CN1416527A - 使用长寿命激发型荧光的测定方法 - Google Patents

Abstract

通过荧光测定试样中的测定对象物质的方法，包括在(1)对测定对象物质特异反应产生荧光的特异性荧光探针、以及(2)自身具有长寿命荧光并能够以该特异性荧光探针作为受体使该受体产生荧光共振能量转移的供体(但是该供体与特异性荧光探针不形成化学键产生的结合)的存在下进行测定，并使该受体与测定对象物质反应产生的荧光通过该受体引起的荧光共振能量转移成为长寿命激发型荧光的步骤。

Description

使用长寿命激发型荧光的测定方法

技术领域

本发明涉及检测荧光测定试样中的测定对象物质的方法。更具体地说，本发明涉及检测荧光测定试样中的测定对象物质的方法，其中作为获得特异性的手段，不使用对蛋白质或核酸等标记荧光物质的探针类，不受背景荧光的影响，准确且高灵敏度地进行测定对象物质的测定。

背景技术

检测荧光测定试样中的测定对象物质的方法(荧光法)能够简便且高灵敏度地进行测定，使用免疫板读数器等分析装置能够实现自动化，因此在以临床检查为主的多种领域得以利用。特别是由于荧光具有的多种特性(荧光强度、异向性、激发能量转移、荧光寿命等)，在由几千、几万试样中选择药物的前导化合物候补的筛选——High-throughput screening(HTS)中的分析(assay)测定中，一直利用荧光法。荧光法在效率高、简便等方面，非常适用于HTS，认为荧光法今后将成为HTS的分析测定的中心(Rogers，M.V.，Drug DiscoveryToday，vol.2，pp.156-160，1997)。

检测荧光测定试样中的测定对象物质的方法中，有时会产生并非测定对象物质引起的所谓背景荧光。背景荧光包括由于试样中的测定对象物质以外的内因性物质自身具有荧光而产生荧光的情况，由非特异性地附着在试样中的蛋白质等上的荧光色素产生荧光的情况，或者由注入了测定对象物质的容器(板等)产生荧光的情况。由于任何一种情况均会对灵敏度、特异性产生影响，因而是检测荧光测定试样中的测定对象物质的方法共同的问题，需要一种不受背景荧光的影响进行测定的方法。

关于避免背景荧光的影响，讨论了使用时间分解荧光(TimeResolved Fluorescence：TRF)测定的方法。镧系元素离子络合物的荧光寿命非常长，为数十微秒至数毫秒，与此相对成为背景荧光起因的常规有机化合物产生的荧光寿命很短，为数纳秒至数十纳秒，因此在脉冲激发光照射后，如果设置延迟时间(Delay Time)，在夹杂的背景荧光消失后测定来源于镧系元素离子络合物的长寿命荧光，则能够不受背景荧光的影响进行测定，使用时间分解荧光测定的方法就利用了这一点。

但是，镧系元素离子络合物自身对测定对象物质不具有特异性，因此为了获得特异性，有必要利用抗原抗体反应(例如用镧系元素离子络合物标记对测定对象物质特异的抗体后使用)或核酸碱基的相互作用(用镧系元素离子络合物标记能够与测定对象物质杂交的单链DNA片断)等，利用这些反应、作用并不能适应于困难的生理活性种或机体反应的测定。

另一方面，荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance EnergyTransfer：FRET)是指在一个测定系统中存在2种荧光性分子，即供体(donor)和受体(acceptor)时，尽管激发的是供体，但也能够观察到受体的荧光这种现象，由于供体的荧光光谱与受体的吸收(激发)光谱有重叠而产生。

