＳＤＳ　−ＰＡＧＥ試料緩衝液の 中に再懸濁させた。試料を５分間沸騰させ、そして分析のために１０％ＳＤＳ　 −ＰＡＧＥゲル（Ｌａｅｍｍｌｉ、　１９７０）上に負荷した。陽性のクローン を選択し、そして１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補充した５００ｍ１のし ブロスの中に新鮮な一夜の培養物を１＝２５に希釈することによって、ｃｙｐＣ 融合タンパク質の大規模調製物を調製した。０．６〜１．０のＯＤ６゜。に到達 したとき、ＩＰＴＧを１ｍＭに添加した。培養をＩＰＴＧにより誘発後４時間続 け、次いて細胞を氷上に３０分間配置し、次いて５０００ｘ　ｇで２０分間沈澱 させた。細胞を冷いＰＢＳの中で１×洗浄し、そして５０μｇ／ｍｌのリゾチー ムを含む冷い細菌の溶菌緩衝液（１％グルコース、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ｔｌｃ Ｉ　ｐＨ８，０，ｌ０ｍＭ　ＥＤＴＡ）の中に再懸濁させ、そして氷上に一夜放 置した。細菌をフレンチ（Ｆｒｅｎｃｈ）プレスにほぼ＋０．０ＯＯｐｓｉの圧 力において２回通過させることによって、溶菌を実施した。破片および未溶解の 細胞を１０，０００Ｘｇて４°Ｃにおいて１０分間沈澱させた。可溶性融合タン パク質を含有する上澄み液を、ｌ０ｍ１のグルタチオンアガロース（ｇｌｕ−ａ ｇ）　（Ｓｉｇｍａ）と４°Ｃにおいておだやかに揺動しながら１時間インキユ ヘーションした。ｇｌｕ−ａｇを回転し、そして上澄み液を廃棄した。ＰＢＳて 数回洗浄して、ｇｌｕ−ａｇに付着しない細菌の残留タンパク質を除去した。最 終の洗浄は５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１４ＣＩｐＨ７，５ｃ７）中で実施した。２体 積（１０ｍｌ）の５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　Ｉ）Ｈ７，５を添加することに よって、融合タンパク質をアガロースから特別に溶離した。典型的には、融合タ ンパク質の収量は細菌培養物の１リツトル当たり１５ｍｇの範囲である。

実施例５．ペプチジル−プロリルイソメラーゼ活性ｎ−スクシニル−Ａｌａ　− Ａｌａ　−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−パラニトロアニリドペプチドのシス−トランス異性 化を、トランス（シスではない）異性体の中のアニリド結合を加水分解するキモ トリプシンを使用する共役活性測定により測定した（Ｆｉｓｃｈｅｒ、　１９８ ９）。反応速度ソフトウェアを有するベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）　ＤＵ−６ ５を使用して４０５μｍにおける吸収の変化をモニターすることによって、ペプ チドの切断を追跡した。１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｌｌＨ７，８）中に ペプチド（最終濃度７０μｍ）を含有するストック混合物を、ＧＳＴまたはｃｙ ｐＣ融合タンパク質（ＣｓＡを含むか、あるいは含まない）と混合した。９００ μｍの各混合物を１００μｍのキモトリプシン溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（１１ Ｈ７，８）中の０．６６ｍｇ／ｍｌ）と−緒にして反応を開始した。示されてい るデータは３回の決定の平均である。すべての手順は２０°Ｃにおいて実施した 。

５％胎児ウシ血清（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）　−２ｍＭ　Ｌ−グルタミン（Ｉｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅ ｎｔｉｆｉｃ）および１０−’Ｍ　β−メルカプトエタノールを含むＲＰＭ１１ ６４０　（［ｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎ−ｔｉｆｉｃ）の中てＴ細胞系統を維持し た。細胞を加湿したインキュベーターの中て３７℃において７％Ｃ０２で培養し た。ＡＣ６のコンフルエントの１０ｃｍの皿、あるいはＴ細胞の培養物の１０ｍ １から濃縮した細胞を、放射線標識化したタンパク質の調製のために使用した。

培養物を無菌のＰＢＳでＩＸ洗浄し、次いで５％の透析した胎児ウシ血清を補充 したメチオニンおよびシスティン欠乏ＭＥＭ　（Ｇｉｂｃｏ）の中に３０分間入 れた。３０分後、培地を除去し、そして４ｍｌの欠乏ＭＥＭ＋５％の透析血清と 置換した。２５０〜５００μＣｉの！６Ｓメチオニンを添加し、そして細胞をイ ンキュベーターに戻した。ＡＣ６の標識化を最小６時間かつ最大１４時間の間実 施した。Ｔ細胞系統を標識の存在下に２〜４時間成長させた。標識化のインキュ ベーションの終わりにおいて、細胞を収穫前に冷却したＰＢＳで２×洗浄した。

