JP2003522247A

JP2003522247A - 検出試薬

Info

Publication number: JP2003522247A
Application number: JP2001557964A
Authority: JP
Inventors: ニコラス・トーマス; マイケル・イー・クーパー; エレイン・エイディ
Original assignee: アマシャムバイオサイエンスユーケイリミテッド
Priority date: 2000-02-02
Filing date: 2001-02-01
Publication date: 2003-07-22
Also published as: WO2001057141A1; CA2399419A1; US20030211454A1; AU779602B2; EP1252236A1; AU3038001A; IL150948A0

Abstract

(57)【要約】環境感受性レシオメトリックレポーター分子を開示する。その分子は式（Ｉ）の化合物であり、ここでＤ_１およびＤ_２は検出可能分子であり、Ｄ_１は対照分子であり、Ｄ_２は環境感受性分子であり、そしてＬはリンカー基である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、環境感受性（environmentally sensitive）試薬に関する。特に、
本発明は、環境感受性レシオメトリックプローブ（ratiometric probe）に関す
る。

【０００２】多くの検出可能分子は、一般に、生物学的プロセスの研究において、種々の生
物学的及び非生物学的材料の標識及び検出のために使用されると知られている。
いくつかのそのような分子は、それらの環境に感受性であり、そしてしたがって
、環境条件、例えば細胞内又は細胞外の変化を測定するためのインジケーターと
して使用され得る。

【０００３】特に、蛍光色素分子を、蛍光顕微鏡検査法、フローサイトメトリー及び蛍光分
光学のような技術で使用し、そして多くのそのような色素は、それらの環境に感
受性で、環境シグナルの存在又は不存在に依存して異なる蛍光シグナルを与える
。

【０００４】例えば、多くの蛍光プローブであってそれらの直近の環境のｐＨに依存して異
なる蛍光特性を有するものが、利用可能である。細胞内ｐＨは一般にサイトソル
で約６．８と７．４の間、そして細胞の酸性オルガネラで約４．５と６．５の間
である。細胞内部のｐＨはｐＨ単位の分数のみによって変化し、そのような小さ
い変化は、非常に遅いことができる。ｐＨ変化は、多様な範囲の生理学的及び病
理学的プロセスに関係することを意味してきた。例えば、ｐＨ７ないしｐＨ６．
５のサイトソルｐＨ変化及びｐＨ７．２ないし８．０のミトコンドリアの変化は
、アポトーシスで測定された。ｐＨ変化はまた、細胞増殖、筋収縮、エンドサイ
トーシス、悪性腫瘍及びケモタキシス疾患において測定された（例えば、Martin
ez-Zaguilan R, Gillies RJ(1996) Cell Physiol Biochem 6: 169-184; Okamoto
CT (1998) Adv Drug Deliv Rev 29:215-228; Falke JJ, Bass RB, Butler SL,
Chervitz SA, Danielson MA (1997)Ann Rev Cell Dev Biol 13:457-512; Shimiz
u Y, Hunt III SW(1996) Immunol Today 17:565-573参照）。

【０００５】外部ｐＨ環境はまた、細胞内の変化の指摘を与えることができる。例えば、サ
ンプル中の細胞のアポトーシスを、細胞外のｐＨの増大によって検出することが
できる。同様にリソソーム分泌を細胞外のｐＨ変化によって検出することができ
る。

【０００６】多くの励起及び放射波長を使用してカルシウムレベルを測定する商業的に入手
可能な多くの蛍光色素、例えば、Ｆｕｒａ２、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−４及び
Ｑｕｉｎ２がまた存在する。これらはまた、細胞内で種々のやり方で刺激され得
るカルシウムイオン流束を測定するために使用することができる。そのようなプ
ロセス中に、細胞内の遊離Ｃａ^２＋濃度は、容易に１００倍までも変化すること
ができる（Nuccitelli R(1994)A Practical Guide to the Study of Calcium in
Living Cell Vol 40 Academic press San Diego USA）。既知のプローブは、一
般に、それらがＣａ^２＋の結合又は非結合状態であるかにしたがって蛍光特性が
変化した。

【０００７】他の特定のイオンセンサーは、細胞外又は細胞内イオン濃度を検出するために
使用することができる。例えば、ＤｉＢＡＣ_４のような一般的な変化を感知する
プローブ（例えば、Pink TJ, Tsien RY, Pozzan T(1982)J Cell Biol 95:189-19
6参照）を使用して、膜を横断するイオン勾配を測定することができる。膜過分
極及び脱分極としてそれぞれ言及される、膜ポテンシャルの増大及び減少は、神
経インパルス増加、筋収縮、細胞シグナリング及びイオンチャネルゲーチングを
含む、多くの生理学的プロセスで中心的役割を演じる。