FRET作为检测供体与受体的相对距离变化或相对构型变化的原理，可以用于下述测定，例如(1)通过将特异结合的蛋白质或配体分别用供体、受体标记，检测结合时产生的FRET，测定分子间相互作用；(2)通过将相同分子内不同的特定的2个部位分别用供体和受体标记，检测对某种刺激应答产生的FRET效率变化，测定特定的2个部位的相对构型变化；(3)通过将目的酶特异识别的肽序列或含有特异性键(例如酯键等)的基质类似物的两末端用供体和受体标记，检测切断前后的FRET效率变化，测定酶活性等，是特异性高的方法。但是，测定时有必要用供体、受体标记蛋白质或核酸等，使供体与受体形成特定的相对距离或相对构型，存在测定前试剂的制备等烦杂，成本增高的问题。

在一个测定系统内将TRF与FRET组合的方法作为HomogenuosTime Resolved Fluorometry(HTRF)，近年来已有一些报道。有关于供体使用铕离子络合物，受体使用APC(分子量104000的荧光性蛋白质)或Cy5(花青类色素)，在免疫测定或分子间相互作用的检测等中，飞跃性提高检测极限的报道。认为该方法是通过使用TRF，降低背景荧光，大幅度提高S/N比的结果。但是，测定时用供体或受体标记蛋白质等使供体与受体形成特定的相对距离或相对构型的操作是不可避免的。

发明公开

本发明的课题在于提供一种检测荧光测定试样中的测定对象物质的方法中，作为获得特异性的手段，不使用对蛋白质或核酸等标记荧光物质得到的探针类，不受背景荧光的影响，进行测定对象物质的测定的简便且灵敏度高的测定方法。

本发明人为了解决上述课题进行了悉心的研究，意外地发现将自身具有长寿命荧光并能引起FRET的供体以及与该供体相应的受体以极近的距离连接时，不产生FRET，上述供体和上述受体不连接而处于能够自由移动的状态时，产生FRET。

本发明人进一步反复研究，结果发现通过使对试样中的测定对象物质特异反应产生荧光的特异性荧光探针、以及自身具有长寿命荧光且能够以该特异性荧光探针作为受体使该受体产生FRET的供体共存，特异性荧光探针与测定对象物质反应产生荧光，使该荧光通过来自供体的FRET成为长寿命激发型荧光，通过对该长寿命荧光进行TRF测定，能够非常高灵敏度地测定试样中的测定对象物质。另外，本发明人还发现按照该方法，能够不受试样中的测定对象物质以外的内因性物质自身产生的荧光以及注入了测定对象物质的容器(板等)产生的背景荧光的影响进行测定，能够非常准确地进行测定。本发明是基于这些发现完成的。

也就是说，本发明提供通过荧光测定试样中的测定对象物质的方法，包括在(1)对测定对象物质特异反应产生荧光的特异性荧光探针、以及(2)自身具有长寿命荧光并能够以该特异性荧光探针作为受体使该受体产生荧光共振能量转移的供体(但是该供体与特异性荧光探针不形成化学键产生的结合)的存在下进行测定，并使该受体与测定对象物质反应产生的荧光通过该受体引起的荧光共振能量转移成为长寿命激发型荧光的步骤。按照该方法优选的方式，提供一种方法，包括通过时间分解荧光测定对该长寿命激发型荧光进行测定的步骤。

按照本发明更优选方式，提供上述供体为镧系元素离子络合物的上述方法；上述镧系元素离子络合物为铕离子络合物或铽离子络合物的上述方法；上述受体为具有呫吨骨架的受体的上述方法；上述供体为铽离子络合物，且上述受体为具有若丹明骨架的受体的上述方法；以及上述测定对象物质为一氧化氮或カスパ-ゼ的上述方法。

从另一观点来看，本发明还提供一种用于通过荧光测定试样中的测定对象物质的试剂组合物，含有(1)对测定对象物质特异反应产生荧光的特异性荧光探针、以及(2)自身具有长寿命荧光并能够以该特异性荧光探针作为受体使该受体产生荧光共振能量转移的供体(但是该供体与特异性荧光探针不形成化学键产生的结合)。

