KR20030011777A - 장수명 여기형 형광을 이용하는 측정방법 - Google Patents

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카즈야 기쿠치
미쯔노리 코레사와
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다이이치 가가쿠 야쿠힝 가부시키가이샤
테츠오 나가노
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Abstract

시약 중의 측정대상 물질을 형광에 의해 측정하는 방법으로서, (1) 측정대상 물질에 특이적으로 반응하여 형광을 발산하는 특이적 형광탐침, 및 (2) 그 자신이 장수명 형광을 가지고, 전기 특이적 형광탐침을 수용체로서 전기 수용체에 형광공명 에너지 이동을 야기시키는 것이 가능한 공여체(단, 전기 공여체는 특이적 형광탐침과는 화합결합에 의한 결합을 형성하지 않는다)의 존재하에서 측정하고, 전기 수용체와 측정대상 물질과의 형광을 전기 수용체에 야기된 형광공명 에너지 이동에 의해 장수명 여기형 형광으로 하는 단계를 포함하는 방법.

Description

장수명 여기형 형광을 이용하는 측정방법{Measuring Method Using Long Life Fluorescence of Excitation Type}
형광을 검출하여 시료 중의 측정대상 물질을 측정하는 방법(형광법)은, 간편 하고도 고감도의 측정이 가능하며, 면역플레이트 리더(immuno plate reader) 등의 분석장치를 사용하여 자동화가 가능한 것에서 임상검사를 비롯하여 많은 분야에서 이용되고 있다. 특히, 형광이 가지는 여러가지의 특성(형광강도, 이방성, 여기 에너지 이동, 형광수명 등)에서, 몇 천, 몇 만의 시료 중에서 약물의 선도화합물 후보를 선별하는 스크리닝인 고효율 스크리닝(High-throughput screening: HTS)에 있어서 분석(assay)에 있어서 형광법이 이용되고 있다. 형광법은 고효율, 간편 등의점에서 지극히 HTS로의 이용에 적합하며, 형광법은 향후 HTS에 있어서 분석측정의 중심이 되는 것이라고 여겨지고 있다(참조: Rogers, M.V., Drug Discovery Today, Vol. 2, pp. 156-160, 1997).
형광을 검출하고 시료 중의 측정대상 물질을 측정하는 방법에서는, 측정대상 물질에 기인하지 않는, 즉 백그라운드 형광을 발산하는 경우가 있다. 백그라운드 형광은, 시료 중의 측정대상 물질 이외의 내재성 물질이 자가형광을 가지기 위하여 발산하는 경우, 시료 중의 단백질 등에 비특이적으로 부착한 형광색소로 부터 발산하는 경우, 또는 측정대상 물질이 주입되어 있는 용기(플레이트 등)에서 발산하는 경우가 있다. 어느 경우도 감도, 특이적으로 영향을 미치기 때문에, 형광을 검출하여 시료 중의 측정대상 물질을 측정하는 방법에 공통적인 문제점이며, 백그라운드 형광의 영향을 받지 않고 측정하는 방법이 요구되어 왔다.
백그라운드 형광의 영향회피에 관해서는, 시간분해 형광(Time Resolved Fluorescence: TRF)측정을 사용하는 방법이 검토되고 있다. 이것은 란타노이드이온 착체의 형광이 수십 마이크로초에서 수 밀리초로 상당히 장수명인 것에 반하여, 백그라운드 형광의 윈인이 되는 통상의 유기화합물에서 발산하는 형광의 수명은 수 나노초에서 수십 나노초로 짧으므로, 펄스 여기광(pulse exitation light)조사 후, 연장시간(delay time)을 설정하여, 협잡한 백그라운드 형광이 소실한 다음에 란타노이드이온 착체로 부터 유래되는 장수명 형광을 측정하면, 백그라운드 형광의 방해를 받지 않고 측정할 수 있는 것을 이용한 것이다.
그러나, 란타노이드이온 착체자체는 측정대상 물질에 대하여 특이성을 가지지 않기 때문에, 특이성을 수득하기 위해서 항원 ·항체반응(예를 들면, 측정대상 물질에 대한 특이항체를 란타노이드이온 착체에 표지하여 사용한다) 또는 핵산염기의 상호작용(예를 들면, 측정대상 물질과 교배할 수 있는 단쇄 DNA단편을 란타노이드이온 착체에 표지한다) 등을 이용할 필요가 있으며, 이들의 반응, 작용을 이용하는 것이 곤란한 생리활성종이나 생체반응의 측정에는 대응할 수 없었다.
한편, 형광공명 에너지 이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer: FRET)은 하나의 측정계에 2종의 형광성 분자, 공여체(donor)와 수용체(acceptor)가 존재할 때, 공여체를 여기하였음에도 불구하고 수용체의 형광이 관찰되는 현상을 말하며, 공여체의 형광스펙트럼과 수용체의 흡수(여기)스펙트럼에 중복됨에 따라 일어난다.
