DE60009063T2

DE60009063T2 - Liganden für den ip3 rezeptor

Info

Publication number: DE60009063T2
Application number: DE60009063T
Authority: DE
Inventors: Tetsuo Nagano; Kazuya Kikuchi; Takanari Inoue; Masamitsu Iino; Kenzo Hirose
Original assignee: NAGANO TESTUO; Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Nagano Tetsuo Tokio/tokyo Jp
Priority date: 1999-06-02
Filing date: 2000-05-25
Publication date: 2004-11-04
Anticipated expiration: 2020-05-26
Also published as: EP1188760A4; AU4781100A; TWI262190B; US6656927B1; WO2000075150A1; JP4226245B2; EP1188760A1; DE60009063D1; EP1188760B1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Liganden des Inosit-1,4,5-trisphosphat-Rezeptors.
Technischer Hintergrund
D-myo-Inosit-1,4,5-trisphosphat (hierin gelegentlich als "IP₃" abgekürzt) ist ein zweiter Messenger, der an den IP₃-Rezeptor bindet, um so die Freisetzung von Ca²⁺ aus den Ca²⁺-Speicherstellen in den Zellen herbeizuführen, und es kontrolliert die Kinetik der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration in einer Vielzahl von Zellen. IP₃ spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle verschiedener Zellfunktionen wie z. B. Sekretion, Insemination, Muskelkontraktion, Nervensignalübertragung und Zellwachstum (Berridge, M. J., Nature, 361, 315, 1993; Clapham, D. E., Cell, 80, 259, 1995).
Zur Untersuchung der durch IP₃ induzierten Signalübertragung wurde eine Vielzahl von IP₃-Analoga synthetisiert (Li, W., et al., Nature, 392, 936, 1998; McCarren, M. et al., J. Neuron, 3, 461, 1989), und die Strukturen der IP₃-Rezeptoren und anderer IP₃-bindender Proteine wurden untersucht (Mourey, R. J. et al., Biochemistry, 32, 1719, 1993). Es wird berichtet, daß, selbst wenn das Phosphat in der 1-Position von IP₃ abgewandelt ist, dessen Bindungsaffinität zum IP₃-Rezeptor nicht wesentlich beeinflußt wird (Schafer, R., et al., Biochem. J. 272, 817, 1990; Prestwich, G. D., et al., J. Am. Chem. Soc. 113, 1822, 1991). Es ist bekannt, daß Adenophostine – Metaboliten, die aus einer Kultur von Penicillium brevicompactum isoliert wurden – überaus wirksame Agonisten des IP₃-Rezeptors sind (Takahashi, M., et al., J. Biol. Chem. 269, 369, 1994).
Offenbarung der Erfindung
Zur Bereitstellung eines neuartigen IP₃-Rezeptorliganden führten die Erfinder der vorliegenden Erfindung verschiedene Untersuchungen durch. Sie fanden so unerwarteterweise, daß Verbindungen mit extrem hoher Affinität zum IP₃-Rezeptor dadurch bereitgestellt werden können, daß das Phosphat in 1-Position von IP₃ mit einem Farbstoff-Derivat oder einem Fluoreszenzfarbstoff-Derivat wie etwa Malachitgrün und Fluorescein abgewandelt wird. Die vorliegende Erfindung wurde auf Grundlage dieses Tatbestands verwirklicht.
Die vorliegende Erfindung macht somit anhand der folgenden allgemeinen Formel (I) dargestellte Verbindungen oder Salze derselben verfügbar:
worin R eine durch die folgenden Formeln (A), (B) oder (C) dargestellte Gruppe bedeutet:
worin R¹ und R² unabhängig voneinander eine C_1-6-Alkyl-Gruppe bedeuten; R³ eine Amino-Gruppe, eine Mono(C_1-6-alkyl)amino-Gruppe, eine Di(C_1-6-alkyl)amino-Gruppe oder eine C_1-6-Alkoxy-Gruppe bedeutet; X^– ein Anion bedeutet und n eine ganze Zahl von 2 bis 5 bedeutet.