从另一观点来看，本发明还提供一种用于通过荧光测定试样中的测定对象物质的试剂盒，含有(1)对测定对象物质特异反应产生荧光的特异性荧光探针、以及(2)自身具有长寿命荧光并能够以该特异性荧光探针作为受体使该受体产生荧光共振能量转移的供体(但是该供体与特异性荧光探针不形成化学键产生的结合)。

从另一观点来看，本发明还提供用于上述方法的荧光探针，是对试样中的测定对象物质特异反应产生荧光的特异性荧光探针；以及用于上述方法的供体，是自身具有长寿命荧光，并能够以对试样中的测定对象物质特异反应产生荧光的特异性荧光探针作为受体使该受体产生荧光共振能量转移的供体。

附图的简单说明

图1表示在Tb³⁺络合物与DAR-M共存的系统以及Tb³⁺络合物与DAR-MT共存的系统中，由Tb³⁺络合物产生向DAR-M或DAR-MT转移的荧光共振能量转移，DAR-MT表示由FRET产生的来源于DAR-MT的长寿命荧光。图中，(A)表示Tb³⁺络合物与DAR-M共存系统的结果，(B)表示Tb³⁺络合物与DAR-MT共存系统的结果。

图2表示按照本发明的方法使用DAR-M作为特异性荧光探针测定一氧化氮的结果。

图3表示Eu³⁺络合物的荧光光谱与SNR3的吸收光谱的重叠情况。

发明的最佳实施方式

日本专利申请第2000-50868号(2000年2月28日申请)说明书的公开全部作为参照包括在本说明书的公开中。

本发明的方法是通过荧光测定试样中的测定对象物质的方法，其特征在于，通过在(1)对测定对象物质特异反应产生荧光的特异性荧光探针、以及(2)自身具有长寿命荧光，并能够以该特异性荧光探针作为受体使该受体产生荧光共振能量转移的供体存在下进行测定，并使该受体与测定对象物质反应产生的荧光通过该受体引起的荧光共振能量转移(FRET)成为长寿命激发型荧光，优选通过时间分解荧光测定(TRF)对通过上述FRET产生的受体的长寿命激发型荧光进行测定。该供体与特异性荧光探针不形成化学键产生的结合，在测定系统中两者必须独立存在。

测定对象物质的种类没有特别的限定，例如一氧化氮、Ca²⁺、Zn²⁺等生物体内分子、カスパ-ゼ等水解酶等。与测定对象物质反应产生荧光的特异性荧光探针的种类也没有特别的限定，只要能够与测定对象物质特异地反应，并通过这种反应产生荧光，可以使用任何一种物质。本说明书中“特异地反应”这一用语通常是指对试样中含有的其它成分实质上不反应，仅实质上与测定对象物质反应的性质，但是也可以利用具有能够对测定对象物质进行测定的最低限度的特异反应性的探针，上述用语在任何含义中均不得作限定性解释。含有测定对象物质的试样的种类没有特别的限定，可以使用任何一种物质。例如除了生物体试样等来源于天然的试样外，也包括人工的试样。

作为生物体试样，例如分离至体外的生物体试样，如血液(血清、血浆)或尿等体液、组织或细胞等。作为人工的试样，除了来源于基因重组产生的来源于动物或植物的组织或细胞等以外，还可以例举含有基因重组产生的非天然型蛋白质的细胞等，但是并不限于此。另外，本说明书中“测定”这一用语包括检测、定量、定性等各种目的的测定，应当作最广义的解释。

对于特异性荧光探针与测定对象物质反应产生荧光的机理并没有特别的限定。可以例举特异性荧光探针自身在与测定对象物质反应前具有实质上无荧光的化学结构，但是通过与测定对象物质反应，变化为具有荧光的结构的情况；或者在特异性荧光探针的分子内荧光物质以引起消光的状态连接，通过与测定对象物质反应，该连接被切断的情况等，但是并不限于此。

