JP2002525115A - 発作、高血圧、糖尿病および肥満を予報および治療する、遺伝子およびタンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、その発現がＳＨＲ−ラット（ヒト代謝Ｘ症候群についての動物モデル）において調節されている遺伝子を開示する。また、その遺伝子産物がコントロール動物と比較して、ＳＨＲ動物において変更されている遺伝子が開示される。本発明はさらに、これらの遺伝子および遺伝子産物を使用して、代謝Ｘ症候群と関連する状態を診断または処置する方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、核酸およびポリペプチド、ならびにこれらを使用する方法に関する
。特に、本発明は、その発現が代謝Ｘ関連症候群を有する動物において調節され
ている、核酸およびポリペプチド、ならびにそれらを使用する方法に関する。

【０００２】 （関連出願） 本願は、１９９８年９月２８日出願の米国特許出願第０９／６１，９３９号（
本明細書中でその全体が参考として援用される）に対する優先権を主張する。

【０００３】 （発明の背景） ヒト代謝Ｘ症候群は、比較的一般的であるがほとんど理解されていない、複数
の発現を伴う障害である。代謝Ｘ症候群に罹患している個体は、例えば、高血圧
、インスリン抵抗性、脂肪代謝異常症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）および腹部
肥満を示し得る。

【０００４】 ヒト代謝Ｘ症候群の認識されたモデルは、自然発生高血圧ラット（ＳＨＲ）で
あり、このラットは、食塩誘導性(ｓａｌｔ−ｉｎｄｅｃｅｄ）高血圧、インス
リン抵抗性および増加した腹部脂肪により特徴付けられる。ＳＨＲの自然発生変
異体は、発作の傾向があるＳＨＲ（ＳＨＲ ｓｔｒｏｋｅ−ｐｒｏｎｅ）（ＳＨ
Ｒ−ＳＰ）と名付けられており、さらに、深刻な出血または虚血性発作を経験し
ている。ＳＨＲ動物における発作または代謝Ｘ症候群の、発現および潜伏期に影
響する遺伝子（単数または複数）は同定されていない。

【０００５】 （発明の要旨） 本発明は、コントロール動物と比較して、ＳＨＲ動物においてその発現が示差
的に調節されている遺伝子の組の同定に、部分的に基づいている。これらの遺伝
子は、以下を含む：（ｉ）ＣＤ３６（脂肪酸輸送タンパク質（ＦＡＴ）としても
また公知）；（ｉｉ）ナトリウム依存性グルコース共輸送体（ＳＧＬＴ２）；（
ｉｉｉ）アルドラーゼＡ；（ｉｖ）キヌレニンアミノトランスフェラーゼ；（ｖ
）α−心臓（ｃａｒｄｉａｃ）ミオシンおよび（ｖｉ）α−チューブリン；なら
びに（ｖｉ）心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）。これらの遺伝子は、本
明細書中でまとめて、「ＧＥＮＥ ＳＥＴ」と呼ばれる。本発明はまた、その発
現がＳＨＲ動物において変化しているいくつかの遺伝子が、コントロール動物中
のアナログ遺伝子産物と比較して変化した遺伝子産物をコードするという発見に
部分的に基づく。これらの遺伝子は、ＣＤ３６、ＳＬＧＴ２、アルドラーゼＡ、
キヌレニンアミノトランスフェラーゼ、およびＡＮＰを含む。

【０００６】 本発明は、疾患の診断剤および治療剤としての、ＧＥＮＥ ＳＥＴ中の遺伝子
の使用、またはこのＧＥＮＥ ＳＥＴ中の遺伝子の変異を開示する。

【０００７】 本発明は、高血圧、糖尿病（インスリン抵抗性）、肥満／脂肪代謝異常症およ
び発作（虚血性疾患）のような疾患の診断、予後、およびスクリーニング、なら
びに処置（予防処置および治療処置の両方）における使用のための、単離された
タンパク質、タンパク質誘導体、それらのアナログおよび変異体を開示する。

【０００８】 さらに、本明細書中で、ＧＥＮＥ ＳＥＴからの遺伝子を検出することによる
、診断、予後、およびスクリーニングの方法論が、開示される。診断、予後用お
よびスクリーニング用のキットもまた、提供される。

【０００９】 さらに、本発明はまた、高血圧、糖尿病、肥満、ならびに発作の潜伏期および
重篤度の両方に影響する、ＧＥＮＥ ＳＥＴ活性の調節因子についてスクリーニ
ングする方法を開示する。

【００１０】 （発明の詳細な説明） 本発明は、高血圧、肥満症、糖尿病および発作の一般的なラットモデルにおけ
る疾患状態とコントロール状態との間の、示差的発現および変異（すなわち、ア
ミノ酸残基置換を保有する）の両方が見出された６つの遺伝子全部を含む、ＧＥ
ＮＥ ＳＥＴを開示する。ＧＥＮＥ ＳＥＴ（本明細書中以後、「ＧＥＮＥ Ｓ
ＥＴ」）は、以下を含む：（ｉ）ＣＤ３６（脂肪酸輸送タンパク質（ＦＡＴ）と
しても公知）；（ｉｉ）ナトリウム依存性グルコース共輸送体（ＳＧＬＴ２）；
（ｉｉｉ）アルドラーゼＡ；（ｉｖ）キヌレニンアミノトランスフェラーゼ；（
ｖ）α−心臓ミオシンおよび（ｖｉ）α−チューブリン；ならびに心房性ナトリ
ウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）における以前に記載された変異。

【００１１】 ＳＨＲおよびＳＨＲ−ＳＰの表現型をもたらす主な遺伝子欠損を同定するため
に、本発明は、ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）技術（例えば、米国特許第
５，８７１，６９７号によって記載されるような）を利用して、遺伝的連鎖分析
に使用される動物の系統間で示差的に発現された遺伝子の大部分を同定する、包
括的な遺伝子発現分析を含んだ。ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）は、公知
の示差的に発現された遺伝子および新規な示差的な発現された遺伝子の両方を同
定するだけでなく、比較される様々な系統間の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）における
配列バリエーションを同定する。ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）によって
検出されるこれらのバリエーションとしては、挿入、欠失および単一塩基対変更
が挙げられ得るがこれらに限定されない。

【００１２】 従って、本発明は、前述のＧＥＮＥ ＳＥＴ（ならびにその誘導体、フラグメ
ントおよびホモログ）によってコードされるタンパク質の変異体およびそれらを
コードする核酸（ならびにその誘導体、フラグメントおよびホモログ）に関し、
これらは、発作、高血圧、糖尿病および肥満症への素因を増加させるように機能
する。

【００１３】 本発明は、発作、高血圧、糖尿病および肥満症についての診断、予後およびス
クリーニングの方法に関する。１つの実施態様において、被験体は、ＧＥＮＥ
ＳＥＴの変異対立遺伝子についてスクリーニングされる。別の実施態様において
、被験体がスクリーニングされて、ＧＥＮＥ ＳＥＴ由来のｍＲＮＡの発現が、
コントロール内のそれらの発現と比較して区別される。

【００１４】 本発明はまた、高血圧、糖尿病（インスリン抵抗性）、または肥満症（脂質代
謝異常）または発作の発症、またはその素因に影響を与える能力についてＧＥＮ
Ｅ ＳＥＴのメンバーをスクリーニングする方法、およびこれらの遺伝子のモジ
ュレーター（すなわち、アゴニスト、アンタゴニストおよびインヒビター）につ
いてスクリーニングする方法論に関する。

【００１５】 （（１）変異されたＧＥＮＥ ＳＥＴ） ＧＥＮＥ ＳＥＴから生成されたタンパク質、ならびにＧＥＮＥ ＳＥＴタン
パク質の誘導体、フラグメント、ホモログおよびアナログの変異体、ならびに変
異体、タンパク質誘導体およびタンパク質アナログをコードする核酸が、本発明
によって開示される。ＧＥＮＥ ＳＥＴ変異体は、野生型ＧＥＮＥ ＳＥＴタン
パク質のアミノ酸配列内の１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入を保
有するタンパク質であり得る。好ましくは、ＧＥＮＥ ＳＥＴ変異体は、抗ＧＥ
ＮＥ ＳＥＴ抗体に結合し得る。

【００１６】 本発明の別の実施態様において、ＧＥＮＥ ＳＥＴ変異体は、高塩食餌（例え
ば、限定しないが、１７．５％タンパク質、３．７ｍｇ／ｇ体重のＮａ^-、６．
３ｍｇ／ｋｇ体重のＫ^-、および０．０３ｍｇ／ｇ体重のメチオニンならびに１
％ＮａＣｌの飲料水の食餌）を与えられる発作の傾向があるラット（例えば、第
１染色体に位置する発作素因遺伝子座を保有するラット）における高血圧または
発作への潜伏期を増加させる。

【００１７】 ＧＥＮＥ ＳＥＴの誘導体またはアナログとしては、野生型ＧＥＮＥ ＳＥＴ
または変異体ＧＥＮＥ ＳＥＴ、あるいはそれらのフラグメントに実質的に相同
な領域を含む分子が挙げられるが、それらに限定されない。例えば、様々な実施
態様において、同一サイズのアミノ酸配列にわたって、またはその整列が当該分
野で公知のコンピューター相同性プログラムによって行われる整列化配列と比較
した場合、またはストリンジェント、中程度にストリンジェント、または非スト
リンジェント条件下でコードＧＥＮＥ ＳＥＴ配列にハイブリダイズし得る核酸
をコードするものに、少なくとも６０〜７０％の相同性、好ましくは７０〜８０
％の相同性、より好ましくは９０〜９５％の相同性および最も好ましくは９５％
以上の相同性である。

【００１８】 いくつかの実施態様において、単離されたタンパク質は、ＧＥＮＥ ＳＥＴの
メンバーであり、これは、図５Ａ〜Ｇに示したような、ＳＨＲまたはＳＨＲ−Ｓ
Ｐタンパク質における１つ以上のアミノ酸置換を含む。従って、本発明は、Ｌ６
３８Ｑ変異を有する単離されたタンパク質（例えば、アミノ酸配列モチーフＲＱ
Ｅを有する単離されたタンパク質、およびラットまたはヒトＳＧＬＴ２配列に対
して少なくとも６０〜７０％の相同性、好ましくは７０〜８０％の相同性、より
好ましくは９０〜９５％の相同性、および最も好ましくは９５％以上の相同性を
有する単離されたタンパク質）を含む。このタンパク質は、必要に応じて、図４
に示されるＲＱＥ配列に対応する領域に隣接する（すなわち、アミノ末端または
カルボキシ末端において）、１、２、３、４、もしくは５、またはそれ以上のさ
らなるアミノ酸を含み得る。従って、このタンパク質は、必要に応じて、例えば
、アミノ酸ＲＲＱＥ、ＲＱＥＤ、ＲＲＱＥＤ、ＴＲＲＱＥＤ、ＲＲＱＥＤＩなど
を含み得る。

【００１９】 ラットまたはヒトのキヌレニンアミノトランスフェラーゼ配列に対して少なく
とも６０〜７０％の相同性、好ましくは７０〜８０％の相同性、より好ましくは
９０〜９５％の相同性、および最も好ましくは９５％以上の相同性を有する単離
されたタンパク質、および図４Ｅに示されるような、アミノ酸配列置換Ｅ２７Ｇ
を含む単離されたタンパク質もまた含まれる。

【００２０】 本発明はさらに、アミノ酸配列ＩＶＥを含む単離されたタンパク質およびラッ
トまたはヒトのアルドラーゼＡ配列に対して少なくとも６０〜７０％の相同性、
好ましくは７０〜８０％の相同性、より好ましくは９０〜９５％の相同性、およ
び最も好ましくは９５％以上の相同性を有する単離されたタンパク質を含む。こ
のタンパク質は必要に応じて、図４に示されるように、ＩＶＥ配列のアミノまた
はカルボキシ末端においてラットまたはヒトのアルドラーゼ配列由来の１、２、
３、４、もしくは５、またはそれ以上のさらなるアミノ酸を含み得る。

【００２１】 ２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の相同性％を決定するために、この
配列は、最適な比較目的について整列される（例えば、ギャップが、第２のアミ
ノ酸配列または核酸配列との最適整列のために、第１のアミノ酸または核酸配列
の配列において導入され得る）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオ
チド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列におけ
る位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオ
チドによって占有される場合、この分子は、その位置で相同である（すなわち、
本明細書中で使用されるように、アミノ酸または核酸「相同性」は、アミノ酸ま
たは核酸「同一性」と等価である。この相同性は、当該分野で公知のコンピュー
タープログラム（例えば、ＧＣＧプログラムパッケージにおいて提供されるＧＡ
Ｐソフトウェア）を使用して決定され得る。ＮｅｅｄｌｅｍｅｎおよびＷｕｎｓ
ｃｈ １９７０ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８：４４３−４５３を参照のこと。
核酸配列比較について以下の設定を用いてＧＣＧ ＧＡＰソフトウェアを使用す
る：５．０のＧＡＰ作成ペナルティーおよび０．３のＧＡＰ伸長ペナルティー、
上記に参照される類似の核酸配列のコード領域は、少なくとも７０％、７５％、
８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の好ましい同一性の程
度を示す。

【００２２】 用語「配列同一性」とは、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が
、比較の特定の領域にわたって残基ごとの基準で同一である程度をいう。用語「
配列同一性の割合」は、比較の領域にわたって２つの最適に整列された配列を比
較し、同一の核酸塩基（例えば、核酸の場合、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）
またはアミノ酸が両方の配列において生じて一致した位置の数を決定し、一致し
た位置の数を比較の領域における位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で
除算し、そして結果を１００倍して配列同一性の割合を生成することによって計
算される。用語「実質的に同一」とは、本明細書中で使用される場合、ポリヌク
レオチドまたはポリペプチド配列の特徴を示し、ここでこのポリペプチドまたは
ポリヌクレオチドは、比較領域にわたる参照配列と比較して、少なくとも８０％
配列同一性、好ましくは少なくとも８５％配列同一性、およびしばしば９０〜９
５％配列同一性、より通常には少なくとも９９％配列同一性を有する配列を含む
。

【００２３】 アミノ酸配列モチーフＲＳＩを有する単離されたタンパク質、およびラットま
たはヒトのαチューブリン配列に対して少なくとも６０〜７０％の相同性、好ま
しくは７０〜８０％の相同性、より好ましくは９０〜９５％の相同性、および最
も好ましくは９５％以上の相同性を有する単離されたタンパク質もまた含まれる
。このタンパク質は必要に応じて、図４に示されるように、ＲＳＩ配列のアミノ
またはカルボキシ末端においてラットまたはヒトのアルドラーゼ配列由来の１、
２、３、４、もしくは５、またはそれ以上のさらなるアミノ酸を含み得る。本発
明はまた、Ｓ３４０Ｔアミノ酸置換を有するαチューブリンを含む。

【００２４】 本発明のＧＥＮＥ ＳＥＴ、ならびにＧＥＮＥ ＳＥＴのフラグメント、誘導
体、ホモログおよびアナログは、当該分野で公知の様々な方法によって生成され
得る。それらの生成を生じる操作は、遺伝子またはタンパク質レベルで生じ得る
。例えば、クローン化されたＧＥＮＥ ＳＥＴ遺伝子配列は、当該分野で公知の
多数のストラテジーのいずれかによって改変され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら、１９９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）
を参照のこと。目的の配列は、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）を用いて適切な
部位で切断され、続いてさらなる酵素的改変をされ（必要ならば）、単離され、
そしてインビトロで連結され得る。変異体をコードする遺伝子の生成において、
ＧＥＮＥ ＳＥＴの誘導体またはアナログは、注意深く、改変された遺伝子がＧ
ＥＮＥ ＳＥＴと同じ翻訳読み枠内に残り、そして所望のＧＥＮＥ ＳＥＴ活性
がコードされるエキソン領域内の翻訳終止シグナルによって中断されないことを
確実にするべきである。

【００２５】 ＧＥＮＥ ＳＥＴコード核酸配列は、インビボまたはインビトロで変異されて
、コード領域内の変化（例えば、アミノ酸置換、付加または欠失）が生成され得
、ならびに翻訳、開始および／もしくは終止配列を作製および／もしくは破壊さ
れ得るか、あるいは新たな制限エンドヌクレアーゼ部位を形成し得るかまたは既
存のもの破壊して、インビトロでの改変をさらに容易にし得る。当該分野で公知
の変異誘発のための任意の技術が利用され得る。この技術としては、化学変異誘
発；インビトロ部位特異的変異誘発（例えば、Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら、１９７
８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：６５５１を参照のこと）；ＴＡＢ７（登
録商標）リンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用などが挙げられるが、これらに
限定されない。

【００２６】 ＧＥＮＥ ＳＥＴ配列の操作はまた、タンパク質レベルで行われ得る。本発明
の範囲内には、翻訳の間または後に示差的に改変される（例えば、グリコシル化
、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロック基による誘導体化、
タンパク質切断、抗体分子または他の細胞リガンドへの連結などによって）ＧＥ
ＮＥ ＳＥＴタンパク質フラグメントまたは他の誘導体もしくはアナログが含ま
れる。任意の多数の化学的改変が公知の技術によって行われ得、この技術として
は、以下が挙げられるがこれらに限定されない：臭化シアン、トリプシン、キモ
トリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨによる特異的化学切断；ア
セチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下における代謝合成
など。特に、本発明の範囲内には、ＧＥＮＥ ＳＥＴのレベルまたは活性を減少
する改変が含まれる。

【００２７】 さらに、変異体ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質（またはそのアナログおよび誘導
体）（これは、インビボまたはインビトロで所望の活性を媒介する）は、ペプチ
ド合成機の使用によって合成され得る。さらに、所望であれば、非伝統的なアミ
ノ酸または化学アミノ酸アナログが、ＧＥＮＥ ＳＥＴ配列に置換または付加と
して導入され得る。非伝統的なアミノ酸としては、以下が挙げられるがこれらに
限定されない：一般的なアミノ酸のＤ−アイソマー、αアミノイソ酪酸、４−ア
ミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキ
サン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、
ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、シ
ステイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シ
クロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナー（ｄｅｓ
ｉｇｎｅｒ）アミノ酸（例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、
Ｎα−メチルアミノ酸）、および一般的なアミノ酸アナログ。さらに、アミノ酸
は、Ｄ型（右旋性）またはＬ型（左旋性）アイソマーのいずれかであり得る。

【００２８】 本発明の別の実施態様において、ＧＥＮＥ ＳＥＴ誘導体は、キメラまたは融
合タンパク質であり、ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質またはそのフラグメント（好
ましくは、ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質または変異体ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク
質の少なくとも１０アミノ酸からなる）を含み、これは、異なるタンパク質のア
ミノ酸配列へのペプチド結合を介してアミノ末端またはカルボキシル末端にて結
合される。１つの実施態様において、このようなキメラタンパク質は、タンパク
質をコードする核酸（すなわち、異なるタンパク質についてのコード配列にイン
フレームで結合したＧＥＮＥ ＳＥＴコード配列を含む）の組換え発現によって
生成される。このようなキメラ産物は、所望のアミノ酸配列をコードする適切な
核酸配列を、互いに、当該分野で公知の方法によって適切なコードフレームに連
結し、そして当該分野で一般的に公知の方法によってキメラ産物を発現させるこ
とにより、作製され得る。あるいは、このようなキメラ産物は、タンパク質合成
技術によって作製され得る（例えば、ペプチド合成機の使用によって）。野生型
ＧＥＮＥ ＳＥＴまたは任意の異種タンパク質コード配列に融合された変異体Ｇ
ＥＮＥ ＳＥＴの部分を含むキメラ遺伝子が構築され得る。本発明の特定の実施
態様は、少なくとも６アミノ酸のＧＥＮＥ ＳＥＴまたは変異体ＧＥＮＥ ＳＥ
Ｔのフラグメントを含むキメラタンパク質を開示する。

【００２９】 さらに、ヌクレオチドコード配列の縮重に起因して、本発明の変異体ＧＥＮＥ ＳＥＴと同じアミノ酸配列を実質的にコードする他のＤＮＡ配列が、本発明の
実施において利用され得る。変異体ＧＥＮＥ ＳＥＴに固有である遺伝子は、所
望のアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によってＧＥＮＥ ＳＥＴ遺伝子
のすべてまたは一部を含むヌクレオチド配列の変更によって得られ得る。例えば
、配列内の１つ以上のアミノ酸残基は、機能的等価物として作用する類似の極性
の別のアミノ酸によって置換され得、「サイレント変更（ｓｉｌｅｎｔ ａｌｔ
ｅｒａｔｉｏｎ）を生じる。配列内のアミノ酸についての置換は、アミノ酸が属
するクラスの他のメンバーから選択され得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ
酸としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：アラニン、ロイシン、
イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメ
チオニン。極性中性アミノ酸としては、以下が挙げられるがこれらに限定されな
い：グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、お
よびグルタミン。正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジ
ン、およびヒスチジンが挙げられるがこれらに限定されない。負に荷電した（酸
性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられるがこれ
らに限定されない。

【００３０】 さらに、本発明は、変異体ＧＥＮＥ ＳＥＴ分子を開示し、これは、変異体Ｇ
ＥＮＥ ＳＥＴ分子についての前述の変異を含む。

【００３１】 （（２）ＧＥＮＥ ＳＥＴの核酸配列およびタンパク質） ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質および核酸は、当該分野で公知の任意の方法論に
よって得られ得る。特に、ヒト、ラット、ハムスター、イヌ、マウス、ウシ、ブ
タ、ウマ、ホシザメ（ｄｏｇｆｉｓｈ）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏ
ｇａｓｔｅｒおよびＸｅｎｏｐｕｓについてのＧＥＮＥ ＳＥＴアミノ酸および
ヌクレオチド配列は、公のデーターベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）において
利用可能である。

【００３２】 任意の真核生物細胞は、潜在的に、ＧＥＮＥ ＳＥＴ核酸の単離のための核酸
供給源として働き得る。ＧＥＮＥ ＳＥＴの核酸配列は、脊椎動物、哺乳動物、
ヒト、ブタ、ウシ、ネコ、トリ、ウマ、イヌ、霊長類などの供給源から単離され
得る。そのＤＮＡは、クローニングされたＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ「ライブラリ
ー」）から当該分野で公知の標準的なプロトコルによって、化学合成によって、
ｃＤＮＡクローニングによって、または所望の細胞から精製されたゲノムＤＮＡ
（またはそのフラグメント）のクローニングによって、得られ得る。例えば、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら、１９９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂ
ｏｒ，ＮＹ）；Ｇｌｏｖｅｒ，１９８５、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａ
ｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＭＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒ
ｄ，Ｕ．Ｋ．）を参照のこと。ゲノムＤＮＡに由来するクローンは、コードエキ
ソン領域に加えて、調節および非コードイントロンＤＮＡ領域を含み得る；一方
、ｃＤＮＡに由来するクローンは、コードエキソン配列のみを含む。単離の後、
次いで、目的の配列は、増殖のための適切なベクターに分子的にクローニングさ
れる。

【００３３】 相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）からの遺伝子の分子クローニングにおいて、このｃＤ
ＮＡは、総細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）^-ｍＲＮＡから、当該分野で周知の方法
による逆転写によって合成される。目的の遺伝子はまた、ゲノムＤＮＡから得ら
れ得、ここでランダムＤＮＡフラグメントが生成される（例えば、制限エンドヌ
クレアーゼの使用または機械的剪断によって）。そのうちのいくつかは、所望の
配列をコードする。次いで、線状ＤＮＡフラグメントは、標準的な技術によって
、それらのサイズの関数として分離され得る。標準的な技術としては、アガロー
スおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動ならびにカラムクロマトグラフィーが
挙げられるがこれらに限定されない。