Gemäß bevorzugter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden die vorstehend erwähnten Verbindungen oder Salze derselben bereitgestellt, wobei die durch die allgemeine Formel (I) dargestellten Verbindungen diejenigen sind, die anhand der folgenden Formel (I-1) dargestellt sind:
worin R die gleiche Bedeutung hat wie vorstehend definiert; die obengenannten Verbindungen oder Salze derselben, worin R eine anhand Formel (A) dargestellte Gruppe ist, worin R¹ und R² eine Methyl-Gruppe bedeuten, R³ eine Dimethylamino-Gruppe bedeutet, X^– ein Chlor-Ion bedeutet und n 3 ist; sowie die obengenannten Verbindungen oder Salze derselben, worin R eine anhand Formel (A) dargestellte Gruppe ist, worin R¹ und R² eine Methyl-Gruppe bedeuten, R³ eine Dimethylamino-Gruppe bedeutet, X^– ein Chlor-Ion bedeutet und n 3 ist.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden IP₃-Rezeptorliganden bereitgestellt, umfassend eine anhand der vorstehend erwähnten allgemeinen Formel (I) dargestellte Verbindung oder ein Salz derselben. Der IP₃-Rezeptor läßt sich durch Binden des obengenannten IP₃-Rezeptorliganden und anschließendes Bestrahlen mit Licht denaturieren. Die IP₃-Rezeptorliganden, umfassend eine anhand der vorstehend erwähnten allgemeinen Formel (I) dargestellte Verbindung oder ein Salz derselben, sind daher brauchbar als Reagen zien zur Denaturierung des IP₃-Rezeptors. Die vorliegende Erfindung stellt auch Medikamente bereit, umfassend die anhand der vorstehend erwähnten allgemeinen Formel (I) dargestellte Verbindung oder ein Salz derselben. Diese Medikamente sind brauchbar als Mittel zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von Krankheiten, die von überschüssigem IP₃ oder einer Überexpression des IP₃-Rezeptors herrühren.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Denaturierung des IP₃-Rezeptors bereitgestellt, umfassend die Schritte: Binden der anhand der vorstehend erwähnten allgemeinen Formel (I) dargestellten Verbindung oder eines Salzes derselben an den IP₃-Rezeptor und anschließendes Bestrahlen des Produkts mit Licht. Die vorliegende Erfindung macht auch Zellen oder Zellextrakte verfügbar, bei denen der IP₃-Rezeptor denaturiert ist, vorzugsweise mit Hilfe der vorstehend erwähnten Methoden.
Kurze Erklärung der Zeichnungen
1 zeigt, daß die Verbindungen der vorliegenden Erfindung als IP₃-Rezeptorliganden fungieren. In dieser Abbildung zeigt 1A die Ergebnisse der durch IBD und BSA induzierten Oberflächenplasmonresonanz. 1B zeigt die Ergebnisse kompetitiver Assays mit IP₃, Verbindung 1, Verbindung 2a und Verbindung 2b, die zeigen, daß die Bindung von IBD an eine Spitze mit immobilisierter Verbindung 1 durch diese Verbindungen gehemmt wurde. 1C zeigt die Ergebnisse eines kompetitiven Assays mit Verbindung 2b und Carboxymalachitgrün (CMG) bei einer niedrigen Konzentration von IBD. Die IBD-Konzentration belief sich auf 52,8 nM (B) oder 1,76 nM (C).
2 zeigt, daß der IP₃-Rezeptor durch Bindung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung an den IP₃-Rezeptor und anschließendes Bestrahlen mit Licht erfolgreich denaturiert wurde. 2A zeigt die Ergebnisse dahingehend, daß die durch IP₃ induzierte Ca²⁺-freisetzende Wirkung nach Laser-Bestrahlung supprimiert wurde; 2B zeigt die Ergebnisse dahingehend, daß bei Änderung der Laser-Bestrahlungszeit die Ca²⁺-freisetzende Wirkung bestrahlungszeitabhängig supprimiert wurde; 2C zeigt, daß die Ca²⁺-freisetzende Wirkung nur durch Laser-Bestrahlung oder nur durch Zugabe von Verbindung 2b im Vergleich zur freisetzenden Wirkung ohne Zugabe von Verbindung 2b und ohne Laser-Strahlung nicht verringert wurde, wohingegen die Ca²⁺-freisetzende Wirkung deutlich verringert wurde, wenn sowohl Verbindung 2b zugesetzt als auch Laser-Strahlung angewandt wurde.