FRET는, 공여체와 수용체의 상대적 거리의 변화 또는 상대적 배치의 변화를 검출원리로서, 예를 들면, (1) 특이적으로 결합하는 단백질 또는 배위자(ligand)를 각각 공여체, 수용체에 표지하고, 결합시에 일어나는 FRET를 검출에 따른 분자간 상호작용의 측정; (2) 동일분자내의 다른 특정의 2개소를 각각 공여체와 수용체에 표지하고, 어떤 자극에 응답하여 일어나는 FRET 효율의 변화를 검출하여 특정의 2개소의 상대적 배치 변화의 측정; (3) 목적하는 효소가 특이적으로 인식하는 펩티드 서열 또는 특이적 결합(에스테르 결합 등)을 포함하는 기질 아날로그의 양말단을 공여체와 수용체에 표지하고, 절단전후의 FRET 효율의 변화를 검출함에 따른 효소활성의 측정 등에 이용되며, 특이성이 높은 방법이다. 그러나, 측정시에 공여체와 수용체가 특정의 상대적 거리 또는 상대적 배치가 되도록 단백질 또는 핵산 등을 공여체, 수용체에 표지해 둘 필요가 있으며, 측정전의 시약의 조제 등이 번잡하며, 높은 코스트가 되는 문제가 있었다.
하나의 측정계에서 TRF와 FRET를 조합하는 방법은 동질성 시간 분해 형광 특정법(Homegenuos Time Resolved Fluorometry: HTRF)으로서 최근 몇 가지의 보고가 있다. 공여체에 유로피움이온 착체를 사용하여, 수용체에 APC(분자량 104,000의 형광성 단백질), 또는 Cy5(시아닌계 색소)를 사용하여, 면역측정이나 분자간 상호작용의 검출 등에 있어서, 검출한계를 비약적으로 향상시켰다는 보고도 있다. 이 방법은, TRF를 이용하는 것에 따라 백그라운드 형광을 저감시키고, S/N비를 크게 향상시킨 결과라고 여겨지나, 측정시에 공여체와 수용체가 특정의 상대적 거리 또는 상대적 배치가 되도록 단백질 등을 공여체 또는 수용체에 표지해 두는 조작은 불가피하다.
본 발명은 형광을 검출하여 시료 중의 측정대상 물질을 측정하는 방법에 관한다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 형광을 검출하여 시료 중의 측정대상 물질을 측정하는 방법이며, 특이성을 수득하는 수단으로서 단백질 또는 핵산 등에 형광물질을 표지한 탐침류를 사용하는 것이 아니라, 백그라운드 형광의 영향을 받지 않고 측정대상 물질을 정확 또는 고감도로 측정하는 방법에 관한 것이다.
도 1은, Tb3+착체와 DAR-M이 공존하는 시스템 및 Tb3+착체와 DAR-MT가 공존하는 시스템에 있어서, Tb3+착체에서 DAR-M 또는 DAR-MT로의 형광공명 에너지 이동(FRET)가 일어나고, DAR-MT에서는 FRET에 의한 DAR-MT 유래의 장수명 형광이일어난 것을 나타낸다. 그래프에서, (A)는 Tb3+착체와 DAR-M이 공존하는 시스템의 결과를 나타내고, (B)는 Tb3+착체와 DAR-MT가 공존하는 시스템의 결과를 나타낸다.
도 2는, 본 발명의 방법에 의해 특이적 형광탐침으로서 DAR-M을 이용하여 일산화질소를 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은, Eu3+착체의 형광스펙트럼과 SNR3의 흡수스펙트럼의 반복적인 상태를 나타낸다.
발명을 실시하기 위한 최적의 형태
일본국 특허출원 제 2000-50868호(2000년 2월 28일 출원)의 명세서에 개시된 내용을 모두 참조로 하여 본 명세서의 개시에 포함한다.
본 발명의 방법은 시료 중의 측정대상 물질을 형광에 의해 측정하는 방법으로서,
(1) 측정대상 물질에 특이적으로 반응하여 형광을 발산하는 특이적 형광탐침, 및
(2) 그 자신이 장수명 형광을 가지고, 전기 특이적 형광탐침을 수용체로서 전기 수용체에 형광공명 에너지 이동을 야기시키는 것이 가능한 공여체의 존재하에서 측정을 수행하고, 전기 수용체와 측정대상 물질과의 반응에 의한 형광을 전기 수용체에 야기된 형광공명 에너지 이동(FRET)에 의해 장수명 여기형 형광으로 하고, 바람직하게는 전기 FRET로부터 일어난 수용체의 장수명 여기형 형광을 시간분해 형광측정(TRF)에 의해 측정하는 것을 특징으로 한다. 전기 공여체와 특이적 형광탐침은, 화합결합에 따른 결합을 형성하지 않고, 측정계내에서 양자는 독립적으로 존재하는 것이 필요하다.