作为特异性荧光探针自身在与测定对象物质反应前具有实质上无荧光的化学结构，但是通过与测定对象物质反应，变化为具有荧光的结构时的具体实例，可以例举通过与一氧化氮反应产生荧光的二氨基荧光素衍生物(特开平10-226688号说明书)、二氨基若丹明衍生物(国际公开WO99/01447号说明书)、锌荧光探针(特愿平11-040325号说明书)、单重态氧测定探针(国际公开WO99/51586号说明书)等。例如国际公开WO99/01447号说明书中记载的二氨基若丹明衍生物与一氧化氮特异反应，变化为具有三唑环的结构，通过该结构变化产生荧光。

作为在特异性荧光探针的分子内荧光物质以引起消光的状态连接，通过与测定对象物质反应，该连接被切断时的具体实例，可以例举与カスパ-ゼ反应产生荧光的PhiPhiLux-G2D2(OncoImmuni公司制)(“新アポト-シス试验法”，第2版，羊土社，第201-204页，1999)。PhiPhiLux-G2D2在被カスパ-ゼ-3、-7等切断的特异性氨基酸序列(GDEVDGID)两端分别具有结合了1分子若丹明的结构，由于两端的若丹明之间形成二倍体结构，以荧光消光的状态存在。如果通过与カスパ-ゼ的反应，在GDEVD和GID之间2分子若丹明的连接被切断，则消光作用消失，产生荧光。

作为自身具有长寿命荧光并能够以该特异性荧光探针作为受体使该受体产生荧光共振能量转移的供体，可以例举Eu³⁺(铕离子)、Tb³⁺(铽离子)、Sm³⁺(钐离子)、Dy³⁺(镝离子)等镧系元素离子与配基形成螯合物得到的镧系元素离子络合物。该镧系元素离子络合物可以采用常规方法获得，例如按照Selvin等的方法(Selvin P.R.Et al，J.Am.Chem.Soc.，Vol.117，pp.8132-8138，1995)合成镧系元素离子以及作为形成络合物的配基公知的DTPA(二亚乙基三胺五乙酸(Diethylenetriaminepentaacetic Acid))类似物之一DTPA-cs124，将得到的配基与镧系元素离子在液体中混合，能够得到镧系元素离子络合物。

特异性荧光探针与上述供体(例如镧系元素离子络合物)能够选择最适的组合，使之引起对受体即特异性荧光探针最适的荧光共振能量转移，且该受体发出能够通过时间分解荧光测定进行测定的长寿命激发型荧光。关于荧光共振能量转移，记载于Stryer L.，Ann.Rev.Biochem.，Vol.47，pp.819-846，1978等中，是否产生了荧光共振能量转移能够按照上述文献中记载的方法准确判断，例如可以参照本说明书实施例中具体记载的测定方法，同时适当进行实验性的确认。

另外，长寿命荧光一般是指其寿命为约10^-5秒至10^-3秒的荧光，供体的荧光寿命通常为约10^-3秒，荧光共振能量转移产生的长寿命激发型荧光的寿命通常为约10^-4秒。另外，对于时间分解荧光测定，在Hammila I.& Webb S.，Drug Discovery Today，Vol.2，pp.373-381，1997中有详细记载，由于在本说明书的实施例中说明了具体的方法，本领域技术人员能够容易地进行这种测定。

本发明的试剂组合物作为含有上述(1)对测定对象物质特异反应产生荧光的特异性荧光探针、以及(2)自身具有长寿命荧光并能够以该特异性荧光探针作为受体使该受体产生荧光共振能量转移的供体的组合物提供。组合物的制备中，必要时可以使用配制试剂通常使用的添加剂。另外，本发明的试剂盒不预先将上述(1)和(2)的成分混合，而是以分别独立的状态提供。各种成分均可以根据需要配合试剂的配制中通常使用的添加剂，作为组合物进行配制。作为用于制备组合物的添加剂，例如溶解助剂、pH调节剂、缓冲剂、等渗剂等添加剂，其配合量可以由本领域技术人员适当选择。这些组合物作为粉末形态的混合物、冷冻干燥物、颗粒剂、片剂、液体制剂等适当形态的组合物提供。