Beste Art der Durchführung der Erfindung
Die durch R¹ und R² dargestellte C_1-6 Alkyl-Gruppe kann linear, verzweigt cyclisch oder eine Kombination daraus sein, und beispielsweise kann eine Methyl-Gruppe, Ethyl-Gruppe, n-Propyl-Gruppe, Isopropyl-Gruppe, Cyclopropyl-Gruppe, n-Butyl-Gruppe, sec-Butyl-Gruppe, Isobutyl-Gruppe, Cyclobutyl-Gruppe, Cyclopropylmethyl-Gruppe, n-Pentyl-Gruppe, n-Hexyl-Gruppe, Cyclohexyl-Gruppe und dergleichen verwendet werden. Bevorzugt ist, daß R¹ und R² Methyl-Gruppen sind. Als Alkyl-Gruppe in der durch R³ dargestellten Mono(C_1-6-alkyl)amino-Gruppe oder Di(C_1-6-alkyl)amino-Gruppe oder als Alkyl-Einheit in der C_1-6-Alkoxy-Gruppe können die vorstehend angeführten C_1-6-Alkyl-Gruppen verwendet werden. Als R³ ist die Dimethylamino-Gruppe bevorzugt. X^– steht für ein Anion, dessen Art keiner speziellen Einschränkung unterliegt. Zum Beispiel ist ein Halogen-Ion wie etwa ein Chlor-Ion bevorzugt. Das Symbol n steht für eine ganze Zahl von 2 bis 5 und ist vorzugsweise 3. R ist vorzugsweise eine durch die obengenannte Formel (A) dargestellte Gruppe, d. h., ein Malachitgrün-Rest.
Die anhand der vorstehend erwähnten Formel (I) dargestellten Verbindungen der vorliegenden Erfindung können nach folgendem Schema hergestellt werden:
(In dem Schema ist die Herstellung einer Verbindung mit n = 3 gezeigt.)
1D-1-O-(3-Aminopropyl-1-(phospho)-myo-inosit-4,5-bisphosphat (Verbindung 1: Strupish, J., et al., Biochem. J. 263, 901, 1988) kann über 14 Schritte aus D-myo-Inosit hergestellt werden (Prestwich, G. D., et al., J. Chem. Soc. 113, 1822, 1991; Ozaki, S., et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 1992, 729; Gigg, J., et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 423, 1987; Bannwarth, W., et al., Helv. Chim. Acta 70, 175, 1987). Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung lassen sich herstellen durch Umsetzung von Verbindung 1 mit einem Ester von N-Hydroxysuccinimid und einem Fluorescein-Derivat oder Malachitgrün-Derivat oder dergleichen. Zum Beispiel kann die Verbindung 1, gelöst in 0,1 M NaHCO₃-Puffer (pH 8,3), in Gegenwart eines Lösungsmittels wie etwa Dimethylformamid mit dem obengenannten N-Hydroxysuccinimidester versetzt werden, und dann wird die Mischung 2 bis 3 Stunden unter Lichtabschirmung bei Raumtemperatur umgesetzt.
Der 4-(Carboxymalachitgrün)-N-hydroxysuccinimidester (CMG-SE), ein Produkt der Veresterung von N-Hydroxysuccinimid, kann beispielsweise durch Acylieren von N-Hydroxysuccinimid (NHS) mit einem sauren Kondensat aus 4-Carboxybenzaldehyd (ein Äquivalent) und Dimethylanilin (zwei Äquivalente) in Gegenwart von N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid(EDC)-hydrochlorid und anschließende Oxidation des Produkts mit 2,3-Dichlor-5,6-dicyan-1,4-benzochinon (DDQ) erhalten werden. 5-Carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimidester (CF-SE) kann in Form eines im Handel erhältlichen Produkts bezogen werden (erhältlich beispielsweise von Research Organics, Inc.).
Die durch Formel (I) dargestellten Verbindungen der vorliegenden Erfindung können Salze bilden, und jedes dieser Salze gehört zum Umfang der vorliegenden Erfindung. Des weiteren können die Verbindungen ein intramolekulares Ionenpaar (Zwitterion) bilden. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können je nach Art der Substituenten ein oder mehrere asymmetrische Kohlenstoffe aufweisen, und alle Stereoisomere wie etwa optisch aktive Isomere und Diastereoisomere, alle Mischungen aus Stereoisomeren, Racematen und dergleichen gehören zum Umfang der vorliegenden Erfindung. Was die durch R dargestellte Gruppe anbetrifft, so können gelegentlich Tautomere vorliegen, und alle derartigen Tautomere gehören zum Umfang der vorliegenden Erfindung. Weiterhin können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung – in freier Form oder als Salz – als Hydrate oder Solvate vorliegen, und diese Substanzen gehören ebenfalls zum Umfang der vorliegenden Erfindung.