プレートに付着する洗浄したＡＣ６細胞に２ｍｌの氷冷溶菌緩衝液（１５０ｍＭ 　ＮａＣ１，５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）１ｃＩ　ｐ）１７．５．　１　ｍＭ　Ｍｇ ＣＩｔ、２ｍＭ　ＣａＣ１ｔ。

０．５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−ｔｏｏ、　１　ｍＭ　ＰＭＳＦ）を直接添加する ことによって、細胞リゼイトを調製した。皿をゴムのポリスマンでこすり取るこ とによって、ＡＣ６細胞のリゼイトを集めた。リゼイトをマイクロフージの中で ４°Ｃにおいて１０分間回転して、核と破片を沈澱させた。

実施例６：ＣＹｌｌＣ親和性反応 はぼｌＸｌ０”のＴＣＡの沈澱可能な計数の標識化リゼイトを反応につき使用し た。反応体積を溶菌緩衝液中で１ｍｌにした。各反応を１０１１　ｇのゲルタデ オン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）および１００μｌの５０％のｇｌｕ− ａｇで４°Ｃにおいておだやかに撹拌しながら２時間インキュベーションするこ とによって、前以て清浄にした。反応物をマイクロフージの中で４°Ｃにおいて ５分間回転し、そしてベレットを廃棄した。前以て清浄にしたリゼイトに、１０ μｇのｃｙｐｃ融合タ融合タンパクロμｌの５０％のｇｌｕ−ａｇ温溶液一緒に 添加した。反応物を４°Ｃにおいておだやかに撹拌しながら３〜４時間インキュ ベーションし、その時管をマイクロフージの中で４　”Ｃにおいて５分間回転し 、そして上澄み液を除去した。ｇｌｕ−ａｇベレットを１ｍｌの冷い溶解緩衝液 で４×洗浄し、最終の洗浄のために新しい管に移した。上澄み液を廃棄し、そし てペレットをβ−メルカプトエタノールを含有する５０〜１００μｌのＳＤＳ　 −ＰＡＧＥの試料緩衝液の中に再懸濁させた。試料を５分間沸騰させ、そして９ ．５％ＳＯ３−ＰＡＧＥゲル上に負荷した。

ゲルをメタノール：酢酸：クーマツシーブルーの中で染色／固定し、そしてメタ ノール・アミノ酸の中で脱染色した。ゲルを増強溶液（ＮＥＮ）の中でインキュ ベーションし、次いでよく洗浄しかつセロファン膜（Ｈｏｅｆｅｒ　５ｃｉｅｎ ｔｉｆｉｃ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）上で乾燥することによってオートラジオ グラフィーのために調製した。示したゲルについての露出期間は、コダックＸＡ Ｒフィルムを使用して７〜１０日であった。

実施例７：シクロフィリンＣクローンの特性決定実施例１に記載するサブトラク ション（Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、　１９９０）を使用することによって、ＡＣ６ 細胞を造血素および炎症性サイトカインＩＬ−１で処理したとき、ｍＲＮＡレベ ルにおいて定量的または定性的に改良調節されたいくつかのｃＤＮＡクローンが 単離された。クローンの１つは、　２１２アミノ酸のタンパク質、ｃｙｐＣ，を コードする１２８８ｂｐのｃＤＮＡであった（図１）。ｃｙｐｃは２２．７９５ ダルトンの予測された分子量ングしたゲノムのＤＮＡプロットは、ｃｙｐｃがシ クロフィリンＡおよびＢと区別される単一のコピー遺伝子であることを示唆する 。ストリンジェントの条件下のヒトゲノムＤＮＡとのハイブリダイゼーションは 、ｃｙｐＣの密接に関係するヒト相同体が存在することを示唆する。