측정대상 물질의 종류는 특히 한정되지 않으나, 예를 들면, 일산화질소, Ca2+, Zn2+등의 생체내분자, 카스파제 등의 가수분해 효소 등을 들 수 있다. 측정대상 물질과 반응하여 형광을 발산하는 특이적 형광탐침의 종류도 특히 한정되지 않으며, 측정대상 물질과 특이적으로 반응하고, 또는 그 반응에 의해 형광을 발산하는 것이면 어느 것이라도 이용하여도 무방하다. 본 명세서에 있어서 「특이적으로 반응」이라는 용어는, 통상적으로는 시료 중에 포함되는 다른 성분에는 실질적으로 반응하지 않고, 실질적으로 측정대상 물질에만 반응하는 물질을 의미하고 있으나, 측정대상 물질의 측정이 가능하게 되는 최저한도의 특이적인 반응성을 가지는 탐침도 이용가능하며, 상기의 용어는 어떠한 의미에 있어서도 한정적으로 해석해서는 안된다. 측정대상 물질을 포함하는 시료의 종류는 특별히 한정되지 않고, 어떠한 것을 이용하여도 무방하다. 예를 들면, 생체시료 등의 천연유래의 시료 외, 인공적인 시료도 포함된다.
생체시료로서는, 예를 들면 생체외에 분리된 생체시료, 예를 들면, 혈액(혈청, 혈장) 또는 소변 등의 체액, 조직, 또는 세포 등을 들 수 있다. 인공적인 시료로서는, 예를 들면 유전자재조합에 의해 생산된 동물이나 식물유래의 조직이나 세포 등 외에 유전자재조합에 의해 생산된 비천연형 단백질을 포함하는 세포 등을들 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에 있어서 「측정」이라는 용어는, 검출, 정량, 정성 등 여러가지의 목적의 측정을 포함하고 가장 광범위하게 해석되어야만 한다.
특이적 형광탐침이 측정대상 물질과 반응하여 형광을 발산하는 기구에 대해서도 특별히 제한은 없다. 예를 들면, 특이적 형광탐침 자체가 측정대상 물질과의 반응전은 실질적으로 무형광의 화학구조를 가지고 있으나, 측정대상 물질과 반응하는 것에 따라 형광을 가지는 구조에 변화하는 경우, 또는 특이적 형광 탐침의 분자내에서 형광물질이 소광을 일으키는 것과 같은 상태에서 연결되어 있으며, 측정대상 물질과의 반응에 의해 그 연결이 절단되는 경우 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
특이적 형광탐침 자체가 측정대상 물질과의 반응전은 실질적으로 무형광의 화학구조를 가지고 있으나, 측정대상 물질과 반응하는 것에 따라 형광을 가지는 구조에 변화하는 경우의 구체적인 예로서는, 일산화질소와 반응하는 것에 따라 형광을 발산하는 디아미노플루오레신 유도체(참조: 특개(평) 10-226688호 명세서), 디아미노로다민 유도체(참조: 국제공개 WO99/01447호 명세서), 아연 형광탐침(참조: 특원(평) 11-040325호 명세서), 일중항 산소측정용 탐침(참조: 국제공개 WO99/51586호 명세서) 등을 들 수 있다. 예를 들면, 국제공개 WO99/01447호 명세서에 기재된 디아미노로다민 유도체는, 일산화질소와 특이적으로 반응하여 트리아졸환을 가지는 구조로 변화하고, 이 구조변화에 의해 형광을 발산한다.
특이적 형광탐침의 분자내에서 형광물질이 소광을 일으키는 것과 같은 상태로 연결되어 있으며, 측정대상 물질과의 반응에 의해 그 연결이 절단되는 경우의 구체적인 예로서는, 카스파제와 반응하고 형광을 발산하는 PhiPhiLux-G2D2(OnicoImmuni사 제품). (참조: 「신아포토시스 실험법」, 제 2판, 양토사, pp. 201-204, 1999)를 예로 들 수 있다. PhiPhiLux-G2D2는 카스파제-3, -7 등에 의해 절단되는 특이적 아미노산 서열(GDEVDGID)의 양단에 각각 1분자씩 로다민이 결합한 구조를 가지고 있으나, 양단의 로다민끼리 이량체 구조를 형성하기 때문에, 형광이 소실한 상태에서 존재하고 있다. 카스파제와의 반응에 의해, GDEVD와 GID의 사이에서 로다민 2분자의 연결이 절단되면, 소광작용을 잃어버려 형광을 발산한다.
그 자신이 장수명 형광을 가지고, 전기 특이적 형광탐침을 수용체로서 전기 수용체에 형광공명 에너지 이동을 야기시키는 것이 가능한 공여체로서는, 예를 들면, Eu3+(유로피움이온), Tb3+(텔비움이온), Sm3+(써머리움이온), Dy3+(디스프로슘이온) 등의 란타노이드이온이 배위자와 킬레이트를 형성한 란타노이드이온 착체를 들 수 있다. 전기 란타노이드이온 착체는 당업계의 통상적인 방법에 의해 수득하는 것이 가능하며, 예를 들면, 란타노이드이온과 착체를 형성하는 배위자로서 공지의 다이에틸렌트리아민펜타아세트산(diethylenetriaminepentaacetic acid: DTPA) 유연체의 하나인 DTPA-cs124를 셀빈 등(참조: Selvin P.R. et al, J. Am. Chem. Soc., Vol. 117, pp. 8132-8138, 1995)의 방법으로 합성하고, 수득된 배위자를 란타노이드이온과 액중에서 혼합하여 란타노이드이온 착체를 수득할 수 있다.