Die anhand der vorstehend erwähnten allgemeinen Formel (I) dargestellten Verbindungen haben hohe Affinität zum IP₃-Rezeptor und sind als IP₃-Rezeptorliganden brauchbar. Da die Verbindungen der vorliegenden Erfindung einen Chromophor oder einen Fluorophor aufweisen, können sie zum Beispiel als Fluoreszenz-Reagenzien zur Messung der Affinität einer Testsubstanz gegenüber dem IP₃-Rezeptor verwendet werden. Spezielle Beispiele für derartige Verfahren sollen in den Beispielen der Beschreibung ausführlicher beschrieben werden. Des weiteren kann durch Binden der Verbindung der vorliegenden Erfindung an den IP₃-Rezeptor und Durchführen einer Bestrahlung mit Licht der IP₃-Rezeptor, an den die Verbindung der vorliegenden Erfindung bindet, denaturiert werden. Zum Beispiel kann der IP₃-Rezeptor durch Bestrahlen von Zellkulturen, Gewebekulturen, Zellextrakten und dergleichen mit Licht in Gegenwart der Verbindung der vorliegenden Erfindung in vitro denaturiert werden. Weiterhin kann man sich ein Versuchstier, bei dem die Funktion des IP₃-Rezeptors verringert oder zum Erliegen gekommen ist, dadurch schaffen, daß die Verbindung der vorliegenden Erfindung an einen Säuger – ausgenommen Menschen – verabreicht und dann der Säuger mit Licht bestrahlt wird, um die IP₃-Rezeptoren in vivo zu denaturieren.
Zur Behandlung von Erkrankungen, die von überschüssigem IP₃ oder einer Überexpression des IP₃-Rezeptors herrühren, kann die Verbindung der vorliegenden Erfindung zudem einem Säuger – darunter auch Menschen – als Medikament verabreicht werden, und anschließend kann der Säuger mit Licht bestrahlt werden, um die Funktion des IP₃-Rezeptors in vivo zu verringern, um so die Erkrankung zu behandeln. Die vorliegende Erfindung macht daher Verfahren zur Denaturierung des IP₃-Rezeptors verfügbar, umfassend die Schritte: Binden der anhand der vorstehend erwähnten allgemeinen Formel (I) dargestellten Verbindung oder eines Salzes derselben an den IP₃-Rezeptor und anschließendes Durchführen einer Bestrahlung mit Licht; Zellen oder Zellextrakte, bei denen der IP₃-Rezeptor denaturiert ist; sowie Mittel zur Denaturierung des IP₃-Rezeptors, die die obengenannten IP₃-Rezeptorliganden umfassen. Die Bedingungen der Bestrahlung mit Licht zur Denaturierung des IP₃-Rezeptors können je nach den Eigenschaften des Farbstoff-Derivats oder Fluoreszenzfarbstoff-Derivats des obengenannten IP₃-Rezeptorliganden gewählt werden. Normalerweise kann die Bestrahlung mit Laser-Licht erfolgen, das eine lange Wellenlänge von etwa 620 nm oder etwa 500 nm aufweist und die Zellen nicht beeinträchtigt.
Das Medikament der vorliegenden Erfindung umfaßt eine oder mehrere Substanzen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus den anhand der vorstehend erwähnten allgemeinen Formel (I) dargestellten Verbindungen und Salzen, Hydraten und Solvaten derselben, als wirksamer Bestandteil. Die obengenannten Substanzen können per se als Medikament der vorliegenden Erfindung verabreicht werden. Vorzugsweise kann die Substanz als pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht werden. Die Form der pharmazeutischen Zusammensetzung unterliegt keinen speziellen Einschränkungen, und es kann eine pharmazeutische Zusammensetzung zur oralen Verabreichung oder parenteralen Verabreichung mit einer oder mehreren Arten geeigneter Additive für pharmazeutische Präparate hergestellt und dann verabreicht werden. Zu den Beispielen für pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, gehören zum Beispiel Tabletten, Kapseln, Pulver, Weichgranalien, Granalien, Lösungen, Sirupe und dergleichen. Zu den Beispielen für pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, gehören zum Beispiel Injektionen, Suppositorien, Inhalationsmittel, Augentropfen, Nasentropfen, Salben, Cremes, Pflaster und dergleichen.
Die obengenannten pharmazeutischen Zusammensetzungen können durch Zusatz pharmazeutisch und pharmakologisch annehmbarer Additive hergestellt werden. Zu den Beispielen für pharmazeutisch und pharmakologisch annehmbare Additive gehören beispielsweise Arzneimittelträger, Sprengmittel und Zerfallhilfsmittel, Bindemittel, Gleitmittel, Beschichtungsmittel, Farbstoffe, Verdünnungsmittel, Grundstoffe, Lösemittel und Lösehilfsmittel, isotonische Mittel, pH-Regler, Stabilisatoren, Treibmittel, Haftmittel und dergleichen.