【００３４】 一旦、ＤＮＡフラグメントが生成されると、ＧＥＮＥ ＳＥＴ遺伝子のすべて
または一部を含む特定のＤＮＡフラグメントの同定は、多数の方法によって達成
され得る。本発明の好ましい実施態様において、ＧＥＮＥ ＳＥＴ遺伝子は、ゲ
ノムまたはｃＤＮＡライブラリー内の所望のＧＥＮＥ ＳＥＴ配列を増幅するた
めに利用され得るポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用によって単離されるか
、あるいは、ライブラリーに組み込まれていないゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡか
ら直接単離される。次いで、合成オリゴヌクレオチドは、潜在的な目的のＲＮＡ
またはＤＮＡ供給源、好ましくはｃＤＮＡライブラリーからの配列のＰＣＲ媒介
増幅におけるプライマーとして利用され得る。さらに、いくつかの異なる縮重プ
ライマーが、ＰＣＲ増幅反応における使用のために合成され得る。ＰＣＲ増幅反
応は、例えば、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ（登録商標）Ｔｈｅｒｍ
ａｌ ＣｙｃｌｅｒおよびＴａｑポリメラーゼ（Ｇｅｎｅ ＡｍｐＪ）の使用に
よって行われ得る。

【００３５】 ＰＣＲ増幅反応の開始の間に利用されるハイブリダイゼーション条件のストリ
ンジェンシーを変動させて、公知のＧＥＮＥ ＳＥＴヌクレオチド配列と単離さ
れたＧＥＮＥ ＳＥＴホモログの核酸との間のより高いかまたはより低い程度の
ヌクレオチド配列類似性を許容することもまた可能である。交叉種ハイブリダイ
ゼーションについて、低いストリンジェンシー条件が好ましい。同種ハイブリダ
イゼーションについて、中程度のストリンジェント条件が好ましい。ＧＥＮＥ
ＳＥＴホモログのフラグメントまたはセグメントの首尾良い増幅後、そのセグメ
ントは分子的にクローニングされ、配列決定され、そしてプローブとして利用さ
れて、完全ｃＤＮＡまたはゲノムクローンが単離され得る。次に、これは、遺伝
子の完全ヌクレオチド配列のその後の決定および単離を可能にする。あるいは、
ＰＣＲ増幅もまた使用されて、ＧＥＮＥ ＳＥＴ ｍＲＮＡレベルが検出および
定量され得る。

【００３６】 さらに、ＧＥＮＥ ＳＥＴ遺伝子またはその関連ｍＲＮＡ（またはそのフラグ
メント）の一部が精製され得るか、またはオリゴヌクレオチドが合成され得、そ
して生成されたＤＮＡフラグメントは、標識されたプローブへの核酸ハイブリダ
イゼーションによって分析され得る。例えば、ＢｅｎｔｏｎおよびＤａｖｉｓ、
１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８０；ＧｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＨｏｇ
ｎｅｓｓ，１９７５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７
２：３９６１を参照のこと。これらのＤＮＡフラグメントは、標識されたオリゴ
ヌクレオチドプローブに対する実質的な相同性を保有し、ハイブリダイズする。
ＧＥＮＥ ＳＥＴ核酸はまた、例えば、選択のための抗ＧＥＮＥ ＳＥＴ抗体を
使用する発現クローニングによって同定および単離され得る。クローニングまた
は増幅によってＧＥＮＥ ＳＥＴ ＤＮＡを得るための代替法としては、以下が
挙げられるがこれらに限定されない：公知のＧＥＮＥ ＳＥＴ配列から遺伝子配
列自体を化学的に合成する方法、または目的のＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質をコ
ードするｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する方法。他の方法論の使用が可能であり
、そして本発明の範囲内であることに留意すべきである。

【００３７】 一旦クローンが得られると、その同一性は、核酸配列決定および公知のＧＥＮ
Ｅ ＳＥＴ配列とのコンピューターデータベース媒介比較によって確認され得る
。ＤＮＡ配列分析は、当該分野で公知の任意の技術によって行われ得、この技術
としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：化学ベースの配列決定（
ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ，１９８０、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５
：４９９−５６０を参照のこと）；酵素的ジデオキシヌクレオチド鎖終結配列決
定（Ｓａｎｇｅｒら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．７４：５４６３を参照のこと）；Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ配列決定（
ＴｏａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、米国特許第４，７９５，６９９号を
参照のこと）；自動化ＤＮＡシーケンサー（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）またはＰＣＴ公開ＷＯ９７／１
５６９０に記載される配列決定方法論。

【００３８】 ＧＥＮＥ ＳＥＴ核酸にハイブリダイズ可能な（例えば、配列番号１、６、１
０〜１１、１４〜１５、１８〜１９、２６〜２７、３２〜３３、または３７をコ
ードする核酸に相同または相補的なヌクレオチド配列を保有する）核酸、または
その誘導体もしくはアナログは、低、中または高ストリンジェンシーの条件下で
の核酸ハイブリダイゼーションによって単離され得る。例示のために、限定はし
ないが、このような低ストリンジェンシーの条件を使用する手順は以下のとおり
である（例えば、ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ，１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：６７８９−６７９２もまた参照のこ
と）：固定化ＤＮＡを含むフィルターを、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＰＶＰ
、０．１％ Ｆｉｃｏｌｌ、１％ ＢＳＡ、および５００μ／ｍｌの変性サケ精
子ＤＮＡを含有する溶液中で、４０℃にて６時間プレハイブリダイズした。ハイ
ブリダイゼーションを、以下の改変を伴う同じ溶液で行った：０．０２％ ＰＶ
Ｐ、０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌサケ精子
ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）硫酸デキストランおよび５〜２０×１０⁶ｃｐ
ｍ ³²Ｐ標識プローブを利用した。このフィルターを、ハイブリダイゼーション
混合物中で４０℃にて１８〜２０時間インキュベートし、次いで、２×ＳＳＣ、
２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１％
ＳＤＳを含有する溶液中で、５５℃にて１．５時間洗浄した。次いで、この洗
浄溶液を新鮮な溶液と置き換え、そしてこのフィルターを、６０℃にてさらに１
．５時間再インキュベートした。このフィルターをブロット乾燥（ｂｌｏｔｔｅ
ｄ ｄｒｙ）し、そしてオートラジオグラフにかけた。必要ならば、フィルター
を第３の時間６５〜６８℃にて洗浄し、そしてＸ線フィルムに再暴露した。当該
分野で周知の低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションの様々な他の条件が
、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションプロトコルに利用され得る（例
えば、交叉種ハイブリダイゼーションのために使用されるように）。

【００３９】 例示のために、限定しないが、中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション
の条件を利用する手順は、以下のとおりである：固定したＤＮＡを含むフィルタ
ーを、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％ ＳＤＳおよび１００
μｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で、５５℃にて６時間プレハ
イブリダイズした。ハイブリダイゼーションを同じ溶液中で行い、そして５〜２
０×１０⁶ｃｐｍ ³²Ｐ標識プローブを利用した。このフィルターを、ハイブリ
ダイゼーション混合物中で、５５℃にて１８〜２０時間インキュベートし、次い
で、１×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳを含有する溶液中で６０℃にて３０分間
２回洗浄した。次いで、フィルターをブロット乾燥し、そしてオートラジオグラ
フにかけた。利用され得る中ストリンジェンシー条件の他の条件は、当該分野で
周知である。

【００４０】 再度、例示のために、限定しないが、高ストリンジェンシーハイブリダイゼー
ションの条件を利用する手順は、以下のとおりであった：固定化ＤＮＡを含むフ
ィルターのプレハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ ＰＶＰ、０．０２％
Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ ＢＳＡ、および５００μ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮ
Ａからなる緩衝液中で、６５℃にて８時間〜一晩行った。フィルターを、１００
μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡおよび５〜２０×１０⁶ｃｐｍ ³²Ｐ標識プローブを
含有するプレハイブリダイゼーション混合物中で６５℃にて４８時間ハイブリダ
イズした。フィルターの洗浄を、２×ＳＳＣ、０．０１％ ＰＶＰ、０．０１％
Ｆｉｃｏｌｌおよび０．０１％ ＢＳＡを含有する溶液中で、３７℃にて１時
間行った。続いて、これを、オートラジオグラフィーの前に、０．１×ＳＳＣ中
で５０℃にて４５分間洗浄した。使用され得る高ストリンジェンシーハイブリダ
イゼーションの他の条件が、当該分野で周知である。

【００４１】 変異体ＧＥＮＥ ＳＥＴ対立遺伝子およびＧＥＮＥ ＳＥＴ遺伝子発現を検出
するために利用され得る、ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質の誘導体およびアナログ
をコードする核酸、ＧＥＮＥ ＳＥＴアンチセンス核酸およびプライマーが、本
発明により開示される。本明細書中で使用される場合、「ＧＥＮＥ ＳＥＴタン
パク質のフラグメントまたは部分をコードする核酸」とは、ＧＥＮＥ ＳＥＴタ
ンパク質の列挙されたフラグメントまたは部分のみを言い、連続配列としてＧＥ
ＮＥ ＳＥＴタンパク質の他の近接する部分をいうのではない。

【００４２】 ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質のＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質（ならびにその誘
導体、アナログおよびフラグメント）は、当該分野内で公知の任意の方法（組換
え体発現方法、天然の供給源からの精製、化学合成などが挙げられるが、これら
に限定されない）により得られ得る。例えば、ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質は、
組換えタンパク質発現技術により得られ得、ここで、ＧＥＮＥ ＳＥＴ遺伝子ま
たはその一部が、特定の宿主細胞内で発現させるために適切なクローニングベク
ターへ挿入される。当該分野で公知の多数のベクター宿主系が使用され得る。可
能なベクターには以下が挙げられるが、これらに限定されない；バクテリオファ
ージ（例えば、λ誘導体）；プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣプラス
ミド誘導体またはｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））
または他の当該分野において周知のベクター。目的のＤＮＡフラグメントのクロ
ーニングベクターへの挿入は、例えば、そのフラグメントをクローニングベクタ
ーに連結させることにより達成され得、そのクローニングベクターは相補的結合
性末端を有する。しかし、ＤＮＡをフラグメント化するために使用される相補的
制限部位が、そのクローニングベクター内に存在しない場合、そのＤＮＡ分子の
末端は、酵素学的に改変され得る。あるいは、所望される任意の部位が、ＤＮＡ
末端にヌクレオチド配列（例えば、リンカー）を連結させることにより産生され
得、これらの連結されたリンカーは、化学的に合成された特定のオリゴヌクレオ
チドを含み得、そのオリゴヌクレオチドは制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコ
ードする。代替的な方法論において、消化されたベクターおよびＧＥＮＥ ＳＥ
Ｔ遺伝子は、ホモポリマーテーリング（ｔａｉｌｉｎｇ）により改変され得る。
その組換え分子は、続いて、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクト
ロポレーションなどを介して宿主細胞に導入され得、多数の目的ＧＥＮＥ ＳＥ
Ｔ遺伝子配列のコピーを産生を促進する。

【００４３】 代替的方法論において、「ショットガン」アプローチにおける適切なクローニ
ングベクターへの挿入後、所望される遺伝子が同定、および単離され得る。例え
ば、サイズ分別による所望される遺伝子の濃縮が、クローニングベクターへの挿
入前に、実行され得る。

【００４４】 本発明の特定の実施態様において、単離されたＧＥＮＥ ＳＥＴ遺伝子、ｃＤ
ＮＡ、または合成されたＤＮＡ配列を組み込む組換えＤＮＡ分子を用いる宿主細
胞の形質転換は、その遺伝子の複数のコピーの産生を促進する。従って、この遺
伝子は、形質転換体を増殖させることにより大量に得られ得、その組換えＤＮＡ
分子をその形質転換体より単離し、そして必要である場合、その挿入された遺伝
子を単離された組換えＤＮＡより回収する。

【００４５】 ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質（またはその機能的に活性なアナログ、フラグメ
ントまたは他の誘導体）をコードするこのヌクレオチド配列は、適切な発現ベク
ター（すなわち、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳のために必
要なエレメントを含むベクター）に挿入され得る。あるいは、必要な転写シグナ
ルおよび翻訳シグナルもまた、ネイティブなＧＥＮＥ ＳＥＴ遺伝子および／ま
たはその隣接領域により供給され得る。種々の宿主ベクター系を利用して、タン
パク質コード配列を発現し、それらの種々の宿主ベクター系には以下が挙げられ
るが、それらに限定されない；ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノ
ウイルスなど）に感染した哺乳動物細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイル
ス）に感染した昆虫細胞系；酵母ベクター含有酵母または、バクテリオファージ
、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡあるいはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌のよ
うな微生物。ベクターの発現エレメントはその強度および特異性で変動する。利
用される宿主ベクター系に依存して、多くの適切な転写エレメントおよび翻訳エ
レメントの任意の一つが、本発明の実施において使用され得る。

【００４６】 ベクターへのＤＮＡフラグメントの挿入のための前述された任意の方法論を使
用し、適切な転写／翻訳制御シグナルおよびタンパク質コード配列からなるキメ
ラ遺伝子を含む発現ベクターを構築し得る。これらの方法は、インビトロ組換え
ＤＮＡおよび合成技術ならびにインビボ組換え体（すなわち、遺伝子組換え）を
含み得る。ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質またはペプチドフラグメントをコードす
る核酸配列の発現は、第二の核酸配列により調節され得、そのため、ＧＥＮＥ
ＳＥＴタンパク質またはペプチドが、組換えＤＮＡ分子を用いて形質転換された
宿主細胞内で発現される。例えば、ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質の発現は、当該
分野において公知の任意のプロモーター／エンハンサーエレメントにより制御さ
れ得、それらのエレメントには以下が挙げられるが、それらに限定されない；（
ｉ）ＳＶ４０初期プロモーター領域（例えば、Ｂｅｒｎｏｉｓｔ＆Ｃｈａｍｂｏ
ｎ．１９８１．Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０を参照のこと）；（ｉｉ
）ラウス肉腫ウイルスの３’末端の長末端反復配列（ＬＴＰ）に含まれるプロモ
ーター（例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０．Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７
９７を参照のこと）；（ｉｉｉ）ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモータ
ー（例えば、Ｗａｎｇｅｒら、１９８１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ７８：１４４１−１４４５を参照のこと）；（ｉｖ）メタロチオネ
イン遺伝子の調節配列（例えば、Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２．Ｎａｔｕｒｅ
２９６：３９−４２）；（ｖ）βラクタマーゼプロモーター（例えば、Ｖｉｌ
ｌａＫａｍａｒｏｆｆら、１９７８．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ７５：３７２７−３７３１を参照のこと）またはｔａｃプロモーター（
例えば、ＤｅＢｏｅｒら、１９８３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ．８０：２１−２５を参照のこと）のような原核生物の発現ベクター。さ
らに、以下の動物転写制御領域（組織特異性を示す）は、トランスジェニック動
物において利用されており、その制御領域には以下が挙げられる；（ｉ）膵臓腺
房細胞において活性であるエラスタラーゼＩ遺伝子制御領域（例えば、Ｓｗｉｆ
ｔら、１９８４．Ｃｅｌｌ ３８：６３９−６４６を参照のこと）；（ｉｉ）膵
臓β細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域（例えば、Ｈａｎａｈａ
ｎ、１９８５．Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−１２２を参照のこと）；（ｉｉ
ｉ）リンパ球において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（例えば、Ｇｒ
ｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４．Ｃｅｌｌ ３８：６４７−６５８を参照のこと
；（ｉｖ）肝臓において活性であるα−１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（
例えば、Ｋｅｌｓｅｙら、１９８７．Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１
６１−１７１を参照のこと）および骨髄性細胞において活性であるβグロビン遺
伝子制御領域（例えば、Ｍｏｇｒａｍら、１９８５．Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３
３８−３４０を参照のこと）。

【００４７】 本発明の特定の実施態様において、ＧＥＮＥ ＳＥＴをコードする核酸に作動
可能に連結されるプロモーター、1つ以上の複製起点および、必要に応じて、1つ
以上の選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を含むベクターが使
用され得る。別の特定の実施態様において、発現構築物は各３つのｐＧＥＸベク
ター（すなわち、グルタチオンＳトランスフェラーゼ発現ベクター：Ｓｍｉｔｈ
＆Ｊｏｈｎｓｏｎ、１９８８．Ｇｅｎｅ ７：３１−４０）のＥｃｏＲＩ制限部
位にＧＥＮＥ ＳＥＴをコードする配列をサブクローニングすることにより産生
され、従って、正確なリーディングフレームでのＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質産
物の発現を可能にする。

【００４８】 ＧＥＮＥ ＳＥＴ遺伝子インサートを含む発現ベクターが、３つの一般的なア
プローチを使用して同定され得、そのアプローチには以下が挙げられる；（ｉ）
核酸ハイブリダイゼーション；（ｉｉ）「マーカー」遺伝子機能の存在または非
存在および（ｉｉｉ）挿入されたヌクレオチド配列の発現。第１のアプローチに
おいて、発現ベクターに挿入されたＧＥＮＥ ＳＥＴ遺伝子の存在は、上述の挿
入されたＧＥＮＥ ＳＥＴ遺伝子に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドプロ
ーブを使用する、核酸ハイブリダイゼーションにより検出される。第２のアプロ
ーチにおいて、組換えベクター／宿主系が、特定の「マーカー」遺伝子機能（例
えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転換表現型、バキュ
ロウイルスにおける閉塞体（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）形成など）の存在
または非存在に基づいて同定され、そして選択されるが、これらの機能は目的の
ＧＥＮＥ ＳＥＴ遺伝子をそのベクターに挿入することにより引き起こされる。
特に、ＧＥＮＥ ＳＥＴ遺伝子が、ベクターのマーカー遺伝子配列に挿入される
場合、ＧＥＮＥ ＳＥＴインサートを所有する組換え種は、マーカー遺伝子機能
の非存在によって同定され得る。第３のアプローチにおいて、組換え発現ベクタ
ーは、組換え体により発現されるＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質産物をアッセイす
ることにより同定される。例えば、このようなアッセイは、種々のインビトロア
ッセイ系においてＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質の物理的または機能的特性に基づ
かれ得る（例えば、抗ＧＥＮＥ−ＳＥＴタンパク質抗体の結合）。

【００４９】 目的の組換えＤＮＡ分子の単離および同定後、当該分野において周知のいくつ
かの方法論が、その増殖のために使用され得る。一旦、適切な宿主系および増殖
条件が確立されると、その組換え発現ベクターは増殖され、大量調製され得る。
以前に開示されるように、利用され得る発現ベクターには、以下のベクターおよ
びその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない；ヒトまたは動物ウイルス
（例えば、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルス）；昆虫ウイルス（例えば
、バキュロウイルス）；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、
λ）およびプラスミドならびにコスミドＤＮＡベクター；など。

【００５０】 同様に、挿入された配列の発現を調節するか、あるいは、特定の所望される様
式においてその遺伝子産物を改変およびプロセスする、宿主細胞株が選択され得
る。特定のプロモーターからの発現が、誘導物質の存在により増大され得；それ
ゆえ、組換えＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質の発現が制御され得る。さらに、異な
る宿主細胞は、翻訳および翻訳後のプロセシングおよび改変（例えば、タンパク
質のグリコシル化、リン酸化）に対する特徴および／または特定の機構を所有す
る。従って、適切な細胞株または宿主系が選択され、所望される改変を保証し、
そして組換えタンパク質のプロセシングが達成される。例えば、細菌系における
この組換えタンパク質の発現を使用して、非グリコシル化コアタンパク質産物を
産生し得るが、酵母における発現は、グリコシル化タンパク質産物を産生する。
同様に、哺乳動物細胞における発現を利用して、異種タンパク質の「野生型」グ
リコシル化を保証する。

【００５１】 本発明の他の特定の実施態様において、ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質（または
フラグメント、アナログ、または誘導体）が、融合タンパク質産物またはキメラ
タンパク質産物（ペプチド結合を介して異なるタンパク質の異種タンパク質配列
に結合されるタンパク質、フラグメント、アナログ、または誘導体を含む）とし
て発現され得る。これらのキメラ産物は、適切なリーディングフレームにおいて
、当該分野において公知の方法によって、所望されるアミノ酸配列をコードする
適切な核酸配列の互いの連結により産生され得、適切なコーディングフレームに
おいて、当該分野において一般的に公知の方法によりそのキメラ産物を発現する
。あるいは、そのようなキメラ産物は、タンパク質合成技術により作製され得る
（例えば、ペプチド合成器の使用により）ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ配列の両
方のクローニングおよびその後の発現は、本発明の範囲内であることを留意すべ
きである。

【００５２】 本発明の組換えＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質はまた、標準的な方法により単離
そして精製され得、その方法には以下が挙げられる；クロマトグラフィー（例え
ば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、およ
び分配カラムクロマトグラフィー）；遠心分離；示差的溶解度またはタンパク質
の精製のための他の標準的技術。代替的実施態様において、ネイティブなＧＥＮ
Ｅ ＳＥＴタンパク質が、上記のような標準的な方法（例えば、免疫親和性精製
）を利用して、天然の供給源より精製され得る。別の実施態様において、ＧＥＮ
Ｅ ＳＥＴタンパク質は、当該分野において公知の標準的な合成方法により合成
され得る（例えば、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら、１９８４．Ｎａｔｕｒｅ ３１
０：１０５−１１１を参照のこと）。ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質の機能的特性
は、任意の適切なアッセイを使用して評価され得る。

【００５３】 （（３）処置の方法） 本発明は、治療化合物（本明細書中以後、「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」と称
す）の投与による、虚血性および代謝性の疾患および障害を処置ならびに予防す
る方法論を開示する。1つに実施態様において、このような「Ｔｈｅｒａｐｅｕ
ｔｉｃｓ」には、ＧＥＮＥ ＳＥＴ変異タンパク質（およびその誘導体、フラグ
メントおよびアナログ）ならびに変異ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質（およびその
誘導体、フラグメントまたはアナログ）をコードする核酸が挙げられる。

【００５４】 別の実施態様において、このタンパク質産物はまた（これはＧＥＮＥ ＳＥＴ
に対する常在性酵素の活性の減少という直接の結果として産生されない）、本発
明のＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓとして利用され得る。例として、これに限定され
ないが、キヌレニンアミノトランスフェラーゼ酵素における変異（すなわち、ア
ミノ酸置換）は、おそらくキヌレニン酸、（抗高血圧剤として機能し得る小さい
、水溶性分子）を産生する酵素の能力ををブロックする。

【００５５】 別の実施態様において、このＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃは、変異ＧＥＮＥ ＳＥ
Ｔタンパク質であり、これは「野生型」ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質に関連する
1つ以上のアミノ酸残基置換を有する。

【００５６】 このＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃが投与される被験体は、このましくは動物であり
、その動物には例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどが挙げら
れるが、これらに限定されず、そして、好ましくは、哺乳動物である。好ましい
実施態様において、この被験体はヒトである。

【００５７】 一般的に、その種起源または種反応性（抗体の場合において）が被験体の種起
源または種反応性と同じ種である産物の投与が好ましい。従って、好ましい実施
態様において、ヒト変異ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質または核酸（またはその誘
導体、フラグメント、またはアナログ）は、治療的または予防的にヒト患者に投
与される。

【００５８】 従って、本発明の特定の実施態様において、ＧＥＮＥ ＳＥＴアンタゴニスト
およびインヒビター（抗ＧＥＮＥ ＳＥＴ抗体およびＧＥＮＥ ＳＥＴアンチセ
ンス核酸およびＧＥＮＥ ＳＥＴ誘導体（例えば、これはＧＥＮＥ ＳＥＴの競
合的インヒビターとして機能する）が挙げられるが、これらに限定されない）を
投与し、発作または虚血性疾患、高血圧、糖尿病または肥満症を処置または予防
する。

【００５９】 （ａ）遺伝子治療 本発明の特定の実施態様において、ＧＥＮＥ ＳＥＴ変異タンパク質（または
その誘導体）またはＧＥＮＥ ＳＥＴアンチセンス核酸をコードする配列を含む
核酸を、遺伝子治療の方法により投与する。遺伝子治療とは、被験体への核酸の
投与により実施される治療を言う。本発明のこの実施態様において、その核酸は
そのコードタンパク質を産生するか、または治療効果を媒介するアンチセンス核
酸である。当該分野において周知である遺伝子治療についての任意の方法が、本
発明の実行において利用される。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９３ Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）；Ｋｒｉｅｇｌｅ
ｒ、１９９０．Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）を参照のこと。

