WO2001063265A1 - Procede de mesure dans lequel on utilise la fluorescence de longue duree du type d'excitation - Google Patents

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WO2001063265A1
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Tetsuo Nagano
Kazuya Kikuchi
Mitsunori Koresawa
Hirotatsu Kojima
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Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring a substance to be measured in a sample by detecting fluorescence. More specifically, the present invention relates to a method for measuring a substance to be measured in a sample by detecting fluorescence, wherein probes for labeling a protein or nucleic acid with a fluorescent substance are used as a means for obtaining specificity. The present invention relates to a method for accurately and highly sensitively measuring a substance to be measured without using a fluorescent substance and without being affected by background fluorescence. Background Technology ⁇
  • the method of measuring the substance to be measured in a sample by detecting fluorescence enables simple and highly sensitive measurement, and can be automated using an analyzer such as an immuno plate reader. Therefore, it is used in many fields including clinical tests.
  • fluorescence method due to the various properties of fluorescence (fluorescence intensity, anisotropy, excitation energy transfer, fluorescence lifetime, etc.), high-screening is a screening method that narrows down candidates for drug lead compounds from thousands or tens of thousands of samples.
  • the fluorescence method is used in the assay measurement in throughput screening (HTS).
  • the fluorescence method is extremely suitable for use in HTS in terms of high efficiency and simplicity, and the fluorescence method is considered to be the center of assay measurement in HTS in the future (Rogers, MV, Drug Discovery Today, Vol. 2, pp. 156-160, 1997).
  • the method of measuring the target substance in a sample by detecting the fluorescence may cause so-called background fluorescence that is not caused by the target substance. Background fluorescence occurs when an endogenous substance other than the target substance in the sample has autofluorescence, occurs from a fluorescent dye non-specifically attached to proteins, etc. in the sample, or The container (such as a plate) into which the substance is injected There is. In either case, sensitivity and specificity are affected, so this is a common problem in methods for detecting the target substance in a sample by detecting fluorescence.Measurement is not affected by background fluorescence. A method was required.
  • Time Resolved Fluorescence TRF
  • TRF Time Resolved Fluorescence
  • the lanthanide ion complex has a very long fluorescence of several tens of microseconds to several milliseconds, whereas the lifetime of the fluorescent light generated by ordinary organic compounds that cause background fluorescence is several nanometers. Since it is as short as seconds to several tens of nanoseconds, a delay time (Delay Time) is provided after irradiation with pulsed excitation light, and long-lived fluorescence derived from the lanthanoidion complex is measured after the contaminated background light disappears. This is based on the fact that measurement can be performed without interference from background fluorescence.
  • an antigen-antibody reaction for example, a specific antibody for the substance to be measured is converted to a lanthanide ion complex to obtain the specificity
  • Labeling or the interaction of nucleobases (eg, labeling a single-stranded DNA fragment that can hybridize with the substance to be measured with a lanthanoid ion complex). It could not respond to the measurement of biologically active species or biological reactions, which are difficult to use.
  • ⁇ t-ray transfer (Fluorescence Resonance Energy Transfer: FRET) is a method in which two fluorescent molecules, a donor (donor) and an acceptor (acceptor), are present in one measurement system. Is a phenomenon in which the fluorescence of the acceptor is observed despite the excitation of light, and is caused by the overlap between the fluorescent spectrum of the donor and the absorption (excitation) spectrum of the acceptor.
  • FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • FRET is based on the principle of detecting a change in the relative distance or change in the relative configuration between a donor and an acceptor. For example, (1) Label a protein or ligand that specifically binds with a donor and an acceptor, respectively And measurement of intermolecular interaction by detecting FRET generated upon binding; (2) Two different specific sites within the same molecule are labeled with a donor and an acceptor, respectively.
  • An object of the present invention is to provide a method for measuring a substance to be measured in a sample by detecting fluorescence without using probes in which a fluorescent substance is labeled on a protein or a nucleic acid as a means for obtaining specificity.
  • An object of the present invention is to provide a simple and highly sensitive measurement method for measuring a target substance without being affected by ground fluorescence.
  • the present inventors have been diligently studying to solve the above-mentioned problems, and surprisingly, a donor capable of causing FRET itself and having a long lifetime fluorescence and an acceptor for the donor pair have been brought into close proximity. FRET does not occur when linked at a distance, and FRET occurs when the donor and the acceptor are not linked and can move freely. I found that there is. '
  • the present inventors have found that a specific fluorescent probe that specifically reacts with a substance to be measured in a sample to generate fluorescence, and that itself has long-lived fluorescence, By coexisting a donor capable of generating FRET with the acceptor, the fluorescence generated by the reaction between the specific fluorescent probe and the substance to be measured can be used as a long-lived excitation type by FRET from the donor. It was found that the TRF measurement of the long-lived fluorescence as the fluorescence enables the measurement of the target substance in the sample with extremely high sensitivity.
  • the present inventors have found that autofluorescence derived from an endogenous substance other than the substance to be measured in the sample, and the background generated from the force of the container (such as a plate) into which the substance to be measured is injected. It can be measured without being affected by the background fluorescence, and extremely accurate measurement is possible '. This effort was completed based on these findings. .
  • the present invention relates to a method for measuring a substance to be measured in a sample by fluorescence
  • the method comprises the steps of: performing a measurement in the presence of a target, and converting the fluorescence from the reaction between the receptor and the substance to be measured into long-lived excitation-type fluorescence by fluorescence resonance energy transfer induced by the receptor. .
  • a method including a step of measuring the long-lived excitation-type fluorescence by time-resolved fluorescence measurement.
  • the above method wherein the donor is a lanthanide ion complex; the above method, wherein the lanthanide ion complex is a europium ion complex or a terbium ion complex;
  • the above method wherein the acceptor has a xanthene skeleton; the above method, wherein the donor is a terbium ion complex; and the acceptor is an acceptor having a rhodamine skeleton; and A method as described above, wherein the method is nitric oxide or force spase.
  • a reagent composition for measuring a substance to be measured in a sample by fluorescence comprising:
  • composition comprising: '
  • the present invention provides a reagent kit for measuring a substance to be measured in a sample by fluorescence
  • the present invention provides a specific fluorescent probe which specifically reacts with a substance to be measured in a sample to generate fluorescence, and is a fluorescent probe for use in the above method;
  • a donor is provided for use in the above method.
  • FIG. 1 shows that the Tb 3+ complex and DAR-MT coexist in a system and the Tb 3+ complex and DAR-MT coexist in a system from the Tb 3+ complex to DAR-M or DAR-MT.
  • Fluorescence resonance energy transfer (FRET) occurred, and DAR-MT showed that long-lived fluorescence from DAR-MT by FRET occurred.
  • FRET Fluorescence resonance energy transfer
  • FIG. 2 shows the results of measuring nitric oxide using DAR-M as a specific fluorescent probe according to the method of the present invention.