ネズミ／ハムスターおよびネズミ／ラットのハイブリッド細胞系のパネルを使用 して、ネズミｃｙｐＣが染色体１８にマツピングされた。

図２は、ｃｙｐＣといくつかの従来同定されたシクロフィリンとの間の相同性の 広範な領域を示す。インテリジェネティクス（Ｉｎｔｅ’ｌｌｉ−ｇｅｎｅｔｉ ｃｓ）のソフトウェアのゲナリン（Ｇｅｎａｌｉｇｎ）プログラムを使用して、 配列の整合を発生させた。相同性の領域はｃｙｐＣのアミノ酸３６からアミノ酸 ２０５に及ぶ。このオーバーラツプ内の相同性の程度は、ヒトｃｙｐＢ（Ｐｒｉ ｃｅ、　１９９１）との７７％の同一性（１６５アミノ酸にわたる）、ネズミｃ ｙｐＡ（Ｈａｓｅｌ、　１９９０）との５８％の同一性（１５８アミノ酸にわた る）から、ドロソフィラ・二す（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｎ１ｎａ）　Ａ遺伝子 （Ｓｃｈｎｅｕｗｌｙ、　１９８９　；　５ｈｉｅｎ、　１９８９）との５０％ の同一性（１６５アミノ酸にわたる）までの範囲である。アミノ酸３６からアミ ノ酸１７７への伸長として定義される相同性のコア領域内で、残基の４６％は比 較した５つの配列の間で絶対的に保存される。全体の配列にわたって相同性を比 較するとき、ネズミｃｙｐＡおよび酵母ｃｙｐｌは互いに一層密接に関係するが 、ｃｙｐＣはネズミｃｙｐＡまたは酵母ｃｙｐｌのいずれに対するよりも酵母ｃ ｙｐ２およびヒトｃｙｐＢにいっそう密接に関係することが明らかである。ｃｙ ｐＣは従来単離された晴れ動物のシクロフィリンＡタンパク質に関してアミノ末 端およびカルボキシル末端の両者の伸長を有することを認めることは興味あるこ とである。これに関して、ｃｙｐｃはトロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）　 、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）（ＴｒｏｐｓｃｈＩＪｇ、　＋９８ ８）　、サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）　（Ｋｏｓｅｒ。

＋９９０）　、および最近、ヒトシクロフィリンＢ　（Ｐｒｉｃｅ、　１９９１ ）から単離されたシクロフィリンに類似する。アミノ末端は、ｃｙｐＣの細胞内 の局在化においである役割を演するある数の疎水性残基を含有する。

実施例８：ｃｙｐＣのｍＲＮＡの組織特異的発現のプロフィルンーザンブロット ハイプリダイゼーション（図３）は、ｃｙｐｃが組織および細胞系の制限された サブセットにおいて発現されることを明らかにする。ｃｙｐＣのｍＲＮＡの発現 の増加は、シクロフィリン八と同様に、ネズミ骨髄誘導化細胞系ＡＣ６において ＩＬ−１により誘発することかできる。肝臓はｃｙｐＣで検出可能なシグナルを 発現しないか、試験したすべての組織はシクロフィリンＡのｍＲＮＡを発現する 。シクロフィリンＡはユビキチンでありかつその発現において高度に豊富である ことか報告された（Ｋｏｌｓｔｓｋｙ、　１９８６）が、検定した組織の中に存 在するメツセージの量の実質的な変動が存在することをわれわれは発見した。ｃ ｙｐＣのｍＲＮＡは、シクロフィリンへのように、腎臓において比較的高い局所 的で発現される；これはＣｓＡが高度に腎細胞毒性であるが、一般に肝細胞毒性 ではないという証拠に照らして興味あることである。シクロフィリンＡ、Ｂおよ びＣおよび多分シクロフィリン族のまだ同定されていない構成員の他のものの濃 度の変動は、ＣｓＡに対する特異的応答を決定することがあるであろう。

実施例９　：　ＣｓＡによるシクロフィリンＣの阻害アミノ酸１６−２１２をコ ードするｃｙｐｃのｃＤＮＡの一部分を細菌の発現ベクターｐｃＥｘ　２Ｔ　（ Ｓｍｉｔｈ、　１９８８）の中にクローニングし、そしてグルタチオン−６−ト ランスフェラーゼｃｙｐＣタンパク質を生産しそして精製した。この融合タンパ ク質をシス−トランスプロリル−イソメラーゼ活性について検定した。図４はｃ ｙｐＣ融合タンパク質の活性、およびこの活性へのＣｓＡの効果を示す。ｎ−ス クシニル−Ａｌａ　−ＡｌａＰｒｏ−Ｐｈｅ−パラニトロアニリドペプチドのシ ス−トランス異性化を、トランス異性体の中のアニリド結合を加水分解するが、 シス異性体の中のアニリド結合を加水分解しないキモトリプシンを使用する共役 活性測定において測定した（Ｆｉｓｃｈｅｒ、　１９８９）。この反応にｃｙｐ Ｃを添加すると、ペプチド基質の切断速度を濃度依存的方法で加速する（Ａ対Ｂ およびＣ）。ＣｓＡの添加は、また濃度依存的方法で、この加速を逆転する（Ｂ 対りおよびＥ）。薬物ＦＫ５０６はｃｙｐｃ融合のＰＰＩアーゼ活性に対して効 果をもたなかった。これらの結果が証明するように、ｃｙｐＣはＰＰＩアーゼ活 性を有し、そしてこの活性はＣｓＡにより特異的にブロックされる。