【００６０】 好ましい実施態様において、ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃはＧＥＮＥ ＳＥＴ核酸
を含み、これは発現ベクターの一部であり、この発現ベクターは、適切な宿主に
おいて、ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質またはフラグメントまたはキメラタンパク
質、好ましくは、変異ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質またはフラグメントまたはキ
メラタンパク質、あるいは、それらのＧＥＮＥ ＳＥＴアンチセンス核酸を発現
する。特定の実施態様において、核酸はプロモーターを所有し、このプロモータ
ーは、変異ＧＥＮＥ ＳＥＴコード領域またはＧＥＮＥ ＳＥＴアンチセンス核
酸をコードする配列に作動可能に連結され、ここで、そのプロモーターは誘導性
または構成的であり、そして必要に応じて組織特異的である。別の特定の実施態
様において、核酸を使用し、ここで、変異ＧＥＮＥ ＳＥＴコード配列および任
意の他の所望される配列が、ゲノムにおける所望される部位での相同組換えを促
進し、従って、変異ＧＥＮＥ ＳＥＴ核酸の染色体内発現を提供する領域に隣接
される。例えば、Ｋｏｌｌｅｒ＆Ｓｍｉｔｈｉｅｓ、１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５を参照のこと。患
者へのその核酸の送達は、直接的であり得るか（この場合において、患者は直接
、核酸または核酸所持ベクターに曝露される）、または間接的であり得る（この
場合において、細胞が初めにその核酸でインビトロで形質転換され、次いで患者
に移植される）。これらの２つのアプローチは、インビボ遺伝子治療またはエキ
ソビボ遺伝子治療としてそれぞれ公知である。

【００６１】 特定の実施態様において、この核酸は直接インビボで投与され、ここで、その
核酸が発現され、コード産物を産生する。これは、その核酸を適切な核酸発現ベ
クターの一部として構築し、そしてそれを細胞内に投与されるように投与する、
当該分野において公知の任意の多くの方法によって達成され得、その方法には、
以下が挙げられるが、これらに限定されない；（ｉ）欠損または弱毒化したレト
ロウイルスまたは他のウイルスベクターを使用する感染（例えば、米国特許第４
，９８０，２８６号を参照のこと）；（ｉｉ）裸のＤＮＡの直接注射；（ｉｉｉ
）微粒子ボンバートメントの使用；（ｉｖ）脂質または細胞表面レセプターまた
はトランスフェクト薬剤を用いるコーティング、リポソーム、微粒子またはマイ
クロカプセルにおけるカプセル化；（ｖ）核に入ることが公知であるペプチドに
結合してそれを投与する工程；（ｖi)そのレセプターを特異的に発現する細胞型
を標的にするために使用され得るレセプター媒介性エンドサイトーシスの対象と
なるリガンドに結合してそれを投与する工程など。別の実施態様において、核酸
リガンド複合体が形成され得、この複合体において、リガンドはエンドソームを
崩壊させるためのフゾジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）ウイルスペプチドを含
み、この核酸がリソソーム分解を避けることを可能にする。さらに別の実施態様
において、この核酸は、特異的レセプターを標的化することにより、細胞特異的
取り込みおよび発現についてインビボにおいて標的化され得る（例えば、ＰＣＴ
公開ＷＯ９２／０６１８０およびＷＯ９３／２０２２１を参照のこと）。あるい
は、この核酸は細胞内に導入され得、そして、相同組換えにより発現のために宿
主細胞ＤＮＡ内に組み込まれ得る。例えば、Ｚｉｊｌｓｔｒａら、１９８９．Ｎ
ａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８を参照のこと。

【００６２】 特定の実施態様において、変異ＧＥＮＥ ＳＥＴ核酸を含むかまたはＧＥＮＥ
ＳＥＴアンチセンス核酸をコードするウイルスベクターが使用される。例えば
、レトロウイルスベクターが使用され得る。例えば、Ｍｉｌｌｅｒら、１９９３
．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９を参照のこと。これらの
レトロウイルスベクターは、改変されてレトロウイルス配列を欠失しており、そ
の配列は必ずしもウイルスゲノムのパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの組
み込みのために必要ではない。遺伝子治療において使用されるべきＧＥＮＥ Ｓ
ＥＴ核酸はベクターにクローン化されて、そのベクターは患者への遺伝子の送達
を促進する。例えば、Ｃｌｏｗｅｓら、１９９４．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ
．９３：６４４−６５１；Ｋｉｅｍら、１９９４．Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７
−１４７３を参照のこと。

【００６３】 アデノウイルスは、遺伝子治療において使用され得る他のウイルスベクターで
ある。アデノウイルスは、気道上皮に遺伝子を送達するための特に魅力的なビヒ
クルである。アデノウイルスは、気道上皮に自然に感染し、そこでウイルスは温
和な疾患を引き起こす。アデノウイルスに基づく送達系のための他の標的は、肝
臓、中枢神経系、内皮細胞および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞を
感染し得るという利点を有する。例えば、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉら、１９９３
．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４を参照のこと。さらに、
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）もまた、遺伝子治療における使用のために提供さ
れる。例えば、Ｗａｌｓｈら、１９９３．Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ
．Ｍｅｄ．２０４：２８９−３００（１９９３）を参照のこと。

【００６４】 遺伝子治療に対する別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェク
ション、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクションまたはウイルス感染のよ
うな方法によって、組織培養物中の細胞に遺伝子を移すことを含む。一般的に、
転移方法は、細胞に対する選択可能なマーカーの転移を含む。次いで、転移され
た遺伝子を取り込み、そして発現するそれらの細胞を単離するために選択下にお
く。次いで、それらの細胞を患者に送達する。この実施態様において、得られた
組換え細胞をインビボで投与する前に、その細胞核酸が導入される。このような
導入は、当該分野において公知の任意の方法によって実行され得、その方法には
以下が挙げられるが、それらに限定されない；トランスフェクション、エレクト
ロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイルスまたはバ
クテリオファージベクターを用いる感染、細胞融合、染色体媒介性遺伝子転移、
微小核体媒介性遺伝子転移、スフェロプラスト融合など。外来性遺伝子を細胞に
導入するための当該分野において周知の多くの技術が存在し（例えば、Ｌｏｅｆ
ｆｅｒ＆Ｂｅｈｒ、１９９３．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ ２１７：５９９−６
１８を参照のこと）、レシピエント細胞の必要な発生的かつ生理的機能が崩壊さ
れない限り、本発明に従って使用され得る。この技術は、細胞への核酸の安定な
転移を提供するはずであり、その結果その核酸は、その細胞により発現可能であ
り、好ましくは、遺伝性であり、そしてその細胞の子孫により発現可能である。

【００６５】 得られた組換え細胞は、当該分野において公知の種々の方法によって、患者に
送達され得る。好ましい実施態様において、上皮細胞に注射される（例えば、皮
下的に）。別の実施態様において、組換え皮膚細胞は、患者における皮膚移植片
として適用され得る。組換え血液細胞（例えば、造血性幹細胞または前駆体細胞
）が好ましくは静脈内投与される。使用のために想定される細胞量は、所望され
る効果、患者の状態などに依存し、そして当業者において決定され得る。

【００６６】 遺伝子治療の目的のために、核酸が導入され得る細胞は、任意の所望され、利
用可能な細胞型を含み、それらの細胞には以下が挙げられるが、それらに限定さ
れない；上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞
；血液細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球
、好酸球、巨核球、顆粒球）；種々の幹細胞、または前駆体細胞、特に、造血性
幹細胞または前駆体細胞（例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児の肝臓などから
得られるような細胞）。本発明の好ましい実施態様において、遺伝子治療のため
に使用される細胞は、患者に対して自己性である。

【００６７】 組換え細胞が遺伝子治療に使用される実施態様において、変異ＧＥＮＥ ＳＥ
Ｔ核酸またはＧＥＮＥ ＳＥＴアンチセンス核酸をコードする核酸が細胞に導入
され、その結果、それがその細胞またはそれらの子孫によって発現可能となり、
次いで、この組換え細胞は、治療効果のためにインビボで投与される。特定の実
施態様において、幹細胞または前駆体細胞が使用される。インビトロで単離およ
び維持され得る任意の幹細胞および／または前駆体細胞が、潜在的に本発明のこ
の実施態様に従って使用され得る。このような幹細胞には以下が挙げれらが、こ
れらに限定されない；造血性幹細胞（ＨＳＣ）、皮膚および腸の内層のような上
皮組織の幹細胞、胚性心筋細胞、肝臓幹細胞（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０
８５９８）および神経幹細胞（例えば、Ｓｔｅｍｐｌｅ＆Ａｎｄｅｒｓｏｎ、１
９９２．Ｃｅｌｌ ７１：９７３−９８５を参照のこと）。

【００６８】 上皮幹細胞（ＥＣＳ）またはケラチノサイトは、公知の手順によって皮膚およ
び腸の内層のような組織から得られ得る。例えば、Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ、１９８
０Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．２１Ａ：２２９を参照のこと。皮膚のような層
状上皮組織において、再生は、胚層（基底膜に最も近い層）内の幹細胞の有糸分
裂により生じる。患者またはドナーの皮膚または腸の内層から得られたＥＳＣま
たはケラチノサイトが、組織培養において増殖され得る。例えば、Ｐｉｔｔｅｌ
ｋｏｗ＆Ｓｃｏｔｔ、１９８６．Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｒｏｃ．６１：７
７１を参照のこと。ＥＣＳがドナーにより提供される場合、宿主対移植片反応性
を抑制するための方法（例えば、照射法、適度な免疫抑制を促進するための薬物
または抗体の投与）もまた利用され得る。

【００６９】 造血性幹細胞（ＨＳＣ）に関して、インビトロでのＨＳＣの単離、増殖および
維持を促進する技術が、本発明のこの実施態様において使用され得る。これが達
成され得る技術には、以下が挙げられる；（ｉ）将来の宿主またはドナーより単
離された骨髄細胞からのＨＳＣ培養物の単離および確立または（ｉｉ）以前に確
立された長期ＨＳＣ培養物の使用、これは同種間または異種間であり得る。非自
家性ＨＳＣが、好ましくは将来の宿主／患者の移植免疫応答を抑制する方法と組
み合わせて使用される。本発明の好ましい実施態様において、ヒト骨髄細胞は、
針吸引により背側の腸骨稜から得られ得る。例えば、Ｋｏｄｏら、１９８４．Ｊ
．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７３：１３７７−１３８４を参照のこと。本発明の
好ましい実施態様において、ＨＳＣは高度に濃縮されるか、または実質的に純粋
な形態で作製され得る。この濃縮は、長期培養前、長期培養中または長期培養後
に達成され得、当該分野において公知の任意の技術によってなされ得る。骨髄細
胞の長期培養は、例えば、改変されたＤｅｘｔｅｒ細胞培養技術（Ｄｅｘｔｅｒ
ら、１９７７．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：３３５を参照のこと）ま
たはＷｉｔｌｏｃｋ−Ｗｉｔｔｅ培養技術（Ｗｉｔｌｏｃｋ＆Ｗｉｔｔｅ、１９
８２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：３６０８−３６
１２を参照のこと）を使用することにより確立され、そして維持され得る。

【００７０】 特定の実施態様において、遺伝子治療の目的のために導入されるべき核酸は、
コード領域に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含み、その結果、核酸
の発現が、適切な転写誘導物質の存在または非存在を制御することによって制御
可能である。

【００７１】 （（ｂ）抗ＧＥＮＥ ＳＥＴ抗体） 本発明の１つの実施態様において、本明細書中上記で議論されたように、ＧＥ
ＮＥ ＳＥＴタンパク質または核酸（あるいはそれらの誘導体、フラグメントま
たはアナログを含む）を結合する抗体を用いて、高血圧症、糖尿病、肥満症また
は虚血性発作を処置または予防する。抗ＧＥＮＥ ＳＥＴ抗体はまた本発明の診
断方法、予後方法およびスクリーニング方法において使用され得る。このような
抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂフラグ
メント、およびＦａｂ発現ライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない
。特定の実施態様において、ヒトＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質に対する抗体が生
成される。別の特定の実施態様において、インビトロおよび／またはインビボで
ＧＥＮＥ ＳＥＴ活性を減少させるか、または阻害する抗体が提供される。

【００７２】 当該分野で公知の種々の手順は、ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質または誘導体も
しくはアナログに対するポリクローナル抗体の生成のために使用され得る。特定
の実施態様において、ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質（例えば、アミノ酸配列番号
１、６、１０〜１１、１４〜１５、１８〜１９、２６〜２７、３２〜３３もしく
は３７、またはその部分配列のタンパク質、またはそれらの配列もしくは部分配
列をコードする核酸）のエピトープに対するウサギポリクローナル抗体が得られ
得る。抗体の生成については、種々の宿主動物を、ネイティブなＧＥＮＥ ＳＥ
Ｔタンパク質、合成バージョン、またはその誘導体もしくはフラグメントを注射
することにより免疫し得、これらの動物としては、ウサギ、マウス、ラットなど
が挙げられるが、これらに限定されない。宿主の種に依存して、種々のアジュバ
ントを用いて免疫応答を増強し得る（例えば、フロイントアジュバント）。

【００７３】 ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質配列（またはその誘導体またはアナログ）に対す
るモノクローナル抗体の調製については、連続するインビトロ細胞株による抗体
分子の生成を提供する任意の技術が用いられ得、これらの技術としては、ヒトモ
ノクローナル抗体（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ．Ｉｎｃ．
，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照のこと））を生成するためのハイブリドーマ技
術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：
４９５−４９７を参照のこと）；トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技
術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２
を参照のこと）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術が挙げられるが、これらに限
定されない。本発明のさらなる実施態様において、モノクローナル抗体は、最近
の技術を利用して、無菌（ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ）動物において生成され得る（例
えば、ＰＣＴ公開ＵＳ９０／０２５４５を参照のこと）。ヒト抗体は、本発明の
範囲内であり、そしてヒトハイブリドーマ（例えば、Ｃｏｔｅら、１９８３、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０）を
用いることにより、またはヒトＢ細胞をインビトロでエプスタイン−バーウイル
ス（ＥＢＶ）で形質転換すること（例えば、Ｃｏｌｅら、１９８５、Ｍｏｎｏｃ
ｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（
Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照のこと））によって
得られ得る。「キメラ抗体」の生成（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５）
は、さらに本発明の範囲内であり、このキメラ抗体は、適切な生物学的活性のヒ
ト抗体分子由来の遺伝子とともにＧＥＮＥ ＳＥＴに対して特異的なマウス抗体
分子由来の遺伝子をスプライシングすることにより生成され得る。

【００７４】 本発明の１つの実施態様において、単鎖抗体（米国特許第４，９４６，７７８
号を参照のこと）は、ＧＥＮＥ ＳＥＴ特異的単鎖抗体を生成するために適合さ
れ得る。本発明のさらなる実施態様は、ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質（またはそ
の誘導体もしくはアナログ）に対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａ
ｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にするような、Ｆａｂ発現ライブラ
リー（例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１
２８１を参照のこと）の利用を開示する。

【００７５】 この分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは、公知の技術により生成
され得る。例えば、このようなフラグメントとしては、以下が挙げられるが、こ
れらに限定されない：抗体分子のペプシン消化により生成され得るＦ（ａｂ’） ₂ フラグメント；Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントのジスルフィド架橋を還元すること
により生成され得るＦａｂ’フラグメント、パパインおよび還元剤で抗体分子を
処理することにより生成され得るＦａｂフラグメントならびにＦｖフラグメント
。

【００７６】 抗体の生成において、所望の抗体についてのスクリーニングは、当該分野で公
知の技術を用いて達成され得る（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳ
Ａ））。特定の実施態様において、ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質の特定の部分を
認識する抗体の選択は、このような部分を含むＧＥＮＥ ＳＥＴフラグメントに
結合する産物に対して特異的なハイブリドーマを利用するアッセイによって達成
され得る。ＧＥＮＥ ＳＥＴ活性を低減するか、または阻害する能力を有する抗
体の選択については、当業者は、下記のＧＥＮＥ ＳＥＴ活性についてのアッセ
イのいずれかにおいて抗体をスクリーニングし得る。

【００７７】 （（ｃ）アンチセンスＧＥＮＥ ＳＥＴ核酸） 本発明の特定の実施態様において、ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質の機能は、Ｇ
ＥＮＥ ＳＥＴアンチセンス核酸により低減されるか、または阻害され、これを
利用して、発作、高血圧症、糖尿病または肥満症を処置するかまたは予防する。
本発明は、ＧＥＮＥ ＳＥＴまたはその一部分をコードする遺伝子またはｃＤＮ
Ａに対してアンチセンスである少なくとも６つのヌクレオチドの核酸の治療的用
途または予防的用途を提供する。本明細書中で使用される場合、ＧＥＮＥ ＳＥ
Ｔ「アンチセンス」核酸とは、配列相補性によって、ＧＥＮＥ ＳＥＴ ＲＮＡ
（好ましくはｍＲＮＡ）の一部にハイブリダイズし得る核酸種をいう。アンチセ
ンス核酸は、ＧＥＮＥ ＳＥＴ ｍＲＮＡのコード領域および／または非コード
領域に相補的であり得る。このようなアンチセンス核酸は、ＧＥＮＥ ＳＥＴ機
能を低減するか、または阻害するＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓとしての有用性を有
し、そして上記で記載されるように障害の処置または予防において使用され得る
。

【００７８】 ＧＥＮＥ ＳＥＴアンチセンス核酸は、少なくとも６つのヌクレオチドであり
、そして好ましくはオリゴヌクレオチド（６〜１５０ヌクレオチド、またはより
好ましくは、６〜５０ヌクレオチドの範囲である）である。特定の局面において
、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌ
クレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、または少なくとも１２５ヌクレオ
チドである。このオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはキメラ混合物
（またはその誘導体もしくは改変されたバージョン）であり得、そして一本鎖ま
たは二本鎖であり得る。このオリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、または
リン酸骨格で改変されていてもよい。このオリゴヌクレオチドは、ペプチド、ま
たは細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６５５３〜６５５６を参照のこと）または血
液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）を横切
る輸送を容易にする薬剤；ハイブリダイゼーション誘発切断薬剤（例えば、Ｋｒ
ｏｌら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６）または
插入剤（例えば、Ｚｏｎ、１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９
）のような他の付加基を含み得る。

【００７９】 本発明のＧＥＮＥ ＳＥＴアンチセンス核酸は、好ましくは、オリゴヌクレオ
チドであり、そしてより好ましくは、一本鎖ＤＮＡである。好ましい実施態様に
おいて、このオリゴヌクレオチドは、ヒトＧＥＮＥ ＳＥＴの一部分に対してア
ンチセンスである配列を含む。このオリゴヌクレオチドは、一般に当該分野で公
知の置換基を用いてその構造に対して任意の位置で改変され得る。

【００８０】 本発明のオリゴヌクレオチドは、当該分野で公知の標準的方法により（例えば
、自動化ＤＮＡ合成機（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓなど）の使用により）合成され得る。限定ではなく、例示として
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが、Ｓｔｅｉｎら（１９８８、Ｎｕｃｌ
．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９）の方法により合成され得；メチルリン
酸オリゴヌクレオチドが、制御孔ガラスポリマー支持体（例えば、Ｓａｒｉｎら
、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：７４４８
−７４５１）および類似の合成方法論を用いることにより調製され得る。

【００８１】 本発明の特定の実施態様において、ＧＥＮＥ ＳＥＴアンチセンスオリゴヌク
レオチドは、触媒性ＲＮＡすなわちリボザイムを含む（例えば、ＰＣＴ国際公開
ＷＯ９０／１１３６４；Ｓａｒｖｅｒら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：
１２２２−１２２５を参照のこと）。別の特定の実施態様において、このオリゴ
ヌクレオチドは、２Ｎ−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（例えば、Ｉｎｏｕｅら、
１９８７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８）または
キメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（例えば、Ｉｎｏｕｅら、１９８７、ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０を参照のこと）である。

【００８２】 別の実施態様において、本発明のＧＥＮＥ ＳＥＴアンチセンス核酸は、外因
性配列からインビボ転写により細胞内で生成される。例えば、ベクターをインビ
ボで導入し、その結果、このベクター（またはその一部分）が転写され、本発明
のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を生成する。このようなベクターは、ＧＥＮＥ
ＳＥＴアンチセンス核酸をコードする配列を含み、そしてこれが転写されて、所
望のアンチセンスＲＮＡを生成する限り、エピソーム性のままであり得るか、ま
たは染色体に組み込まれ得る。前述のベクターは、プラスミド、ウイルス、また
は当該分野で公知の他のものから構成され得、これらは、哺乳動物細胞における
複製および発現に利用され、そして当該分野で標準的な組換えＤＮＡ技術方法論
によって構築され得る。ＧＥＮＥ ＳＥＴアンチセンスＲＮＡをコードする配列
の発現は、哺乳動物（好ましくはヒト）細胞において作用するように、当該分野
で公知の任意のプロモーターによってであり得る。このようなプロモーターは、
誘導性であっても構成性であってもよく、そして以下が挙げられるが、これらに
限定されない：（ｉ）ＳＶ４０初期プロモーター領域（例えば、Ｂｅｒｎｏｉｓ
ｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０）
；（ｉｉ）ラウス肉腫ウイルスの３’末端長反復（ＬＴＲ）に含まれるプロモー
ター（例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０、Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９
７を参照のこと）；（ｉｉｉ）ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター
（例えば、Ｗａｇｎｅｒら、１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ７８：１４４１−１４４５を参照のこと）；（ｉｖ）メタロチオネイ
ン遺伝子の調節配列（例えば、Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２．Ｎａｔｕｒｅ
２９６：３９−４２を参照のこと）など。

【００８３】 本発明のアンチセンス核酸は、ＧＥＮＥ ＳＥＴ遺伝子（好ましくは、ヒトＧ
ＥＮＥ ＳＥＴ遺伝子）のＲＮＡ転写物の少なくとも一部分に相補的な配列を含
む。しかし、絶対的な相補性は、好ましくはあるが必要条件ではない。本明細書
中で用いられる場合、「ＲＮＡの少なくとも一部分に相補的な」配列は、ＲＮＡ
とハイブリダイズして、安定な二重鎖を形成し得る（二本鎖ＧＥＮＥ ＳＥＴア
ンチセンス核酸の場合）十分な相補性を有する配列をいう。同様に、二重鎖ＤＮ
Ａの一本鎖または三重鎖形成は、同様の様式でアッセイされ得る。ハイブリダイ
ズする能力は、アンチセンス核酸の相補性の程度および長さの両方に依存する。
一般に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、より多くの塩基がＧＥＮＥ ＳＥ
ＴＲＮＡと不適合になるが、核酸は安定な二重鎖（またはある場合には三重鎖）
を含み得、なおかつ形成し得る。当業者は、標準的な手順を用いることによって
ミスマッチの許容程度を確認して、ハイブリダイズした複合体の融解点を決定し
得る。

【００８４】 本発明はさらに、薬学的に受容可能なキャリア内に、本発明のＧＥＮＥ ＳＥ
Ｔアンチセンス核酸の有効量を含む薬学的組成物（すなわち、Ｔｈｅｒａｐｅｕ
ｔｉｃｓ）を提供する。特定の実施態様において、ＧＥＮＥ ＳＥＴアンチセン
ス核酸を含む薬学的組成物は、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセルに
よって投与され得る。ＧＥＮＥ ＳＥＴアンチセンス核酸の徐放性放出を達成す
るために、このような組成物を使用することは有用であり得る。

【００８５】 虚血性疾患の処置または予防において有効なＧＥＮＥ ＳＥＴアンチセンス核
酸の量は疾患の性質に依存し、そして標準的な臨床技術により決定され得る、可
能な場合は、インビトロで細胞において、次いで、ヒトにおける試験および使用
の前に、有用な動物モデル系においてアンチセンスの細胞傷害性を決定すること
が望ましい。