  • FIG. 3 shows the degree of overlap between the fluorescent spectrum of the Eu 3+ complex and the absorption spectrum of SNR3. '' Best mode for realizing invention
  • the method of the present invention is a method for measuring a substance to be measured in a sample by fluorescence
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the type of the substance to be measured is not particularly limited, but examples thereof include in vivo molecules such as nitric oxide, Ca 2+ and Zn 2+, and hydrolases such as caspase.
  • the type of the specific fluorescent probe that generates fluorescence by reacting with the substance to be measured is not particularly limited, and any probe that can specifically react with the substance to be measured and generates fluorescence by the reaction is used. You may.
  • the term “specifically reacts” generally means a property that does not substantially react with other components contained in a sample but reacts substantially only with the substance to be measured. But the minimum required for measurement of the substance to be measured Probes with limited specific reactivity are also available and the above terms should not be construed in any way as limiting.
  • the type of sample containing the substance to be measured is not particularly limited, and any type may be used. For example, it includes not only natural samples such as biological samples but also artificial samples.
  • the biological sample includes, for example, a biological sample separated out of a living body, for example, a body fluid such as blood (serum, plasma) or urine, a tissue, or a cell.
  • a biological sample separated out of a living body for example, a body fluid such as blood (serum, plasma) or urine, a tissue, or a cell.
  • the artificial sample include tissues and cells derived from animals and plants produced by genetic recombination, and cells containing non-naturally-occurring proteins produced by genetic recombination.
  • the term “measurement” should be interpreted in the broadest sense, including measurement for various purposes such as detection, quantification, and qualitative analysis.
  • the specific fluorescent probe reacts with the substance to be measured to generate fluorescence.
  • the specific fluorescent probe itself has a virtually non-fluorescent chemical structure before reacting with the target substance, but changes to a fluorescent structure by reacting with the target substance, or Fluorescent substances are linked in such a way as to cause quenching within the molecule of the specific fluorescent probe, and the link may be broken by the reaction with the substance to be measured. There is nothing. .
  • the specific fluorescent probe itself has a substantially non-fluorescent chemical structure before reacting with the target substance, but changes to a fluorescent structure by reacting with the target substance
  • Examples thereof include diaminofluorescein derivatives that generate fluorescence upon reacting with nitric oxide (Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-226688), diaminorhodamine derivatives (International Publication W099 / 01447), A dumbbell fluorescent probe (Japanese Patent Application No. 11-040325), a probe for singlet oxygen measurement (International Publication W099 / 51586), and the like.
  • the diaminorhodamine derivative described in International Publication WO099 / 01447 specifically reacts with mononitrated nitrogen to change to a structure having a triazole ring, and this structural change generates fluorescence.
  • a specific example of a case where a fluorescent substance is linked in such a way as to cause quenching in the molecule of a specific fluorescent probe, and the connection is cut off by a reaction with the substance to be measured is as follows.
  • the resulting PhiPhiLux-G2D2 (from Oncolmmuni). ("New apoptosis experiment method", 2nd edition, Yodosha, pp. 201-204, 1999).
  • PhiPhiLux-G2D2 has a structure in which one molecule of rhodamine is bonded to each end of a specific amino acid sequence (GDEVDGID) cleaved by caspase 3, 17 or the like, but rhodamines at both ends are dimerized. It exists in a state where fluorescence is quenched to form a body structure. When the link between the two ordamine molecules is broken between GDEVD and GID due to the reaction with caspase, the quenching effect is lost and fluorescence is generated.
  • GDEVDGID specific amino acid sequence
  • Examples of donors that have long-lived fluorescence themselves and are capable of inducing fluorescence resonance energy transfer to the acceptor using the specific fluorescent probe as an acceptor include, for example, Eu 3+ (europium ion), Lanthanide ion complexes in which lanthanoid ions such as Tb 3+ (terbium ion), Sm 3+ (summarium ion), and Dy 3+ (dysprosium ion) form a chelate with a ligand can be given.
  • the lanthanide ion complex can be obtained by a conventional method.
  • DTPA-csl24 which is one of the known DTPA (Diethylenetriarainepentaacetic Acid) analogs as a ligand forming a complex with a lanthanoid ion
  • DTPA-csl24 which is one of the known DTPA (Diethylenetriarainepentaacetic Acid) analogs as a ligand forming a complex with a lanthanoid ion
  • DTPA-csl24 which is one of the known DTPA (Diethylenetriarainepentaacetic Acid) analogs as a ligand forming a complex with a lanthanoid ion
  • the specific fluorescent probe which is an acceptor induces optimal fluorescence resonance energy transfer, and the acceptor has a long life which can be measured by time-resolved fluorescence measurement. It is possible to select an optimal combination so as to emit excited fluorescence.
  • the fluorescence resonance energy transfer is described in Sryer L., Ann. Rev. Biochem., Vol. 47, pp. 819-846, 1978, and the like. Can be accurately determined in accordance with the method described in Example 1. While referring to the obtained measurement method, it can be confirmed experimentally as appropriate.
  • the long life fluorescent in general, means a fluorescence of about 1 (gamma 3 seconds from the life 10- 5 seconds, fluorescence lifetime of the donor is usually 10-3 seconds to, fluorescence resonance
  • the lifetime of long-lived excitation-type fluorescence generated by energy transfer is usually about 10 to 4 seconds
  • time-resolved fluorescence measurement is described in Hammila L & Webb S., Drug Discovery Today, Vol. 2, pp. 373- 381, 1997, and a specific method is shown in Examples of the present specification, so that those skilled in the art can easily carry out this measuring method.
  • the reagent composition of the present invention comprises the above-mentioned (1) a specific fluorescent probe which specifically reacts with a substance to be measured to generate fluorescence, and (2) has a long-life fluorescence by itself, and
  • the composition is provided as a composition containing a donor capable of inducing fluorescence resonance energy transfer in the acceptor using the probe as an acceptor.
  • an additive which is commonly used in the preparation of a reagent may be used, if necessary.
  • the kit of the present invention is provided in an independent state without previously mixing the components (1) and (2).
  • Each of the components may be prepared as a composition by mixing, if necessary, additives commonly used in the preparation of reagents.
  • additives for use in the preparation of the composition include additives such as a dissolution aid, a pH regulator, a buffer, an isotonic agent, and the like. Can be appropriately selected. These compositions are provided as a composition in an appropriate form such as a mixture in a powder form, a freeze-dried product, a condyle granule, a tablet, and a liquid preparation. ' Example
  • DAR-1 [3,6-bis (ethylamino) -9- (3,4-diamino-2-carboxyphenyl) xanthridium internal salt] produced by the method described in International Publication W099 / 01447 Dissolved in ethanol, add 1.7 volumes of methyl iodide to DAR-1, and bring to 80 ° C. The temperature rose. 1 At each J gap, add 1.7 equivalents of methyl iodide while confirming the disappearance of the raw materials and the formation of the dimethyl form by TLC, and terminate the reaction when the desired target product is formed did.