实施例

以下，结合实施例更具体地说明本发明，但是本发明的范围并不限于下述实施例。实施例1：特异性荧光探针(DAR-M)的制备

将按照国际公开WO99/01447号说明书中记载的方法制备的DAR-1〔3，6-二(二乙氨基)-9-(3，4-二氨基-2-羧基苯基)呫吨鎓·分子内盐〕溶解于乙醇中，相对于DAR-1加入碘甲烷1.7当量，升温至80℃。每1小时通过TLC确认原料的消失程度以及二甲基体的生成程度，同时追加碘化甲烷1.7当量，在生成了所需目的产物的时刻结束反应。用硅胶色谱和制备TLC精制产物，得到DAR-M〔3，6-二(二乙氨基)-9-〔3-氨基-4-(N-甲氨基)-2-羧基苯基〕呫吨鎓·分子内盐〕。m.p.150-154℃¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)δ1.13(12H，t，J＝7.0)，2.86(3H，s)，3.33(8H，q，J＝7.0)，6.37-6.43(5H，m)，6.75(1H，d，J＝7.9)，6.81(2H，d，J＝9.0)FAB-MS 487(M⁺+1)

将上述得到的DAR-M溶解于甲醇，通入一氧化氮气体后，蒸馏除去溶剂，通过制备TLC精制，得到DAR-MT〔3，6-二(二乙氨基)-9-(4-羧基-1-甲基苯并三唑-5-基)呫吨鎓·分子内盐〕。m.p.155-160℃¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)δ1.12(12H，t，J＝7.1)，3.32(8H，q，J＝7.1)，4.37(3H，s)，6.31(2H，dd，J＝9.0，2.5)，6.43(2H，d，J＝2.5)，6.58(2H，d，J＝9.0)，7.26(1H，d，J＝8.6)，7.83(1H，d，J＝8.6)FAB-MS 498(M⁺+1)

实施例2(1)试样的制备

按照Selvin等的方法(Selvin P.R.Et al，J.Am.Chem.Soc.，Vol.117，pp.8132-8138，1995)合成DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)类似物之一的DTPA-cs124。将10mM的DTPA-cs124的DMSO溶液和当量的10mM TbCl₃水溶液混合后，使用0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.8)稀释至终浓度达到10μM，放置30分钟以上，使之形成铽离子络合物(Tb³+络合物)。分别向上述Tb³⁺络合物溶液中添加实施例1中得到的DAR-M和DAR-MT，使终浓度达到1.0、2.0、3.0、5.0、10.0μM，用于测定。制备没有使DAR-M或DAR-MT与Tb³⁺络合物共存的单独的试样，作为对照用于测定。(2)TRF光谱的测定

按照以下的光度计设定条件测定上述(1)得到的试样的光谱。模式：Phosphate、激发：328nm、延迟时间：50μs、Flash Count：1、GateTime：1.00ms、循环时间：20ms、缝宽：2.5nm(激发、发射共同)、扫描速度：900nm/min

结果如图1所示。Tb³⁺络合物与DAR-M共存的系统(图1A)中，观察到来源于Tb³⁺络合物的545nm的荧光强度依赖于DAR-M的浓度而减少。另一方面，Tb³⁺络合物与DAR-MT共存的系统(图1B)中，观察到来源于Tb³⁺络合物的545nm的荧光强度依赖于DAR-MT的浓度而减少，同时出现与来源于Tb³⁺络合物的荧光不同的在584nm处具有峰顶的荧光。没有DAR-M或DAR-MT与Tb³⁺络合物共存的系统中，即使在同样条件下测定光谱，也没有观察到荧光，得出DAR-M和DAR-MT不具有延迟时间超过50μs的长寿命荧光的结论。由以上内容可知，Tb³⁺络合物和DAR-M共存的系统中，产生由Tb³⁺络合物向DAR-M转移的FRET，但是由于DAR-M不具有荧光，仅观察到Tb³⁺络合物的荧光强度减少，另一方面，Tb³⁺络合物与DAR-MT共存的系统中，产生由Tb³⁺络合物向DAR-MT转移的FRET，通过该FRET产生DAR-MT的长寿命荧光。(3)荧光寿命的测定