특이적 형광탐침과 상기 공여체(예를 들면 란타노이드이온 착체)는, 수용체인 특이적 형광탐침에 최적의 형광공명 에너지 이동을 야기시키고, 또한 전기 수용체가 시간분해 형광측정에 의해 측정가능한 장수명 여기형 형광을 일으키는 것과 같이, 최적의 조합을 선택하는 것이 가능하다. 형광공명 에너지 이동에 대해서는, Stryer L., Ann. Rev. Biochem., Vol. 47, pp. 819-846, 1978 등에 기재되어 있으며, 형광공명 에너지 이동이 일어났는지 아닌지는 상기 문헌에 기재된 방법에 의해 정확히 판정가능하며, 예를 들면, 본 명세서의 실시예에 구체적으로 기재된 측정방법을 참조하면서, 적의 실험적으로 확인할 수 있다.
또한, 장수명형광이라 함은, 일반적으로는 그 수명이 10-5초에서 10-3초정도의 형광을 의미하며, 공여체의 형광수명은 통상 10-3초정도, 형광공명 에너지 이동에 의해 생긴 장수명 여기형 형광의 수명은 통상 10-4초정도이다. 또한, 시간분해 형광측정에 대해서는, Hammila I. & Webb S., Drug Discovery Today, Vol. 2, pp. 373-381, 1997에 상세하게 기재되어 있으며, 본 명세서의 실시예에 구체적인 방법이 나타나 있기 때문에, 당업자는 용이하게 이 측정방법을 수행하는 것이 가능하다.
본 발명의 시약조성물은, 상기의 (1) 측정대상 물질에 특이적으로 반응하고 형광을 발산하는 특이적 형광탐침, 및 (2) 그 자신이 장수명 형광을 가지고, 전기 특이적 형광탐침을 수용체로서 전기 수용체에 형광공명 에너지 이동을 야기시키는 것이 가능한 공여체를 포함하는 조성물로서 제공된다. 조성물의 조제에는, 필요에따라 시약의 조제에 통상적으로 이용되는 첨가제를 이용하여도 무방하다. 또한, 본 발명의 키트는 상기 (1) 및 (2)의 성분을 각각 사전에 혼합하지 않고, 독립시킨 상태에서 제공된다. 각각의 성분은, 필요에 따라 시약의 조제에 통상적으로 이용되는 첨가제를 배합하여 조성물로서 조제되어도 무방하다. 조성물의 조제에 이용하기 위한 첨가제로서, 예를 들면, 용해보조제, pH조절제, 완충제, 등장화제 등의 첨가제를 들 수 있으며, 이들의 배합량은 당업자에 적절한 선택이 가능하다. 이들의 조성물은, 분말형태의 혼합물, 동결건조물, 과립제, 정제, 액제 등 적절한 형태의 조성물로서 제공된다.
본 발명의 과제는, 형광을 검출하여 시료 중의 측정대상 물질을 측정하는 방법에 있어서, 특이성을 수득하는 수단으로서, 단백질 또는 핵산 등에 형광물질을 표식한 탐침류를 사용하지 않고, 백그라운드 형광의 영향을 받지 않고 측정대상 물질의 측정을 수행하는 간편하거나 고감도의 측정방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 상기의 과제를 해결해야 하는 예의검토를 한 결과, 의외로 그 자신이 장수명 형광을 가지고 FRET를 일으켜 수득하는 공여체와 전기 공여대에 대한 수용체와를 극히 가까운 거리가 되도록 연결한 경우에는 FRET를 야기시키지않고, 전기 공여체 및 전기 수용체가 연결되지 않고 자유적롭게 이동할 수 있는 상태에 있을 때에 FRET가 일어나는 경우가 있다는 것을 알아내었다.
아울러, 본 발명자들은 검토를 반복한 결과, 시료 중의 측정대상 물질에 특이적으로 반응하여 형광을 발산하는 특이적 형광탐침, 및 그 자신이 장수형광을 가지고, 전기 특이적 형광탐침을 수용체로서 전기 수용체에 FRET를 일으키는 것이 가능한 공여체를 공여시킴에 따라, 특이적 형광탐침과 측정대상 물질과의 반응에 의해 생기는 형광을 공여체로부터의 FRET에 의해 장수명 여기형 형광으로 하고, 그 장수명 형광을 TRF측정에 의해, 시료 중의 측정대상 물질을 지극히 고감도로 측정할 수 있는 것을 알아내었다. 또한, 본 발명자들은 이 방법에 의하면, 시료 중의 측정대상 물질이외의 내재성 물질에 유래하는 자가형광이나 측정대상 물질이 주입되어 있는 용기(플레이트 등)에서 생기는 백그라운드 형광의 영향을 받지않고 측정할 수 있으며, 지극히 정확한 측정이 가능하게 된다는 것을 알아내었다. 본 발명은 이들의 지견을 바탕으로 완성된 것이다.