  • DTPA Diethylenetriaminepentaacetic Acid
  • DTPA-csl24 was synthesized by the method of Senolevin et al. (Selvin PR et al, J. Am. Chem. Soc., Vol. 117, pp. 8132-8138, 1995). . After mixing 10 mM TbCl 3 solution of DMS0 solution Contact Yopi equivalents of 10mM DTPA- csl24, diluted with 0. 1M Tris-HCl buffer so as to have a final concentration of 10 M and (pH8. '8), 30 Terbium ion complex (Tb 3+ complex) was.
  • DAR-M or DAR-MT obtained in Example 1 was added to the solution of the Tb 3+ complex so that the final concentration was 1.0, 2.0, 3.0, 5.0, 10. Used for measurement.
  • a single sample in which DAR- ⁇ or DAR- ⁇ did not coexist with the Tb 3+ complex was prepared and used for measurement as a control.
  • the fluorescence lifetime ( ⁇ ) was determined from the obtained decay curve.
  • Table 1 The results are shown in Table 1.
  • the fluorescence lifetime at 545 nm derived from the Tb 3+ complex was shortened in a concentration-dependent manner of DAR-M.
  • the fluorescence lifetime at 545 nm derived from the Tb 3+ complex depends on the concentration of DAR-MT, The fluorescence lifetime at 584 nm, which is different from the fluorescence derived from the 3+ complex, was shortened while being in the s order.
  • the reagent for measuring nitrogen monoxide obtained in the above (1) was placed in a fluorescent cell, and changes in fluorescence intensity at an excitation wavelength of 328 nm and a fluorescence wavelength of 584 nm were measured over time with stirring. 120 seconds after the start of the measurement, N0C13, a nitric oxide donor that gradually releases nitric oxide in the buffer, was added to a final concentration of “ ⁇ ” and the measurement was continued up to 3600 seconds. A Tb 3+ complex or DAR-M solution having the same concentration as the nitric oxide measurement reagent was prepared and used as a control.
  • FIG. 2 shows the change over time of the net fluorescence intensity derived from the detection of nitric oxide by subtracting the change over time of the fluorescence intensity of the DAR-M-only reagent from the change. Immediately after the addition of N0C13, the fluorescence intensity of 584 dishes increased over time.
  • Example 4 (Reference example)
  • SNR3 substance that efficiently causes fluorescence resonance energy transfer as a model of a specific fluorescent probe, induces fluorescence resonance energy transfer in combination with a donor, and produces a long-lived excitation type generated from the substance. The fluorescence was measured.
  • Shimadzu UV-1600 was used for UV-visible absorption spectrum measurement: the sampling pitch was set to 0.2 nm or 0.5 nm, and a low speed was used from among six scan speeds.
  • the fluorescence spectrum was measured using a Perkin Elmer LS50B with a scan speed of 900 nm / min and both the excitation side slit and the fluorescence side slit at 2.5 nm.
  • the following equation was used to calculate the overlap integral J of the fluorescent spectrum of the Eu 3+ complex and the absorption spectrum of SNR3. '
  • the DMS0 solution (10) of SNR3 was diluted with a potassium phosphate buffer ( ⁇ 7.4) to prepare a 10 ⁇ solution, and this solution was used for spectrum measurement.
  • the UV-visible absorption spectrum and the fluorescence spectrum were measured, and the overlap integral J of the fluorescence spectrum of the Eu 3+ complex and the absorption spectrum of SN 3 was determined.
  • the results are shown in Figure 3.
  • the maximum values of the fluorescence intensities of the SNR3 and ⁇ 3 + complexes were adjusted to 100, respectively, and the results were superimposed on the absorption spectrum of ⁇ of the SNR3 solution (0.1 M potassium phosphate buffer, ⁇ 7.4).

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Description

' 明 細書 長寿命励起型蛍光を用いる測定方法 技術分野 '
本発明は、 蛍光を検知して試料中の測定対象物質を測定する方法に関する。 よ り具体的には、 本発明は、 蛍光を検知して試料中の測定対象物質を測定する方法 であって、 特異性を得る手段としてタンパク質又は核酸等に蛍光物質を標識した プロ一ブ類を使用することなく、 バックグラウンド蛍光の影響を受けずに測定対 象物質の測定を正確かつ高感度に行う方法に関するものである。 背景技術 ·
蛍光を検知して試料中の測定対象物質を測定する方法 （蛍光法） は、 簡便かつ 高感度な測定が可能であり、 ィムノプレートリーダなどの分析装置を使用して自 動化が可能なことから、 臨床検査をはじめ多くの分野で利用されている。 特に、 蛍光の持つ様々な特性 （蛍光強度、異方性、励起エネルギー移動、蛍光寿命など） から、 何千、 何万という試料の中から薬物のリード化合物の候補を絞り込むスク リーニングである High- throughput screening (HTS) における分析 (assay) 測 定において蛍光法が利用されている。蛍光法は高効率、簡便さ等の点で極めて HTS への利用に適しており、 蛍光法は今後 HTSにおける assay測定の中心になるもの と考えられている (Rogers, M. V. , Drug Discovery Today, Vol. 2, pp. 156-160, 1997)。 - 蛍光を検知して試料中の測定対象物質を測定する方法では、 測定対象物質に起 因しない、 いわゆるバックグラウンド蛍光を生.じることがある。 バックグラウン ド蛍光は、 試料中の測定対象物質以外の内在性物質が自家蛍光を有するために生 じる場合、試料中のタンパク質等に非特異的に付着した蛍光色素から生じる場合、 あるいは測定対象物質が注入されている容器 （プレートなど） 力 ら生じる場合な どがある。 いずれの場合も、 感度、 特異性に影響を与えるため、 蛍光を検知して 試料中の測定対象物質を測定する方法に共通した問題点であり、 バックグラウン ド蛍光の影響を受けずに測定する方法が要求されていた。