【００８６】 （（４）診断、予後およびスクリーニングの方法） 本発明はまた、発作、高血圧症、糖尿病および／または肥満症の診断、予後、
およびスクリーニングに関する方法論を開示する。

【００８７】 １つの実施態様において、抗ＧＥＮＥ ＳＥＴ抗体を用いて、イムノアッセイ
ベースの方法論の使用により、被験体の１つ以上の組織（例えば、血液）におけ
る変異体ＧＥＮＥ ＳＥＴレベルを検出および定量する。具体的には、このよう
なイムノアッセイは、患者由来のサンプルと、抗ＧＥＮＥ ＳＥＴ抗体とを、免
疫特異的結合が生じ得るような条件下で接触させ、そして抗体による任意の免疫
特異的結合の量を検出または測定することにより行われる。しかし、変異体ＧＥ
ＮＥ ＳＥＴタンパク質のアミノ酸配列内の特定のアミノ酸欠失、挿入または置
換が特異的抗（野生型）ＧＥＮＥ ＳＥＴ抗体により認識されるエピトープを変
化させ得、その結果、抗体がより少ない程度に変異体ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク
質を結合するか、またはそれに全く結合しないかもしれないことに注意すべきで
ある。さらに、抗体は、変異体ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質、またはその一部分
に対して生成され得、この抗体は、（下記のインビトロイムノアッセイ方法論に
より決定されるように）特定の変異体ＧＥＮＥ ＳＥＴに特異的に結合するが野
生型ＧＥＮＥ ＳＥＴには結合しない。これらの特異的抗変異体ＧＥＮＥ ＳＥ
Ｔ抗体を用いて、抗変異体ＧＥＮＥ ＳＥＴ抗体による免疫特異的結合を測定す
ることによって、ＧＥＮＥ ＳＥＴの存在、および必要に応じて、抗（野生型）
ＧＥＮＥ ＳＥＴ抗体による免疫特異的結合の欠如を検出し得る。さらに、欠失
または挿入変異を有するＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質は、以下が挙げられるが、
それらに限定されない方法論によりタンパク質サイズにおける増加および減少の
いずれかによって検出され得る：例えば、変異体ＧＥＮＥ ＳＥＴおよび野生型
ＧＥＮＥ ＳＥＴの両方を認識する抗ＧＥＮＥ ＳＥＴ抗体を用いたウェスタン
ブロット分析（これには限定されない）。

【００８８】 本発明の実施において利用され得るイムノアッセイとしては、以下が挙げられ
るが、これらに限定されない：ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ（Ｒ
ＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」イムノア
ッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、
凝集アッセイ、補体結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イム
ノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイなどのような技術を用いる競合的およ
び非競合的アッセイ系。

【００８９】 本発明の特定の実施態様において、診断、予後およびスクリーニングの方法が
開示され、そしてこの方法は、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡにおける変異体ＧＥ
ＮＥ ＳＥＴ対立遺伝子検出（すなわち、遺伝子スクリーニング）を利用する。
これらの前述の変異体ＧＥＮＥ ＳＥＴ対立遺伝子は、以下を含むが、これらに
限定されないゲノムＤＮＡにおける変異を検出するための、当該分野で公知の方
法によって検出され得る：ＤＮＡハイブリダイゼーション法（例えば、サザンブ
ロッティング）、ＲＦＬＰマッピング、ＰＣＲベースの増幅方法論など。これら
の方法は、野生型ＧＥＮＥ ＳＥＴ配列内の変異および対応する位置の両方に相
補的な核酸プローブとともに使用され得る。

【００９０】 好ましい実施態様において、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ＡＳＰ）を用いて、変
異体ＧＥＮＥ ＳＥＴ対立遺伝子を検出し得る。ＡＳＰ方法論において、標的Ｄ
ＮＡは、特定のＰＣＲ増幅プライマーの３’末端に完全に相補的な場合にのみ優
先的に増幅される。このプライマーの３’末端は、相補的な配列を保有するＧＥ
ＮＥ ＳＥＴ遺伝子（標的ＤＮＡ）内の既知の変異部位の１つまたは２つのヌク
レオチドでまたはその中で終結するように設計される。適切な反応条件下で、標
的ＤＮＡは、プライマーの３’末端に１個のヌクレオチド不適合（例えば、変異
により引き起こされたヌクレオチド置換）または小さな欠失もしくは挿入が存在
する場合には増幅されない。例えば、Ｏｋａｙａｍａら、１９８９、Ｊ．Ｌａｂ
．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１１４：１０５−１１３；Ｓｏｍｍｅｒら、１９９２、Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２：８２−８７を参照のこと。従って、ＡＳＰは
、プライマー配列（これは、予め選択されたＧＥＮＥ ＳＥＴ標的配列に相補的
である）とサンプル内の核酸との間の（少なくとも）１個のヌクレオチド不適合
の存在または非存在のいずれかを検出するために利用され得る。ＧＥＮＥ ＳＥ
Ｔ配列の増幅は、１個の不適合ヌクレオチドさえも欠如していることを示す。

【００９１】 さらに、変異体が、欠失変異または挿入変異を含む場合、変異体ＧＥＮＥ Ｓ
ＥＴ対立遺伝子は、ＧＥＮＥ ＳＥＴ核酸配列またはその一部分の長さの増加ま
たは減少についてスクリーニングすることによって検出され得る。長さの増加ま
たは減少は、以下を含むが、それらに限定されない核酸の長さを測定するために
当該分野で公知の任意の方法により検出され得る：診断またはスクリーニングさ
れる被験体由来および標準的サンプルまたはコントロールサンプル由来のＧＥＮ
Ｅ ＳＥＴ配列の特定のフラグメントの増幅、ならびに任意のサイズ分画法（例
えば、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動）によるフラグメントの長さの比較
。

【００９２】 さらに、診断用途または予後用途のためのキットもまた本明細書中に開示され
、このキットは、１つ以上の容器、抗ＧＥＮＥ ＳＥＴ抗体または抗ＧＥＮＥ
ＳＥＴ変異体抗体、および必要に応じて、この抗体に対する標識された結合パー
トナーを含む。あるいは、抗ＧＥＮＥ ＳＥＴ抗体または抗ＧＥＮＥ ＳＥＴ変
異体抗体は、検出可能に標識され得る（例えば、化学発光部分、酵素部分、蛍光
部分または放射活性部分を用いて）。別の実施態様において、１つ以上の容器中
に、ＧＥＮＥ ＳＥＴ ＲＮＡまたは好ましくは変異体ＧＥＮＥ ＳＥＴ ＲＮ
Ａに特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブを含むキットが提供される。本
発明の特定の実施態様において、１つ以上の容器に、適切な反応条件下で、ＧＥ
ＮＥ ＳＥＴ核酸の少なくとも一部分の増幅反応をプライムし得る１対のプライ
マー（例えば、各々６〜３０ヌクレオチドのサイズ範囲で）を含むキットが提供
される。これらの増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；リガー
ゼ連鎖反応；Ｑβレプリカーゼ、循環的プローブ反応（ｃｙｃｌｉｃ ｐｒｏｂ
ｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）または当該分野で公知の他の増幅方法が挙げられるが、
これらに限定されない。キットは、必要に応じて、容器中に標準物質またはコン
トロールとして使用するための、予め決められた濃度の精製ＧＥＮＥ ＳＥＴタ
ンパク質またはＧＥＮＥ ＳＥＴ核酸をさらに含み得る。

【００９３】 （（５）ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質およびＧＥＮＥ ＳＥＴ核酸のモジュレ
ーターについてのアッセイ） ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質（ならびにＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質の誘導体
、アナログ、フラグメントおよびホモログ）の活性をアッセイするため、ならび
にＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質をコードする核酸（ならびにその誘導体、アナロ
グ、フラグメントおよびホモログ）について、当該分野で種々の方法論が利用可
能である。推定ＧＥＮＥ ＳＥＴモジュレーター（例えば、ＧＥＮＥ ＳＥＴア
ゴニスト、アンタゴニストおよびインヒビター）のスクリーニングのための方法
もまた、利用可能である。ＧＥＮＥ ＳＥＴ活性のこのようなモジュレーターと
しては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＧＥＮＥ ＳＥＴアンチ
センス核酸、抗ＧＥＮＥ ＳＥＴ抗体、およびＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質レセ
プターに結合するための、ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質の競合的インヒビター。

【００９４】 ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質（ならびにＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質の誘導体
、フラグメント、アナログおよびホモログ）の活性、これらのＧＥＮＥ ＳＥＴ
タンパク質をコードする核酸（ならびにそれらの誘導体、フラグメント、アナロ
グおよびホモログ）、ならびにＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質活性の推定モジュレ
ーターもまたインビボで確認され得る。例えば、ヒトにおけるＧＥＮＥ ＳＥＴ
タンパク質の注入は、血漿および尿中のｃＧＭＰレベルの有意な増加を引き起こ
す。例えば、Ｖｅｓｅｌｙら、１９９５、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．３１０：
１４３−１４９；Ｖｅｓｅｌｙら、１９９６，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：Ｃｌｉｎ
．＆Ｅｘｐ．４５：３１５−３１９を参照のこと。ヒトへのＧＥＮＥ ＳＥＴタ
ンパク質の投与はまた、有意な利尿および血圧の低下を誘発し（例えば、Ｖｅｓ
ｅｌｙら、１９９６，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ５９：２４３−２５４）；
類似の効果もまた、齧歯類において観察された（例えば、Ｇａｒｃｉａら、１９
８９、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ １３：５６７−５７４）。一致して、変異体
ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質および核酸（ならびにそれらの誘導体、アナログ、
フラグメントおよびホモログ）ならびに推定ＧＥＮＥ ＳＥＴモジュレーターは
、動物、好ましくは、非ヒト試験動物に「試験化合物」を投与し、次いで、上記
の生理学的パラメーター（例えば、尿および／または血漿中のｃＧＭＰレベル、
利尿効果、血圧の低下など）の１つ以上の測定によりアッセイされ得る。

【００９５】 本発明の別の実施態様は、以下を含む活性の変化についてＧＥＮＥ ＳＥＴ変
異体をスクリーニングするための方法論を開示する：（ｉ）ＧＥＮＥ ＳＥＴ変
異体を、発作、高血圧症、糖尿病または肥満症がちな試験動物に投与すること、
および（ｉｉ）試験動物における発作潜伏期を測定すること（ここで、発作潜伏
期は、ＧＥＮＥ ＳＥＴ活性を示す）。特定の実施態様において、組換え試験動
物（ＧＥＮＥ ＳＥＴ導入遺伝子を発現するか、または野生型試験動物と比較し
て増加したレベルでネイティブなＧＥＮＥ ＳＥＴ遺伝子プロモーターではない
プロモーターの制御下でＧＥＮＥ ＳＥＴのメンバーを発現する）を用いて、Ｇ
ＥＮＥ ＳＥＴ活性の変化について、ＧＥＮＥ ＳＥＴをスクリーニングする。

【００９６】 本発明の別の実施態様において、ＧＥＮＥ ＳＥＴ活性のモジュレーター、ま
たは発作に対する潜伏期もしくは素因のモジュレーターをスクリーニングするた
めの方法が提供され、この方法は、ＧＥＮＥ ＳＥＴ活性の推定モジュレーター
を組換え発現する発作の傾向がある動物における発作潜伏期を測定する工程を包
含し、ここで、この推定モジュレーターを組換え発現しない、類似の発作の傾向
がある動物と比較した発作潜伏期の変化は、この推定モジュレーターがＧＥＮＥ
ＳＥＴ活性、または発作に対する潜伏期もしくは素因を調節する能力を有する
ことを示す。

【００９７】 なお別の実施態様において、発作に対する潜伏期もしくは素因に対する効果に
ついてＧＥＮＥ ＳＥＴ変異体をスクリーニングするための方法が提供され、こ
の方法は、ＧＥＮＥ ＳＥＴ変異体を組換え発現する発作の傾向がある動物にお
ける発作潜伏期を測定する工程を包含し、ここで、ＧＥＮＥ ＳＥＴ変異体を組
換え発現しない、類似の発作の傾向がある動物と比較した発作潜伏期の変化は、
ＧＥＮＥ ＳＥＴ変異体が発作、高血圧症、糖尿病または肥満症に対する潜伏期
もしくは素因に対する効果を有することを示す。好ましい実施態様において、Ｇ
ＥＮＥ ＳＥＴ変異体は、発作潜伏期の増加または発作に対する素因の減少につ
いてスクリーニングされる。

【００９８】 （（６）薬学的組成物およびＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ） 本発明は、有効な量の本発明のＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓを被験体に投与する
ことによる、処置および予防の方法を開示する。好ましい実施態様において、Ｔ
ｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓは、実質的に純粋である。この被験体は、好ましくは動
物であり、この動物は、好ましくは、哺乳動物であり、最も好ましくはヒトであ
る。

【００９９】 Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓが核酸を含む場合に用いられ得る処方物および投与
の方法は、前出の３（ａ）節および３（ｃ）節に記載される。その一方で、さら
なる適切な処方物および投与経路が、以下に記載されるものの中から選択され得
る。

【０１００】 多くの型の薬学的組成物送達系が当該分野で周知であり、そして本発明のＴｈ
ｅｒａｐｅｕｔｉｃｓを投与するために利用され得る。これらの前述の送達系と
しては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：（ｉ）リポソーム、微粒
子およびマイクロカプセルにおけるカプセル化；（ｉｉ）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉ
ｃｓを発現し得る組換え細胞；（ｉｉｉ）レセプター媒介エンドサイトーシス（
例えば、ＷｕおよびＷｕ、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２
９−４４３２を参照のこと）；（ｉｖ）レトロウイルスまたは他のベクターの一
部分としてのＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ核酸の構築など。投与／導入の方法とし
ては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：皮内経路、筋肉内経路、腹
腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜上経路および経口経路。こ
のＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓは、任意の都合のよい経路により（例えば、注入ま
たはボーラス注射により、上皮または粘膜内層（例えば、口内粘膜、直腸粘膜お
よび腸内粘膜など）を介する吸収により）投与され得、そして他の生物学的活性
薬剤とともに投与され得る。投与は、全身的であってもよいし、局所的であって
もよい。さらに、任意の適切な経路（例えば、脳室内およびクモ膜下腔または硬
膜下腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）注入）により中枢神経系へ、本発明のＴｈ
ｅｒａｐｅｕｔｉｃｓを導入することは、望ましくあり得る。脳室内注入は、例
えば、リザーバ（例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバ）を取り付けた脳室内カテーテ
ルの使用により容易にされ得る。肺投与もまた（例えば、吸入器またはネブライ
ザーおよびエアロゾル化薬剤を有する処方物の使用により）利用され得る。

【０１０１】 本発明の特定の実施態様において、本発明のＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓを処置
が必要な領域に局所的に投与することは望ましくあり得る；これは、例えば、限
定ではないが、手術の間の局所的注入、局所的適用（例えば、手術後の包帯とと
もに）、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラント（こ
のインプラントは、多孔性、非多孔性、またはゼラチン様物質（シラスチック（
ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のような膜または線維を含む）により達成され得る。

【０１０２】 本発明の別の特定の実施態様において、このＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓは、小
胞（特にリポソーム）中で送達され得る。例えば、Ｌａｎｇｅｒ、１９９０、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３を参照のこと。なお別の特定の実施
態様において、このＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓは、以下を含むが、これらに限定
されない徐放システムを介して送達され得る：ポンプ（例えば、Ｓｅｆｔｏｎ，
１９８７、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１を
参照のこと）およびポリマー物質（例えば、ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ、１９
８３、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄ
ｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ｗ
ｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を参照のこと）。さらに、徐放システムは
、治療標的（例えば、脳）の近位に配置され、従って、わずか全身的用量全体の
何分の１かが必要であるにすぎない。例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、１９８４、Ｍｅ
ｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌ
ｅａｓｅ，（Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を参照のこと。

【０１０３】 Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃがタンパク質ベースのＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃをコー
ドする核酸である、本発明の特定の実施態様では、この核酸は、インビボで投与
されて、適切な核酸発現ベクターの一部として前述のタンパク質を構築し、そし
て以下を含むがこれらに限定されない方法論によって細胞内になるようにこの構
築物を投与することによって、そのコードされたタンパク質の発現を促進し得る
：（ｉ）レトロウイルスベクターの使用（例えば、米国特許第４，９８０，２８
６号を参照のこと）；（ｉｉ）直接的な注入の使用；（ｉｉｉ）微粒子ボンバー
ドメントの使用（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、ＤｕＰｏｎｔ）：（
ｉｖ）脂質または細胞表面レセプターもしくはトランスフェクト剤でのコーティ
ング；（ｖ）核に進入することが公知であるホメオボックス様ペプチドと結び付
けた投与（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８６４〜１８６８を参照のこと）など。

【０１０４】 本発明の代替の実施態様では、核酸ベースのＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃは、細胞
内に導入され得、そして発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に相同組換えによって取
り込まれ得る。

【０１０５】 本発明はまた、薬学的組成物を開示する。このような組成物は、治療的に有効
量のＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃを薬学的に受容可能なキャリア内に含む。特定の実
施態様では、用語「薬学的に受容可能」は、本明細書中で利用される場合、動物
、およびより特にはヒトにおける使用のために、連邦政府または州立政府機関の
取締機関により認可されているか、あるいは米国薬局方または他の一般に認識さ
れる薬局方に収載されている組成物として規定される。用語「キャリア」は、本
明細書中で利用される場合、治療剤がともに投与される、希釈剤、アジュバント
、賦形剤、またはビヒクルをいう。このような薬学的キャリアには、無菌の液体
（例えば、水、生理学的食塩水など）および油（例えば、石油、動物、植物また
は合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油など））が挙
げられるが、これらに限定されない。水は、薬学的組成物が静脈内に投与される
場合に好ましいキャリアである。さらに、生理食塩水溶液ならびに水性デキスト
ロース溶液およびグリセロール溶液もまた、液体キャリアとして、特に注射用溶
液のために用いられ得る。適切な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラ
クトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、フラワー、チョーク、シリカゲ
ル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナ
トリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エ
タノールなどが挙げられる。所望される場合、組成物はまた、わずかな量の湿潤
剤または乳化剤、あるいはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組成物は、溶液、懸
濁液、乳化剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性処方物などの形態を採り
得る。この組成物は、坐剤として、伝統的な結合剤およびキャリア（例えば、ト
リグリセリド）とともに処方され得る。経口処方物は、標準的なキャリア（例え
ば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグ
ネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど）を含み
得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｍａｒｔｉｎ、１９６５．Ｒｅｍｉｎｇｔ
ｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている
。このような組成物は、治療的に有効量のＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃを、好ましく
は精製された形態において、および最も好ましくは、実質的に精製された形態に
おいて、患者に対して適切な投与のための形態を提供するために適切な量のキャ
リアと共に含む。この処方物は、投与の様式に適合されるべきである。

【０１０６】 本発明の好ましい実施態様では、この組成物は、ヒトへの静脈内投与のために
採用される薬学的組成物として、慣用的な手順に従って処方される。代表的には
、静脈内投与のための組成物は、無菌性の等張水性緩衝液における溶液である。
必要な場合、この組成物はまた、可溶化剤および注射の部位での痛みを軽減する
ための局所麻酔剤（例えば、リグノカイン（ｌｉｇｎｏｃａｉｎｅ））を含み得
る。一般に、成分は、別々にか、または一緒に混合されてかのいずれかで、単位
投薬形態において、例えば、ハーメチックシールされた容器（例えば、活性薬剤
の量を示すアンプルまたはサチェット（ｓａｃｈｅｔｔｅ））中に乾燥凍結乾燥
粉末または水を含まない濃縮物として供給される。この組成物が注射により投与
されなければならない場合、これは、無菌性の薬学的グレードの水または生理食
塩水を含む注入ビンで分散され得る。この組成物が注射により投与される場合、
注射のための無菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得、その結果、これ
らの成分が投与前に混合され得る。

【０１０７】 本発明のＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓは、薬学的に受容可能な塩（塩酸、リン酸
、酢酸などから誘導される塩、および遊離カルボキシル基を用いて形成された塩
を含む（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、水酸化鉄（ＩＩＩ）、イ
ソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジ
ン、プロカインなどから誘導された塩）。

【０１０８】 特定の障害または状態の処置に効果的である、本発明のＴｈｅｒａｐｅｕｔｉ
ｃの量は、障害または状態のその性質に依存し、そして標準的な臨床技術によっ
て定量的に決定され得る。さらに、インビトロアッセイは、（必要に応じて）、
最適な投薬範囲の同定を補助するために用いられ得る。この処方物中に用いられ
るべき正確な用量はまた、投与の経路、およびこの疾患もしくは障害の重篤度に
依存し、そして開業医の判定および各患者の状況に従って決定されるべきである
。しかし、静脈内投与のための適切な用量範囲は、一般に、体重１キログラム（
ｋｇ）あたり約２０〜５００μｇの活性化合物である。鼻腔内投与のために適切
な投薬範囲は、一般に、体重１ｋｇあたり約０．０１ｐｇから体重１ｋｇあたり
１ｍｇである。有効用量は、インビトロまたは動物モデルの試験系から誘導され
る用量応答曲線から推定され得る。坐剤は、一般に、０．５重量％〜１０重量％
の範囲で活性成分を含み；経口処方物は、好ましくは、１０％〜９５％の活性成
分を含む。

【０１０９】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１以上の成分で充填された１以上の容
器を備える、薬学的包装物またはキットを提供する。必要に応じて、薬学的製品
または生物学的製品の製造、使用または販売を取り締まる政府機関により指示さ
れる形態における通知（この通知は、ヒトでの投与のための製造、使用、販売の
機関による認可を示す）が、このような容器に付随する。

【０１１０】 （（７）動物モデル） 本発明は、動物モデルを開示する。１つの実施態様では、発作、高血圧、糖尿
病または肥満についての動物モデルが、提供される。トランスジェニック動物は
、分子生物学的手段を通じて、育種または生産され得、この動物は（例えば、異
種プロモーター（すなわち通常はＧＥＮＥ ＳＥＴ成分を発現しない組織におい
て、ＧＥＮＥ ＳＥＴタンパク質および／または核酸の発現を容易にするプロモ
ーター）の制御下で、ＧＥＮＥ ＳＥＴ遺伝子のメンバー（単数または複数）を
導入することによって）、１以上のＧＥＮＥ ＳＥＴ遺伝子を過剰発現させるか
、または過小発現させる。さらに、「ノックアウト」マウスは、初めに、その染
色体中のＧＥＮＥ ＳＥＴ遺伝子と、好ましくは、異種配列（例えば、抗生物質
耐性遺伝子）の挿入によってかまたは非相同組換えによって生物学的に不活性化
された、外因性ＧＥＮＥ ＳＥＴ遺伝子との間での相同組換えを促進することに
よって生成される。

【０１１１】 本発明の好ましい実施態様において、異種ＤＮＡの導入は、胚由来幹（ＥＳ）
細胞を、挿入により不活性化されたＧＥＮＥ ＳＥＴ遺伝子または異種プロモー
ターの制御下であるＧＥＮＥ ＳＥＴ遺伝子を含むベクターで形質転換すること
、続いてこのＥＳ細胞を胚盤胞中に注入すること、ならびにこの胚盤胞を「養母
」動物中に移植することによって行われる。従って、得られたマウスは、ＧＥＮ
Ｅ ＳＥＴ遺伝子が不活性化されているか、または過剰発現もしくは誤って発現
（ｍｉｓｅｘｐｒｅｓｓ）されているキメラ動物（「ノックアウト動物」または
「トランスジェニック動物」）である（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８９、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８〜１２９２を参照のこと）。次いで、このキ
メラ動物は、さらなるノックアウト動物またはトランスジェニック動物を生じる
ように育種され得る。このようなキメラ／トランスジェニック動物には、マウス
、ハムスター、ヒツジ、ブタ、ウシなどが挙げられるがこれらに限定されず、そ
して好ましくは、非ヒト動物である。トランスジェニック動物およびノックアウ
ト動物はまた、当該分野において周知である方法によって、Ｄ．Ｍｅｌａｎｏｇ
ａｓｔｅｒ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓなどにおいて作製され得る。