对于上述(1)的试样，在以下的光度计设定条件下每50μs测定荧光强度，按照I＝I₀exp(-t/τ)的公式求出荧光的衰减曲线。通过求出的衰减曲线求出荧光寿命(τ)。模式：Short Phos.衰变、激发：328nm、发射：545nm或584nm、Flash Count：1、Gate Time：0.01ms、循环时间：20ms、缝宽：10nm、Integ.Time：1.0s

结果如表1所示。

Tb³⁺络合物与DAR-M共存的系统(表中的DAR-M列)中，来源于Tb³⁺络合物的545nm的荧光寿命依赖于DAR-M的浓度而缩短。另一方面，Tb³⁺络合物与DAR-MT共存的系统(表中的DAR-MT列)中，来源于Tb³⁺络合物的545nm的荧光寿命以及与来源于Tb³⁺络合物的荧光不同的新出现的584nm的荧光寿命在μs等级上一致，同时依赖于DAR-MT的浓度而缩短。由以上内容可知，与上述(2)的结果同样，与来源于Tb³⁺络合物的荧光不同的新出现的584nm的荧光是产生由Tb³⁺络合物向DAR-MT转移的FRET的结果，通过该FRET产生的DAR-MT的长寿命荧光。表1

                                 DAR-M          DAR-MT序列       试样                   τ₅₄₅(ms) τ₅₄₅(ms) τ₅₈₄(ms)1    10μMTb³⁺DTPAcs124            1.52       1.52      -2    Run1+1μM DAR衍生物            0.59       0.45      0.453    Run1+2μM DAR衍生物            0.29       0.29      0.294    Run1+3μM DAR衍生物            0.22       0.19      0.195    Run1+5μM DAR衍生物            0.13       0.13      0.136    Run1+10μM DAR衍生物           0.08       0.08      0.08实施例3：一氧化氮的测定(1)一氧化氮测定试剂的配制

将10mM DTPA-cs124的DMSO溶液和当量的10mM TbCl₃水溶液混合后，使用0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.0)稀释至终浓度达到10μM，放置30分钟以上，再向得到的Tb³⁺络合物中添加10mM DAR-M DMSO溶液，使终浓度达到3.0μM，制得一氧化氮测定试剂。(2)测定方法

将上述(1)得到的一氧化氮测定试剂装入荧光杯中，搅拌的同时经时测定激发波长328nm、荧光波长584nm的荧光强度的变化。测定开始120秒后添加在缓冲液中缓慢放出一氧化氮的一氧化氮供体NOC13使终浓度达到10μM，继续测定达到3600秒。配制分别与一氧化氮测定试剂浓度相同的Tb³⁺络合物或DAR-M溶液作为对照。机器：日立F-4500、模式：时间分解荧光测定、激发：328nm、发射：584nm、缝宽：2.5nm(激发、发射共同)、光电压：950V

由一氧化氮测定试剂中荧光强度的经时变化减去仅DAR-M的试剂的荧光强度的经时变化，得到的来源于一氧化氮检测的实际荧光强度的经时变化如图2所示。确认在NOCl₃添加后584nm的荧光强度立即随时间而增大。实施例4(参考例)

使用有效引起荧光共振能量转移的物质(SNR3)作为特异性荧光探针的模型，通过与供体的组合引起荧光共振能量转移，测定由该物质产生的长寿命激发型荧光。(1)SNR3的制备(a)2-羟基-4-四氢喹嗪并〔1，9-hi〕(2’-羧基苯甲酰基)苯