バックグラウンド蛍光の影響回避に関しては、 時間分解蛍光 （Time Resolved Fluorescence： TRF) 測定を使用する方法が検討されている。 これは、 ランタノィ ドイオン錯体の蛍光が数十マイクロ秒から数ミリ秒と非常に長寿命であるのに対 して、 バックグラウンド蛍光の原因となる通常の有機化合物から生じる蛍光の寿 命は数ナノ秒から数十ナノ秒と短いことから、 パルス励起光照射後、 遅延時間 (Delay Time) を設けて、 夾雑するバックグラウンド章光が消失した後にランタ ノィドィオン錯体に由来する長寿命蛍光を測定すれば、 バックグラウンド蛍光の 妨害を受けることなく測定できることを利用したものである。
しかしながら、 ランタノイドイオン錯体自体は、 測定対象物質に対して特異性 を有していないため、 特異性を得るために抗原 ·抗体反応 （例えば、 測定対象物 質に対する特異抗体をランタノィドイオン錯体で標識して使用する） あるいは核 酸塩基の相互作用 （例えば、 測定対象物質とハイブリダィズしうる一本鎖 DNA断 片をランタノイドイオン錯体で標識する） などを利用する必要があり、 これらの 反応、 作用を利用することが困難な生理活性種や生体反応の測定には対応するこ とができなかった。
'一方、 赏:t ェ レ ー移動 (Fluorescence Resonance Energy Transfer： FRET) は一つの測定系に 2種の蛍光性分子、 供与体 （ドナー） と受容体 （ァクセ プター） が存在する時、 供与体を励起したにも関わらず受容体の蛍光が観察され る現象を言い、 供与体の蛍光スぺクトルと受容体の吸収 （励起） スぺクトルに重 なりがあることによって生じる。
FRETは、供与体と受容体の相対的距離の変化あるいは相対的配置の変化を検出 原理と.して、例えば、 （1)特異的に結合するタンパク質またはリガンドをそれぞれ 供与体、受容体で標識し、結合時に生じる FRETを検出することによる分子間相互 作用の測定； (2)同一分子内の異なる特定の 2ケ所をそれぞれ供与体と受容体で標 識し、何らかの刺激に応答して生じる FRET効率の変化を検出することによる、特 定の 2ケ所の相対的配置の変化の測定；（3)目的の酵素が特異的に認識するぺプチ ド配列あるいは特異的結合 （エステル結合など） を含む基質アナログの両末端を 供与体と受容体で標識し、切断前後の FRET効率の変化を検出することによる酵素 活性の測定などに利用されており、. 特異性の高い方法である。 しかしながら、 測 定時に供与体と受容体が特定の相対的距離あるいは相対的配置になるようにタン パク質あるいは核酸等を供与体、 受容体で標識しておく必要があり、 測定前の試 薬の調製等が煩雑であり、 高コストになるという問題があった。
一つの測定系内で TRF と FRET とを組み合わせる方法は、 Homogenuos Time Resolved Fluorometry (HTRF) として近年、 いくつかの報告がある。 供与体にュ 一口ピウムィオン錯体を使用し、 受容体に APC (分子量 104， 000の蛍光性タンパ ク質）、 または Cy5 (シァニン系色素） を使用し、 免疫測定や分子間相互作用の検 出等において、検出限界を飛躍的に向上させたとの報告がある。 この方法は、 TRF を用いることによりバックグラウンド蛍光を低減させ、 S/N比を大きく向上させ た結果であると考えられる。 しかしながら、 測定時に供与体と受容体が特定の相 対的距離あるいは相対的配置になるよう、 タンパク質等を供与体又は受容体で標 識しておく操作は不可避であった。 発明の開示
本発明の課題は、 蛍光を検知して試料中の測定対象物質を測定する方法におい て、 特異性を得る手段として、 タンパク質あるいは核酸等に蛍光物質を標識した プローブ類を使用することなく、 バックグラウンド蛍光の影響を受けずに測定対 象物質の測定を行う簡便かつ高感度な測定方法を提 することにある。
本発明者らは、 上記の課題を解決すべく鋭意検討していたところ、 意外にも それ自身が長寿命蛍光を有し FRET を起こし得る供与体と該供与対に対する受容 体とを、極近距離になるように連結じた場合には FRETを生じず、前記供与体およ ぴ前記受容体が連結されず自由に移動できる状態にある時に FRET が生じる場合 があることを見出した。 '
本発明者らはさらに検討を重ねた結果、 試料中の測定対象物質に特異的に反応 •して蛍光を生じる特異的蛍光プローブ、 およびそれ自身が長寿命蛍光を有し、 該 特異的蛍光プローブを受容体として該受容体に FRET を生じさせることが可能な 供与体を共存させることにより、 特異的蛍光プローブと測定対象物質との反応に より生じる蛍光を供与体からの FRETにより長寿命励起型蛍光とし、その長寿命蛍 光を TRF測定することにより、 試料中の測定対象物質を極めて高感度に測定でき ることを見出した。 また、 本発明者らは、 この方法によれば、 試料中の測定対象 物質以外の内在性物質に由来する自家蛍光や、 測定対象物質が注入されている容 器 （プレートなど） 力 ら生じるバックグラウンド蛍光の影響を受けずに測定する ことが き、 極めて正確な測定が可能になる'ことを見出した。 本努明はこれらの 知見を基に完成されたものである。 .
すなわち、 本発明は、 試料中の測定対象物質を蛍光により測定する方法であつ て、
(1)測定対象物質に特異的に反応して蛍光を生じる特異的蛍光プローブ、 及び
(2)それ自身が長寿命蛍光を有し、該特異的蛍光プローブを受容体として該受容体 に蛍光共鳴エネルギー移動を惹起させることが可能な供与体 （ただし該供与体は 特異的蛍光プローブとは化学結合による結合を形成しない）
の存在下で測定を行い、 該受容体と測定対象物質との反応による蛍光を該受容体 に惹起された蛍光共鳴エネルギー移動により長寿命励起型蛍光とする工程を含む 方法を提供するものである。 この方法の好ましい態様によれば、 該長寿命励起型 蛍光を時間分解蛍光測定により測定する工程を含む方法が提供される。
本発明のさらに好ましい態様によれば、 前記供与体がランタノィドイオン錯体 である上記の方法；前記ランタノィドイオン錯体がユーロピウムイオン錯体また はテルビウムイオン錯体である上記の方法；前記受容体がキサンテン骨格を有す る受容体である上記の方法；前記供与体がテルビウムイオン錯体であり、 前記受 容体がローダミン骨格を有する受容体である上記の方法；及ぴ前記測定対象物質 がー酸化窒素又は力スパーゼである上記の方法が提供される。 -
'別の観点からは、 本発明により'、 試料中の測定対象物質を蛍光により測定する ための試薬組成物であって、 .
(1)測定対象物質に特異的に反応して蛍光を生じる特異的蛍光プローブ、 及び
(2)それ自身が長寿命蛍光を有し、該特異的蛍光プローブを受容体として該受容体 に蛍光共鳴エネルギー移 ¾を惹起させることが可能な供与体 （ただし該供与体は 特異的蛍光プローブとは化学結合による結合を形成しない）
を含む組成物が提供される。 '
さらに別の観点からは、 本発明により、 試料中の測定対象物質を蛍光により測 定するための試薬キットであって、
(1)測定対象物質に特異的に反応して蛍光を生じる特異的蛍光プローブ、 及び
(2)それ自身が長寿命蛍光を有し、該特異的蛍光プ口ーブを受容体として該受容体 に蛍光共鳴エネルギー移動を惹起させることが可能な供与体 （ただし該供与体は 特異的蛍光プローブとは化学結合による結合を形成しない）
を含むキットが提供される。
さらに別の観点からは、 本発明により、 試料中の測定対象物質に特異的に反応 して蛍光を生じる特異的蛍光プローブであって、 上記の方法に用いるための蛍光 プローブ；及ぴそれ自身が長寿命蛍光を有し、 試料中の測定対象物質に特異的に 反応して蛍光を生じる特異的蛍光プローブを受容体として該受容体に蛍光共鳴ェ ネルギー移動を惹起させることが可能な供与体であって （ただし該供与体は特異 的蛍光プローブとは化学結合による結合を形成しない）、上記の方法に用いるため の供与体が提供される。 図面の簡単な説明
第 1図は、 Tb3+錯体と DAR - Mとが共存する系及ぴ Tb3+錯体と DAR - MTとが共存す る系において、 Tb3+錯体から DAR-M又は DAR- MT への蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET)が生じ、 DAR-MTでは FRETによる DAR- MT由来の長寿命蛍光が生じたことを 示す。 図中、 （A)は Tb3+錯体と DAR- Mが共存する索の結果を示レ、 （B)は Tb3+錯体 と DAR - MTが共存する系の結果を示す。
第 2図は、 本発明の方法により特異的蛍光プローブとして DAR- Mを用いて一酸 化窒素を測定した結果を示す。
第 3図は、 Eu3+錯体の蛍光スぺクトルと SNR3の吸収スぺクトルの重なり具合を 示す。 ' 発明を実;^するための最良の形態
日本国特許出願第 2000- 50868号（2000年 2月 28日出願） の明細書の開示を全 て参照として本明細書の開示に含める。
本発明の方法は、 試料中の測定対象物質を蛍光により測定する方法であって、
(1)測定対象物質に特異的に反応して蛍光を生じる特異的蛍光プローブ、 及び
(2)それ自身が長寿命蛍光を有し、該特異的蛍光プローブを受容体として該受容体 に蛍光共鳴エネルギー移動を惹起させることが可能な供与体
の存在下で測定を行い、 該受容体と測定対象物質との反応による蛍光を該受容体 に惹起された蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET)により長寿命励起型蛍光とし、 好ま しくは前記 FRET.より生じた受容体の長寿命励起型蛍光を時間分解蛍光測定 (TRF) により測定することを特徴としている。 該供与体と特異的蛍光プローブとは化学 結合による結合を形成しておらず、 測定系内で両者は独立に存在することが必要 である。 .