즉, 본 발명은 시료 중의 측정대상 물질을 형광에 의해 측정하는 방법으로서,
(1) 측정대상 물질에 특이적으로 반응하여 형광을 발산하는 특이적 형광탐침, 및
(2) 그 자신이 장수명 형광을 가지고, 전기 특이적 형광탐침을 수용체로서 전기 수용체에 형광공명 에너지 이동을 야기시키는 것이 가능한 공여체(단, 전기 공여체는 특이적 형광탐침과는 화학결합에 의한 결합을 형성하지 않는다)
의 존재하에서 측정하고, 전기 수용체와 측정대상 물질과의 반응에 따른 형광을 전기 수용체에 야기된 형광공명 에너지 이동에 의해 장수명 여기형 형광으로 하는 단계를 포함하는 방법을 제공하는 것이다. 이 방법의 바람직한 태양에 의하면, 전기 장수명 여기형 형광을 시간분해 형광측정에 의해 측정하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 좀 더 바람직한 태양에 의하면, 전기 공여체가 란타노이드이온 착체인 상기의 방법; 전기 란타노이드이온 착체가 유로피움이온 착체 또는 텔비움이온 착체인 상기의 방법; 전기 수용체가 크산틴(xantine) 골격을 가지는 수용체인 상기의 방법; 전기 공여체가 텔비움이온 착체이며, 전기 수용체가 로다민 골격을 가지는 수용체인 상기의 방법; 및 전기 측정대상 물질이 일산화질소 또는 카스파제(caspase)인 상기의 방법이 제공된다.
다른 관점으로는, 본 발명에 의해 시료 중의 측정대상 물질을 형광에 의해 측정하기 위한 시약조성물로서,
(1) 측정대상 물질에 특이적으로 반응하여 형광을 발산하는 특이적 형광탐침, 및
(2) 그 자신이 장수명 형광을 가지고, 전기 특이적 형광탐침을 수용체로서 전기 수용체에 형광공명 에너지 이동을 야기시키는 것이 가능한 공여체(단, 전기 공여체는 특이적 형광탐침과는 화학결합에 따른 결합을 형성하지 않는다)
를 포함하는 조성물이 제공된다.
또 다른 관점으로는, 본 발명에 의해 시료 중의 측정대상 물질을 형광에 의해 측정하기 위한 시약키트로서,
(1)측정대상 물질에 특이적으로 반응하여 형광을 발산하는 특이적 형광탐침, 및
(2) 그 자신이 장수명 형광을 가지고, 전기 특이적 형광탐침을 수용체로서 전기 수용체에 형광공명 에너지 이동을 야기시키는 것이 가능한 공여체(단, 전기 공여체는 특이적 형광탐침과는 화학결합에 따른 결합을 형성하지 않는다)
를 포함하는 키트가 제공된다.
또 다른 관점으로는, 본 발명에 의해 시료 중의 측정대상 물질에 특이적으로 반응하여 형광을 발산하는 특이적 형광탐침이며, 상기의 방법에 이용하기 위한 형광탐침; 및 그 자신이 장수명 형광을 가지고, 시료 중의 측정대상 물질에 특이적으로 반응하여 형광을 발산하는 특이적 형광탐침을 수용체로서 전기 수용체에 형광공명 에너지 이동을 야기시키는 것이 가능한 공여체이며(단, 전기 공여체는 특이적 형광탐침으로는 화학결함에 따른 결합을 형성하지 않는다), 상기의 방법에 이용하기 위한 공여체가 제공된다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 좀 더 구체적으로 설명하나. 본 발명의 범위는 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
예 1: 특이적 형광탐침(DAR-M)의 제조
국제공개 W099/01447호 명세서에 개시된 방법으로 제조한 DAR-1 [3, 6-비스(디에틸아미노)-9-(3, 4-디아미노-2-카복시페닐)크산틸리움 ·분자내염]을 에탄올로 용해하고, 요오드화메틸을 DAR-1에 대하여 1.7 등량을 첨가하고, 80℃에 승온하였다. 1시간마다 원료의 소실정도와 디메틸체의 생성정도를 TLC로 확인하면서, 요오드화메틸 1.7 등량을 추가하고, 원하는 목적물이 생성한 시점에서 반응을 종료하였다. 생성물을 실리카겔크로마토그래피 및 정제용TLC로 정제하고 DAR-M[3, 6-비스(디에틸아미노)-9-[3-아미노-4(N-메틸아미노)-2-카복시페닐]크산틸리움 ·분자내염]을 수득하였다.
m.p. 150-154℃
1H-NMR(300 MHz, CDCl3) δ1.13(12H, t, J=7.0), 2.86(3H, s), 3.33(8H, q, J=7.0), 6.37-6.43(5H, m), 6.75(1H, d, J=7.9), 6.81(2H, d, J=9.0)
FAB-MS 487(M++1)
상기에서 수득한 DAR-M을 메탄올에 용해하고, 일산화질소가스를 스며들게 한 다음에 용매를 유거하였다. 정제용TLC에 의해 정제하여 DAR-MT[3, 6-비스(디에틸아미노)-9-(4-카복시-1-메틸벤조트리아졸-5-일)크산틸리움 ·분자내염]을 수득하였다.