【０１１２】 本発明の別の実施態様は、ネイティブなＧＥＮＥ ＳＥＴ遺伝子プロモーター
ではないプロモーターの制御下で、変異体ＧＥＮＥ ＳＥＴ遺伝子（ここでこの
変異体ＧＥＮＥ ＳＥＴ遺伝子は、発作までの潜伏期を増大させる変異体ＧＥＮ
Ｅ ＳＥＴをコードする）を含む組換え非ヒト動物を提供する。なお別の実施態
様は、核酸を非ヒト動物、またはその祖先に導入すること（ここで上記の核酸は
、変異体ＧＥＮＥ ＳＥＴ遺伝子配列を含む）を包含するプロセスの産物である
組換え非ヒト動物を開示する。

【０１１３】 （特定の実施態様） 自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）、発作の傾向がある（ｓｔｒｏｋｅ−ｐｒｏ
ｎｅ）ＳＨＲ（ＳＨＲ−ＳＰ）およびコントロールのＷｉｓｔａｒ Ｋｙｏｔｏ
ラット（ＷＫＹ）に由来する心臓、脳、脂肪、肝臓および腎臓の組織を、コント
ロールＷＫＹ動物と比較して、ＳＨＲラットおよびＳＨＲ−ＳＰラットにおいて
示差的に発現されている遺伝子の同定および特徴付けを容易にするために、Ｇｅ
ｎｅＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）方法論（米国特許第５，８７１，６９７号）に
よって分析した。

【０１１４】 （材料および方法） （動物）６〜７週齢の雄性ＳＨＲラット、ＳＨＲＳＰラット、およびＷＫＹラ
ット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ．，Ｉｎｃ．）を、安楽死の前に
少なくとも１週間、同時に環境に慣れさせ、ペレットにしたラット固形飼料およ
び水を自由に与え、そして光および温度の制御された部屋で飼育した。

【０１１５】 （総細胞ＲＮＡおよびポリ（Ａ）⁺ｍＲＮＡの単離） ＳＨＲラット、ＳＨＲ−ＳＰラットおよびＷＫＹラットを、通常のラット固形
飼料（Ｐｕｒｉｎａ）および水を自由にして維持した。１３週齢のラットを屠殺
し、そして心臓、肝臓、脂肪、腎臓および脳の組織を取り出し、そして切開直後
に液体窒素中に迅速に凍結した。器官全体を、その後の処理のために−７０℃で
保存した。

【０１１６】 総細胞ＲＮＡを、５ｍｇの心臓、肝臓、脂肪、腎臓、または脳の組織から、ま
ず組織を液体窒素中で微細な粉末に粉砕することによって抽出した。次いで、こ
の粉末化された組織を、５００μｌのＴｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標
）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ）
を含むチューブに移し、そしてＰｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザー（Ｂｒｉｎｋｍ
ａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ；Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）を使用して、Ｔｒｉ
ｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）中に分散させた。例えば、Ｃｈｏｍｓｚｙ
ｎｓｋｉら、１９８７．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２、１５６〜１５９；
Ｃｈｏｍｓｚｙｎｓｋｉら、１９９３．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５：５
３２〜５３３，５３６〜５３７を参照のこと。次いで、総細胞ＲＮＡ画分を、相
分離を容易にするために、５０μｌの１−ブロモ−３−クロロプロパン（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．；Ｃｉｎｃｉｎａｔ
ｔｉ，ＯＨ）で抽出した。抽出混合物を、１２，０００×Ｇにて４℃で１５分間
遠心分離し、そして水相を取り出し、そして新鮮なチューブに移した。夾雑ＤＮ
Ａを、必要に応じて、０．０１Ｍ ＤＴＴ（ＢＲＬ）および１ｕ／μｌのＲＮａ
ｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の存在下におけるＤｎａｓｅＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍ
ａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）での処理によってこの段階で取り除いた。次いで、ＲＮＡ
を、使用された最初の容量のＴｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）あたり
０．５容量のイソプロパノールで沈澱させた。そしてこのサンプルを、１２，０
００×Ｇで１０分間室温で再び遠心分離した。次いで、上清を廃棄し、ペレット
を７０％エタノールで洗浄し、そして１２，０００×Ｇで室温にて５分間再度遠
心分離した。最後に、７０％エタノールを取り除き、そして遠心チューブを逆さ
まにして、その位置で立てて乾燥させた。得られたＲＮＡペレットを、１００μ
ｌの水（すなわち、１μｌ／最初の組織重量ｍｇ）中に再懸濁させ、そして完全
に溶解するまで５５℃まで加熱した。総細胞ＲＮＡの最終濃度を、ＯｌｉＧｒｅ
ｅｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ；Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）
を備える蛍光測定法によって定量した。さらに、総細胞ＲＮＡの質を、分光測定
法およびホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動の両方によって決定した。あ
るいは、このＲＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出によって得、そしてＲＮ
Ａの質を再度、分光測定法およびホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動によ
って評価した。

【０１１７】 ポリ（Ａ）^-ＲＮＡを、製造業者によって指示されるように、オリゴ（ｄＴ）
磁気ビーズ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を備えるかま
たはＤｙｎａｂｅａｄｓ ｍＲＮＡ Ｄｉｒｅｃｔ Ｋｉｔ（登録商標）（Ｄｙ
ｎａｌ；Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）を備えた、アフィニティークロマトグラフィ
ーを使用して、１００μｇの総細胞ＲＮＡから調製した。得られた産物を、低容
量の滅菌水中に回収し、そして最終的な収量を、ＯＤ₂₆₀測定およびＯｌｉＧｒ
ｅｅｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ；Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ
）を用いた蛍光測定法によって定量した。ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを、ｃＤＮＡ合成
およびＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）プロトコルにおける引き続く利用の
ために−２０℃で貯蔵した。

【０１１８】 （ｃＤＮＡ合成） ｃＤＮＡ合成の前に、サンプルが上記の任意の段階で処理されていなかった場
合に、上述の組織に由来する各々のポリ（Ａ）⁺ＲＮＡサンプルを、ＤＮａｓｅ
で処置し、内因性の夾雑ＤＮＡを除去した。１００ｍｇの組織あたり２８μｌの
５×逆転写酵素緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｇａｉｔｈｅｒ
ｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、１０μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ、５ユニットのＲＮＡｇｕａ
ｒｄ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓ
ｗｅｄｅｎ）および１００ｍｇの組織あたり１ユニットのＲＮａｓｅを含まない
ＤＮａｓｅＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、再懸濁したＲＮＡサ
ンプルに添加した。次いで、この反応混合物を、３７℃で２０分間インキュベー
トした。総ＲＮＡ濃度を、１００倍希釈物のＯＤ₂₆₀を測定することによって定
量し、そしてこれらのサンプルを−２０℃で貯蔵した。

【０１１９】 ｃＤＮＡを、ポリ（Ａ）^-ＲＮＡから以下の通りに合成した：上述の組織の各
々から単離された１．０μｇのポリ（Ａ）^-ＲＮＡを、１０μｌの水中で、５０
ｎｇのランダムヘキサマープライマー（５０ｎｇ／μｌ）と混合した。これらの
混合物を、７０℃まで１０分間加熱し、氷水スラリー中で素早く冷やし、そして
氷上で１〜２分間維持した。次いで、凝縮物を、微量遠心機におけるおよそ１０
秒間の遠心分離によって収集した。

【０１２０】 第１鎖合成を、反応混合物に以下のものを加えることによって実行した：プラ
イマーがアニールしたポリ（Ａ）⁺ＲＮＡの各々に対して、４μｌの５×第１鎖
緩衝液（ＢＲＬ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌ
ａｎｄ、ＮＹから）、２μｌの１００ｍＭ ＤＴＴ、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴ
Ｐミックス、および２μｌの水。あるいは、２００ｐｍｏｌのオリゴ（ｄＴ）２
５Ｖ（Ｖ＝Ａ、ＣまたはＧ）（配列番号４３）を、第１鎖合成反応においてプラ
イマーとして利用した。次いで、この反応混合物を、３７℃で２分間インキュベ
ートし、続いて、４００ｕのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（登録商標）逆転写
酵素（ＢＲＬ）を含む１μｌを添加し、そしてこの反応物を３７℃で１時間イン
キュベートした。

【０１２１】 次いで、第２鎖ｃＤＮＡ合成を行った。サンプルを氷上に配置し、そして第１
鎖反応混合物の各々に以下のものを加えた：３０μｌの５×第２鎖緩衝液、９０
μｌの冷水、３μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、１μＬ（１０ユニット）のＥ．ｃｏ
ｌｉ ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）、４μｌ（４０ユニット）のＥ．ｃｏｌｉ Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩ（ＢＲＬ）、および１μｌ（３．５ユニット）のＥ．ｃｏｌ
ｉ ＲＮａｓｅＨ（ＢＲＬ）。そしてこの反応混合物を、１６℃で２時間インキ
ュベートした。次いで、得られた二本鎖ｃＤＮＡを２μｌのＴ４ ＤＮＡポリメ
ラーゼ（５ユニット）とともに、１６℃で５分間インキュベートした。

【０１２２】 次いで、得られたｃＤＮＡを、各反応混合物に以下のものを加えて、Ａｒｃｔ
ｉｃ Ｓｈｒｉｍｐ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（「ＳＡＰ」
；ＵＳＢ；Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＯＨ）で脱リン酸化した：２０μｌ １０×Ｓ
ＡＰ緩衝液、２５μｌの水、および５μｌ（５ユニット）のＳＡＰ。この反応物
を、３７℃で３０分間インキュベートした。

【０１２３】 このｃＤＮＡを、フェノール／クロロホルム（５０：５０ｖ／ｖ）、クロロホ
ルム／イソアミルアルコール（９９：１ｖ／ｖ）で抽出し、そして０．３Ｍ、２
０μｇグリコーゲンへのＮａＯＡｃ（ｐＨ５．０）の添加によって水相から沈澱
させ、続いて２．５容量のエタノールを添加して、−２０℃で１０分間インキュ
ベートした。このｃＤＮＡを、１４，０００×ｇで１０分間遠心分離することに
よって収集した。次いで、この上清を吸引し、そして得られたｃＤＮＡペレット
を７５％エタノールで洗浄し、ＴＥ緩衝液（ｐＨ＝７．０）中に再懸濁し、そし
てｃＤＮＡの収率を、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ；Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を用いて蛍光測定法を使用して評価した。

【０１２４】 （ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）方法論） ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）方法論は、ｃＤＮＡ断片化、タグ化およ
び増幅（米国特許第５，８７１，６９７号を参照のこと）を含み、そしてＳｈｉ
ｍｋｅｔｓら（１９９９、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７、７９８〜８０３）に
おける３工程のプロセスを包含する。対を構成する２つの制限酵素の各々５ユニ
ット、１ｎｇの二本鎖ｃＤＮＡおよび５μｌの適切な１０×制限エンドヌクレア
ーゼ緩衝液を含む５０μｌ反応ミックスにおいて、９６対までの制限エンドヌク
レアーゼ各々についての別々の制限酵素消化を行うことによって、断片化を達成
した。全てのｍＲＮＡの分析を、８０と９６との間の個数の別々のセットのｃＤ
ＮＡ断片化反応を行うことによって達成した（各々は、異なる対の制限酵素を用
いる）。タグ化を、ｃＤＮＡフラグメントの５’末端および３’末端に適合性の
末端を有する増幅カセットの連結によって達成した。フルオレスカミン（ＦＡＭ
）標識を、ＰＣＲプライマーの一方の５’末端上に取り込ませ、そしてビオチン
標識を第２のプライマー中に取り込ませた。連結反応のインキュベーションを、
１０ｍＭ ＡＴＰ、２．５％ ＰＥＧ、１０ユニットＴ４ ＤＮＡリガーゼおよ
び１×リガーゼ緩衝液において、１６℃で１時間行った。

【０１２５】 ＰＣＲ増幅を、反応チューブの各々への以下の試薬の添加によって行った：２
μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、５μｌの１０×ＴＢ緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ
、１６０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、ｐＨ９．１５）、０．２
５μｌのＫｌｅｎＴａｑ（登録商標）（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ａｄｖａｎｔａｇ
ｅ）：ＰＦＵ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）
（１６：１）および３２．７５μｌのＨ₂Ｏならびに２つのユニバーサルプライ
マー（このプライマーの一方の末端は、５’末端でビオチン標識されている）。
二十（２０）サイクルの増幅（９６℃で３０秒、５７℃で１分、７２℃で２分）
、続いて７２℃で１０分を、機械化された蓋を備えたＰＴＣ−１００ Ｔｈｅｒ
ｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ）
において行った。

【０１２６】 ＰＣＲ後の増幅産物の精製を、ストレプトアビジン磁気ビーズ（ＭＰＧ（登録
商標）ビーズ；ＣＰＧ、Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ；ＮＪ）を使用して行った。
緩衝液１（３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、
ｐＨ７．５）での２回のビーズの洗浄後に、２０μｌの緩衝液１を、ＰＣＲ産物
と室温で１０分間混合し、そしてこの混合物をストレプトアビジンビーズに添加
した。これらのビーズを磁石で分離し、そして緩衝液２（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、
１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で一回洗浄した。次いで、これらを乾燥させ、
そして３μｌの緩衝液３（８０％（ｖ/ｖ）ホルムアミド、４ｍＭ ＥＤＴＡ、
５％ ＴＡＭＲＡタグ化またはＲＯＲタグ価分子サイズ標準物（ＰＥ−Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）中に再懸濁し
た。９６℃で３分間の変性後、次いで、サンプルを５％ポリアクリルアミドゲル
、６Ｍ尿素、０．５×ＴＢＥ超薄（ｕｌｔｒａｔｈｉｎ）ゲル上にロードし、そ
して所有権のあるＮｉａｇａｒａ（登録商標）ゲル電気泳動システム上で電気泳
動した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲプライマーの一方の５’末端にある蛍光ＦＡＭ標
識によって可視化した。蛍光検出およびストレプトアビジン−ビオチン選択工程
は、検出されたフラグメントすべてが両方の酵素によって消化されていることを
保証した。

【０１２７】 Ｎｉａｇａｒａ（登録商標）ゲル電気泳動システムの主要な成分は、定常レー
ザー励起および多色ＣＣＤ画像化システムを用いるプラットホームに搭載された
交換可能な水平超薄ゲルカセットである。各々のゲルカセットは、Ｂｅｃｋｍａ
ｎ Ｂｉｏｍｅｋ ２０００（登録商標）ロボットアーム（Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｓ
ｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して、９６ウェルプレートから直接、全部で４
８レーン（１２の幅の４サイクル）にロードされ得る。Ｎｉａｇａｒａ電気泳動
システムは、４５分で３０塩基と４５０塩基との間のフラグメントを分離すると
いう、ハイスループットの利点を有する。

【０１２８】 （Ｎｉａｇａｒａ（登録商標）Ｇｅｌ Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ（登録
商標）） Ｎｉａｇａｒａ（登録商標）ゲル電気泳動システムからの出力を、Ｊａｖａベ
ースのインターネットで準備されているＯｐｅｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｉｔｉａ
ｔｉｖｅ（ＯＧＩ）ソフトウェアスートを使用して処理した。ゲルの画像を、初
めに、質およびレーントラッキングについて視覚的に調べた。各々のレーンは、
単一のＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）反応のＦＡＭ標識産物および５０〜
５００ｂｐの範囲にわたる分子量「サイズラダー（ｓｉｚｉｎｇ−ｌａｄｄｅｒ
）」を含んだ。このラダーピークは、カメラフレーム（１Ｈｚで収集）と塩基対
（ｂｐ）で示すＤＮＡフラグメントサイズとの間の相関性を提供した。トラッキ
ングの後に、これらのレーンを抽出し、そしてサイズラダーにおけるピークを確
認した。ラダーピーク間の線形内挿を利用して、蛍光トレースをフレームから塩
基対に変換した。最終的な品質管理（ＱＣ）工程は、種々の異常（ａｎｏｍａｌ
ｙ）（例えば、低いシグナル対ノイズ比、弱いピーク解像度、ラダーピークの損
失、およびレーンからレーンのサンプルの浸出）について調べた。前述の基準の
全てを通ったデータを、点毎の長さ対振幅アドレス（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ａｄ
ｒｅｓｓ）として、引き続く差異の同定のためにＯｒａｃｌｅ ８データベース
に提示した。

【０１２９】 （差異の同定） 各々のサンプルのセットを含む各々の制限酵素対（部分配列）について、複合
性トレース（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｔｒａｃｅ）を算定した。この複合性トレー
スの算定は、個々のサンプルの複製物の全て（代表的には、３つ）をまとめ、続
いて、コントロールセットのトレースに対して実験セットのトレースを正規化す
る、最も良好に一致させるためのスケーリングアルゴリズムを適用することを必
要とした。次いで、スケーリングされたトレースを点ごとの方式で比較して、統
計学的に有意な差異について、最小の予め特定された閾値を満たす振幅の差異の
領域を規定した。一旦、差異の領域を特徴付けると、各セットの対応するトレー
スについての局所的な最大値を同定した。差異の分散を、以下によって決定した
：

【０１３０】

【数１】 ここでλ₁（ｊ）およびλ₂（ｊ）は、スケーリング係数を表し、そして（ｊ：Ｓ
）は、複数のサンプルに対するトレース複合値（ｔｒａｃｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔ
ｅ ｖａｌｕｅ）を表す。差異が統計学的に有意である確率を、以下によって算
定した：

【０１３１】

【数２】 ここでｙは、相対強度である。全ての差異のピークを、特定された発現の差異の
分析における固有のデータベースアドレスとして保存した。

【０１３２】 （ノーザンブロット分析） 各々の遺伝子型の３匹の動物からの１μｇのポリ（Ａ）−ＲＮＡを、アガロー
ス／ホルムアルデヒドゲルにおいて電気泳動し、ＰＶＤ−ナイロンフィルターに
ブロットし、そして³²Ｐ−ｄＣＴＰで標識された充填（ｆｉｌｌ−ｉｎ）オリゴ
ヌクレオチドでプローブした。このハイブリダイゼーションを、Ｆｕｊｉ ＢＡ
Ｓ２０００（登録商標）を使用して、保存蛍光体イメージングプレート（ｓｔｏ
ｒａｇｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒ ｉｍａｇｉｎｇ ｐｌａｔｅ）を用いて定量した
。ブロットをストリッピングし、そして再プロービングして、Ｇａｄｐｈについ
て遺伝子発現レベルを正規化した。誘導レベルを、平均正規化ハイブリダイゼー
ションシグナルの比として表す。

【０１３３】 （ラジエーションハイブリッド（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄ）マッピ
ング） １０６の個々のハイブリッドからなる、市販されているラットＴ５５ラジエー
ションハイブリッドパネル（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ；Ｈｕｎｔｓ
ｖｉｌｌｅ、ＡＬ）を、この分析に利用した。ハイブリッドサンプル１、２０、
３５、３８、６０および９０は、パネル中の他のサンプルと比較した場合に、非
常に低い保持を有することが経験的に決定された。さらに、９６ウェル形式（９
４ＲＨサンプル、ならびに陰性コントロールおよび陽性コントロール）にてＰＣ
Ｒを効率的に実行するために、全部で９４のラットハイブリッド（ＲＨ）サンプ
ルを利用した。従って、上記の６つの低保持ＲＨサンプルを除くＴ５５ラジエー
ションハイブリッドパネルからのＲＨサンプル１〜１００を使用した。

【０１３４】 ＭａｐＰａｉｒｓ（登録商標）単純配列反復（ＳＳＲ）マーカー（Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を利用した。全てのマーカーを二連で行い、そして
対として評価／スコア付けした。ＲＨテンプレートを、Ｔｅｃａｎ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ １００（登録商標）ピペッティングロボットを使用して、２０ｎｇ／ウ
ェルで、３８４ウェルのＰＣＲプレート（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）中に分布さ
せ、そして乾燥させた。ＰＣＲ反応を、以下の濃度の試薬を使用して、５μｌの
総容量中で行った：０．５μＭの各プライマー、２００ｍＭ ｄＮＴＰ、１×Ｐ
Ｃ２緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．１）、１６ｍＭ硫酸アンモ
ニウム、３．５ｍＭＭｇＣｌ₂、１５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１×Ｒｅｄｉｌｏ
ａｄ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）および０．２５Ｕ ＫｌｅｎＴａ
ｑ（登録商標）（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ａｄｖａｎｔａｇｅ；ＡＢ Ｐｅｐｔｉ
ｄｅｓ，Ｉｎｃ．）。ＰＣＲ増幅反応条件（Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅ）は、以下
の通りであった：９４℃での初めの３分の変性；続いて、９４℃で３０秒の変性
；初めのアニーリング温度６５℃で３０秒；６８℃で３０秒間の伸長；第２サイ
クルのアニーリング温度６３℃で３０秒間；全てのその後のサイクルでは、全部
で３５サイクルについてアニーリング温度６０℃。次いで、ＰＣＲ産物を、１×
ＴＢＥ緩衝液を使用して、２００Ｖで３０分間の、３％アガロース（ＢＲＬ）ゲ
ルを通じる電気泳動に供した。ゲルの画像を、Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ
９５０（登録商標）画像化システムを使用して示した。全てのマーカーを２回分
類し、そして不一致な結果またはあいまいな結果を繰り返した。データをスプレ
ッドシートにて編集し、そしてＲＨＭＡＰＰＥＲ（Ｓｔｅｉｎら（１９９５）「
ＲＨＭＡＰＰＥＲ」、未刊行ソフトウェア、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔ
ｕｔｅ／ＭＩＴ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｈ
ｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｐｕｂ／
ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｒｈｍａｐｐｅｒ／にて利用可能）を使用して分析した。

【０１３５】 （結果および考察） （高血圧自然発症ラットにおいて示差的に発現される遺伝子の同定） 示差的遺伝子発現（ＤＧＥ）を、ＳＨＲラットおよびＷＫＹラットの腹部脂肪
組織、腎臓／副腎、心臓、脳および肝臓のｍＲＮＡで実施した。使用されたＤＧ
Ｅ方法は、上記（米国特許第５，８７１，６９７号を参照のこと）およびＳｈｉ
ｍｋｅｔｓ，Ｒ．Ａ．ら（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｐｒｏｆｉｌｉｎ
ｇ Ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ ａ Ｇｅｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｑｕｅｒｙ、Ｎ
ａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７、７９８−８０３（１９９９））に記載のように、
ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）であった。

【０１３６】 ６２〜１１９のＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）反応を、三つ組みのＳＨ
Ｒラット、ＳＨＲＳＰラット、およびＷＫＹラットの５つの各組織に対して、各
々、独特の制限酵素の対を用いて実施した。結果を表１に示す。表１は、遺伝子
型および器官による総遺伝子発現の差異を提供する。

【０１３７】 表１ ＳＨＲＳＰラット、ＳＨＲラットおよびＷＫＹラットにおける示差的遺
伝子発現

【０１３８】

【表１】 ＊示差的に発現された遺伝子フラグメントの数を決定する際に使用された１．５
倍カットオフ ◆示差的に発現された遺伝子フラグメントの数を決定する際に使用された２倍カ
ットオフ。

