JP7418788B2 - グルカゴン認識ペプチド並びにグルカゴン検出法 - Google Patents
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Description
[1] グルカゴン受容体の標的認識部位に基づくペプチド部(P)と、グルカゴンと前記ペプチド部(P)との相互作用により検出を可能にする標識部(T)と、前記ペプチド部(P)と標識部(T)とを連結する連結部(L)とを含む、グルカゴン検出用プローブであって、下記式:
[2] 前記ペプチド部のアミノ酸配列が、配列番号1で表されるグルカゴン受容体のアミノ酸配列の122~149位、184~240位、278~308位、及び361~389位からなる群から選ばれる領域中の少なくとも1の部分配列を含み、かつ
133位のアミノ酸、135位のアミノ酸、138位のアミノ酸、140~145位のアミノ酸、149位のアミノ酸、191位のアミノ酸、194~195位のアミノ酸、198位のアミノ酸、200~202位のアミノ酸、204~205位のアミノ酸、208~209位のアミノ酸、212位のアミノ酸、215位のアミノ酸、286位のアミノ酸、290~291位のアミノ酸、294~295位のアミノ酸、297~300位のアミノ酸、302~308位のアミノ酸、361~362位のアミノ酸、365~366位のアミノ酸、369位のアミノ酸、374位のアミノ酸、378位のアミノ酸、381~384位のアミノ酸、386~387位のアミノ酸
からなる群から選ばれる少なくとも5個のアミノ酸を含む、少なくとも10残基の配列であるか、又は当該アミノ酸配列に1又は数個のアミノ酸の置換、欠失、及び/又は付加がされた改変配列であって、当該改変配列のペプチドがグルカゴンと相互作用する配列である、項目1に記載のプローブ。
[3] 前記標識部が、1又は複数の蛍光標識を含む、項目1又は2に記載のプローブ。
[4] 前記蛍光標識が、以下の:
Rは、非限定的に、互いに独立して、水素原子;炭素数1から15の直鎖型若しくは分枝型のアルキル基;炭素数1から10の直鎖型若しくは分枝型のエーテル;フェニル基;フェニル基の一部をアミノ基、ハロゲン、ニトロ基に置換したフェニル基;アミノ基;シアノ基;ニトロ基;カルボン酸若しくはその塩若しくはエステル若しくはアミド;スルホン酸若しくはその塩若しくはエステル若しくはアミド;チオール基;水酸基若しくはその塩;ケトン;ハロゲン;糖を表し;
A-1の場合、nは1~9の整数、A-2の場合、nは1~9の整数、A-3の場合、nは1~5の整数、A-4の場合、nは1~7の整数、A-5の場合、nは1~6の整数、A-6の場合、nは1~4の整数、A-7の場合、nは1~7の整数であり、A-8の場合、nは1~5の整数であり、nが2以上の場合、各Rは、互いに同一であっても異なっていてもよく;
※は、結合手を示し、結合手において連結部(L)と結合する)
からなる群から選択される、項目3に記載のプローブ。
[5] 前記蛍光標識が、以下の:
からなる群から選択される、項目4に記載のプローブ。
[6] 前記蛍光標識が、以下の:
で表される、項目5に記載のプローブ。
[7] 前記標識部(T)が、 前記ペプチド部のペプチドのN末端又はC末端に結合する、項目1~4のいずれか一項に記載のプローブ。
[8] 前記ペプチド部の配列が、5~40残基である、項目1~7のいずれか一項に記載のプローブ。
[9] 前記ペプチド部(P)の配列が、以下の:
XEVAXMYSSFQVMYTVGY (配列番号2)、
VLVIDGLLRTRYSQXIGDDLSVSTW (配列番号4)、
KCLFENVQCWTSNDNMGFWWILR (配列番号6)、
HEVVFAFVTDEHAQGTLRSAXLFFDLF(配列番号7)、
YTVGYIDGLLRTRYSQXIGDDLSVSTW (配列番号9)、及び
KCLFENVQCWTSNDNMGFWIDGLLRTRY(配列番号11)、
(式中、Xは、アラニン又はリジンである)
からなる群から選ばれる配列、又は当該配列に1又は数個のアミノ酸の置換、欠失、及び/又は付加がされた改変配列であって、当該改変配列のペプチドがグルカゴンと相互作用する配列である、項目1~8のいずれか一項に記載のプローブ。