m.p. 155-160℃
1H-NMR(300 MHz, CDCl3) δ1.12(12H, t, J=7.1), 3.32(8H, q, J=7.1), 4.37(3H, s), 6.31(2H, dd, J=9.0, 2.5), 6.43(2H, d, J=2.5), 6.58(2H, d, J=9.0), 7.26(1H, d, J=8.6), 7.83(1H, d, J=8.6)
FAB-MS 498(M++1)
예 2
(1) 시료의 조제
다이에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA)유연체의 하나인 DTPA-cs124를 셀빈 등(참조: Selvin P.R. et al, J. Am. Chem. Soc., Vol. 117, pp. 8132-8138, 1995)의 방법으로 합성하였다. 10mM DTPA-cs124의 DMSO용액 및 당량의 10mM TbCl3수용액을 혼합한 다음, 최종농도 10μM이 되도록 0.1M Tris-HCl 완충액(pH 8.8)을 이용하여 희석하고, 30분 이상 방치하여 텔비움이온 착체(Tb3+착체)를 형성시켰다. 전기 Tb3+착체의 용액에 예 1에서 수득한 DAR-M 또는 DAR-MT를 각각 최종농도 1.0, 2.0, 3.0, 5.0, 10.0μM이 되도록 첨가하고, 측정에 이용하였다. DAR-M 또는 DAR-MT를 Tb3+착체와 공존시키지 않는 단독시료를 조제하여 대조로서의 측정에 이용하였다.
(2) TRF스펙트럼의 측정
이하의 광도계 설정조건에서 상기 (1)에서 수득한 시료의 스펙트럼을 측정하였다.
Mode: Phosphate, Excitation: 328nm, Delay Time: 50㎲, Flash Count: 1, Gate Time: 1.00ms, Cycle Time: 20ms, Slit 폭: 2.5nm(Excitation, Emission 공통), Scan speed: 900nm/min
결과를 도 1에 나타내었다. Tb3+착체와 DAR-M이 공존하는 시스템(도 1A)에서는, DAR-M의 농도의존적으로 Tb3+착체에 유래하는 545nm의 형광강도의 감소가 관찰되었다. 한편, Tb3+착체와 DAR-MT가 공존하는 시스템(도 1B)에서는, DAR-MT의 농도의존적으로 Tb3+착체에 유래하는 545nm의 형광강도의 감소가 관찰됨과 동시에, Tb3+착제유래의 형광과는 다른 584nm에 피크를 가지는 형광이 나타났다. DAR-M 또는 DAR-MT를 Tb3+착체와 공존하지 않는 시스템에서는, 동일한 조건에서 스펙트럼을 측정하여도 형광은 관찰되지 않고, DAR-M 및 DAR-MT는 연장시간 50㎲를 넘는 장수명의 형광을 가지고 있지 않다고 결론내렸다. 이상에서, Tb3+착체 및 DAR-M이 공존하는 시스템에서는, Tb3+착체에서 DAR-M으로의 FRET가 일어났으나, DAR-M이 형광을 가지지 않기 때문에 Tb3+착체의 형광강도의 감소만이 관찰되었으며, 한편, Tb3+착체 및 DAR-MT가 공존하는 시스템에서는, Tb3+착체에서 DAR-MT로의 FRET가 일어나며, 이 FRET에 의한 DAR-MT의 장수명 형광이 발산된 것을 확인할 수 있었다.
(3) 형광수명의 측정
이하의 광도계 설정조건에서 상기(1)의 시료에 대해서 50㎲마다 형광강도를 측정하고, I=I0exp(-t/τ)의 식에 적용시킨 형광의 감쇠곡선을 구하였다. 구한 감쇠곡선에서 형광수명(τ)을 구하였다.
Mode: Short Phos, Decay, Excitation: 328nm, Emission: 545nm 또는 584nm, Flash Count: 1, Gate Time: 0.01ms, Cycle Time: 20ms, Slit 폭: 10nm, Integ Time: 1.0s
결과를 표 1에 나타내었다.
Tb3+착체와 DAR-M이 공존하는 시스템(표에서의 DAR-M의 예)에서는, DAR-M의 농도의존적으로 Tb3+착체에 유래하는 545nm의 형광수명이 단축되었다. 한편, Tb3+착체와 DAR-MT가 공존하는 시스템(표에서의 DAR-MT의 예)에서는, DAR-MT의 농도의존적으로 Tb3+착체에 유래하는 545nm의 형광수명과, Tb3+착체유래의 형광과는 새롭게 출현한 584nm의 형광수명이, ㎲오더에서 일치하면서 단축되었다. 이상에서, 전기 (2)의 결과와 동일하게, Tb3+착체유래의 형광과는 새롭게 출현한 584nm의 형광은, Tb3+착체에서 DAR-MT로의 FRET가 일으킨 결과, 이 FRET에 의해 발생한 DAR-MT의 장수명형광인 것을 확인할 수 있었다.
표 1
예 3: 일산화질소의 측정
(1) 일산화질소 측정시약의 조제
10mM DTPA-cs124의 DMSO용액 및 당량의 10mM TbCl3수용액을 혼합한 다음, 최종농도 10μM가 되도록 0.1M인산 나트륨완충액(pH 7.0)을 이용하여 희석하고 30분 이상 방치하여 수득한 Tb3+착체에, 아울러 10mM DAR-M DMSO용액을 최종농도 3.0μM이 되도록 첨가하고, 일산화질소 측정시약을 조제하였다.