測定対象物質の種類は特に限定されないが、 例えば、 一酸化窒素、 Ca2+、 Zn2+ などの生体内分子、 カスパーゼなどの加水分解酵素などが挙げられる。 測定対象 物質と反応して蛍光を生じる特異的蛍光プローブの種類も特に限定され.ず、 測定 対象物質と特異的に反応でき、 かつ.その反応により蛍光を生じるものであればい かなるものを用いてもよい。 本明細書において 「特異的に反応」 という用語は、 通常は、 試料中に含まれる他の成分には実質的に反応せず、 実質的に測定対象物 質にのみ反応する性質を意味 Lているが、 測定対象物質の測定が可能になる最低 限度の特異的な反応性を有するプローブも利用可能であり、 上記の用語はいかな る意味においても限定的に解釈してはならない。 測定対象物質を含む試料の種類 は特に限定されず、 いかなるものを用いてもよい。 例えば、 生体試料などの天然 由来の試料のほか、 人工的な試料も包含される。
生体試料としては、 例えば、 '生体外に分離された生体試料、 例えば、 血液 （血 清、 血漿） 若しくは尿などの体液、 組織、 又は細胞などが挙げられる。 人工的な 試料'としては、 例えば、 遺伝子組換えにより生産された動物や植物由来の組織や 細胞などのほか、 遺伝子組換えにより生産された非天然型タンパク質を含む細胞 などを挙げることができるが、 これらに限定されることはなレ、。 また、 本明細書 において 「測定」 という用語は、 検出、 定量、 定性など種々の目的の測定を含め て最も広義に解釈されるべきである。
特異的蛍光プローブが測定対象物質と反応して蛍光を生じる機構についても特 に制限はない。 例えば、 特異的蛍光プローブ自体が測定対象物質との反応前は実 質的に無蛍光の化学構造を有しているが、 測定対象物質と反応することによって 蛍光を有する構造に変化する場合、 あるいは特異的蛍光プローブの分子内で蛍光 物質が消光を起こすような状態で連結されており、 測定対象物質との反応により その連結が切断される場合などを挙げることがでぎるが、 これらに限定されるこ とはない。 .
特異的蛍光プローブ自体が測定対象物質との反応前は実質的に無蛍光の化学構 造を有しているが、 測定対象物質と反応することによって蛍光を有する構造に変 化する場合の具体例としては、 一酸化窒素と反応することにより蛍光を生じるジ ァミノフルォレセィン誘導体（特開平 10 - 226688号明細書）、ジァミノローダミン 誘導体 （国際公開 W099/01447号明細書）、 亜鈴蛍光プローブ （特願平 11- 040325 号明細書）、 一重項酸素測定用プローブ （国際公開 W099/51586号明細書） などが 挙げられる。例えば、国際公開 W099/01447号明細書に記載されたジァミノローダ ミン誘導体は、 一酵化窒素と特異的に反応してトリアゾール環を有する構造に変 化し、 この構造変化により蛍光を生じる。 特異的蛍光プローブの分子内で蛍光物質が消光を起こすような状態で連結され ており、 測定対象物質との反応によりその連結が切新される場合の具体例として は、 カスパーゼと反応し蛍光を生じる PhiPhiLux- G2D2 (Oncolmmuni社製）。 （「新 アポトーシス実験法」、 第 2版、 羊土社、 pp. 201- 204, 1999) を挙げることができ ^ る。 PhiPhiLux-G2D2は、 カスパーゼー 3、 一 7などによって切断される特異的ァ ミノ酸配列 （GDEVDGID) の両端にそれぞれ 1分子ずつローダミンが結合した構造 を有しているが、 両端のローダミン同士が二量体構造を形成するため、 蛍光が消 光した状態で存在している。 カスパーゼとの反応により、 GDEVDと GIDの間で口 ーダミン 2分子の連結が切断されると、 消光作用が失われて蛍光を生じる。
それ自身が長寿命蛍光を有し、 該特異的蛍光プローブを受容体として該受容体 に蛍光共鳴エネルギー移動を惹起させることが可能な供与体としては、 .例えば、 Eu3+ (ユーロピウムイオン）、 Tb3+ (テルビウムイオン）、 Sm3+ (サマリゥムイオン）、 Dy3+ (ジスプロシウムイオン） などのランタノイドイオンが配位子とキレートを 形成したランタノィドイオン錯体を挙げることができる。 該ランタノィドイオン 錯体は常法によって得ることが可能であり、 例えば、 ランタノイドイオンと錯体 を形成する配位子として公知の DTPA (Diethylenetriarainepentaacetic Acid) 類 縁体の一つである DTPA- csl24をセルビンら （Selvin P. R. et al, J. Am. Chem. Soc.， Vol. 117, pp. 8132-8138, 1995) の方法で合成し、 得られた配位子をランタ ノィドイオンと液中で混合することによってランタノィドイオン錯体を得ること ができる。
特異的蛍光プローブと上記供与体 （例えばランタノイドイオン錯体） ば、 受容 体である特異的蛍光プローブに最適な蛍光共鳴エネルギー移動を惹起させ、 かつ 該受容体が時間分解蛍光測定により測定可能な長寿命励起型蛍光を発するように、 最適な組み合わせを選択することが可能である。 蛍光共鳴エネルギー移動につい ては、 S ryer L. , Ann. Rev. Biochem. , Vol. 47, pp. 819-846, 1978 などに記載 されており、 蛍光共鳴エネルギー移動が生じたか否かは上記文献に記載された方 法に従って正確に判定可能であり、 例えば、 本明細書の実施例に具体的に記載さ れた測定方法を参照しつつ、.適宜実験的に確認を行うことができる。
なお、 長寿命蛍光とは、 一般的には、 その寿命が 10— 5秒から 1(Γ3秒程度の蛍光 を意味しており、 供与体の蛍光寿命は通常 10— 3秒程度、 蛍光共鳴エネルギー移動 により生じた長寿命励起型蛍光の寿命は通常 10— 4秒程度である。 また、 時間分解 蛍光測定については、 Hammila L & Webb S. , Drug Discovery Today, Vol. 2, pp. 373-381, 1997 に詳細に記載されており、 本明細書の実施例に具体的手法が示さ れているので、 当業者は容易にこの測定方法を行うことが可能である。