Die Dosen des Medikaments der vorliegenden Erfindung unterliegen keinen speziellen Einschränkungen. Die Dosen können je nach Art der Wirkung und Stärke der Wirkung des Medikaments in geeigneter Weise gewählt werden und je nach verschiedenen Faktoren, die gewöhnlich zu berücksichtigen sind, wie etwa Körpergewicht und Alter eines Patienten, Art und Symptomatik einer Krankheit, Verabreichungsweg und dergleichen, in geeigneter Weise erhöht oder erniedrigt werden. Bei oraler Verabreichung zum Beispiel kann das Medikament in einer Menge von 0,01 bis 1000 mg pro Tag bei Erwachsenen verwendet werden. Nach Verabreichung des Medikaments der vorliegenden Erfindung kann eine therapeutische oder prophylaktische Behandlung einer Erkrankung erfolgen, die von überschüssigem IP₃ oder einer Überexpression des IP₃-Rezeptors herrührt, indem eine Bestrahlung mit Licht in einer Stärke durchgeführt wird, die zur in vivo-Verringerung der IP₃-Rezeptorfunktion ausreicht. Stärke und Häufigkeit der Bestrahlung mit Licht können durch den Fachmann je nach Dosis und Verabreichungsweg des Medikaments der vorliegenden Erfindung, Art der Krankheit, Körpergewicht und Alter des Patienten und dergleichen in geeigneter Weise gewählt werden.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung soll nun anhand der folgenden Beispiele im einzelnen erläutert werden. Der Umfang der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Beispiel 1: Herstellung der Verbindungen
1D-1-O-(3-Aminopropyl-1-(phospho)-myo-inosit-4,5-bisphosphat (die in obigem Schema gezeigte Verbindung 1, Strupish J., et al., Biochem. J. 253, 901, 1988) wurde nach einem in der Literatur beschriebenen Verfahren hergestellt (Prestwich, G. D., et al., J. Chem. Soc. 113, 1822, 1991; Ozaki, S., et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 1992, 729; Gigg, J., et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 423, 1987; Bannwarth, W., et al., Helv. Chim. Acta 70, 175, 1987). N-Hydroxysuccinimid (NHS) wurde mit einem sauren Kondensat aus 4-Carboxybenzaldehyd (ein Äquivalent) und Dimethylanilin (zwei Äquivalente) als Acylierungsmittel in Gegenwart von N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid(EDC)-hydrochlorid acyliert. Das Produkt wurde dann mit 2,3-Dichlor- 5,6-dicyan-1,4-benzochinon (DDQ) oxidiert, um 4-(Carboxymalachitgrün)-N-hydroxysuccinimidester (CMG-SE) zu ergeben.
Verbindung 1 in 0,1 M NaHCO₃ Puffer (pH 8,3) wurde mit 5-Carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimidester (CF-SE, Research Organics, Inc.) oder CMG-SE versetzt, und dann wurde die Reaktionsmischung 2 bis 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, um die in obigem Schema erwähnten Verbindungen 2a bzw. 2b zu ergeben. CMG-SE, die Verbindungen 2a und 2b wurden mittels C₁₈-Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Die optische Reinheit der obengenannten Verbindungen wurde errechnet aus der spezifischen Drehung von 1D-4,5-Di-O-allyl-3,6-di-O-benzyl-1-I-methoxyacetyl-myo-inosit (Zwischenprodukt von Verbindung 1, Ozaki, S., et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 729, 1992).
Spektraldaten (Radenberg, T., et al., Biochem. J. 264, 323, 1989):
1D-4,5-Di-O-allyl-3,6-di-O-benzyl-1-I-methoxyacetyl-myo-inosit: [α]²⁵ _D = 52,5 (c 2,2, CHCl₃);
4-(Carboxymalachitgrün)-N-hydroxysuccinimidester (CMG-SE): ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 2,96 (s, 4H), 3,37 (s, 12H), 6,96 (d, J = 8,79 Hz, 4H), 7,37 (d, J = 8,79 Hz, 4H), 7,49 (d, J = 8,22 Hz, 2H), 8,29 (d, J = 8,22 Hz, 2H); FAB-MS: 470 (M⁺).
Verbindung 2a: ¹H-NMR (D₂O) δ: 1,88 (m, 2H), 3,46 (m, 2H), 3,58 (dd, J = 2,37, 9,78 Hz, 1H), 3,77 (t, J = 9,15 Hz, 1H), 3,87–4,00 (m, 4H), 4,14 (t, J = 2,19 Hz, 1H), 4,22 (dd, J = 8,79, 9,69 Hz, 1H), 6,96 (dd, J = 2,19, 9,24 Hz, 2H), 7,08 (d, J = 2,19 Hz, 2H), 7,29 (d, J = 9,15 Hz, 2H), 7,38 (d, J = 7,71 Hz, 1H), 8,07 (dd, J = 1,65, 7,95 Hz, 1H), 8,50 (d, J = 1,11 Hz, 1H); FAB-MS: 836 (MH⁺).