(2) 측정방법
상기 (1)에서 수득된 일산화질소 측정시약을 형광셀에 삽입하고, 교반하면서 여기파장 328nm, 형광파장 584nm의 형광강도의 변화를 경시적으로 측정하였다. 측정개시 120초 후에 완충액 중에서 서서히 일산화질소를 방출하는 일산화질소 공여체인 NOC13을 최종농도 10μM이 되도록 첨가하고, 3600초까지 측정을 계속하였다. 일산화질소 측정시약과 각각 동일 농도의 Tb3+착체 또는 DAR-M용액을 조제하여 대조하였다.
Mode: 형광시간 변화측정, Excitation: 328nm, Emission: 584nm, Slit 폭: 2.5nm(Excitation, Emission공통), 포트말전압: 950 V
일산화질소 측정시약에 있어서 형광강도의 경시변화에서 DAR-M만의 시약의 형광강도의 경시변화를 뺀 일산화질소 검출에 유래하는 정미의 형광강도의 경시변화를 도 2에 나타내었다. NOC13 첨가직후에서 경시적인 584nm의 형광강도의 증대가 인정되었다.
예 4(참고예)
형광공명 에너지 이동을 효율적으로 일으키는 물질(SNR3)을 특이적 형광탐침의 모델로서 이용하고, 공여체와의 조합으로 형광공명 에너지 이동을 야기하고, 전기 물질에서 일어난 장수명 여기형 형광을 측정하였다.
(1) SNR3의 제조
(a) 2-히드록시-4-테트라히드로퀴놀리디노[1, 9-hi](2'-카복시벤조일)벤젠
무수푸탈산(2g, 13.5mmol), 8-히드록시퀴놀리딘(1g, 5.28mmol)을톨루엔(30ml) 중에서 혼합하고 밤새 가열 환류하였다. 용매를 유거한 후, 잔사를 실리카겔컬럼크로마토그래피(AcOEt/CH2Cl2=1/1)로 정제하여 목적물을 수득하였다(수율 40%).
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ1.68-1.91(m, 4H), 2.32-2.46(t, 2H, J=6.2Hz), 2.55-2.63(t, 2H, J=6.2Hz), 3.15-3.30(m, 4H), 6.40(s, 1H), 7.32(d, 1H, J=6.6Hz), 7.55-7.68(m, 2H), 7.94(d, 1H, J=7.5Hz), 12.95(s, br 1H)
(b) 6-N,N-디에틸아미노-1-나프톨
6-아미노-1-나프톨(2g, 12.6mmol), 요오드에탄(10g, 64mmol), 트리에틸아민(1ml)을 무수디메틸포름아미드(5ml)에서 혼합하고, 120℃에서 5시간 교반하였다. 반응혼합물에 200ml의 디클로로메탄을 첨가하여 물로 세정하고, 아울러 포화식염수로 세정하였다. 유기상을 건조한 다음, 용매를 유거하여 수득된 잔사를 실리카겔컬럼크로마토그래피(n-hexane: CH2Cl2=1:9)로 정제하여 목적물을 수득하였다(수율 32%).
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ1.20(t, 6H, J=7.0Hz), 3.44(q, 4H), 6.47(dd, 1H, J=7.0, 1.3Hz), 6.84(d, 1H, J=2.6Hz), 7.07(dd, 1H, J=9.3, 2.6Hz), 7.21(m, 2H), 8.00(d, 1H, J=9.4Hz)
(c) 3-디에틸아미노-10-테트라히드로퀴놀리디노[1, 9-hi]-9-[2'-카복시
페닐]-벤조[c]크산틸리움(SNR3)
상기(a)에서 수득된 2-히드록시-4-테트라히드로퀴놀리디노[1, 9-hi](2'-카복시벤조일)벤젠(60mg, 0.18mmol), 상기(b)에서 수득된 6-N,N-디에틸아미노-1-나프톨(40mg, 0.18mmol)을 메탄설폰산(2ml)에 용해하고, 85℃로 12시간 교반하였다. 반응혼합물을 냉각한 후, 약 500ml의 빙수를 붓고, 혼합액을 빙수에서 냉각하면서 2N NaOH수용액으로 중화하고, 아울러 5ml농염산을 첨가하여 산성으로 만들었다. 발생한 침전을 여취하고, 실리카겔컬럼크로마토그래피(10% MeOH/CH2Cl2)로 정제하고 목적물을 수득하였다(수율 20%)
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ1.23(t, 6H, J=7.0Hz, a); 2.12(m, 8H, b); 3.11(m, 4H, c); 4.13(q, 4H, J=7.9Hz, d); 6.24(s, 1H, e); 6.59(d, 1H, J=8.8Hz, f); 6.79(d, 1H, J=2.6Hz, g); 7.17(m, 3H, h, i, j); 7.62(m, 2H, k, l); 8.04(m, 1H, m); 8.35(d, 1H, J=9.2Hz, n)
FAB-MS: 517(M+)
(2) 스펙트럼 측정
자외가시 흡광스펙트럼 측정에는 시마쯔 UV-1600을 이용하고, 산프린피치를0.2nm 또는 0.5nm으로 하고, 스캔스피드 6단계 중에서 저속을 사용하였다. 형광스펙트럼 측정에는 퍼킨엘마 LS50B을 이용하고, 스캔스피드를 900nm/분으로 하고, 여기측 슬릿 및 형광측 슬릿을 함께 2.5nm으로서 측정을 수행하였다. Eu3+착체의 형광스펙트럼과 SNR3의 흡수스펙트럼의 반복 적분 J의 산출은, 이하의 식을 이용하였다.