実施例１ＯニジクロフイリンＣと２つの独立の細胞質タンパク質との相互作用 ｃｙｐＣの生理学的役割、ならびにシグナルの形質導入の阻害または促進を、Ｃ ｓＡの存在または不存在下に細胞質タンパク質とその相互作用を研究することに よって調査した。ＧＳＴ　−ｃｙｐＣ融合タンパク質を親和性リガンドとして使 用して、それと相互作用する細胞のタンパク質をサーチした。グルタチオンアガ ロースカラムを使用して、■３メチオニン／”Ｓシスティン生合成したＡＣ６細 胞リゼイトを添加したＧＳＴ−ｃｙｐｃタンパク質を結合した。洗浄後、非標識 ＧＳＴ−ｃｙｐＣタンパク質およびその関連した標識化ＡＣ６タンパク質を、β −メルカプトエタノールおよびＳＤＳ試料緩衝液の存在下に沸騰により回収した 。

図５はこのような親和性単離の結果を示す。この実験において、ＡＣ６からの３ ６３メチオニン／システイン標識化細胞リゼイトをＧＳＴ単独（対照）、ｃｙｐ Ｃ融合タンパク質またはｃｙｐＣ融合タンパク質＋ＣｓＡとインキュベーション した。７７Ｋｄの見掛けの分子量をもつタンパク質はＣｓＡの不存在下にｃｙｐ ｃ融合タンパク質に結合するが、ＣｓＡの存在下に、５５Ｋｄの見掛けの分子量 をもつタンパク質は結合する。ＣｓＡの不存在下に、ｐ５５タンパク質は結合し ないが、ＣｓＡの存在下にｐ７７は結合しない。代謝的標識化の間の培地の中の ＩＬ−１の存在または不存在はこれらの関連するタンパク質に対して明らかな作 用をもたない。

ｃｙｐＣ：　ｐ　７７対ｃｙｐＣ：　ＣｓＡ複合体の形成についてのＣｓＡ濃度 への依存性を図６においていっそう詳細に調査し、ここで一定量の融合タンパク 質および標識化細胞タンパク質を使用して増加する量のＣｓＡを反応の中に滴定 する。この実験において、ＣｓＡの濃度を５μｇ／ｍｌに増加したとき、５５Ｋ ｄのバンドは複合体の一部分として明瞭に存在した。　＋２５μｇ／ｍｌを越え るＣｓＡ濃度において、５５Ｋｄのバンドの強度は増加せず、すべての利用可能 な５５Ｋｄタンパク質がＣｓＡ　：　ｃｙｐｃリガントと既に複合化しているこ とを示唆する。しかしながら、１２５μｇ／ｍｌより大きいＣｓＡｌ１度におい て、７７Ｋｄの強度は増分的に減少する。

２μｇ／ｍｌのＣｓＡ濃度は、ｃｙｐＣのイソメラーゼ活性を完全に阻害するた めに十分てあり、そしてシクロフィリンＡと同様に、ｃｙｐＣがこのような条件 下にＣｓＡてほとんど飽和されていることがありうる。

こうして、最高のＣｓＡ濃度において、非常にわずかの遊離ｃｙｐＣが存在する であろう。これらの結果が示唆するように、天然のｃｙｐｃタンパク質は７７Ｋ ｄのタンパク質のための高い親和性のリガンドであるが、ｃｙｐｃ　：　ＣｓＡ 複合体は５５Ｋｄのタンパク質のための高い親和性のリガンドである。図６のい くつかのレーンにおける両者のバンドの出現は、それらの反応におけるｃｙｐＣ 融合タンパク質の遊離およびＣｓＡ結合した両者の形態を多分反映する。免疫抑 制薬物ＦＫ５０６の添加は、７７Ｋｄタンパク質へのｃｙｐｃの結合に対して作 用をもたない。