【０１３９】 多数の反応を、脳のような、より高度な転写複雑性を有する組織において実施
し、発現される配列の適切な適用範囲を確証する。１１．５８３（心臓）〜３６
．４５２（脳）のアバンダンスの、異なる遺伝子フラグメントを測定した（表１
）。これは、転写される遺伝子の約８５％の範囲を表す。ＳＨＲラットおよびＷ
ＫＹラットにおける各遺伝子フラグメントのアバンダンスの比較により、高血圧
、肥満症、およびインスリン抵抗性と潜在的に関連する遺伝子のリストを同定し
た。１０８（心臓）〜３８３（脳）の遺伝子フラグメント（これは、アッセイさ
れる遺伝子フラグメントの０．７％〜１．４％を表す）が、発現において、２つ
の株間で１．５倍より大きく改変された（表１）。これらの示差的に発現される
遺伝子の正体を、公的に利用可能なラット配列のデータベース（図１を参照のこ
と）において、整合する制限断片長を有する遺伝子を見出すことによって解読し
た。新規の遺伝子（このデータベースにおける整合を有さないフラグメントに対
応する）を、単離および配列決定した。ノーザンブロットおよび／または競合的
ＰＣＲによる遺伝子発現差異の独立的確認を、９２個の遺伝子フラグメント（こ
れは、５８個の遺伝子を表す（いくつかの遺伝子は、１回より多くアッセイされ
たため［表１および２］））について得た。表２は、ＳＨＲラットとＷＫＹラッ
トとの間の示差的遺伝子発現を例証する。５つの組織のすべてにわたる示差的遺
伝子発現を例証する。ここで、「＋」は、ＳＨＲにおけるｍＲＮＡアバンダンス
の増加を示し、そして「−」は、ＳＨＲにおけるｍＲＮＡアバンダンスの減少を
示す。遺伝子がマッピングされた染色体を示し、そして「^*」は、その遺伝子が
既知のＱＴＬ内の位置にマッピングされていることを示す。さらに、適用可能で
ある場合には、本発明により同定されたアミノ酸残基置換もまた提供する。

【０１４０】 表２：ＳＨＲラットとＷＫＹラットとの間の遺伝子発現の差異

【０１４１】

【表２】 。

【０１４２】 代表的なＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）クロマトグラムを、図１〜２に
示す。発現結果を確認するためにノーザンブロット分析を実施し、そしてそれを
以下に記載する。５８個の遺伝子のうちの１５、またはそれらのコードするタン
パク質は、ＳＨＲ系統とコントロール系統との間で発現または活性において異な
ることが以前の研究で示されており、これは、ＤＧＥに対するＧｅｎｅＣａｌｌ
ｉｎｇ（登録商標）の有効性を実証する。

【０１４３】 腎臓／副腎において示差的に発現されるいくつかの遺伝子は、高血圧またはイ
ンスリン抵抗性因果律についての優れた候補である。これらのうちの２つである
ステロイド２１−ヒドロキシラーゼ（Ｃｙｐ２１）および３−β−ヒドロキシス
テロイドデヒドロゲナーゼ（Ｈｓｄｂ３）は、ステロイド合成酵素をコードする
。このステロイド合成酵素の欠如は、不適切なアルドステロン合成および過剰な
ナトリウム排泄を通して低血圧へと導き得る（それぞれ、ＣＹＰ２１欠損；Ｊｏ
ｓｐｅら、１９８７、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ
．１４２、７９８−８０４）、ＯＭＩＭ ２０１９１０、およびＨＳＤＢ３欠損
、ＯＭＩＭ ２０１８１０。Ｈｓｄｂ３は、ＳＨＲ腎臓／副腎において８５倍増
加したが、Ｃｙｐ２１は４．４倍増加した（表２、図１）。これらの変化は、副
腎コルチコイド合成を増加し、おそらくＳＨＲラットで観察された塩類貯留およ
び高血圧を生じさせると予測され得る。この仮説の支持は、顕性の鉱質コルチコ
イド過剰２型（ＯＭＩＭ ２０７７６５）の症候群であり、ここでは、関連の１
１−β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子における欠損が、コルチ
コイド合成の増加および高血圧を生じさせる。

【０１４４】 ステロイド代謝に関与するいくつかの他の酵素の発現もまた、ＳＨＲの腎臓／
副腎で調節された。これには、１５−ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲ
ナーゼ（プロスタグランジン分解の主要な酵素）、および２０−α−ヒドロキシ
ステロイドデヒドロゲナーゼが挙げられる。これらの遺伝子における欠損は、ヒ
トの障害と関連していないが、ＳＨＲにおいてこれらのすべての酵素の発現で観
察された増加はまた、血圧またはインスリン応答性の観点から重要であり得ると
考えられる鉱質コルチコイドおよび糖質コルチコイドの産生において、改変を引
き起こすことが予測され得る。これに関して、ヒトＣＹＰ２１欠損の他の特徴が
低血糖症および肥満症であることに留意すべきである（Ｃｏｒｎｅａｎ，Ｒ．Ｅ
．、Ｈｉｎｄｍａｒｓｈ，Ｐ．Ｃ．およびＢｒｏｏｋ，Ｃ．Ｇ．、１９９８、Ｏ
ｂｅｓｉｔｙ ｉｎ ２１−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｐ
ａｔｉｅｎｔｓ、Ａｒｃｈ．Ｄｉｓ．Ｃｈｉｌｄ ７８、２６１−２６３）。

【０１４５】 ３つの輸送体（ナトリウム−グルコース輸送体［Ｓｇｌｔ２］（表２および図
２）、有機アニオン輸送タンパク質ＮＫＴ、およびアクアポリン−３［Ａｑｐ３
］）が、ＳＨＲ腎臓において調節された。Ａｑｐ３と密接に関連する水チャネル
であるアクアポリン−２（Ａｑｐ２）の欠損は、腎性尿崩症（ＯＭＩＭ １２５
８００）を引き起こす。Ａｑｐ２は、ラットうっ血性心不全モデル（Ｎｉｅｌｓ
ｅｎら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４、５
４５０−５４５５）において示差的に発現されるが、Ａｑｐ３は、浸透圧的に駆
動される水分再吸収において機能する渇応答性の腎チャネル（ｒｅｎａｌ ｃｈ
ａｎｎｅｌ）である（Ｅｃｅｌｂａｒｇｅｒら、１９９５、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ．２６９、Ｆ６６３−Ｆ６７２）。ＳＨＲの腎臓におけるＡｑｐ３の発現
の増加は、容積膨張および高血圧を導く水分再吸収を潜在的に増加させ得る。

【０１４６】 Ｌ−キヌレニンのキヌレン酸への変換を触媒する２つの酵素である、キヌレニ
ンアミノトランスフェラーゼ（Ｋａｔ）およびキヌレニン／α−アミノアジピン
酸アミノトランスフェラーゼ（Ａａｄａｔ）が、ＳＨＲの組織において改変され
た（以下を参照のこと）。９つの分泌タンパク質が、ＳＨＲにおいて示差的に発
現され、これには２つの補体成分（Ｃ１ｑβおよびＣ３）および３つのプロテア
ーゼインヒビター（カリスタチン（ｋａｌｌｉｓｔａｔｉｎ）、コントラプシン
（ｃｏｎｔｒａｐｓｉｎ）関連、およびプロテイナーゼインヒビターα−Ｉ−Ｉ
ＩＩ）が含まれる。Ａｎｆ（これは、血圧を調節する）およびインスリン様増殖
因子−１（これは、インスリンレベルに影響する）が、それぞれ、心臓および肝
臓での発現において適度に変化した。

【０１４７】 脂肪酸輸送体（Ｃｄ３６、Ａｐｏｂ、および低分子量脂肪酸結合タンパク質）
に関与する３つの遺伝子が、ＳＨＲの脂肪において調節された。ＳＨＲ脂肪細胞
における脂肪酸結合タンパク質の心臓アイソフォーム（ＦＡＢＰ−Ｈ）の発現増
加は、ＦＡＢＰファミリーのこのメンバーについてのインスリン抵抗性における
役割を示唆する。なぜなら、関連のＦＡＢＰにおける改変体は、肥満症、脂肪代
謝異常症、およびインスリン抵抗性に関連していたからである（Ｈｏｔａｍｉｓ
ｌｉｇｉｌ，Ｇ．Ｓ．ら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４、１３７７−１３
７９；Ｂａｉｅｒ，Ｌ．Ｊ．ら、１９９５、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５
、１２８１−１２８７）。この遺伝子のｃＤＮＡ配列は、ＳＨＲラットおよびＷ
ＫＹラットにおいて同一であったが、検出された種々のレベルのｍＲＮＡは、Ｓ
ＨＲインスリン抵抗性表現型に寄与するタンパク質レベルに影響し得る。

【０１４８】 ＳＨＲとＭＫＹとの間の遺伝子発現差異の大半が組織特異的であった。このこ
とは、異なる遺伝子がＳＨＲ特異的な疾患特性の各々と関連付けられ得ることを
示唆する（表２）。１つのハウスキーピング遺伝子であるα−可溶性ＮＳＦ接着
タンパク質（α−ＳＮＡＰ）は興味深い。なぜなら、そのアバンダンスが、研究
されたすべての組織において調節され、このことはその遺伝子発現における全身
的な改変を示唆するからである。α−ＳＮＡＰは、主要なインスリン応答性グル
コース輸送体ＧＬＵＴ４の細胞表面への移行に関与していることが公知であるの
で、この発現における著しい減少は、ＳＨＲにおけるインスリン抵抗性の機構の
一部分を説明し得る。

【０１４９】 （ＳＨＲＳＰラットにおいて示差的に発現される遺伝子の同定） ＤＧＥをまた、ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）を使用して、ＳＨＲＳＰ
およびＳＨＲの心臓、脳、および腎臓のｍＲＮＡに対して実施した。５７（腎臓
）〜１１５（脳）のＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）反応を、三つ組みのＳ
ＨＲラットおよびＷＫＹラットの各組織（表１）に対して、各々、独特の制限酵
素の対を用いて実施した。これは、７４８８（腎臓）〜３５７３９（脳）の異な
る遺伝子フラグメントのアバンダンスの測定を可能にする（表１）。ＳＨＲＳＰ
ラットおよびＳＨＲラットにおける各遺伝子フラグメントのアバンダンスの比較
は、発現において１．５倍より大きく改変され（表１）そして潜在的に発作と関
連付けられ得る２４（心臓）〜１５０（脳）の遺伝子フラグメント（すなわち、
アッセイされた遺伝子の０．２％〜０．５％）を同定した。これらの各遺伝子の
正体を決定し、そしてノーザンブロットおよび／または競合的ＰＣＲによる発現
差異の独立的確認を、３３個の遺伝子フラグメント（これは、２６個の遺伝子を
表す（表１および３））について得た。表３は、ＳＨＲ−ＳＰラットとＳＨＲラ
ットとの間の示差的遺伝子発現を提示する。５つの組織のすべてにわたる示差的
遺伝子発現を提示する。ここで、「＋」は、ＳＨＲ−ＳＰにおけるｍＲＮＡアバ
ンダンスの増加を示し、そして「−」は、ＳＨＲ−ＳＰにおけるｍＲＮＡアバン
ダンスの減少を示す。遺伝子がマッピングされた染色体を提供し、そして「^*」
は、その遺伝子が既知のＱＴＬ内の位置にマッピングされていることを示す。さ
らに、適用可能である場合には、本発明により同定されたアミノ酸残基置換もま
た提供する。

【０１５０】 表３ ＳＨＲＳＰラットとＳＨＲラットとの間の遺伝子発現差異

【０１５１】

【表３】 。

【０１５２】 代表的なＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）クロマトグラムを、図２に示す
。発現結果を確認するためにノーザンブロット分析を実施し、そしてそれを以下
に記載する。２６個の遺伝子のうちの２つのみ（Ａｎｆおよびα心臓ミオシン重
鎖）が、ＳＨＲＳＰ系統とコントロール系統との間で発現において異なることが
以前の研究で示されている（Ｋｉｍら、１９９６、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏ
ｌ．１１８、５４９−５６）。

【０１５３】 既知の遺伝子の中で、ＳＨＲＳＰの脳において調節されるのは２つの解糖酵素
［β−β−エノラーゼおよびアルドラーゼＡ（Ａｌｄｏａ）］であった。このこ
とは、ＳＨＲＳＰの脳におけるグルコース代謝の改変を示唆する。

【０１５４】 興味深いことに、出血性発作の高い発生率を有する障害である脳のアミロイド
アンギオパシー（ＯＭＩＭ １０５１５０；Ｇｈｉｓｏら、１９８６、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：２９７４−２９７８）において
変異されることが以前に示された、シスタチンＣ（Ｃｓｔ３）が、ＳＨＲＳＰの
脳において増加した。ヒト変異は、シスタチンＣがプロテイナーゼを阻害する能
力を改変しなかったが、これはアミロイド沈着へと導く二量体化および凝集体化
を可能にする。しかし、ＳＨＲＳＰの発作におけるＣｓｔ３の役割に反して、Ｓ
ＨＲＳＰの脳にアミロイドーシスはない。

【０１５５】 （示差的に発現される遺伝子のマッピング） 示差的に発現される候補遺伝子の染色体位置を、１６００を超える遺伝マーカ
ーについて類型化されたラット照射ハイブリッドパネルを用いて決定した（Ｓｔ
ｅｅｎ，Ｒ．Ｇ．ら、Ａ ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ
ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｋａｇｅ ａｎｄ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄ
ｍａｐ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｒａｔ．Ｇｅｎ．Ｒｅｓ．（
出願時に印刷中））。候補遺伝子の遺伝子型決定に続き、マップ位置をＲＨＭＡ
ＰＰＥＲを用いて構築した。マッピングされた遺伝子の例を示す（図３、表２お
よび３）。差時的に発現された遺伝子のマップ位置を、以前に報告された発作、
高血圧、インスリン抵抗性、および肥満症のＱＴＬと比較した。染色体位置が決
定された差時的に発現される遺伝子３４個のうち、７つが以前に記載されたＱＴ
Ｌの支持間隔（ｓｕｐｐｏｒｔ ｉｎｔｅｒｖａｌ）内にマッピングされた（図
３、表２および３）：Ｋａｔは、Ｃｈｒ３上のＳＨＲの高血圧ＱＴＬ内にマッピ
ングされた；Ｃｄ３６は、Ｃｈｒ４のテロメアの同時発生的なＳＨＲのインスリ
ン抵抗性、高血圧、および高トリグリセリド血症ＱＴＬ内にマッピングされた；
Ｓｇｌｔ２およびＡｌｄｏａは、高血圧および発作ＱＴＬに対する支持間隔（Ｇ
ｕら、１９９６、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７、７７７−７８８；Ｒｕｂ
ａｔｔｕら、１９９６、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１３、４２９−４３４）内の、Ｃ
ｈｒ１上のＳａ遺伝子座近傍にマッピングされた；Ａｎｆは、発作潜伏期間の増
加についてのＳＨＲＳＰ ＱＴＬ（Ｒｕｂａｔｔｕら（１９９６））内のＣｈｒ
５上にマッピングされた；およびＣｈｒ２０の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨ
Ｃ）クラスＩ遺伝子、ＬＷ２およびα鎖は、ＳＨＲ高血圧ＱＴＬ内にマッピング
された（図３、表２および３）。

【０１５６】 （候補遺伝子の変異検出） ＱＴＬの支持間隔内にマッピングされた１４個の示差的に発現される遺伝子を
、ＳＨＲＳＰ系統、ＳＨＲ系統、およびＷＫＹ系統におけるｃＤＮＡ配列の変動
について試験した。非保存的アミノ酸置換が、ＳＨＲＳＰラットおよびＳＨＲラ
ットにおいて発作、高血圧、およびインスリン抵抗性に寄与し得る遺伝子のうち
の５つにおいて見出された（Ａｌｄｏａ、Ｋａｔ、Ｃｄ３６、Ｓｇｌｔ２および
Ａｎｆ）（表３および４；図４）。

【０１５７】 （Ｃｄ３６） Ｃｄ３６発現は、ＳＨＲの心臓および脂肪組織において有意に低減されること
が見出された（図２Ｃ）。さらに、Ｃｄ３６は、グルコース取りこみに関連する
インスリン抵抗性および高トリグリセリド血症に対するＳＨＲ ＱＴＬ内にマッ
ピングされた（図３Ｂ）。脂肪酸輸送タンパク質（ＦＡＴ）／ＣＤ３６ホモログ
は、多数のアミノ酸置換を含むことが見出された。アミノ酸置換を保有するＳＨ
Ｒ−ＳＰ、ＳＨＲ、ＷＫＹおよびヒトにおけるＦＡＴ／ＣＤ３６改変体のアミノ
酸残基１４８〜１９１および２１３〜２５７の領域のアミノ酸配列を図４に示す
（それぞれ、（配列番号１０〜１３）および（配列番号１４〜１７））。この結
果はまた、異なるＤＧＥアプローチを使用したＤＧＥおよびＲＨマッピングに基
づいて、Ｃｄ３６をＳＨＲのインスリン抵抗性ＱＴＬに関する候補遺伝子として
同定した、Ａｉｔｍａｎら（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１、７６−８３（１９９９
））によって見出された。ＳＨＲ Ｃｄ３６における複数の配列改変体が、重複
した祖先のＣｄ３６遺伝子（Ａｉｔｍａｎら（１９９９））の不等ゲノム組換え
の結果であることが見出された。さらに、このグループは、ＳＨＲの心臓および
脂肪組織の形質膜におけるＣＤ３６タンパク質の欠如を実証し、そしてトランス
ジェニックマウスにおけるＣＤ３６過剰発現が、血液のトリグリセリドおよび脂
肪酸の低下を生じさせることを見出した。

【０１５８】 ラットにおけるＳＨＲ ＣＤ３６対立遺伝子とインスリン抵抗性との間の関連
は、このレセプターの重要な機能を示唆し、そしてＣｈｒ７ｑの潜在的相同領域
に対してヒトにおいて対応するＮＩＤＤＭの連鎖の知見は、ＣＤ３６が同様にヒ
トでのインスリン抵抗性において因果的役割を果たし得ることを示唆する。この
糖尿病とのＣｄ３６の関連は、以前には確証されていなかった。これに関して、
本発明は、ＩＩ型（または、非インスリン依存性）糖尿病についてのモデルであ
るＧｏｔｏ−ＫａｋｉｚａｋｉラットにおけるＣｄ３６発現のレベルが、正常な
ラットより２０倍高いことを見出した。この観察は、被験体がＩＩ型糖尿病に罹
患しやすいか否かを評価する手段としての、Ｃｄ３６ ｍＲＮＡまたはＣＤ３６
タンパク質の発現に対して診断的なプローブの使用を示唆する。この遺伝子およ
び遺伝子産物はまた、ＩＩ型糖尿病への素因を取り消すため、またはＩＩ型糖尿
病を有すると診断された被験体または肥満である被験体を処置するための治療的
介入の標的として作用し得る。

【０１５９】 形質膜の脂肪酸の結合および移入に加えて、Ｃｄ３６は、トロンボスポジンお
よびコラーゲンに結合する血小板接着分子として機能する。ヒトにおけるＣＤ３
６変異は、血小板−コラーゲンの接着における欠損へと導く（Ｆｒｉｅｄａ，Ｓ
．、Ｐｅａｒｃｅ，Ａ．、Ｗｕ，Ｊ．およびＳｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ｌ．
、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０、２９８１−２９８６；Ｒｉｇｏ
ｔｔｉ，Ａ．、Ａｃｔｏｎ，Ｓ．Ｌ．およびＫｒｉｅｇｅｒ，Ｍ．、１９９５、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０、１６２２１−１６２２４；Ｉｂｒａｈｉｍｉ
，Ａ．ら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３、
２４２６−２６５１；Ｄｉａｚ−Ｒｉｃａｒｔ，Ｍ．ら、１９９６、Ａｒｔｅｒ
ｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１６、８８３−８８８）
。これに関して興味深いことに、ＳＨＲＳＰのＣｄ３６遺伝子は、ＳＨＲ由来の
さらなるアミノ酸変動についてコードし、そしてＳＨＲＳＰのＣｈｒ４発作保護
的遺伝子座（Ｒｕｂａｔｔｕ，Ｓ．ら（１９９６））の近傍にマッピングされる
。これは、同様に、発作表現型へのＣｄ３６の関与の可能性を示唆する。

【０１６０】 （ナトリウム−グルコース共輸送体、Ｓｇｌｔ２） Ｓｇｌｔ２は、ＳＨＲの腎臓におけるアバンダンスにおいて減少し（図２Ｂ）
、ＳＨＲの高血圧ＱＴＬ内にマッピングされた（図３Ａ）。これは、高度に保存
されたアミノ酸（Ｌ６３８Ｑ；図４）の非保存的置換を含むことが見出された。
ＳＨＲ、ＷＫＹ、ヒト、ウサギ、およびブタにおけるＳＧＬＴ２改変体（Ｌ６３
８Ｑ）のアミノ酸置換を保有する領域のアミノ酸配列を、図４（配列番号１〜５
）に示す。この知見は、Ｓｇｌｔ２における変動が、ＳＨＲラットにおける高血
圧に直接的に関与し得ることを示唆する。選択性、化学量論または活性化状態に
作用する活性化変異は、ナトリウム再吸収を増加させ得、これは、血漿容積膨張
および同時発生的な高血圧へと導く。同様に、この輸送体酵素を通したグルコー
ス再吸収の増加は、血漿グルコースの増加へと導き得る。興味深いことに、ナト
リウム−グルコース共輸送体のインヒビターは、糖尿病におけるオイグリセミッ
クとして前臨床研究において使用されている（Ｔｓｕｊｉｈａｒａ，Ｋ．ら、１
９９６、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（Ｔｏｋｙｏ）４４：１１７４−１
１８０）。

【０１６１】 （キヌレニンアミノトランスフェラーゼ、Ｋａｔ） Ｋａｔは、ＳＨＲおよびＳＨＲＳＰの腎臓におけるアバンダンスにおいて増加
した（図２Ａ）。これは、ＳＨＲＳＰの高血圧ＱＴＬ内にマッピングされた（図
３Ｂ）。そしてこの酵素は、ヒトからＣ．ｅｌｅｇａｎｓまでの全ての公知のＫ
ａｔホモログにわたり保存されている残基の電荷を変化させるアミノ酸置換（Ｅ
２７Ｇ；図４）を含むことが見出された。これは、Ｋａｔにおける変動が、ＳＨ
Ｒにおける高血圧に直接的に関与し得ることを示唆する。ＳＨＲ、ＷＫＹ、ヒト
および線虫におけるキヌレニンアミノトランスフェラーゼ改変体（Ｅ２７Ｇ）の
アミノ酸置換を保有する領域のアミノ酸配列を、図４（配列番号６〜９）に示す
。

【０１６２】 Ｋａｔ−Ｅ２７Ｇが野生型とは機能的に異なることの証拠は、ＷＫＹと比較し
た、ＳＨＲの脳および腎臓におけるＫａｔ活性の著しい減少を実証した以前の研
究（Ｋａｐｏｏｒ，Ｖ．、Ｋａｐｏｏｒ，Ｒ．およびＣｈａｌｍｅｒｓ，Ｊ．、
１９９４、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２１：８
９１−８９６；Ｋａｐｏｏｒ，Ｖ．、Ｔｈｕｒｕｔｈｙｉｌ，Ｓ．Ｊ．およびＨ
ｕｍａｎ，Ｂ．、１９９８、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ９、１４３１−１４３４
）に由来する。Ｋａｔは、Ｌ−キヌレニンからキヌレン酸（グルタミン酸作動性
（ｇｌｕｔａｍａｔｅｒｇｉｃ）神経伝達の内因性アンタゴニスト）への変換を
触媒する。血圧の制御における髄質のグルタミン酸作動性経路の重要性、ならび
にＳＨＲの心臓血管ニューロンのグルタミン酸への感受性の増加についての証拠
が蓄積されていることを考慮すると、Ｋａｔ−Ｅ２７Ｇが、ＳＨＲにおける高血
圧の病因において役割を果たし得ることは、もっともらしく思われる。さらに、
血液のキヌレニンレベルの増加が、難治性のヒト高血圧と関連付けられるという
いくつかの証拠が存在する（Ｒｕｄｚｉｔｅ，Ｖ．Ｋ．、Ｖｉｔｏｌ，Ａ．Ｖ．
、Ｌｉｅｐｉｎｊａ，Ｄ．Ｊ．およびＳｉｌａｖａ，Ａ．Ｋ．、１９９０、Ｃｏ
ｒ．Ｖａｓａ．３２、５６−６３）。キヌレニンアミノトランスフェラーゼ活性
を有する第２の酵素であるＡａｄａｔのアバンダンスの減少が、ＳＨＲの脂肪組
織において観察された。これはまた、以前に報告された、ＳＨＲにおけるＫＡＴ
活性の減少に寄与し得る（Ｋａｐｏｏｒ，Ｖ．、Ｋａｐｏｏｒ，Ｒ．およびＣｈ
ａｌｍｅｒｓ（１９９４）；Ｋａｐｏｏｒ，Ｖ．、Ｔｈｕｒｕｔｈｙｉｌ，Ｓ．
Ｊ．およびＨｕｍａｎ，Ｂ．（１９９８））。