本発明の試薬組成物は、上記の（1)測定対象物質に特異的に反応して蛍光を生じ る特異的蛍光プローブ、及び (2)それ自身が長寿命蛍光を有し、該特異的蛍光プロ ーブを受容体として該受容体に蛍光共鳴エネルギー移動を惹起させることが可能 な供与体を含む組成物として提供される。 組成物の調製には、 必要に応じて試薬 の調製に通常用いられる'添加剤を用いてもよい。 また、 本発明のキットは、 上記 (1)及び (2)の成分をそれぞれ予め混合せず、 独立させた状態で提供される。 それ ぞれの成分は、 必要に応じて試薬の調製に通常用レ、られる添加剤を配合して組成 物として調製されていてもよい。 組成物の調製に用いるための添加剤として、 例 えば、 溶解捕助剤、 pH調節剤、 緩衝剤、 等張ィヒ剤などの添加剤を挙げることがで き、 これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。 これらの組成物は、 粉末形' 態の混合物、 凍結乾燥物、 顆.粒剤、 錠剤、 液剤など適宜の形態の組成物として提 供される。 ' 実施例
以下、 本発明を実施例によ,,りさらに具体的に説明するが、 本発明の範囲は下記 の実施例に限定されることはない。
例 1 ：特異的蛍光プローブ (MR- M)の製造
国際公開 W099/01447号明細書に記載の方法で製造した DAR- 1 [3， 6 -ビス（ジェ チルアミノ） - 9- (3， 4 -ジァミノ- 2-カルボキシフエニル）キサンチリゥム ·分子内 塩]をエタノールに溶解し、 ョゥ化メチルを DAR - 1に対して 1. 7等量加え、 80°Cに 昇温した。 1 [Jき間毎に、 原料の消失程度とジメチル体の生成程度を TLCで確認し ながら、 ヨウ化メチル 1. 7等量を追加し、 所望の目的物が生成じた時点で反応を 終了した。 生成物をシリカゲルクロマトグラフィー及びプレパラティブ TLCで精 製して DAR - M [3， 6-ビス（ジェチルァミノ） - 9 -〔3-ァミノ- 4 (N-メチルァミノ） - 2-力 ルポキシフエニル]キサンチリゥム ·分子内塩]を得た。
m. p. 150- 154°C
¾—丽 R (300 MHz, CDC13) δ 1. 13 (12H, t, J=7. 0) , 2. 86 (3H, s) , 3. 33 (8H, q, J=7. 0) , 6. 37-6. 43 (5H, m) , 6. 75 (1H, d, J=7. 9) , 6. 81 (2H, d, J=9. 0) FAB-MS 487 (M++1) 上記で得た DAR- Mをメタノールに溶解し、 一酸化窒素ガスを吹き込んだ後に溶 媒を留去した。 プレパラティブ TLCにより精製して MR-MT [3, 6 -ビス（ジェチル ァミノ） - 9- (4-カルボキシ- 1 -メチルベンゾトリアゾール -5-ィル）キサンチリゥ ム '分子内塩]を得た。
m. p. 155- 160°C
—匪 R (300 MHz, CDCI3) δ 1. 12 (12H, t, 】=7. 1) , 3. 32 (8H, q, J=7. l) , . 37 (3H， s)， 6. 31 (2H, dd， J=9. 0, 2. 5) , 6. 43 (2H, d, J=2. 5) , 6. 58 (2H， d, J=9. 0) , 7. 26 (1H， d， J=8. 6) , 7. 83 (1H, d, J=8. 6)
FAB-MS 498 (M++l) 例 2 ,
(1)試料の調製
DTPA (Diethylenetriaminepentaacetic Acid) 類縁体の一つである DTPA- csl24 をセノレビンら (Selvin P. R. et al, J. Am. Chem. Soc. , Vol. 117, pp. 8132 - 8138， 1995) の方法で合成した。 10mM DTPA- csl24の DMS0溶液おょぴ当量の 10mM TbCl3 水溶液を混合した後、 終濃度 10 Mとなる様に 0. 1M Tris-HCl緩衝液 (pH8. '8) を 用いて希釈し、 30分以上放置してテルビウムイオン錯体 （Tb3+錯体） を形成させ た。 前記 Tb3+錯体の溶液に例 1で得た DAR-M又は DAR- MTをそれぞれ終濃度 1. 0、 2. 0、 3. 0、 5. 0、 10. Ο Μ になるよう添加し、 測定に用いた。 DAR- Μ又は DAR - ΜΤ を Tb3+錯体と共存させない単独の試料を調製して対照としての測定に用いた。
(2) TRFスぺク トルの測定
以下の光度計設定条件で上記（1)で得た試料のスぺク トルを測定した。
Mode : Phosphate^ Excitation : 328nm、 Delay Time : 50 μ s Flash Count : 1、 Gate Time : 1. 00 ms、 Cycle Time : 20 ms,、 Slit 幅： 2. 5 nm (Excitation^ Emission 共通)、 Scan speed : 900 nm/min 結果を第 1図に示す。 Tb3+錯体と DAR-Mが共存する系 （第 1A図） では、 MR-M の濃度依存的に Tb3+錯体に由来する 545 nmの蛍光強度の減少が観察された。一方、 Tb3+錯体と DAR- MTが共存する系 （第 IB図） では、 DAR-MTの濃度依存的に Tb3+錯 体に由来する 545 nmの蛍光強度の減少が観察されるとともに、 Tb3+錯体由来の蛍 光とは別の 584 nmにピーク頂を有する蛍光が出現した。 DAR- M又は MR- MTを Tb3+ 錯体と共存させない系では、 同様の条件でスぺクトルを測定しても蛍光は観察さ れず、 DAR- M及ぴ DAR- MTは Delay Time 50 μ sを超える長寿命の蛍光を有してい ないと結論された。 以上より、 Tb3+錯体及び DAR-Mが共存する系では、 Tb3+錯体か ら DAR - Mへの FRETが生じたが、 MR-Mが蛍光を有さないため Tb3+錯体の蛍光強度 の減少のみが観察され、 一方、 Tb3+錯体及ぴ DAR- MTが共存する系では、 Tb3+錯体 から DAR- MTへの FRETが生じ、 この FRETによる DAR- MTの長寿命蛍光が生じたこ とがわかった。 '
(3)蛍光寿命の測定