図７は、ヒトｊｕｒｋａｔＴ細胞系および３つのネズミＴ細胞系から調製した２ ＳＳメチオニン／システイン標識化タンパク質を使用して実施したｃｙｐＣ融合 タンパク質反応の結果を示す。試験したすべての細胞系は、ＣｓＡの不存在下に 結合する７７Ｋｄのタンパク質を有するように思われる（レーン２）。ネズミ細 胞系およびヒトｊｕｒｋａｔ系統は、また、ＣｓＡの存在下に結合する５５Ｋｄ のタンパク質を有するように思われる（レーン３）。ＡＣ６の間質の細胞系と対 照的に、Ｔ細胞系はこれらの複合体に関連する他のタンパク質、主として一７０ Ｋｄのバンドを含有することができる。しかしながら、これらの存在はｃｙｐｃ を必要とせず、そしてそれらの強度はＣｓＡの存在または不存在で再現性ある方 法で変化しない。ネズミおよびヒトＴ細胞系の中の同様なまたは同一のタンパク 質の出現は、その相手のタンパク質のために交雑種の親和性を示し、そしてまた ＣｓＡの作用のメカニズムを研究するときのこのタンパク質の利用を示すことが できる。

選抜した参考文献 Ｂｉｅｒｅｒ、　Ｂ、、　Ｓｏｍｅｒｓ、　Ｐ、、　Ｗａｎｄｌｅｓｓ、　Ｔ、 、　Ｂｕｒａｋｏｆｆ、　Ｓ、、　５ｃｈｒｅｉ−ｂｅｒ、　Ｓ、（＋９９０） 。非天然イムノフィリンリガンドを使用するプロピング免疫抑制作用。５ｃｉｅ ｎｃｅ　２５０．５５６−５５９゜Ｃｈｍｅｚｙｎｓｋｉ、　Ｐ、、　５ａｃｃ ｈｉ、　Ｎ、（１９８７）　６酸性グアニジニウムチオシアネート−フェノール −クロロホルム抽出。Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１６２゜１５６−１５９゜ Ｄａｎｉｅｌｓｏｎ、　Ｐ、、　Ｆｏｒｓｓ−Ｐｅｔｔｅｒ、Ｓ、、　Ｂｒｏｗ 、　Ｍ、、　Ｃａ１ａｖｅｔｔａ、　Ｌ、。

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Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４４．１４１８−１４２４゜Ｄｕｒｅｔｔｅ、　Ｐ 、、　Ｂｏｇｅｒ、　Ｊ、、　Ｄｕｍｏｎｔ、　Ｆ、、　Ｆｉｅｒｅｓｏｎｅ、 　Ｒ，、Ｆｒａｎｋｓ−ｈｕｎ、　Ｒ，、Ｋｏｐｒａｋ、　Ｓ、、　Ｌｉｎ、　 Ｃ，、Ｍｅｌｉｎｏ、　Ｍ、、　Ｐｅ５ｓｏｌａｎｏ、　Ａ、。

Ｐｉｓｓａｎｏ、　、１．、　Ｓｃｈｍｉｄｔ、　、１．、　Ｓｉｇａｌ、　Ｎ 、、　５ｔａｒｕｃｈ、　Ｍ、、　Ｗｉｔｚｅｌ、　Ｂ。

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Ｃｒａｂｊｒｅｅ、　Ｇ１１９８９）。シクロスポリンＡはＴ細胞の活性化に関 係する核タンパク質の機能を特異的に阻害する。５ｃｉｅｎｃｅ　２４６．１６ １７−１６２０゜ Ｆｉｓｃｈｎｅｒ、Ｇ、、Ｗｉｔｔｍａｎｎ−Ｌｉｅｂｏｌｄ、Ｂ、、Ｌａｎｇ 、Ｋ、、Ｋｉｅｆｈａｂｅｒ、Ｔ、。

Ｓｃｈｍｉｄ、　Ｆ、（＋９８９）。シクロフィリンおよびペプチジル−プロリ ルのラス−１〜ランス異性体は多分同一のタンパク質である。Ｎａｔｕｒｅ　３ ３７゜４７６−４７８゜ １１ａｃｎｄｌｅｒ、　Ｂ、、　Ｈｏｆｅｒ　Ｗａｒｂｉｎｅｋ、　Ｒ，、Ｈｏ ｆｅｒ、　Ｐ、（１９８７）　ａ　ヒトＴ細胞シクロフィリンについての相補的 ＤＮＡ、　ＥＭＢＯＪ、　６．９４７−９５００Ｈａｅｎｄｌｅｒ、　Ｂ、、　 Ｋｅｌｌｅｒ、　Ｒ，、Ｈｉｅｓｔａｎｄ　Ｐ、、　Ｋｏｃｈｅｒ、　Ｈ，、Ｗ ｅｇｍａｎｎ。