[10] 前記相互作用が、100nM以下のKd値である、項目9に記載のプローブ。
[11] 前記連結部(L)が、カルボニル基又はスルホニル基を含む、項目1~10のいずれか一項に記載のプローブ。
[12] 試料中のグルカゴン濃度を測定する方法であって、
試料を項目3~11のいずれか一項に記載のプローブと接触させる工程、
励起光を照射し、励起された蛍光標識からの蛍光を測定する工程、及び
グルカゴンと、前記プローブの前記ペプチド部(P)との相互作用により変化した波長の蛍光に基づいてグルカゴン濃度を決定する工程
を含む、前記方法。
[13] 前記試料が、血液試料である、項目12に記載の方法。
[14] グルカゴン濃度が、前記変化した波長の蛍光と、グルカゴン濃度との関係を示す検量線に基づいて決定される、項目12又は13に記載の方法。
[15] グルカゴン濃度決定用のキットであって、項目1~11のいずれか一項に記載のプローブを含むキット。
XEVAXMYSSFQVMYTVGY (配列番号2)、
VLVIDGLLRTRYSQXIGDDLSVSTW (配列番号4)、
KCLFENVQCWTSNDNMGFWWILR (配列番号6)、
HEVVFAFVTDEHAQGTLRSAXLFFDLF(配列番号7)、
YTVGYIDGLLRTRYSQXIGDDLSVSTW (配列番号9)、及び
KCLFENVQCWTSNDNMGFWIDGLLRTRY(配列番号11)
(式中、Xは、アラニン又はリジンである)
からなる群から選ばれるアミノ酸配列又はその改変配列を含むペプチドを使用しうる。配列番号2、4、6及び7のアミノ酸配列は、配列番号1のアミノ酸配列の132位~149位、191位~215位、286位~308位、及び361位~387位のアミノ酸配列にそれぞれ相当する。配列番号9のアミノ酸配列は、配列番号1のアミノ酸配列の145位~149位と194位~215位に相当する。配列番号11のアミノ酸配列は、配列番号1のアミノ酸配列の286位~304位と194位~202位に相当する。
Rは、非限定的に、互いに独立して、水素原子;炭素数1から15の直鎖型若しくは分枝型のアルキル基;炭素数1から10の直鎖型若しくは分枝型のエーテル;フェニル基;フェニル基の一部をアミノ基、ハロゲン、ニトロ基に置換したフェニル基;アミノ基;シアノ基;ニトロ基;カルボン酸若しくはその塩若しくはエステル若しくはアミド;スルホン酸若しくはその塩若しくはエステル若しくはアミド;チオール基;水酸基若しくはその塩;ケトン;ハロゲン;糖(グルコース、マンノース、メリビオース、ガラクトース、フルクトースなど)を表し;
A-1の場合、nは1~9の整数、A-2の場合、nは1~9の整数、A-3の場合、nは1~5の整数、A-4の場合、nは1~7の整数、A-5の場合、nは1~6の整数、A-6の場合、nは1~4の整数、A-7の場合、nは1~7の整数であり、A-8の場合、nは1~5の整数であり、nが2以上の場合、各Rは、互いに同一であっても異なっていてもよく;
※は、結合手を示す)
ここで、結合手は連結部(L)と結合することができる。
ここで、結合手は連結部(L)と結合することができる。特に好ましくは、蛍光標識は、式a-5で表される化合物を使用することができる。
試料にグルカゴン検出用プローブと接触させる工程;
励起光を照射し、励起された蛍光標識からの蛍光を測定する工程;
グルカゴンと前記グルカゴン検出用プローブのペプチド部(P)との相互作用により変化した波長の蛍光強度に基づいてグルカゴン濃度を決定する工程
を含む。グルカゴン濃度の決定は、蛍光強度と濃度との関係を示す検量線に基づく。
5-(ジメチルアミノ)ナフタレン-1-スルホン酸の合成
収率:85%
1H-NMR (CD3OD, 500MHz, r.t., TMS,δ/ppm) 2.86 (6H, s), 7.34 (1H, d), 7.54 (1H, t), 7.86 (1H, d), 8.00 (1H, t), 8.45 (1H, d), 8.89 (1H, d).