【０１６３】 ＳＨＲ中の血圧に対するキヌレン酸の効果を直接的に試験するために、１２週
齢の動物に、２ｍｇ／ｋｇのキヌレン酸（Ｓｉｇｍａ）を用いて３日間静脈内に
投薬し、そして動脈内閉塞によりそれらの血圧を測定した。キヌレン酸を投薬さ
れた動物（ｎ＝２３）は、ビヒクルを投薬したＳＨＲ（ｎ＝２３）と比較して心
拍数、体重または血糖レベルにおいて有意な変化を伴うことなく、収縮期血圧（
３０ｍｍＨｇ、ｐ＝０．０８３）および拡張期血圧（３３．２ｍｍＨｇ、ｐ＝０
．０２７）における有意な増加を示した。これは、キヌレン酸が血圧に影響し得
ることの最初の直接的な証拠であり、そして主に腎臓および脳におけるキヌレン
アミノトランスフェラーゼの発現は、この経路が、腎臓から脳への血圧調節のフ
ィードバック機構に関与し得ることを示唆する。このキヌレン酸の効果はまた、
おそらくＮＭＤＡにおける、この化合物の生成のインヒビター、その分解の刺激
物質もしくはその作用の競合物、または他のアミノ酸レセプターが、ヒトにおけ
る血圧調節のための潜在的な治療剤への道であり得ることを示唆する。これらの
知見に基づいて、キヌレニン経路における遺伝子はまた、ヒト高血圧に対する優
れた候補遺伝子であり得る。

【０１６４】 これらの結果は、このような低血圧の被験体にキヌレン酸を投与することによ
り、低血圧を処置し得ることを示す。これらはまた、血圧が正常よりも高い被験
体においてＫＡＴの活性を阻害することの重要性を意味する。このようなインヒ
ビターを同定するために、本発明は、ＫＡＴの調製物を推定ＫＡＴインヒビター
と接触させること、および活性を阻害することに成功した物質として実際のイン
ヒビターを検出することにより、ＫＡＴ活性のインヒビターについてスクリーニ
ングする方法を含む。

【０１６５】 上記の結果はまた、アンタゴニストにより阻害可能であり得る、血圧関連グル
タミン酸作動性レセプターについての役割を示唆する；有利な場合では、このよ
うなアンタゴニストは、キヌレン酸と関連する。このような物質を同定するため
のスクリーニング方法は、脳のグルタミン酸作動性レセプターの調製物を推定ア
ンタゴニストと接触させる工程、およびこのレセプターに特異的に結合する任意
の物質をリードとして同定する工程を包含する。

【０１６６】 （Ａｎｆ） 以前の研究は、ＡｎｆがＳＨＲＳＰラットにおける発作感受性についてのもっ
ともらしい候補遺伝子であることを示唆した。例えば、ＡＮＦレベルが、発作患
者において上昇し（Ｅｓｔｒａｄａ，Ｖ．ら、１９９４、Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｐｅｒ
ｔｅｎｓ．７、１０８５−１０８９）、そして外因性ＡＮＦの投与は、急性発作
における脳水腫を減弱させる（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｇ．Ａ．およびＥｓｔｒａ
ｄａ，Ｅ．Ｙ．、１９９５、Ｓｔｒｏｋｅ ２６、８７４−８７７）。Ａｎｆ発
現の減少は、マウスにおいて用量依存様式で、塩感受性高血圧へと導く（Ｊｏｈ
ｎ，Ｓ．Ｗ．ら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７、６７９−６８１）。Ａｎ
ｆは、発作潜伏期間の増加および梗塞サイズの増加の両方を生じる、ラットＣｈ
ｒ５上のＳＨＲＳＰのＱＴＬに近接してマッピングされることが公知である（Ｒ
ｕｂａｔｔｕ，Ｓ．ら（１９９６）；Ｊｅｆｆｓ，Ｂ．ら、１９９７、Ｎａｔ．
Ｇｅｎｅｔ．１６、３６４−３６７）。これらの知見は、この遺伝子によりコー
ドされるペプチドホルモンについて、発作素因における新規の血圧非依存的な役
割を示唆する。

【０１６７】 Ａｎｆの発現は、Ａｎｆ発現およびＡＮＰレベルが、ＳＨＲまたはＷＫＹと比
較してＳＨＲＳＰの心室において（共に、６週齢で高血圧前）、および心室肥大
を伴う確立された高血圧において増強されることを示した以前の研究と一致して
、ＳＨＲＳＰの心臓において増加することが見出された（図２Ｅおよび２Ｆ）（
Ａｒａｉ，Ｈ．ら、１９８８、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．６２、９２６−９３０）。さ
らに、免疫細胞化学的研究は、ＳＨＲＳＰの心室筋細胞におけるＡＮＰの発現分
布が、ＷＫＹラットの心室筋細胞におけるより高いことを示した（Ｎｉｓｈｉｍ
ｕｒａ，Ｔ．、Ｍｉｚｕｋａｗａ，Ｋ．、Ｎａｋａｏ，Ｋ．、Ｙａｍａｄａ，Ｈ
．、Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，Ｍ．およびＯｃｈｉ，Ｊ．１９９４、Ａｒｃｈ．Ｈｉ
ｓｔｏｌ．Ｃｙｔｏｌ．５７、１−７）。内頸動脈における外因的に投与された
ＡＮＦの血管弛緩性（ｖａｓｏｒｅｌａｘａｎｔ）効果もまた、ＳＨＲラットま
たはＷＫＹラットよりＳＨＲＳＰラットにおいてより少ないことが示された（Ｒ
ｕｓｓｏ，Ｒ．ら、１９９８、Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．１６、１５１−１５６
）。

【０１６８】 ＳＨＲＳＰラット、ＳＨＲラット、およびＷＫＹラット由来のＡｎｆ ｃＤＮ
Ａの配列決定は、ＳＨＲＳＰにおける１３の配列の変化を明らかにした。Ｇｅｎ
ｅＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）はまた、これらのうちの１つである３’ＵＴＲに
おける２−ｂｐの欠失を直接的に同定した。プロホルモンであるｐｒｏＡＮＦ内
で高度に保存されたアミノ酸を変化させると予期された、１つのＳＨＲＳＰ配列
改変体を同定した。この改変体の遺伝子は、ヌクレオチド３６３で（配列Ｘ００
６６５と相対的に）ＧからＴへの置換を有し、これは７５位で保存されたグリシ
ンのセリン残基での置換を生じると予期された（図４Ｄ）。ＳＨＲ−ＳＰ、ＳＨ
Ｒ、ＷＫＹ、ヒト、ブタ、およびウマのプレプロナトリオヂラチン（ｐｒｅｐｒ
ｏｎａｔｒｉｏｄｉｌａｔｉｎ）改変体のアミノ酸置換を保有する領域のアミノ
酸配列を、図４（配列番号２６〜３１）に示す。Ｇ７５Ｓは、強力なナトリウム
排泄増加性活性を有するペプチドであるαＡＮＦ（ＡＮＦ９９−１２６）の組成
を改変しない。しかし、これは、ｐｒｏＡＮＦ（ＡＮＦ１−１２６）からのαＡ
ＮＦの切断に影響し得る。なぜなら、ｐｒｏＡＮＦのコンフォメーションが、特
定のＡＮＦエンドプロテイナーゼが忠実に作用するために必須であることが示さ
れたからである（ＲａｎｇａｒａｊｕおよびＨａｒｒｉｓ、１９９１、Ａｒｃｈ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２９０、４１８−４２６）。ＳＨＲＳＰの
発作潜伏期間およびサイズにおけるＡｎｆ−Ｇ７５Ｓの役割を叙述するために、
さらなる研究が必要である。興味深いことに、ＡＮＦは、食餌誘導性発作の異な
るラットモデルにおける発作の処置において治療的効果を有するようである（Ｌ
ｉｎら、１９９９、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ３３、２１９−２２４）。

【０１６９】 （ＡｌｄｏＡ） ＡｌｄｏＡは、試験されたすべてのＳＨＲＳＰ組織での発現において有意な減
少を示し（図２Ｄ）、Ｃｈｒ１上の発作素因のＱＴＬと共存し、そしてアミノ末
端近傍でメチオニンからバリンへの置換を含むことが見出された（図４Ｄ）。置
換されたメチオニンは、１２の哺乳動物種を含む試験された全ての種において、
完全に保存されている。血清および脳脊髄液のアルドラーゼＡ活性の測定は、発
作における予後マーカーとしての用途を見出したが、これまでＡｌｄｏＡが直接
的に関与し得るという証拠は存在していなかった。アルドラーゼＡは、第１染色
体上の発作素因遺伝子座にマッピングされることが実証され、そしてタンパク質
のアミノ末端近傍にメチオニン（Ｍｅｔ）からバリン（Ｖａｌ）へのアミノ酸置
換を保有した。アルドラーゼＡのアミノ酸配列が、多数の属および種を通して極
めて保存されていることに留意しなければならない。ＳＨＲ−ＳＰ、ＳＨＲ、Ｗ
ＫＹ、マウス、ヒト、アザラシ、イヌ、およびウサギにおけるアルドラーゼＡ改
変体のアミノ酸置換を保有する領域のアミノ酸配列を、図４（配列番号１８〜２
５）に示す。

【０１７０】 極めて保存されたアルドラーゼＡ遺伝子における示差的発現およびアミノ酸置
換の知見、ならびに発作素因の領域近傍でのその一致した位置は、この酵素（こ
の活性は、脳血管性傷害を有する患者の血清において上昇することが長く公知で
あった）が、脳血管性事象の発症において直接的な役割を果たし得ることを示唆
する。ＳＨＲ−ＳＰにおいて置換されたアミノ酸残基は、少なくとも１２の哺乳
動物を含む、配列決定されたすべての生物体において完全に保存されていること
が実証された。アルドラーゼＡは、十分に特徴付けられたグルコース誘導解糖酵
素であるが、これはまた、α−チューブリン（このｍＲＮＡは、一過性脳虚血脳
傷害の後に蓄積する）に結合することが示されている（例えば、Ｖｏｌｋｅｒお
よびＫｎｕｌｌ、１９９７、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３３
８（２）：２３７−２４３を参照のこと）。サイトケラチンの分解が、虚血性脳
傷害の進展において中心的事象であると提唱されている。さらに、アミノ酸置換
（Ｓ３４０Ｔ）が、ＷＫＹコントロールげっ歯類および文献に報告された配列の
両方におけるタンパク質のアミノ酸配列と比較して、ＳＨＲおよびＳＨＲ−ＳＰ
のα−チューブリンにおいて見出された。この証拠は、血管性損傷への素因にお
けるアルドラーゼＡおよびα−チューブリンの可能性ある関与を示唆する。

【０１７１】 同様に、ＳＨＲ−ＳＰ、ＳＨＲ、ＷＫＹ、マウスおよびヒトにおけるα−心臓
ミオシン改変体のアミノ酸置換を保有する領域のアミノ酸配列を、図４（配列番
号３２〜３６）に示し、そしてＳＨＲ、ＷＫＹ、マウス、ニワトリ、ヒトおよび
吸虫類におけるα−チューブリン改変体のアミノ酸置換を保有する領域のアミノ
酸配列を、図４（配列番号３７〜４２）に示す。

【０１７２】 本発明は、本明細書中に記載の特定の実施態様により範囲を制限されるべきで
はない。実際、本明細書中に記載されるものに加えて、本発明の種々の改変が、
前述の説明および添付の図面から当業者に明らかとなる。このような改変は、添
付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。

【０１７３】 種々の刊行物が本明細書中で引用され、それらの開示を、本明細書中で参考と
して援用する。

【０１７４】 （等価物） 本発明の特定の実施態様の前述の詳細な説明から、定量的形質遺伝子座（ｑｕ
ａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｉ）を担う遺伝子の迅速な同定のた
めの独特の方法およびそれにより同定された組成物が記載されたことが明らかで
あるはずである。特定の実施態様が本明細書中で詳細に開示されたが、これは、
例示のみの目的のために例としてなされ、そして以下の添付の特許請求の範囲の
範囲に関して制限することを意図しない。特に、種々の置換、改変および変更が
、特許請求の範囲により規定されるような本発明の精神および範囲から逸脱する
ことなく本発明に対してなされ得ることが、本発明者らにより意図される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、３−β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ／Δ−５−Δ−４イ
ソメラーゼｃＤＮＡの３つのフラグメントのＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（登録商標
）クロマトグラムの図示である。Ｈｓｄｂ３ ｍＲＮＡは、ＳＨＲ腎臓において
８５倍豊富に増加された。６６のＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）反応を使
用して、Ｈｓｄｂ３由来の１０のｃＤＮＡフラグメントをアッセイした。制限酵
素対、ｃＤＮＡフラグメントの長さ、およびＨｓｄｂ３ ｃＤＮＡ内のフラグメ
ントの位置を示す。示差的に現れたピークを、垂直線によって示す。各パネルに
おける３つン軌跡は、各系統からサンプリングされた３匹の動物を表す。各軌跡
は、各サンプルを用いる２または３回の反復実験の混成を表す。

【図２Ａ】 図２は、選択された遺伝子の示差的発現の図示である。ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎ
ｇ（登録商標）クロマトグラムは、ＳＨＲ、ＳＨＲＳＰ、およびＷＫＹラットに
おけるＫａｔ、Ｓｇｌｔ２、Ｃｄ３６、Ａｌｄｏａ、およびＡｎｆの示差的発現
を示す。（パネルＡ）Ｋａｔは、ＳＨＲ腎臓において２２倍増加した。（パネル
Ｂ）Ｓｇｌｔ２は、ＳＨＲ腎臓において６．７倍減少した。（パネルＣ）Ｃｄ３
６は、ＳＨＲ脂肪において２１倍減少した。（パネルＤ）Ａｌｄｏａは、ＳＨＲ
ＳＰ心臓において５２倍減少した。（パネルＥ）ＳＨＲＳＰ心臓ｃＤＮＡにおけ
るＡｎｆの３’ＵＴＲにおける２−ｂｐ欠失は、１７２−ｂｐから１７０ｂｐま
でのピークのシフトを生じる。（パネルＦ）Ａｎｆは、ＳＨＲＳＰ心臓において
２．３倍増加した。示差的に発現した遺伝子フラグメントは、赤い垂直線によっ
て示す。各パネルにおける３つの軌跡は、各系統からサンプリングされた３匹の
動物を示す。各軌跡は、各サンプルを用いる２または３回の反復実験の混成を表
す。パネルＥにおいて、ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）反応は、プレプロ
ナトリオジラチン（ｐｒｅｐｒｏｎａｔｒｉｏｄｉｌａｔｉｎ）の未翻領域にお
いて２つの塩基対欠失（これは、１７２から１７０までのピークのシフトを説明
する）を同定した。垂直線は、発現差異のピークを示す。ヌクレオチドにおける
フラグメントの長さをｘ軸に示し、そして相対ピーク強度をｙ軸に示す。各軌跡
は、単一の動物からの複数の反応の混成を表す。

【図２Ｂ】 図２は、選択された遺伝子の示差的発現の図示である。ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎ
ｇ（登録商標）クロマトグラムは、ＳＨＲ、ＳＨＲＳＰ、およびＷＫＹラットに
おけるＫａｔ、Ｓｇｌｔ２、Ｃｄ３６、Ａｌｄｏａ、およびＡｎｆの示差的発現
を示す。（パネルＡ）Ｋａｔは、ＳＨＲ腎臓において２２倍増加した。（パネル
Ｂ）Ｓｇｌｔ２は、ＳＨＲ腎臓において６．７倍減少した。（パネルＣ）Ｃｄ３
６は、ＳＨＲ脂肪において２１倍減少した。（パネルＤ）Ａｌｄｏａは、ＳＨＲ
ＳＰ心臓において５２倍減少した。（パネルＥ）ＳＨＲＳＰ心臓ｃＤＮＡにおけ
るＡｎｆの３’ＵＴＲにおける２−ｂｐ欠失は、１７２−ｂｐから１７０ｂｐま
でのピークのシフトを生じる。（パネルＦ）Ａｎｆは、ＳＨＲＳＰ心臓において
２．３倍増加した。示差的に発現した遺伝子フラグメントは、赤い垂直線によっ
て示す。各パネルにおける３つの軌跡は、各系統からサンプリングされた３匹の
動物を示す。各軌跡は、各サンプルを用いる２または３回の反復実験の混成を表
す。パネルＥにおいて、ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）反応は、プレプロ
ナトリオジラチン（ｐｒｅｐｒｏｎａｔｒｉｏｄｉｌａｔｉｎ）の未翻領域にお
いて２つの塩基対欠失（これは、１７２から１７０までのピークのシフトを説明
する）を同定した。垂直線は、発現差異のピークを示す。ヌクレオチドにおける
フラグメントの長さをｘ軸に示し、そして相対ピーク強度をｙ軸に示す。各軌跡
は、単一の動物からの複数の反応の混成を表す。

【図２Ｃ】 図２は、選択された遺伝子の示差的発現の図示である。ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎ
ｇ（登録商標）クロマトグラムは、ＳＨＲ、ＳＨＲＳＰ、およびＷＫＹラットに
おけるＫａｔ、Ｓｇｌｔ２、Ｃｄ３６、Ａｌｄｏａ、およびＡｎｆの示差的発現
を示す。（パネルＡ）Ｋａｔは、ＳＨＲ腎臓において２２倍増加した。（パネル
Ｂ）Ｓｇｌｔ２は、ＳＨＲ腎臓において６．７倍減少した。（パネルＣ）Ｃｄ３
６は、ＳＨＲ脂肪において２１倍減少した。（パネルＤ）Ａｌｄｏａは、ＳＨＲ
ＳＰ心臓において５２倍減少した。（パネルＥ）ＳＨＲＳＰ心臓ｃＤＮＡにおけ
るＡｎｆの３’ＵＴＲにおける２−ｂｐ欠失は、１７２−ｂｐから１７０ｂｐま
でのピークのシフトを生じる。（パネルＦ）Ａｎｆは、ＳＨＲＳＰ心臓において
２．３倍増加した。示差的に発現した遺伝子フラグメントは、赤い垂直線によっ
て示す。各パネルにおける３つの軌跡は、各系統からサンプリングされた３匹の
動物を示す。各軌跡は、各サンプルを用いる２または３回の反復実験の混成を表
す。パネルＥにおいて、ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）反応は、プレプロ
ナトリオジラチン（ｐｒｅｐｒｏｎａｔｒｉｏｄｉｌａｔｉｎ）の未翻領域にお
いて２つの塩基対欠失（これは、１７２から１７０までのピークのシフトを説明
する）を同定した。垂直線は、発現差異のピークを示す。ヌクレオチドにおける
フラグメントの長さをｘ軸に示し、そして相対ピーク強度をｙ軸に示す。各軌跡
は、単一の動物からの複数の反応の混成を表す。

【図２Ｄ】 図２は、選択された遺伝子の示差的発現の図示である。ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎ
ｇ（登録商標）クロマトグラムは、ＳＨＲ、ＳＨＲＳＰ、およびＷＫＹラットに
おけるＫａｔ、Ｓｇｌｔ２、Ｃｄ３６、Ａｌｄｏａ、およびＡｎｆの示差的発現
を示す。（パネルＡ）Ｋａｔは、ＳＨＲ腎臓において２２倍増加した。（パネル
Ｂ）Ｓｇｌｔ２は、ＳＨＲ腎臓において６．７倍減少した。（パネルＣ）Ｃｄ３
６は、ＳＨＲ脂肪において２１倍減少した。（パネルＤ）Ａｌｄｏａは、ＳＨＲ
ＳＰ心臓において５２倍減少した。（パネルＥ）ＳＨＲＳＰ心臓ｃＤＮＡにおけ
るＡｎｆの３’ＵＴＲにおける２−ｂｐ欠失は、１７２−ｂｐから１７０ｂｐま
でのピークのシフトを生じる。（パネルＦ）Ａｎｆは、ＳＨＲＳＰ心臓において
２．３倍増加した。示差的に発現した遺伝子フラグメントは、赤い垂直線によっ
て示す。各パネルにおける３つの軌跡は、各系統からサンプリングされた３匹の
動物を示す。各軌跡は、各サンプルを用いる２または３回の反復実験の混成を表
す。パネルＥにおいて、ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）反応は、プレプロ
ナトリオジラチン（ｐｒｅｐｒｏｎａｔｒｉｏｄｉｌａｔｉｎ）の未翻領域にお
いて２つの塩基対欠失（これは、１７２から１７０までのピークのシフトを説明
する）を同定した。垂直線は、発現差異のピークを示す。ヌクレオチドにおける
フラグメントの長さをｘ軸に示し、そして相対ピーク強度をｙ軸に示す。各軌跡
は、単一の動物からの複数の反応の混成を表す。

【図２Ｅ】 図２は、選択された遺伝子の示差的発現の図示である。ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎ
ｇ（登録商標）クロマトグラムは、ＳＨＲ、ＳＨＲＳＰ、およびＷＫＹラットに
おけるＫａｔ、Ｓｇｌｔ２、Ｃｄ３６、Ａｌｄｏａ、およびＡｎｆの示差的発現
を示す。（パネルＡ）Ｋａｔは、ＳＨＲ腎臓において２２倍増加した。（パネル
Ｂ）Ｓｇｌｔ２は、ＳＨＲ腎臓において６．７倍減少した。（パネルＣ）Ｃｄ３
６は、ＳＨＲ脂肪において２１倍減少した。（パネルＤ）Ａｌｄｏａは、ＳＨＲ
ＳＰ心臓において５２倍減少した。（パネルＥ）ＳＨＲＳＰ心臓ｃＤＮＡにおけ
るＡｎｆの３’ＵＴＲにおける２−ｂｐ欠失は、１７２−ｂｐから１７０ｂｐま
でのピークのシフトを生じる。（パネルＦ）Ａｎｆは、ＳＨＲＳＰ心臓において
２．３倍増加した。示差的に発現した遺伝子フラグメントは、赤い垂直線によっ
て示す。各パネルにおける３つの軌跡は、各系統からサンプリングされた３匹の
動物を示す。各軌跡は、各サンプルを用いる２または３回の反復実験の混成を表
す。パネルＥにおいて、ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）反応は、プレプロ
ナトリオジラチン（ｐｒｅｐｒｏｎａｔｒｉｏｄｉｌａｔｉｎ）の未翻領域にお
いて２つの塩基対欠失（これは、１７２から１７０までのピークのシフトを説明
する）を同定した。垂直線は、発現差異のピークを示す。ヌクレオチドにおける
フラグメントの長さをｘ軸に示し、そして相対ピーク強度をｙ軸に示す。各軌跡
は、単一の動物からの複数の反応の混成を表す。