将邻苯二甲酸酐(2g，13.5mmol)、8-羟基喹嗪(1g，5.28mmol)在甲苯(30ml)中混合，加热回流一夜。蒸馏除去溶剂后，用硅胶柱色谱(AcOEt/CH₂Cl₂＝1/1)精制残渣，得到目的产物(收率40％)。¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ1.68-1.91(m，4H)，2.32-2.46(t，2H，J＝6.2Hz)，2.55-2.63(t，2H，J＝6.2Hz)，3.15-3.30(m，4H)，6.40(s，1H)，7.32(d，1H，J＝6.6Hz)，7.55-7.68(m，2H)，7.94(d，1H，J＝7.5Hz)，12.95(s，br 1H)(b)6-N，N-二乙氨基-1-萘酚

将6-氨基-1-萘酚(2g，12.6mmol)、碘乙烷(10g，64mmol)、三乙胺(1ml)在无水二甲基甲酰胺(5ml)中混合，在120℃下搅拌5小时。向反应混合物中加入200ml的二氯甲烷，用水洗涤，再用饱和食盐水洗涤。干燥有机相后，蒸馏除去溶剂，用硅胶柱色谱(正己烷：CH₂Cl₂＝1∶9)精制得到的残渣，得到目的产物(收率32％)。¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ1.20(t，6H，J＝7.0Hz)，3.44(q，4H)，6.47(dd，1H，J＝7.0，1.3Hz)，6.84(d，1H，J＝2.6Hz)，7.07(dd，1H，J＝9.3，2.6Hz)，7.21(m，2H)，8.00(d，1H，J＝9.4Hz)(c)3-二乙氨基-10-四氢喹嗪并〔1，9-hi〕-9-〔2’-羧基苯基〕-苯并〔c〕呫吨鎓(SNR3)

将上述(a)得到的2-羟基-4-四氢喹嗪并〔1，9--hi〕(2’-羧基苯甲酰基)苯(60mg，0.18mmol)、上述(b)得到的6-N，N-二乙氨基-1-萘酚(40mg，0.18mmol)溶解于甲磺酸(2ml)中，在85℃下搅拌12小时。将反应混合物冷却后，倒入约500ml的冰水中，用冰水冷却混合液的同时用2N NaOH水溶液中和，再加入5ml浓盐酸调节为酸性。过滤收集生成的沉淀，用硅胶柱色谱(10％MeOH/CH₂Cl₂)精制，得到目的产物(收率20％)。¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ1.23(t，6H，J＝7.0Hz，a)；2.12(m，8H，b)；3.11(m，4H，c)；4.13(q，4H，J＝7.9Hz，d)；6.24(s，1H，e)；6.59(d，  1H，J＝8.8Hz，f)；6.79(d，1H，J＝2.6Hz，g)；7.17(m，3H，h，i，j)；7.62(m，2H，k，l)；8.04(m，1H，m)；8.35(d，1H，J＝9.2Hz，n)FAB-MS：517(M⁺)(2)光谱测定

紫外可见吸光光谱测定使用岛津UV-1600，将点样距(samplingpitch)设定为0.2nm或0.5nm，扫描速度使用6个等级中的低速。荧光光谱测定使用Parkinermer LS50B，将扫描速度设定为900nm/分，激发侧狭缝以及荧光侧狭缝均设定为2.5nm，进行测定。Eu³⁺络合物的荧光光谱与SNR3的吸收光谱的重叠积分J的计算采用以下公式。 $J=\frac{\∫{\mathrm{\ϵ}}_A\left(\mathrm{\λ}\right)F_D\left(\mathrm{\λ}\right){\mathrm{\λ}}^4\mathrm{d\λ}}{\∫F_D\left(\mathrm{\λ}\right)\mathrm{d\λ}}$ ε_A(λ)：受体的摩尔吸光系数(cm^-1nm⁴M^-1)F_D(λ)：供体的荧光强度