Ｇ、、　Ｒａｏ　Ｍｏｖｖａ、　Ｎ、（１９８９）　ｏ酵母シクロフィリンの単 離およびタンパク質、ｃＤＮＡおよび遺伝子の特性決定。Ｇｅｎｅ　８３．３９ −４６゜Ｈａｎｄｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ、　Ｒ，、ｔ（ａｒｄｉｎｇ、　Ｍ、、 　Ｒｉｃｅ、　Ｊ、、　Ｄｒｕｇｇｅ、　Ｒ，（１９８４）ａシクロフィリン： シクロスポリンＡについての特異的細胞質ゾルの結合性タンパク質。５ｃｉｅｎ ｃｅ　２２６．５４４−５４７゜Ｈａｒｄｉｎｇ、　Ｍ、、　Ｇａ１ａｔ、　Ａ 、、　Ｕｅｈｌｉｎｇ、　Ｄ、、　５ｃｈｒｅｉｂｅｒ、　Ｓ、（１９８９）。

免疫抑制ＦＫ５０６についてのレセプターはシス−トランスペプチジル−プロリ ルイソメラーゼである。Ｎａｔｕｒｅ　３４１．７５８−７６０゜Ｈａｓｅｌ、 　Ｋ、、　５ｕｔｃｌｉｆｆｅ、　Ｊ、（１９９０）。マウスシクロフィリンを コードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列。Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１８ ．４０１９゜Ｈｕｌｔｓｃｈ、　Ｔ、、　Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ、　Ｊ、、　Ｋａ ｌｉｎｅｒ、　Ｍ、、　Ｈｏｈｍａｎ、　Ｒ，（１９９０）。

シクロスポリンＡはラット好塩基性白血病細胞およびヒト好塩基性細胞の脱顆粒 を阻害する。Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４４．２６５９−２６６４゜Ｋｏｌｅｔ ｓｋｙ、　Ａ、、　Ｈａｒｄｉｎｇ、　Ｍ、、　Ｈａｎｄｕｓｃｈｕｍａｃｈｅ ｒ、　Ｒ，（１９８６）。シクロフィリン：正常および新形成組織における分布 および変異型の性質。Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３７．１０５４−１０５９゜Ｋ ｏｓｅｒ、　Ｐ、、　５ｙｓｌｖｅｓｔｅｒ、　Ｄ、、　Ｌｉｖｉ、　Ｇ、、　 Ｂｅｒｇｓｍａ、　Ｄ、（１９９０）。サツカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃ ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における第２シクロフイリン関 係遺伝子。Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１８．１６４３゜Ｌａｅｍｍｌｉ 、　Ｕ、、バクテリオファージＴ４のヘッドのアセンブリーの間の構造タンパク 質の切断。Ｎａｔｕｒｅ　２２７．６８０−６８５゜Ｌｏｖｈａｕｇ、　Ｄ、、 　Ｐｅ１ｕｓ、　Ｌ、、　Ｎｏｒｄｌｉｅ、　Ｅ、、　Ｂｏｙｕｍ、　Ａ、、　 Ｍｏｏｒｅ、　Ｍ。

（＋９８６）。単球コンディショニングした培地およびインターロイキンｌは、 ネズミ骨髄培養物の付着性細胞層の中の顆粒球−マクロファージコロニー刺激因 子の生産を誘発する。Ｅｘｐ、Ｈｅｍａｔｏｌ、　１４．１０３７−４２゜ Ｐｒ１ｃｅ、　Ｅ、、　Ｚｙｄｏｗｓｋｙ、　Ｌ、、　Ｊｉｎ、　Ｍ、、　Ｂａ ｋｅｒ、　Ｃ，、Ｍｃｋｅｏｎ、　Ｆ、。

Ｗａｌｓｈ、　Ｃ，（１９９１）。ヒトシクロフィリンＢ：第２シクロフィリン 遺伝子はシグナル配列をもつペプチジル−プロリルイソメラーゼをエンコードす る。Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８８．１９０３−１９０ ７゜Ｐｏｒｔｅｕｓ、　Ｍ、）（、、Ｅ、Ｊ、、　Ｂｕｌｆｏｎｅ、　Ａ、、　 ｔｌｓｄｉｎ、　Ｔ、Ｂ、、　Ｃ１ａｒａｎｅｌｌｏ。

Ｒ，Ｄ、、　Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、　、ＬＬ、Ｒ，（１９９１）。胚のテレン セフ７ｏンの中で優先的に発現されるｃＤＮＡクローンのライブラリーの単離お よび特性決定。Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（印刷中 ）。

Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、　Ｊ、、　Ｂｒ１ｃｅ、　Ｅ、、　Ｃ１ａｒａｎｅｌｌ ｏ、　Ｒ，、Ｄｅｎｎｅｙ、　Ｄ、。