Verbindung 2b: ¹H-NMR (D₂O) δ: 1,80 (m, 2H), 3,14 (s, 12H), 3,35 (m, 2H), 3,47 (dd, J = 2,58, 9,80 Hz, 1H), 3,69 (t, J = 9,54 Hz, 1H), 3,82–3,97 (m, 4H), 4,07 (t, J = 2,91 Hz, 1H), 4,21 (dd, J = 6,21, 9,54 Hz, 1H), 7,20 (d, J = 8,25 Hz, 2H), 7,32 (d, J = 8,79 Hz, 4H), 7,46 (d, J = 8,97 Hz, 4H), 7,59 (d, J = 8,43 Hz, 2H); FAB-MS: 832 (M⁺).
Beispiel 2: Bindungsassay
(1) Expression und Reinigung von humanem IP₃-Rezeptor Typ 1
Die IP₃-bindende Domäne (IBD, Aminosäurereste 1–885, Mignery, G. A., et al., EMBO J. 9, 3893, 1990) von humanem IP₃-Rezeptor Typ 1 (Yamada, N., et al., Biochem. J. 302, 781, 1994) wurde zur Expression in Bakterien in pGEX2T (Amersham Pharmacia) subkloniert. Der N-Terminus von IBD wurde unter Verwendung der Linker-Sequenz Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser an Glutathion S-transferase fusioniert, während der C-Terminus von IBD mit der Linker-Sequenz Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser markiert wurde. Das Protein wurde in Escherichia coli BL-21 (DE3) exprimiert, und das rekombinante Protein wurde mit einem Harz, auf dem Ni-NTA immobilisiert war (Amersham Pharmacia), und einer HiTrap NHS-aktivierten Affinitätssäule (Amersham Pharmacia), an die Verbindung 1 gebunden war, gereinigt. Die Reinheit des Proteins wurde auf der Grundlage des Ergebnisses einer SDS-PAGE zu 22% errechnet.
(2) Messung der Oberflächenplasmonresonanz
Die Oberflächenplasmonresonanz (SPR) wurde mit einem BIAcore 2000 (Amersham Pharmacia) gemessen. Nach Aktivierung mit NHS und EDC wurden 10 mM Verbindung 1 in 100 mM Borat-Puffer (pH 8,5) an die Oberfläche einer CM5-Sensorspitze gebunden und mit Ethanolamin inaktiviert. Zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten von IP₃, Verbindung 1, Verbindung 2a und Verbindung 2b wurde vorher gereinigtes IBD in einem Mobilphasenpuffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3,4 mM EDTA und 0,005% Tween20, pH 7,4) zusammen mit den jeweiligen Verbindungen gelöst. Nach dem Einspritzen der jeweiligen Probe wurde die Oberfläche der Spitze mit 100 mM NaOH regeneriert.
Bei der konzentrationsabhängig an die Spitze gebundenen IBD wurde jedoch keine spezifische Bindung mit BSA (oder Glutathion S-transferase) beobachtet. Aus diesen Ergebnissen, erhalten durch Einspritzen von IBD oder Rinderserumalbumin (BSA) in verschiedenen Konzentrationen (1A), zeigte sich, daß die auf der Sensorspitze immobilisierte Verbindung 1 für diesen Assay geeignet war. Zur Bestimmung der Affinität von IP₃, Verbindung 1, Verbindung 2a und Verbindung 2b zu IBD wurde ein kompetitiver Assay wie folgt durchgeführt. Die IBD (52,8 nM) wurde mit jeder der obengenannten Verbindungen in verschiedenen Konzentrationen gemischt. Wurde die Mischung auf die Spitze aufgebracht, so wurde eine mit Verbindung 1 konkurrierende Verbindung an IBD gebunden und dadurch an der Oberfläche der Spitze immobilisiert (1B). Die aus diesem Assay erhaltene SPR wurde in die Gleichung eingesetzt, um die Dissoziationskonstante (K_d) der jeweiligen Verbindung zu berechnen.