λ：波长

用磷酸钾缓冲液(pH7.4)稀释SNR3的DMSO溶液(10mM)配制10μM溶液，将该溶液用于光谱测定。测定紫外可见吸光光谱以及荧光光谱，求出Eu³⁺络合物的荧光光谱与SNR3的吸收光谱的重叠积分J。结果如图3所示。分别使SNR3和Eu³⁺络合物的荧光强度的最大值为100，表示与10μM的SNR3溶液(0.1M磷酸钾缓冲液，pH7.4)的吸收光谱重叠。SNR3具有λex＝615nm，λem＝655nm的荧光特性，与Eu³⁺络合物的荧光光谱的重叠积分为7.34×10¹⁵(nm⁴cm^-1M^-1)。该值即使与长波长激发荧光物质Cy5的吸收光谱与Eu³⁺络合物的荧光的重叠积分的大小(6.55×10¹⁵nm⁴cm^-1M^-1，Selvin，P.R.，et al.，J.Am.Chem.Soc.，116，6029-6030，1994)比较，对于引起FRET也可以说是足够大的值。

工业实用性

按照本发明的方法，能够不受背景荧光的影响准确且高灵敏度地测定生物体试样等中含有的测定对象物质。另外，作为获得特异性的手段，没有必要使用对蛋白质或核酸等标记荧光物质得到的探针类，因此不仅试剂的制备简单，而且能够用于不能利用抗原抗体反应和核酸碱基的相互作用等的生理活性种或生物体反应的测定。

Claims (11)

1.通过荧光测定试样中的测定对象物质的方法，包括在(1)对测定对象物质特异反应产生荧光的特异性荧光探针、以及(2)自身具有长寿命荧光并能够以该特异性荧光探针作为受体使该受体产生荧光共振能量转移的供体(但是该供体与特异性荧光探针不形成化学键产生的结合)的存在下进行测定，并使该受体与测定对象物质反应产生的荧光通过该受体引起的荧光共振能量转移成为长寿命激发型荧光的步骤。

2.如权利要求1所述的方法，包括通过时间分解荧光测定对该长寿命激发型荧光进行测定的步骤。

3.如权利要求1或2所述的方法，上述供体为镧系元素离子络合物。

4.如权利要求3所述的方法，上述镧系元素离子络合物为铕离子络合物或铽离子络合物。

5.如权利要求1至4中任意一项所述的方法，上述受体为具有呫吨骨架的受体。

6.如权利要求4所述的方法，上述供体为铽离子络合物，且上述受体为具有若丹明骨架的受体。

7.如权利要求1至6中任意一项所述的方法，上述测定对象物质为一氧化氮或カスパ-ゼ。

8.一种用于权利要求1至7中任意一项所述的方法的试剂组合物，含有(1)对测定对象物质特异反应产生荧光的特异性荧光探针、以及(2)自身具有长寿命荧光并能够以该特异性荧光探针作为受体使该受体产生荧光共振能量转移的供体(但是该供体与特异性荧光探针不形成化学键产生的结合)。

9.一种用于权利要求1至7中任意一项所述的方法的试剂盒，含有(1)对测定对象物质特异反应产生荧光的特异性荧光探针、以及(2)自身具有长寿命荧光并能够以该特异性荧光探针作为受体使该受体产生荧光共振能量转移的供体(但是该供体与特异性荧光探针不形成化学键产生的结合)。

10.用于权利要求1至7中任意一项所述的方法的探针，是对试样中的测定对象物质特异反应产生荧光的特异性荧光探针。

11.用于权利要求1至7中任意一项所述的方法的供体，是自身具有长寿命荧光，并能够以对试样中的测定对象物质特异反应产生荧光的特异性荧光探针作为受体使该受体产生荧光共振能量转移的供体(但是该供体与特异性荧光探针不形成化学键产生的结合)。

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