収率:85%
1H-NMR (CD3OD, 500MHz, r.t., TMS,δ/ppm) 2.85 (6H, s), 7.35 (1H, d), 7.52 (1H, t), 7.84 (1H, d), 8.01 (1H, t), 8.47 (1H, d), 8.86 (1H, d).
グルカゴン(入手元:ペプチド研究所)を0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)添加生理食塩水(PBS)に溶解して500nMの濃度のグルカゴン溶液を取得した。上記において合成した200μMのプローブ溶液とグルカゴン溶液を25℃下で混合し、混合直後における蛍光スペクトルを、蛍光測定器(販売元:株式会社 日立ハイテクサイエンス、励起波長327nm)を用いて測定した。各ペプチドを用い、グルカゴンを添加した際、添加しなかった際の蛍光スペクトルを示す(図1A:ECL0、B:ECL1、C:ECL2、D:ECL3、E:ECL0-1、F:ECL2-1)。ECL0、1、2、3、0-1、2-1を用いた際、グルカゴンと反応時に蛍光のピークの短波長側へのシフトが観察された。
本発明のペプチドプローブ(ECL0, 1, 2, 3, 0-1, 2-1)とグルカゴンと類似の配列を持つペプチドとの反応性について解析を行うため、上述と同様の条件でグルカゴンの代わりに、下記表3に示される配列を有するミニグルカゴン、オキシントモジュリン、及びグリセンチンを、0.1%BSA添加PBSに溶解して250nMのグルカゴン類似体の溶液を調製した。また、同様に250nMのグルカゴン溶液を調製した。200μMの各ペプチドプローブ溶液と、グルカゴン溶液又はグルカゴン類似体の溶液とを25℃下で混合し、混合直後における蛍光スペクトルを、蛍光測定器(販売元:株式会社 日立ハイテクサイエンス、励起波長327nm)を用いて測定した。各ペプチドプローブと、グルカゴン溶液を添加した際、グルカゴン類似体の溶液を添加した際、添加しなかった際の蛍光スペクトルを示す(図4)。各ペプチドプローブは、グルカゴン以外のグルカゴン類似体に対しては、オキシントモジュリンにのみ反応性を有した。本発明のペプチドプローブを用いた場合、5-10分で測定が完了した。
既存技術との比較のために、市販のグルカゴン検出ELISAキット(株式会社メルコディア)を用いてグルカゴン及び類似体の検出を行った。実施例3と同様の条件で、濃度を250pMのグルカゴン溶液、及びグルカゴンの代わりに表3に示される配列を有するミニグルカゴン、オキシントモジュリン、及びグリセンチンを、0.1%BSA添加PBSに溶解して250pMのグルカゴン類似体の溶液を調製した。また、同様に250pMのグルカゴン溶液を調製した。調整した溶液を用いて製品に記載のプロトコールに従いグルカゴン並びにその類似体の測定を行った。このプロトコールでは、測定サンプルと抗体溶液の反応時間に20-48時間必要であった。その測定結果を示す(図5)。グルカゴンとオキシントモジュリンにおいて強いシグナルが観察され、さらにミニグルカゴンについても弱いシグナルが観察された。
また将来的には、インシュリンなどの他のマーカーも含めた糖尿病マーカーとして、診断薬、マーカー試薬としても応用が期待されると考える。
Claims (12)