Ｐｏｒｔｅｕｓ、　Ｍ、、　Ｕｓｄｉｎ、　Ｔ、（１９９０）。方向インサート をもつ一重鎖ファージミドを使用するサブトラクティブハイブリダイゼーション 系。

Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１８．４８３３−４８４２゜５ａｉｋｉ、Ｒ８， ５ｃｈａｒｆ、Ｓ、、Ｆａｌｏｏｎａ、Ｆ、、Ｍｕｆｔｉｓ、Ｋ、、Ｈｏｒｎ、 Ｇ、。

Ｅｒ１ｉｃｈ、　Ｈ，、Ａｒｎｈｅｉｍ、　Ｎ、（１９８５）　ｏベーターグロ ビンのゲノム配列の酵素的増幅および鎌状赤血球貧血の診断のための認識部位の 分析。

５ｃｉｅｎｃｅ　２３０．　１３５０−１３５４゜Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　、１． 、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、（１９８９）　 。ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣＩＯｎＩｎｇ　ｏ編者、編。Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 ）Ｉａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　。

Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　Ｓ、、　Ｃｏｕｌｓｏｎ、　Ａ、 （１９７７）。連鎖停止インヒビターを使用するＤＮＡの配列決定。Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　７４．５６４３゜Ｓｃｈｎｅｕｗｌｙ、　Ｓ、 、　Ｓｈｏｒｔｒｉｄｇｅ、　Ｒ，、Ｌａｒｒｉｖｅｅ、　Ｄ、、　Ｏｎｏ、　 Ｔ、、　０ｚａｋｉ。

Ｍ、、　Ｐａｋ、　Ｗ、（＋９８９）。ドロソフィラ・ニナ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉ ｌａ　ｎ１ｎａ）　Ａ遺伝子は眼特異的ソクロフィリン（シクロスポリンＡ結合 タンパク質）をエンコードする。ＰＮＡＳ　８６．５３９０−５３９４゜５ｃｈ ｒｅｉｂｅｒ、　Ｓ、（１９９１）。イムノフィリン類およびそれらの免疫抑制 リガンドの化学および生物学。５ｃｉｅｎｃｅ　２５１．２８３−２８７゜５ｈ ｉｅｈ、Ｂ、、Ｓｔａｍｎｅｓ、Ｍ、、５ｅａｖｅｌｌｏ、Ｓ、、Ｈａｒｒｉｓ 、Ｇ、、Ｚｕｋｅｒ、Ｃ。

（１９８９）。ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）における視的形質導入に 要求されるニナＡ遺伝子はシクロスポリンＡ結合タンパク質の相同体をエンコー ドする。Ｎａｔｕｒｅ　３３８．６７−７０゜５ｉｅｋｉｅｒｋａ、　Ｊ、、　 Ｈｕｎｇ、　Ｓ、、　Ｐｏｅ、　Ｍ、、　Ｌｉｎ、　Ｃ，、Ｓｉｇａｌ、　Ｎ、 （１９８９）。

免疫抑制ＦＫ５０６のための細胞質ゾル結合タンパク質はペプチジル−プロリル イソメラーゼ活性を有するが、シクロフィリンと区別される。　Ｎａｔｕｒｅ　 ３４１．７５５−７５７゜Ｓｉｇａｌ、　Ｎ、、　Ｄｕｍｏｎｔ、　Ｐ、、　Ｄ ｕｒｅｔｔｅ、　Ｐ、、　５ｉｅｋｉｅｒｋａ、　、ｙ、Ｔ　Ｐｅｔｅｒｓｏｎ 。

Ｌ、、　Ｒｉｃｈ、　Ｄ、、　Ｄｕｎｌａｐ、　Ｂ、、　５ｔａｒｕｃｈ、　Ｍ 、、　Ｍｅｌｉｎｏ、　Ｍ、、　Ｋｏｐｒａｋ、　Ｓ、。

Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　Ｄ、、　Ｗｉｔｚｅｌ、　Ｂ、、　Ｐｉｓａｎｏ、　Ｊ、 （１９９１）ｏシクロフィリンはシクロスポリンＡの作用の免疫抑制および腎細 胞毒性メカニズムに関係するか？　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１７３．６１９゜Ｓ ｍ１ｔｈ、　Ｄ、、　Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｋ、（１９８８）。グルタチオン−ｓ −トランスフェラーゼとの融合体として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ ｌｉ）の中で発現されるポリペプチドの単一工程の精製。Ｇｅｎｅ　６７、４０ ゜Ｓｔａｍｎｅｓ、　Ｍ、、　５ｈｉｅｈ、　Ｇ、、　Ｃｈｕｍａｎ、　Ｌ、、 　Ｈａｒｒｉｓ、　Ｇ、、　Ｚｕｋｅｒ、　Ｃ。