以下の光度計設定条件で上記（1)め試料について 50 μ 3毎に蛍光強度を測定し、 I=I0exp (- 1/ τ )の式にあてはめ蛍光の減衰曲線を求めた。求めた減衰曲線より、 蛍光寿命 ( τ ) を求めた。 Mode : Short Phos. Decay Excitation : 328 nm、 Emission : 545 nmまたは 584 nm、 Flash Count : 1、 Gate Time : 0. 01 ms、 Cycle Time : 20 ms、 Slit幅：' 10 nm、 Integ. Time : 1. 0 s 結果を表 1に示した。
Tb3+錯体と MR - Mが共存する系 （表中の DAR - Mの列） では、 DAR- Mの濃度依存的 に Tb3+錯体に由来する 545 nm の蛍光寿命が短縮した。 一方、 Tb3+錯体と MR - MT が共存する系 （表中の MR- MTの列） では、 DAR- MTの濃度依存的に Tb3+錯体に由 来する 545 nmの蛍光寿命と、 Tb3+錯体由来の蛍光とは別の新たに出現した 584 nm の蛍光寿命とが、 s オーダーで一致しながらともに短縮した。 以上より、 前 記（2)の結果と同様に、 Tb3+錯体由来の蛍光とは別の新たに出現した 584 nm'の蛍 光は、 Tb3+錯体から DAR- MTへの FRETが起こった結果、 この FRETにより生じた DAR-MTの長寿命蛍光であることがわかった。 表 1
DAR-M DAR-MT
Run Sample て 545(ms) τ 545(ms) τ 584(ms)
1 10 M Tb3+DTPAcsl24 1.52 1.52
2 RUIII+I M DAR誘導体 0.59 0.45 0.45
3 Runl+2 μ M DAR誘導体 0.29 0.29 0.29
4 Runl+3 μ M DAR誘導体 0.22 0.19 0.19
5 Runl+5 μ M DAR誘導体 0.13 0.13 0.13
6 Runl+10 ix M DAE誘導体 0.08 0.08 0.08 例 3 ：一酸化窒素の測定
(1)一酸化窒素測定試薬の調製
10 mM DTPA-csl24の DMS0溶液および当量の 10 raM TbCl3水溶液を混合した後、 終濃度 ΙΟ μ Μとなる様に 0. 1M リン酸ナトリゥム緩衝液 (ρΗ7. 0) を用いて希釈し 30分以上放置して得た Tb3+錯体に、 さらに 10 mM DAR-M DMS0溶液を終濃度 3. 0 Μになるよう添加し、 一酸ィ匕窒素測定試薬を調製した。
(2)測定方法
上記（1)で得られた一酸ィヒ窒素測定試薬を蛍光セルに入れ、攪拌しながら励起波 長 328 nm、 蛍光波長 584 nmの蛍光強度の変化を経時的に測定した。 測定開始 120 秒後に緩衝液中で徐々に一酸化窒素を放出する一酸化窒素ドナーである N0C13を 終濃度 'ΙΟ μ Μとなるように添カ卩し、 3600秒まで測定を継続した。 一酸化窒素測定 試薬とそれぞれ同濃度の Tb3+錯体又は DAR - M溶液を調製して対照とした。
機器： 日立 F- 4500、
Mode : 蛍光時間変ィ匕測定、 Excitation: 328 nm, Emission: 584 nm. Slit幅： 2. 5 nm (Excitation^ Emission共通)、 ホ卜マノレ電圧： 950 V 一酸化窒素測定試薬における蛍光強度の経時変化から DAR - Mのみの試薬の蛍光 強度の経時変化を差し引いた、 一酸化窒素検出に由来する正味の蛍光強度の経時 変化を図 2に示した。 N0C13添加直後より経時的な 584皿の蛍光強度の増大が認 められた。 例 4 (参考例）
蛍光共鳴エネルギー移動を効率的に起こさせる物質（SNR3)を特異的蛍光プロ一 ブのモデルとして用い、 供与体との組み合わせで蛍光共鳴エネルギー移動を惹起 して、 該物質から生じた長寿命励起型蛍光を測定した。
(1) S願の製造 ■ (a) 2 -ヒドロキシ- 4-テトラヒドロキノリジノ [1， 9- hi] (2' -カルボキシベンゾィ ノレ)ベンゼン
無水フタル酸 （2g, 13.5 ramol)、 8-ヒドロキシキノリジン （1 g, 5.28 ramol) をトルエン （30 ml)中で混合して夜加熱還流した。'溶媒を留去後、 残渣をシリカ ゲル力ラムクロマトグラフィー (AcOEt I CH2C12 = 1/1)で精製して目的物を得た (収率 40%)。
¾ - NMR(300丽 z, DMS0-d6) δ 1.68-1.91 (m, 4H), 2.32-2.46 (t, 2H, J=6.2 Hz) , 2/55-2.63 (t, 2H, J=6.2 Hz) , 3.15-3.30 (m, 4H), 6.40 (s, 1H)， 7.32 (d, 1H, J二 6.6 Hz), 7.55-7.68 (m， 2H), 7.94 (d, 1H, J二 7.5 Hz), 12.95 (s, br 1H)
(b) 6-N, N-ジェチルァミノ - 1 -ナフトール
6_アミノー 1—ナフトール （2g, 12.6讓 ol)、 ョードエタン （10g， 64 mmol)、 ト リエチルァミン （1 ml) を無水ジメチルホルムアミ ド （5 ml)中で混合し， 120°C で 5時間撹拌した。 反応混合物に 200 ml のジクロルメタンを加え水洗し、 さらに 飽和食塩水で洗浄した。 有機相を乾燥後、 溶媒を留去して得られた残査をシリカ ゲルカラムクロマトグラブィー（n - hexane ： CH2C12=1 ： 9)で精製して目的物を得 た（収率 32%)。
- NMR(300丽 z， DMS0 - d6) δ 1.20 (t, 6H, J=7.0 Hz) , 3.44 (q, 4H), 6.47 (dd, 1H, J=7.0, 1.3 Hz), 6,84 (d, 1H, J=2.6 Hz) , 7.07 (dd, 1H， J=9.3, 2.6 Hz), 7.21 (m, 2H), 8.00 (d, 1H， J=9.4 Hz)
(c) 3 -ジェチルァミノ- 10-テトラヒ ドロキノリジノ [1， 9 - hi]- 9- [2，-カルボキシフ 'ェ -ル] -ベンゾ [c]キサンチリゥム （SNR3)
上記（a)で得られた 2 -ヒ ドロキシ- 4 -テトラヒ ドロキノリジノ [1,9 - hi] (2，_カル ポキシベンゾィル）ベンゼン （60mg， 0.18 mmol) , 上記（b)で得られた 6- Ν， Ν -ジェ チルァミノ- 1-ナフトール （40 mg, 0.18 ramol)をメタンスルホン酸 （2 ml)に溶解 し， 85 °Cで 12時間撹拌した。反応混合物を冷却後、およそ 500 ml の氷水にあけ、 混合液を氷水で冷却しながら 2規定 NaOH水溶液で中和し、 さらに 5 ml 濃塩酸を加 えて酸性にした。生じた沈殿を濾取し、シリカゲル力ラムクロマトグラフィー（10% MeOH /CH2C12) で精製して目的物を得た（収率 20%)