- グルカゴン受容体の標的認識部位に基づくペプチド部(P)と、グルカゴンと前記ペプチド部(P)との相互作用により検出を可能にする標識部(T)と、前記ペプチド部(P)と標識部(T)とを連結する連結部(L)とを含む、グルカゴン検出用プローブであって、下記式:
前記ペプチド部(P)の配列が、以下の:
XEVAXMYSSFQVMYTVGY (配列番号2)、
VLVIDGLLRTRYSQXIGDDLSVSTW (配列番号4)、
KCLFENVQCWTSNDNMGFWWILR (配列番号6)、
HEVVFAFVTDEHAQGTLRSAXLFFDLF(配列番号7)、
YTVGYIDGLLRTRYSQXIGDDLSVSTW (配列番号9)、及び
KCLFENVQCWTSNDNMGFWIDGLLRTRY(配列番号11)
(式中、Xは、アラニン又はリジンである)
からなる群から選ばれる配列であり、当該配列のペプチドがグルカゴンと相互作用する配列である、前記グルカゴン検出用プローブ。 - 前記標識部が、1又は複数の蛍光標識を含む、請求項1に記載のプローブ。
- 前記蛍光標識が、以下の:
Rは、非限定的に、互いに独立して、水素原子;炭素数1から15の直鎖型若しくは分枝型のアルキル基;炭素数1から10の直鎖型若しくは分枝型のエーテル;フェニル基;フェニル基の一部をアミノ基、ハロゲン、ニトロ基に置換したフェニル基;アミノ基;シアノ基;ニトロ基;カルボン酸若しくはその塩若しくはエステル若しくはアミド;スルホン酸若しくはその塩若しくはエステル若しくはアミド;チオール基;水酸基若しくはその塩;ケトン;ハロゲン;糖を表し;
A-1の場合、nは1~9の整数、A-2の場合、nは1~9の整数、A-3の場合、nは1~5の整数、A-4の場合、nは1~7の整数、A-5の場合、nは1~6の整数、A-6の場合、nは1~4の整数、A-7の場合、nは1~7の整数であり、A-8の場合、nは1~5の整数であり、nが2以上の場合、各Rは、互いに同一であっても異なっていてもよく;
※は、結合手を示し、結合手において連結部(L)と結合する)
からなる群から選択される、請求項2に記載のプローブ。 - 前記蛍光標識が、以下の:
からなる群から選択される、請求項3に記載のプローブ。 - 前記蛍光標識が、以下の:
で表される、請求項4に記載のプローブ。 - 前記標識部(T)が、 連結部(L)を介し前記ペプチド部(P)のペプチドのN末端又はC末端に結合する、請求項1~3のいずれか一項に記載のプローブ。
- 前記相互作用が、100nM以下のKd値である、請求項1に記載のプローブ。
- 前記連結部(L)が、カルボニル基又はスルホニル基を含む、請求項1~7のいずれか一項に記載のプローブ。
- 試料中のグルカゴン濃度を測定する方法であって、
試料を請求項2~5のいずれか一項に記載のプローブと接触させる工程、
励起光を照射し、励起された蛍光標識からの蛍光を測定する工程、及び
グルカゴンと、前記プローブの前記ペプチド部(P)との相互作用により変化した波長の蛍光に基づいてグルカゴン濃度を決定する工程
を含む、前記方法。 - 前記試料が、血液試料である、請求項9に記載の方法。
- グルカゴン濃度が、前記変化した波長の蛍光と、グルカゴン濃度との関係を示す検量線に基づいて決定される、請求項9又は10に記載の方法。
- グルカゴン濃度決定用のキットであって、請求項1~8のいずれか一項に記載のプローブを含むキット。
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