（＋９９１）。シクロフィリン相同体ニナＡはドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉ 　ｌａ）のロドプシン類のセブセットの適切な合成のために要求される組織特異 的な内在性膜タンパク質である。Ｃｅ１ｌ　６５．２１９−２２７゜Ｔａｋａｈ ａｓｈｉ、　Ｎ、、　Ｈａｙａｎｏ、　Ｔ、、　５ｕｚｕｋｉ、　Ｍ、（１９８ ９）　ｏペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼはシクロスポリンＡ 結合タンパク質シクロフィリンである。Ｎａｔｕｒｅ　３３７．４７３−４７５ ゜Ｔｏｃｃｉ、　Ｍ、、　Ｍａｔｋｏｖｉｃｈ、　Ｄ、、　Ｃｏ１１ｉｅｒ、　 Ｋ、、　Ｋｗｏｋ、　Ｐ、、　Ｄｕｍｏｎｔ、　Ｆ、。

Ｌｉｎ、　ｓ、＋　Ｄｅｇｕｄｃｉｂｕｓ、　ｓ、ｌ　５ｉｅｋｉｅｒｋａ、　 Ｊ、、　Ｃｈｉｎ、　Ｊ、、　Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ。

Ｈ，（１９８９）。免疫抑制ＦＫ５０６は前期Ｔ細胞活性化遺伝子の発現を阻害 する。　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４３．７１８−７２６゜Ｎ　ω　Ｑ　く　−〜 　の　○　に　−浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、３゜ 浄書（内容に変更なし） ＩＬ−１＋−＋−＋−マーカー Ｆ／Ｇ、５ ”Ｏ”０１−０ ２２　２　！ ：ゴ　１ １　ン　ン 手続補正書（方式） 平成６年ユ月２−１日

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．シクロフィリンＣポリペプチドまたはその結合断片をコードする単離された 組換え核酸。
2. ２．図１のＤＮＡ配列に対して本質的に相同的である請求項１に記載の核酸。
3. ３．シグナルＤＮＡ配列をさらに含む請求項２に記載の核酸。
4. ４．請求項１に記載の核酸を含んでなる単離された組換えベクター。
5. ５．請求項４に記載の核酸およびベクターで形質転換された原核生物または真核 生物宿主。
6. ６．請求項２に記載の核酸配列を含んでなる単離された組換えベクター。
7. ７．請求項６に記載の核酸およびベクターで形質転換された原核生物または真核 生物宿主。
8. ８．実質的に純粋なシクロフィリンＣポリペプチドまたはその結合断片。
9. ９．図１のアミノ酸配列に対して本質的に相同的である請求項８に記載のポリペ プチド。
10. １０．請求項８に記載のポリペプチドまたは断片に特異的に結合することができ る抗体。
11. １１．シクロフィリンＣおよびシクロフィリンＣに特異的に結合する細胞成分を 含んでなる実質的に純粋な複合体。
12. １２．シクロフィリンＣポリペプチドおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定して約 ７７Ｋｄのタンパク質を含んでなり、前記タンパク質はシクロスポリンＡの不存 在下にシクロフィリンＣポリペプチドに結合しそして前記結合はカルシウム依存 性ではない、実質的に純粋な複合体。
13. １３．シクロフィリンＣポリペプチドが、マーカーポリペプチドをさらに含む融 合ポリペプチドの１成分である、請求項１２に記載の複合体。
14. １４．マーカーポリペプチドがＧＳＴである請求項１３に記載の複合体。
15. １５．シクロフィリンＣポリペプチドおよび第２のシクロフィリンポリペプチド を含んでなる融合ポリペプチド。
16. １６．ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定して約７７Ｋｄの分子量を有し、シクロスポ リンＡの不存在下にシクロフィリンＣポリペプチドに結合しそして前記結合はカ ルシウム依存性ではないことを特徴とする、実質的に精製されたタンパク質。
17. １７．免疫抑制因子の候補をシクロフィリンＣポリペプチドと接触させ、そして 前記候補と前記ポリペプチドとの間の複合体の存在について検定することを含ん でなる、組織特異的免疫抑制因子をスクリーニングする方法。
18. １８．前記ポリペプチドがシクロフィリンＣ結合性断片である請求項１７に記載 の方法。
19. １９．前記ポリペプチドがマーカーを有する融合タンパク質である請求項１７に 記載の方法。
20. ２０．前記マーカーがＧＳＴである請求項１９に記載の方法。