(3) Berechnung der Dissoziationskonstanten
Zur Berechnung der K_d einer jeden Verbindung wurden die in 1B und 1C aufgetragenen Daten in die Formel 100[1 – [X + Y + K_d – {X² + 2X(K_d – Y) + (K_d + Y)²}^1/2]/2Y] eingesetzt, worin X und Y die Konzentration der jeweiligen Verbindung bzw. die EBD-Konzentration sind. Da die K_d von Verbindung 2b erheblich niedriger war als die halbe IBD-Konzentration, war der Wert nicht genau berechnet. Die IBD-Konzentration wurde daher auf 1,76 nM abgesenkt, und der kompetitive Assay für Verbindung 2b wurde erneut durchgeführt (1C). Der Bindungsassay wurde unter Bedingungen mit Licht und unter Dunkelbedingungen durchgeführt, um sicherzustellen, daß die Bindung nicht durch Licht beeinflußt wurde. Zur Berechnung der unspezifischen Bindung von Verbindung 2b an den IP₃-Rezeptor wurde Carboxymalachitgrün (CMG, der hydrophobe Teil von Verbindung 2b) während des kompetitiven Assays eingespritzt (1C), und im Ergebnis wurde keine unspezifische Bindung beobachtet. Somit war gezeigt, daß die Verbindung 2b spezifisch an den IP₃-Rezeptor bindet.
Die Affinität von Verbindung 1 war etwa 1/6 der von IP₃ (Prestwich, G. D., et al., J. Am. Chem. Soc 113, 1822, 1991), während die Affinität von Verbindung 2a nahezu die gleiche war wie die von IP₃, und die Verbindung 2b hatte eine 167fach höhere Affinität als IP₃ (Tabelle 1).
Tabelle 1
Beispiel 3
Denaturierung des IP₃-Rezeptors durch Bestrahlen mit Licht unter Verwendung der Verbindung der vorliegenden Erfindung
(1) Herstellung einer Gewebeprobe
Zur Herstellung einer Gewebeprobe wurde ein Streifen glatten Muskelgewebes aus Pfortadern männlicher Meerschweinchen (Gewicht: 200–300 g) auf einem Edelstahldraht fixiert.
(2) Messung der Ca²⁺-freisetzenden Wirkung
Die obige Probe wurde bei 35°C 3,5 Stunden in einer 40 μM-Lösung von magfura-2 AM (Molecular Probes) als Ca²⁺-Fluoreszenzindikator inkubiert, so daß mag-fura-2 AM von der Probe aufgenommen wurde. Anschließend wurde die Probe bei 35°C 1,5 bis 2 Stunden in einer 40–60 μM-Lösung von β-Escin als Tensid inkubiert, um das außer in intrazellulären Organellen vorhandene magfura-2 AM zu entfernen.
Die Probe wurde in eine Glaskapillare eingeführt, und dann wurde die Anfangsänderung des Fluoreszenzintensitätsverhältnisses (Fluoreszenzintensität bei Ex. 340 nm, Em. 480 nm/Fluoreszenzintensität bei Ex. 375 nm, Em. 480 nm, d. h., Freisetzungsgeschwindigkeit) bei Zugabe verschiedener Lösungen zur Probe einer exponentiellen Kurve angepaßt, um einen Wert als Ca²⁺-freisetzende Wirkung zu erhalten. Als Fluoreszenzphotometer wurde ein CAF-110 (JASCO) verwendet.
(3) Verfahren zur Denaturierung des IP₃-Rezeptors durch Bestrahlen mit Licht unter Verwendung der Verbindung der vorliegenden Erfindung
Die oben in (1) hergestellte Gewebeprobe wurde mit 1 μM IP₃ versetzt, und dessen Ca²⁺-freisetzende Wirkung wurde gemessen (vor der Bestrahlung). Diese Probe wurde nach der Messung aus dem Fluoreszenzphotometer genommen, und das Innere der Kapillare wurde mit einer 1 μM-Lösung von Verbindung 2b gefüllt. Die Probe wurde dann 3 Minuten mit einem Laser bestrahlt, wobei Antrocknen durch Pipettieren verhindert wurde.
Nach der Laser-Bestrahlung wurde die Probe wieder in das Fluoreszenzphotometer verbracht und dann zur Bestimmung der Ca²⁺-freisetzenden Wirkung mit 1 μM IP₃ versetzt. Die Ergebnisse (nach der Bestrahlung) wurden mit den vor der Bestrahlung erhaltenen Werten verglichen. Es dauerte insgesamt 2,5 Minuten, um die Probe aus dem Fluoreszenzphotometer herauszunehmen, Verbindung 2b zuzugeben und dann mit der Bestrahlung zu beginnen, und es dauerte weitere 1,5 Minuten, die Probe nach Beendigung der Laser-Bestrahlung in das Fluoreszenzphotometer zurückzuverbringen (d. h., die Arbeitszeit war die Bestrahlungszeit plus 4 Minuten). Bei einem Kontrollversuch, bei dem keine Laser-Bestrahlung angewandt wurde, wurde die Probe mit Verbindung 2b versetzt, und nach 2,5 Minuten wurde die Probe lediglich 3 Minuten lang pipettiert und 1,5 Minuten lang stehengelassen, und dann wurde die Messung fortgesetzt. Bei dem Ergebnis der "0 Minuten"-Bestrahlungszeit bei dem Experiment mit Variation der Bestrahlungszeit wurde die Probe mit einer Lösung von Verbindung 2b gefüllt und 4 Minuten stehengelassen, und dann wurde die Messung begonnen. Als Laser wurde ein YAG:Nd Day-Pumplaser verwendet (Wellenlänge 635 nm, Puls länge 2–4 ns, 15 mJ pro Puls bei 10 Hz, Laser-Punkt 3 mm Durchmesser, Continuum).