SNR3의 DMSO용액(10mM)을 인산칼륨완충액(pH 7.4)으로 희석하고 10μM 용액을 조제하고, 이 용액을 스펙트럼측정에 이용하였다. 자외가시 흡수스펙트럼 및 형광스펙트럼을 측정하고, Eu3+착체의 형광스펙트럼과 SNR3의 흡수스펙트럼의 반복 적분J를 구하여, 그 결과를 도 3에 나타내었다. SNR3 및 Eu3+착체의 형광강도의 최대치를 각각 100으로 맞추고, 10μM의 SNR3 용액(0.1M 인산칼륨완충액, pH 7.4)의 흡수스펙트럼과 반복하여 나타내었다. SNR3은 λex=615nm, λem=655nm의 형광특성을 가지고, Eu3+착체의 형광스펙트럼과의 반복 적분은 7.34 ×1015(nm4cm-1M-1)이었다. 이 값은, 장파장여기 형광물질 Cy5의 흡수스펙트럼과 Eu3+착체의 형광의 반복 적분의 크기(6.55 ×1015nm4cm-1M-1, 참조: Selvin, P.R., et al., J. Am. Chem.Soc., 116, 6029-6030, 1994)와 비교하여도 FRET를 일으키기에 충분히 큰 값이라고 말할 수 있다.
본 발명의 방법에 의하면, 생체시료 등에 포함되는 측정대상 물질을 백그라운드 형광의 영향을 받지 않고 정확 또는 고감도로 측정할 수 있다. 또한, 특이성을 수득하는 방법으로서, 단백질이나 핵산 등에 형광물질을 표지한 탐침류를 사용할 필요가 없기 때문에, 시약의 조제가 간단한 것만 아니라, 항원 ·항체반응이나 핵산염기의 상호작용 등을 이용할 수 없는 생리활성종이나 생체반응의 측정에 사용하는 것이 가능하다.

Claims (11)

  1. (1) 측정대상 물질에 특이적으로 반응하여 형광을 발산하는 특이적 형광탐침(fluorescence probe), 및
    (2) 그 자신이 장수명 형광을 가지고, 전기 특이적 형광탐침을 수용체로서 전기 수용체에 형광공명 에너지 이동을 야기시키는 것이 가능한 공여체(단, 전기 공여체는 특이적 형광탐침과는 화학결합에 의한 결합을 형성하지 않는다)의 존재하에서 측정하고, 전기 수용체와 측정대상 물질과의 반응에 따른 형광을 전기 수용체에 야기된 형광공명 에너지 이동에 의해 장수명 여기형 형광으로 하는 단계를 포함하는 시료 중의 측정대상 물질을 형광에 의해 측정하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    전기 장수명 여기형 형광을 시간분해 형광측정에 의해 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    전기 공여체가 란타노이드이온 착체인 방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    전기 란타노이드이온 착체가 유로피움이온 착체 또는 텔비움이온 착체인 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    전기 수용체가 크산틴(xantine) 골격을 가지는 수용체인 방법.
  6. 제 4항에 있어서,
    전기 공여체가 텔비움이온 착체이며, 전기 수용체가 로다민 골격을 가지는 수용체인 방법.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    전기 측정대상 물질이 일산화 질소 또는 카스파제인 방법.
  8. (1) 측정대상 물질에 특이적으로 반응하여 형광을 발산하는 특이적 형광탐침, 및
    (2) 그 자신이 장수명 형광을 가지고, 전기 특이적 형광탐침을 수용체로서 전기 수용체에 형광공명 에너지 이동을 야기시키는 것이 가능한 공여체(단, 전기 공여체는 특이적 형광탐침과는 화학결합에 따른 결합을 형성하지 않는다)를 포함하는, 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 이용하기 위한 시약조성물.
  9. (1) 측정대상 물질에 특이적으로 반응하여 형광을 발산하는 특이적 형광탐침, 및
    (2) 그 자신이 장수명 형광을 가지고, 전기 특이적 형광탐침을 수용체로서 전기 수용체에 형광공명 에너지 이동을 야기시키는 것이 가능한 공여체(단, 전기 공여체는 특이적 형광탐침과는 화학결합에 따른 결합을 형성하지 않는다)를 포함하는, 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 이용하기 위한 시약키트.
  10. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 이용하기 위한, 시료 중의 측정대상 물질에 특이적으로 반응하여 형광을 만드는 특이적 형광탐침.
  11. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 이용하기 위한 그 자신이 장수명 형광을 가지고, 시료 중의 측정대상 물질에 특이적으로 반응하여 형광을 발산하는 특이적 형광탐침을 수용체로서 전기 수용체에 형광공명 에너지 이동을 야기 시키는 것이 가능한 공여체(단, 전기 공여체는 특이적 형광 탐침과는 화학결합에 따른 결합을 형성하지 않는다).
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