¾—腿（300 MHz， DMS0-d6) - δ 1. 23 (t, 6H, J=7. 0 Hz, a)； 2. 12 (m, 8H, b)； 3. 11 (m, 4H, c)； 4. 13 (q, 4H, J=7. 9 Hz, d)； 6. 24 (s， 1H, e)； 6. 59 (d, 1H, J二 8. 8 Hz, f)； 6. 79 (d, 1H, 1=2. 6 Hz, g)； 7. 17 (m, 3H, h, i, j)； 7. 62 (m, 2H, k, 1)； 8. 04 (m, 1H, m)； 8. 35 (d, 1H, J=9. 2 Hz, n)
FAB-MS ： 517 (M+) トル測定
紫外可視吸光スぺク トル測定には島津 UV- 1600を用い:サンプリングピッチを 0. 2 nm又は 0. 5 nmとし、 スキャンスピード 6段階の中から低速を使用した。 蛍光スぺ クトル測定にはパーキンエルマ一 LS50Bを用い、 スキャンスピードを 900 nm/分 とし、励起側スリット及び蛍光側スリットを共に 2. 5 nmとして測定を行った。 Eu3+ 錯体の蛍光スぺクトルと SNR3の吸収スぺク トルの重なり積分 Jの算出は、以下の式 を用いた。 '
ίεΑ(λ) FD( ) 4d εΑ(λ) ：ァクセプターの
J =
モル吸光係数
FD( ) ： ドナーの蛍光強度
( cm^nm4!^"1)
λ ：波長
SNR3の DMS0溶液 （10 ）をリン酸カリウム緩衝液 (ρΗ 7. 4)で希釈して 10 μ Μ 溶液を調製し、 この溶液をスぺクトル測定に用いた。 紫外可視吸光スぺクトル及 ぴ蛍光スぺクトルを測定し、 Eu3+錯体の蛍光スぺクトルと SN 3の吸収スぺクトル の重なり積分 Jを求めた。 結果を図 3に示す。 SNR3及び Έϋ3+錯体の蛍光強度の最大 値をそれぞれ 100にそろえ、 ΙΟ μ Μの SNR3溶液（0. 1M リン酸カリゥム緩衝液、 ρΗ7. 4) の吸収スぺクトルと重ねて示した。 SNR3 は ex = 615 nm, λ em = 655 nm の蛍 光特性を有し、 Eu3+錯体の蛍光スペクトルとの重なり.積分は 7. 34 X 1015
(nm4cm— ^Γ1)であった。 この値は、 長波長励起蛍光物質 Cy5の吸収スぺクトルと Eu3+ 錯体の蛍光の重なり積分の大きさ（6. 55 X 1015
Figure imgf000018_0001
Selvin, P..R. , et al. , J. Am. Chem. Soc. , 116, 6029-6030， 1994)と比較しても FRETを引き起こすのに 十分大きな値であると言える。 産業上の利用可能性 .
本発明の方法によれば、 生体試料などに含まれる測定対象物質をバックグラウ ンド蛍光の影響を受けずに正確かつ高感度に測定できる q また、 特異性を得る手 段として、 タンパク質や核酸等に蛍光物質を標識したプローブ類を使用する必要 がないため、 試薬の調製が簡単なだけでなく、 抗原 ·抗体反応や核酸塩基の相互 作用などを利用できない生理活性種や生体反応の測定に使用することが可能であ, る。

Claims

請求 の 範囲
1 . 試料中の測定対象物質を蛍光により測定する方法であって、
(1)測定対象物質に特異的に反応して蛍光を生じる特異的蛍光プローブ、 及び
(2)それ自身が長寿命蛍光を有し、該特異的蛍光プロ一プを受容体として該受容体 に蛍光共鳴エネルギー移動を惹起させることが可能な供与体 .（ただし該供与体は 特異的蛍光プローブとは化学結合による結合を形成しない）
の存在下で測定を行い、 該受容体と測定対象物質との反応による蛍光を該受容体 に惹起された蛍光共鳴エネルギー移動により長寿命励起型蛍光とする工程を含む 方法。
2 . 該長寿命励起型蛍光を時間分解蛍光測定により測定する工程を含む請求の範 囲第 1項に記載の方法。
3 . 前記供与体がランタノィドイオン錯体である請求の範囲第 1項又は第 2項に 記載の方法。
4 . 前記ランタノィドイオン錯体がユーロピウムイオン錯体又はテルビウムィォ ン錯体である請求の範囲第 3項に記載の方法。
5 . 前記受容体がキサンテン骨格を有する受容体である請求の範囲第 1項ないし 第 4項のいずれか 1項に記載の方法。
6 ·. 前記供与体がテルビウムイオン錯体であり、 前記受容体がローダミン骨格を 有する受容体である請求の範囲第 4項に記載の方法。
7 . 前記測定対象物質が一酸化窒素又はカスパーゼである請求の範囲第 1項ない し第 6項のいずれか 1項に記載の方法。 ·
8 . 請求の範囲第 1項ないし第 7項のいずれか 1項に記載の方法に用いるための 試薬組成物であって、
(1)測定対象物質に特異的に反応して蛍光を生じる特異的蛍光プローブ、 及ぴ
(2)それ自身が長寿命蛍光を有し、該特異的蛍光プローブを受容体として該受容体 に蛍光共鳴エネルギー移動を惹起させることが可能な供与体 （ただし該供与体は 特異的蛍光プローブとは化学結合による結合を形成しない）
を含む組成物。 '
9 . 請求の範囲第 1項な.いし第 7項のいずれか 1項に記載の方法に用いるための 試薬キットであって、
(1)測定対象物質に特異的に反応して蛍光を生じる特異的蛍光プローブ、 及び
(2)それ自身が長寿命蛍光を有し、該特異的蛍光プローブを受容体として該受容体 に蛍光共鳴エネルギー移動を惹起させることが可能な供与体 （ただし該供与体は 特異的蛍光プローブとは化学結合による結合を形成しない）
を含むキット。
1 0 . 試料中の測定対象物質に特異的に反応して蛍光を生じ.る特異的蛍光プロ一 ブであって、 請求の範囲第 1項ないし第 7項のいずれか 1項に記載の方法に用い るためのプローブ。
1 1 . それ自身が長寿命蛍光を有し、 試料中の測定対象物質に特異的に反応して 蛍光を生じる特異的蛍光プローブを受容体として該受容体に蛍光共鳴エネルギー 移動を惹起させることが可能な供与体であって （ただし該供与体は特異的蛍光プ 口ーブとは化学結合による結合を形成しない）、請求の範囲第 1項ないし第 7項の いずれか 1項に記載の方法に用いるための供与体。
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