Die durch IP₃ induzierte Suppression der Ca²⁺-freisetzenden Wirkung wurde nach der Laser-Bestrahlung beobachtet (2A). Bei Veränderung der Laser-Bestrahlungszeit wurde die Ca²⁺-freisetzende Wirkung bestrahlungszeitabhängig supprimiert (2B). Im Vergleich zur freisetzenden Wirkung, die unter Bedingungen ohne Zugabe von Verbindung 2a und Laser-Bestrahlung erhalten wird, wurde die Ca²⁺-freisetzende Wirkung unter Bedingungen von alleiniger Laser-Bestrahlung oder bloßer Zugabe von Verbindung 2a nicht verringert, während deutliche Verringerung der Ca²⁺-freisetzenden Wirkung beobachtet wurde, wenn sowohl Laser-Bestrahlung als auch Zugabe von Verbindung 2a erfolgte ( 2C).
Mit den obigen Ergebnissen wurde sichergestellt, daß der mit der Verbindung der vorliegenden Erfindung gebundene IP₃-Rezeptor durch Binden einer Verbindung der vorliegenden Erfindung an den IP₃-Rezeptor und Bestrahlen mit Licht denaturiert werden kann.
Industrielle Anwendbarkeit
Die anhand der vorstehend erwähnten allgemeinen Formel (I) dargestellten Verbindungen und Salze derselben haben die Eigenschaft, als Ligand an den IP₃-Rezeptor zu binden. Zum Beispiel kann der IP₃-Rezeptor dadurch denaturiert werden, daß der IP₃-Rezeptorligand an den IP₃-Rezeptor gebunden und dann eine Bestrahlung mit Licht angewandt wird. Die Verbindungen sind daher brauchbar als wirksame Bestandteile von Medikamenten.

Claims

Eine Verbindung dargestellt durch die folgende allgemeine Formel (I) oder ein Salz hiervon:
wobei R eine Gruppe darstellt, die durch die folgenden Formeln (A), (B) oder (C) dargestellt wird:
wobei R¹ und R² unabhängig voneinander eine C_1-6 Alkylgruppe darstellen, R³ eine Aminogruppe, eine Mono(C_1-6 Alkyl) Aminogruppe, eine Di(C_1-6 Alkyl) Aminogruppe oder eine C_1-6-Alkoxygruppe darstellen und X^– ein Anion darstellt und n eine ganze Zahl von 2 bis 5 darstellt.
Die Verbindung oder ein Salz hiervon gemäß Anspruch 1, wobei die Verbindung dargestellt durch die allgemeine Formel (I), eine Verbindung dargestellt durch die folgende Formel (I-1) ist:
wobei R die selbe Bedeutung hat wie oben definiert.
Die Verbindung oder ein Salz hiervon gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei R eine Gruppe, die durch die Formel (A) dargestellt wird, ist, wobei R¹ und R² eine Methylgruppe darstellen, R³ eine Dimethylaminogruppe darstellen und X^– ein Chlorid-Ion darstellt und n 3 ist.
Ein IP₃-Rezeptorligand, welcher eine Verbindung oder ein Salz gemäß irgendeinem der Ansprüche 1–3 enthält.
Ein Verfahren zur Denaturierung eines IP₃-Rezeptors, enthaltend die Schritte des Bindens einer Verbindung oder eines Salzes hiervon gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 an den IP₃-Rezeptor und Aussetzen einer Bestrahlung mit Licht.
Eine Zelle oder ein Zellextrakt, in dem ein IP₃-Rezeptor mit der Methode gemäß Anspruch 5 denaturiert wurde.
Ein Reagenz zur Denaturierung eines IP₃-Rezeptors, welches eine Verbindung oder Salz gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 enthält.
Ein Medikament enthaltend eine Verbindung oder ein physiologisch akzeptables Salz hiervon gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3.