【図２Ｆ】 図２は、選択された遺伝子の示差的発現の図示である。ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎ
ｇ（登録商標）クロマトグラムは、ＳＨＲ、ＳＨＲＳＰ、およびＷＫＹラットに
おけるＫａｔ、Ｓｇｌｔ２、Ｃｄ３６、Ａｌｄｏａ、およびＡｎｆの示差的発現
を示す。（パネルＡ）Ｋａｔは、ＳＨＲ腎臓において２２倍増加した。（パネル
Ｂ）Ｓｇｌｔ２は、ＳＨＲ腎臓において６．７倍減少した。（パネルＣ）Ｃｄ３
６は、ＳＨＲ脂肪において２１倍減少した。（パネルＤ）Ａｌｄｏａは、ＳＨＲ
ＳＰ心臓において５２倍減少した。（パネルＥ）ＳＨＲＳＰ心臓ｃＤＮＡにおけ
るＡｎｆの３’ＵＴＲにおける２−ｂｐ欠失は、１７２−ｂｐから１７０ｂｐま
でのピークのシフトを生じる。（パネルＦ）Ａｎｆは、ＳＨＲＳＰ心臓において
２．３倍増加した。示差的に発現した遺伝子フラグメントは、赤い垂直線によっ
て示す。各パネルにおける３つの軌跡は、各系統からサンプリングされた３匹の
動物を示す。各軌跡は、各サンプルを用いる２または３回の反復実験の混成を表
す。パネルＥにおいて、ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）反応は、プレプロ
ナトリオジラチン（ｐｒｅｐｒｏｎａｔｒｉｏｄｉｌａｔｉｎ）の未翻領域にお
いて２つの塩基対欠失（これは、１７２から１７０までのピークのシフトを説明
する）を同定した。垂直線は、発現差異のピークを示す。ヌクレオチドにおける
フラグメントの長さをｘ軸に示し、そして相対ピーク強度をｙ軸に示す。各軌跡
は、単一の動物からの複数の反応の混成を表す。

【図３Ａ】 図３は、示差的に発現された候補遺伝子のラット照射ハイブリッドマッピング
を図示する：（パネルＡ）ＳＧＬＴ２（マップの右）は、３つの独立した第１染
色体連鎖研究（マップの左）に比例する。最大尤度の領域を垂直棒によって示す
。（パネルＢ）ＫＡＴ（マップの右）は１連鎖に比例する。

【図３Ｂ】 図３は、示差的に発現された候補遺伝子のラット照射ハイブリッドマッピング
を図示する：（パネルＡ）ＳＧＬＴ２（マップの右）は、３つの独立した第１染
色体連鎖研究（マップの左）に比例する。最大尤度の領域を垂直棒によって示す
。（パネルＢ）ＫＡＴ（マップの右）は１連鎖に比例する。

【図４Ａ】 図４は、選択された遺伝子におけるアミノ酸残基の種および系統バリエーショ
ンの図示である。推定アミノ酸残基バリエーション（示されたタンパク質をコー
ドするｃＤＮＡにおいて見出されたヌクレオチド変化に基づく）を下線によって
示す。最初のアミノ酸および最後のアミノ酸を、対応するＧｅｎＢａｎｋエント
リーに示したように、翻訳の開始に比例して番号付けする。これらのアミノ酸配
列を、以下のとおりに示す：（パネルＡ）ＳＧＬＴ２（配列番号１〜５）、（パ
ネルＢ）キヌレニンアミノトランスフェラーゼ（配列番号６〜９）、（パネルＣ
）ＣＤ３６／ＦＡＴ（配列番号１０〜１３および１４〜１７）、（パネルＤ）ア
ルドラーゼＡ（配列番号１８〜２５）、（パネルＥ）プレプロナトリオジラチン
（配列番号２６〜３１）、（パネルＦ）α心臓ミオシン（配列番号３２〜３６）
、および（パネルＧ）α−チューブリン（配列番号３７〜４２）。

【図４Ｂ】 図４は、選択された遺伝子におけるアミノ酸残基の種および系統バリエーショ
ンの図示である。推定アミノ酸残基バリエーション（示されたタンパク質をコー
ドするｃＤＮＡにおいて見出されたヌクレオチド変化に基づく）を下線によって
示す。最初のアミノ酸および最後のアミノ酸を、対応するＧｅｎＢａｎｋエント
リーに示したように、翻訳の開始に比例して番号付けする。これらのアミノ酸配
列を、以下のとおりに示す：（パネルＡ）ＳＧＬＴ２（配列番号１〜５）、（パ
ネルＢ）キヌレニンアミノトランスフェラーゼ（配列番号６〜９）、（パネルＣ
）ＣＤ３６／ＦＡＴ（配列番号１０〜１３および１４〜１７）、（パネルＤ）ア
ルドラーゼＡ（配列番号１８〜２５）、（パネルＥ）プレプロナトリオジラチン
（配列番号２６〜３１）、（パネルＦ）α心臓ミオシン（配列番号３２〜３６）
、および（パネルＧ）α−チューブリン（配列番号３７〜４２）。

【図４Ｃ】 図４は、選択された遺伝子におけるアミノ酸残基の種および系統バリエーショ
ンの図示である。推定アミノ酸残基バリエーション（示されたタンパク質をコー
ドするｃＤＮＡにおいて見出されたヌクレオチド変化に基づく）を下線によって
示す。最初のアミノ酸および最後のアミノ酸を、対応するＧｅｎＢａｎｋエント
リーに示したように、翻訳の開始に比例して番号付けする。これらのアミノ酸配
列を、以下のとおりに示す：（パネルＡ）ＳＧＬＴ２（配列番号１〜５）、（パ
ネルＢ）キヌレニンアミノトランスフェラーゼ（配列番号６〜９）、（パネルＣ
）ＣＤ３６／ＦＡＴ（配列番号１０〜１３および１４〜１７）、（パネルＤ）ア
ルドラーゼＡ（配列番号１８〜２５）、（パネルＥ）プレプロナトリオジラチン
（配列番号２６〜３１）、（パネルＦ）α心臓ミオシン（配列番号３２〜３６）
、および（パネルＧ）α−チューブリン（配列番号３７〜４２）。

【図４Ｄ】 図４は、選択された遺伝子におけるアミノ酸残基の種および系統バリエーショ
ンの図示である。推定アミノ酸残基バリエーション（示されたタンパク質をコー
ドするｃＤＮＡにおいて見出されたヌクレオチド変化に基づく）を下線によって
示す。最初のアミノ酸および最後のアミノ酸を、対応するＧｅｎＢａｎｋエント
リーに示したように、翻訳の開始に比例して番号付けする。これらのアミノ酸配
列を、以下のとおりに示す：（パネルＡ）ＳＧＬＴ２（配列番号１〜５）、（パ
ネルＢ）キヌレニンアミノトランスフェラーゼ（配列番号６〜９）、（パネルＣ
）ＣＤ３６／ＦＡＴ（配列番号１０〜１３および１４〜１７）、（パネルＤ）ア
ルドラーゼＡ（配列番号１８〜２５）、（パネルＥ）プレプロナトリオジラチン
（配列番号２６〜３１）、（パネルＦ）α心臓ミオシン（配列番号３２〜３６）
、および（パネルＧ）α−チューブリン（配列番号３７〜４２）。

【図４Ｅ】 図４は、選択された遺伝子におけるアミノ酸残基の種および系統バリエーショ
ンの図示である。推定アミノ酸残基バリエーション（示されたタンパク質をコー
ドするｃＤＮＡにおいて見出されたヌクレオチド変化に基づく）を下線によって
示す。最初のアミノ酸および最後のアミノ酸を、対応するＧｅｎＢａｎｋエント
リーに示したように、翻訳の開始に比例して番号付けする。これらのアミノ酸配
列を、以下のとおりに示す：（パネルＡ）ＳＧＬＴ２（配列番号１〜５）、（パ
ネルＢ）キヌレニンアミノトランスフェラーゼ（配列番号６〜９）、（パネルＣ
）ＣＤ３６／ＦＡＴ（配列番号１０〜１３および１４〜１７）、（パネルＤ）ア
ルドラーゼＡ（配列番号１８〜２５）、（パネルＥ）プレプロナトリオジラチン
（配列番号２６〜３１）、（パネルＦ）α心臓ミオシン（配列番号３２〜３６）
、および（パネルＧ）α−チューブリン（配列番号３７〜４２）。

【図４Ｆ】 図４は、選択された遺伝子におけるアミノ酸残基の種および系統バリエーショ
ンの図示である。推定アミノ酸残基バリエーション（示されたタンパク質をコー
ドするｃＤＮＡにおいて見出されたヌクレオチド変化に基づく）を下線によって
示す。最初のアミノ酸および最後のアミノ酸を、対応するＧｅｎＢａｎｋエント
リーに示したように、翻訳の開始に比例して番号付けする。これらのアミノ酸配
列を、以下のとおりに示す：（パネルＡ）ＳＧＬＴ２（配列番号１〜５）、（パ
ネルＢ）キヌレニンアミノトランスフェラーゼ（配列番号６〜９）、（パネルＣ
）ＣＤ３６／ＦＡＴ（配列番号１０〜１３および１４〜１７）、（パネルＤ）ア
ルドラーゼＡ（配列番号１８〜２５）、（パネルＥ）プレプロナトリオジラチン
（配列番号２６〜３１）、（パネルＦ）α心臓ミオシン（配列番号３２〜３６）
、および（パネルＧ）α−チューブリン（配列番号３７〜４２）。

【図４Ｇ】 図４は、選択された遺伝子におけるアミノ酸残基の種および系統バリエーショ
ンの図示である。推定アミノ酸残基バリエーション（示されたタンパク質をコー
ドするｃＤＮＡにおいて見出されたヌクレオチド変化に基づく）を下線によって
示す。最初のアミノ酸および最後のアミノ酸を、対応するＧｅｎＢａｎｋエント
リーに示したように、翻訳の開始に比例して番号付けする。これらのアミノ酸配
列を、以下のとおりに示す：（パネルＡ）ＳＧＬＴ２（配列番号１〜５）、（パ
ネルＢ）キヌレニンアミノトランスフェラーゼ（配列番号６〜９）、（パネルＣ
）ＣＤ３６／ＦＡＴ（配列番号１０〜１３および１４〜１７）、（パネルＤ）ア
ルドラーゼＡ（配列番号１８〜２５）、（パネルＥ）プレプロナトリオジラチン
（配列番号２６〜３１）、（パネルＦ）α心臓ミオシン（配列番号３２〜３６）
、および（パネルＧ）α−チューブリン（配列番号３７〜４２）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 48/00 ４Ｃ０８５ Ａ６１Ｐ 3/04 ４Ｃ０８６ 48/00 3/06 ４Ｈ０４５ Ａ６１Ｐ 3/04 9/10 3/06 9/12 9/10 43/00 １０５ 9/12 Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １０５ 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 9/10 16/18 9/88 Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｑ 1/25 9/88 1/52 Ｃ１２Ｑ 1/25 1/68 Ａ 1/52 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 DA12 DA13 DA36 FB03 4B024 AA01 AA11 BA04 BA07 BA10 BA61 BA80 CA02 DA02 GA11 HA11 4B050 CC04 DD11 FF16 LL01 LL03 4B063 QA05 QA08 QA18 QA19 QQ02 QQ08 QQ13 QQ21 QQ26 QQ44 QQ79 QQ91 QR33 QR72 QS25 QS34 4C084 AA02 AA07 AA13 BA02 CA07 NA14 ZA39 ZA42 ZA70 ZC02 ZC33 ZC35 4C085 AA13 AA14 BB11 CC02 CC21 CC23 EE01 4C086 AA01 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA39 ZA42 ZA70 ZC02 ZC33 ZC35 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA32 DA89 EA20 EA23 EA27 EA50 FA74

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下からなる群より選択されるタンパク質に対して少なくと
   も８０％同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたタンパク質、あるいは該タ
   ンパク質のうちの１つのフラグメントまたは誘導体：アミノ酸配列ＲＱＥを含む
   ＳＧＬＴ２タンパク質、野生型キヌレニンアミノトランスフェラーゼと比較して
   アミノ酸配列置換Ｅ２７Ｇを含むキヌレニンアミノトランスフェラーゼタンパク
   質、図４Ｃに示されるアミノ酸置換のうちの１つ以上を有するＦＡＴ／ＣＤ３６
   タンパク質、アミノ酸配列ＥＶ１を含むアルドラーゼＡタンパク質、アミノ酸配
   列ＲＳＰを含むプレプロナトリオジラチンタンパク質、アミノ酸配列ＫＡＫを含
   むα−心臓ミオシン、およびアミノ酸配列ＲＳＩを含むα−チューブリンタンパ
   ク質。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の単離されたタンパク質であって、該タンパ
   ク質が配列番号１〜４２のアミノ酸配列のいずれかを含む、タンパク質。
3. 【請求項３】 請求項１に記載の単離されたタンパク質であって、該タンパ
   ク質が、対応するネイティブのヒトタンパク質と比較して、インビボでのより長
   い生物学的半減期を有する、タンパク質。
4. 【請求項４】 請求項１に記載のタンパク質に特異的であり、かつ該タンパ
   ク質に結合する能力を有する、抗体。
5. 【請求項５】 請求項１に記載のタンパク質をコードする、単離された核酸
   配列。
6. 【請求項６】 請求項５に記載の核酸配列に特異的であり、かつ該核酸配列
   に結合する能力を有する、抗体。
7. 【請求項７】 請求項５に記載の核酸の、単離されたアンチセンス核酸誘導
   体。
8. 【請求項８】 請求項７に記載のアンチセンス核酸誘導体に特異的であり、
   かつ該誘導体に結合する能力を有する、抗体。
9. 【請求項９】 高血圧を処置または予防する方法であって、該方法は、この
   ような処置または予防が所望される被験体に、以下： 請求項１に記載のタンパク質、 請求項４に記載の抗体、 請求項５に記載の核酸、および 請求項７に記載のアンチセンス核酸誘導体 からなる群より選択される一定量の治療剤を投与する工程を包含し、 ここで該治療剤は該被験体において高血圧を処置または予防するに十分な量で
   投与される、方法。
10. 【請求項１０】 糖尿病またはインスリン抵抗性を減少または予防する方法
    であって、該方法は、このような処置または予防が所望される被験体に、以下： 請求項１に記載のタンパク質、 請求項４に記載の抗体、 請求項５に記載の核酸、および 請求項７に記載のアンチセンス核酸誘導体 からなる群より選択される一定量の治療剤を投与する工程を包含し、 ここで該治療剤は該被験体において糖尿病またはインスリン抵抗性を処置また
    は予防するに十分な量で投与される、方法。
11. 【請求項１１】 肥満または脂肪代謝異常症を処置または予防する方法であ
    って、該方法は、このような処置または予防が所望される被験体に、以下： 請求項１に記載のタンパク質、 請求項４に記載の抗体、 請求項５に記載の核酸、および 請求項７に記載のアンチセンス核酸誘導体 からなる群より選択される一定量の治療剤を投与する工程を包含し、 ここで該治療剤は該被験体において肥満または脂肪代謝異常症を処置または予
    防するに十分な量で投与される、方法。
12. 【請求項１２】 被験体における発作を処置するかまたは予防するかまたは
    遅延させる方法であって、該方法は、このような処置または予防が所望される被
    験体に、以下： 請求項１に記載のタンパク質、 請求項４に記載の抗体、 請求項５に記載の核酸、および 請求項７に記載のアンチセンス核酸誘導体 からなる群より選択される一定量の治療剤を投与する工程を包含し、 ここで該治療剤は発作を処置するかまたは予防するかまたは遅延させるに十分
    な量で投与される、方法。
13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の方法であって、前記発作が虚血性発作
    である、方法。
14. 【請求項１４】 請求項１２に記載の方法であって、前記治療剤が、高塩分
    食を給餌された発作の傾向があるラットにおける発作に対する潜伏期を増大する
    、方法。
15. 【請求項１５】 請求項１４に記載の方法であって、前記治療剤は配列番号
    ２６〜３１のアミノ酸配列を含むタンパク質である、方法。
16. 【請求項１６】 薬学的組成物であって、以下からなる群より選択される治
    療的または予防的に有効な量の治療剤を含む、組成物： 請求項１に記載のタンパク質、 請求項４に記載の抗体、 請求項５に記載の核酸、および 請求項７に記載のアンチセンス核酸誘導体、および薬学的に受容可能なキャリ
    ア。
17. 【請求項１７】 キットであって、１つ以上の容器中に、治療的または予防
    的に有効な量の、請求項１６に記載の薬学的組成物を含む、キット。
18. 【請求項１８】 ヒト代謝Ｘ症候群に関連する症候群を処置するための医薬
    の製造における治療剤の使用であって、該治療剤は、請求項１に記載のタンパク
    質、請求項４に記載の抗体、請求項５に記載の核酸、請求項６に記載の抗体、請
    求項７に記載のアンチセンス核酸誘導体、または請求項８に記載の抗体である、
    使用。
19. 【請求項１９】 被験体において高血圧、糖尿病、肥満および／または発作
    に対して防御的な対立遺伝子をスクリーニングするための方法であって、ＳＧＬ
    Ｔ２対立遺伝子、変異体キヌレニンアミノフェラーゼ対立遺伝子、変異体ＦＡＴ
    ／ＣＤ３６対立遺伝子、変異体アルドラーゼＡ対立遺伝子、変異体プレプロナト
    リオジラチン対立遺伝子、変異体α−心臓ミオシン対立遺伝子、および変異体α
    −チューブリン対立遺伝子からなる群より選択される変異体対立遺伝子を検出す
    る工程を包含し、該変異体対立遺伝子の存在が高血圧、糖尿病、肥満および／ま
    たは発作に関して予防的である対立遺伝子の指標である、方法。
20. 【請求項２０】 請求項１９に記載の方法であって、前記変異体対立遺伝子
    が配列番号１、６、１０、１１、１４、１５、１８、２６、３２、および３７の
    うちのいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、方法。
21. 【請求項２１】 高血圧、糖尿病、肥満および／または発作に対する潜伏期
    または素因の調節因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は以下
    ： （ａ）高血圧、糖尿病、肥満および／または発作の傾向がある試験動物に対し
    て、試験タンパク質の活性の推定調節因子を投与する工程であって、該試験タン
    パク質が、ＳＧＬＴ２、キヌレニンアミノトランスフェラーゼ、ＦＡＴ／ＣＤ３
    ６、アルドラーゼＡ、プレプロナトリオジラチン、α−心臓ミオシンおよびα−
    チューブリンからなる群より選択される、工程；ならびに （ｂ）該試験タンパク質の活性に関連する１つ以上の生理学的パラメーターを
    測定する工程であって、該推定調節因子を投与されていない動物と比較した１つ
    以上のパラメーターの変化が、該推定調節因子が高血圧、糖尿病、肥満および／
    または発作に対する潜伏期または素因を調節することを示す、工程、 を包含する、方法。
22. 【請求項２２】 請求項２１に記載の方法であって、前記試験動物が、試験
    タンパク質導入遺伝子を発現するかまたは野生型試験動物と比較して増加したレ
    ベルでプロモーターの制御下で該導入遺伝子を発現する、組換え試験動物であり
    、そして該プロモーターが該導入遺伝子のネイティブの遺伝子プロモーターでは
    ない、方法。
23. 【請求項２３】 被験体において高血圧、糖尿病、肥満または発作に対して
    予防的な対立遺伝子をスクリーニングするための方法であって、該方法は、ＳＧ
    ＬＴ２タンパク質遺伝子、キヌレニンアミノフェラーゼタンパク質遺伝子、ＦＡ
    Ｔ／ＣＤ３６タンパク質遺伝子、アルドラーゼＡタンパク質遺伝子、プレプロナ
    トリオジラチンタンパク質遺伝子、α−心臓ミオシンタンパク質遺伝子およびα
    −チューブリンタンパク質遺伝子からなる群より選択される変異体核酸からなる
    群より選択される変異体対立遺伝子を検出する工程を包含し、該対立遺伝子が高
    血圧、糖尿病、肥満または発作に関して防御的である対立遺伝子の指標である、
    方法。
24. 【請求項２４】 高血圧、糖尿病、肥満または発作に対する活性または潜伏
    期または素因の調節因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は以
    下： 高血圧、糖尿病、肥満または発作の危険が増加した試験動物に対して試験化合
    物を投与する工程であって、該試験動物が、ＳＧＬＴ２タンパク質、キヌレニン
    アミノトランスフェラーゼタンパク質、ＦＡＴ／ＣＤ３６タンパク質、アルドラ
    ーゼＡタンパク質、プレプロナトリオジラチンタンパク質、α−心臓ミオシンタ
    ンパク質またはα−チューブリンタンパク質を組換え発現する、工程； 該試験動物において該タンパク質の活性の発現を測定する、工程； 該タンパク質を組換え発現し、かつ高血圧、糖尿病、肥満または発作の危険が
    増加していない、コントロール動物において該タンパク質の活性を測定する、工
    程、および 該試験動物と該コントロール動物において、該タンパク質の発現を比較する工
    程であって、該コントロール動物と比較した該試験動物中の該タンパク質の活性
    の変化が、該試験化合物が高血圧、糖尿病、肥満および／または発作の潜伏期の
    調節因子であることを示す、工程、 を包含する、方法。
25. 【請求項２５】 変異体タンパク質をコードする変異体遺伝子を保有する組
    換え非ヒト動物であって、該遺伝子がＳＧＬＴ２、キヌレニンアミノトランスフ
    ェラーゼ、ＦＡＴ／ＣＤ３６、アルドラーゼＡ、プレプロナトリオジラチン、α
    −心臓ミオシンおよびα−チューブリンであり、そして該遺伝子が該変異体遺伝
    子のネイティブのプロモーターではないプロモーターの制御下にあり、そしてさ
    らに該変異体遺伝子が高血圧、糖尿病、肥満および／または発作に対する潜伏期
    を増加するかまたは該高血圧、糖尿病、肥満および／または発作に対する素因を
    減少するかのいずれかをする変異体タンパク質をコードする、非ヒト動物。
26. 【請求項２６】 組換え非ヒト動物であって、該非ヒト動物またはその先祖
    に核酸を導入する工程を包含するプロセスの産物であり、該核酸が、ＳＧＬＴ２
    遺伝子、キヌレニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＡＴ／ＣＤ３６遺伝子
    、アルドラーゼＡ遺伝子、プレプロナトリオジラチン遺伝子、α−心臓ミオシン
    遺伝子およびα−チューブリン遺伝子からなる群より選択される変異体遺伝子配
    列を含む、非ヒト動物。
27. 【請求項２７】 組換え非ヒト動物であって、ＳＧＬＴ２遺伝子、キヌレニ
    ンアミノトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＡＴ／ＣＤ３６遺伝子、アルドラーゼＡ
    遺伝子、プレプロナトリオジラチン遺伝子、α−心臓ミオシン遺伝子およびα−
    チューブリン遺伝子からなる群より選択される変異体遺伝子を含有し、該遺伝子
    は、該遺伝子のネイティブのプロモーターではないプロモーターの制御下にあり
    、該遺伝子が、高血圧、糖尿病、肥満および／または発作に対する潜伏期を増加
    するかまたは該高血圧、糖尿病、肥満および／または発作に対する素因を減少す
    るかのいずれかをする変異体遺伝子産物をコードする、非ヒト動物。
28. 【請求項２８】 被験体においてＩＩ型糖尿病に対する素因を評価する方法
    であって、該方法は以下： ａ）その配列がＣＤ３６をコードする核酸またはそのフラグメントに特異的に
    ハイブリダイズする第１の核酸を提供する工程； ｂ）該被験体から得られた第２の核酸と該第１の核酸を接触させる工程；およ
    び ｃ）該第１の核酸と該第２の核酸の結合を測定する工程 を包含し、ここで所定の値を超える結合が、該被験体がＩＩ型糖尿病に対する素
    因を有することを示す、方法。
29. 【請求項２９】 被験体においてＩＩ型糖尿病に対する素因を評価する方法
    であって、該方法は以下： ａ）ＣＤ３６またはそのエピトープに免疫特異的に結合する抗体を提供する工
    程； ｂ）該被験体から得られたサンプルを該抗体と接触させる工程；および ｃ）該サンプルの成分に対する該抗体の結合を測定する工程 を包含し、所定の値を超える結合が、該被験体がＩＩ型糖尿病に対する素因を有
    することを示す、方法。
30. 【請求項３０】 被験体においてＩＩ型糖尿病を阻害する方法であって、そ
    の配列がＣＤ３６をコードする核酸またはそのフラグメントに特異的にハイブリ
    ダイズする一定量の核酸を、該被験体においてＩＩ型糖尿病の発達を阻害するに
    有効な量で該被験体に投与する工程を包含する、方法。