【０００８】Ｋ^＋、Ｎａ^＋、Ｃｌ^＋、Ｍｇ^２＋、Ｚｎ^２＋及び他の重金属イオンを含む所望
の他のイオンの測定がまた、望まれる。そのようなイオンを検出する利用可能な
種々のプローブ、例えば、Sodium Green、Magnesium Green、Calcium Crimson、
Mag-Fluo-4、Newport Green(K⁺)、Ｎ-(６−メトキシ−８−キノイル）−ｐトル
エンスルフォンアミド（Ｚｎ^２＋のためのＴＳＱ）、PhenGreen PL(Cu²⁺)、ＳＰ
Ｑ（Ｃｌ⁻検出のための６−メトキシ−Ｎ−（３−スルフォプロピル）キノリニ
ウム内部塩）が存在する。１，２−ジアミノアントラキノンをＮＯ及びＮＯ_２ ⁻ の定量のために使用する。

【０００９】蛍光プローブをまた、酵素基質アッセイ、例えば、プロテアーゼ、キナーゼ、
トランスフェラーゼについてのアッセイで使用し、又はタンパク質―タンパク質
相互作用を検出することができる。そのようなアッセイでは、蛍光プローブそれ
自体を、プローブの蛍光特性の変化につながる酵素活性によって修飾し得る。例
えば、キナーゼ及びフォスファターゼの活性を検出することのできるフォスフェ
ートプローブ、例えば、７−ヒドロキシ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−
ジメチルアクリドン−２−オン）（ＤＤＡＯ）、レソルフィン（Molecular Prob
es Inc.から入手可能）が存在する。

【００１０】しかし、生物系での検出可能分子、例えばこれらの色素の使用は、得られる結
果を解釈するのを困難とさせ得る多くの問題の対象となる。例えば、イオンの細
胞内濃度を測定するために、色素が細胞内に輸送される場合、色素それ自体の変
化し得る取りこみ又は細胞のサイズの変化がよくあり得る。

【００１１】こうして、他と比較したときのある特定の細胞内での高い蛍光は、高いイオン
濃度又は他の環境シグナルのみによるものではないかもしれないが、例えば、細
胞サイズ、透過性又は細胞周期のステージに起因することがあり得る。加えて、
蛍光消光が、プローブが非常に近接するとき起こり得る（これは、例えば、ｐＨ
感受性色素が、酸性小胞にインターナリゼーションされるとき特に重要であり、
ここで該色素は細胞表面上にあるときよりも恐らくより濃縮されている）。

【００１２】したがって、細胞内で、蛍光標識された化合物のような検出可能な分子の転位
をみるとき、蛍光の濃度に依存する影響を補償する、内部標準として作用する一
定のマーカーが存在することが、重要である。よって、検出されるべき、一定な
及び変化し得るシグナルであって、環境条件にしたがって変化する変化し得るシ
グナルをもたらす、レシオメトリックプローブを開発した。２つのシグナルの比
率の変化を測定することによって、環境感受性な部分からのシグナルの測定を、
プローブの取りこみの量又は細胞のサイズから独立して、なすことができる。す
なわち、レシオメトリックプローブは、濃度に独立である測定がなされることを
可能とする。これは、ある種のプローブで、より正確な測定を可能とし、そして
定量的な検出が可能である。

【００１３】現行のレシオメトリックプローブは、ＳＮＡＲＦ（登録商標）、ＳＮＡＦＬ（
登録商標）、ＬｕｓｏＳｅｎｓｏｒ（登録商標）及びＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（
登録商標）Yellow/Blue/Red(Mokecular Probes, Inc.)を含み、これらのすべて
は、ｐＨ測定をなすために使用される。しかし、これらのプローブは、一般に単
一蛍光存在を含み、そして異なる環境条件でのそれらの蛍光シグナルを解釈する
ことは、その単一の存在からの複合のスペクトルの分解（resolution）を要する
。これらのプローブの、異なるｐＨでの放射の変化は、比較的小さい範囲の波長
にわたり検出される。さらにＳＮＡＲＦ（登録商標）、及びＳＮＡＦＬ（登録商
標）は、酸性条件で蛍光が減少し、中性ｐＨで蛍光が増加する。このために、こ
れらのプローブは、膜インターナリゼーション（細胞表面レセプター又は他の手
段によって介在される）を測定するために有用ではなく、なぜならその両方は、
インターナリゼーションするとシグナル減少を生じるからである。他のプローブ
、例えば、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（登録商標）及びＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登
録商標）は、官能化（functionalisation）を欠き、その結果所望の特定の生物
学的分子にコンジュゲートすることができない。

【００１４】よって、開発されるべき改良されたレシオメトリックプローブの必要性が存在
する。本発明の一つの目的は、２つの部分であって、その一方が近似的に一定の
読み出し（read-out）を提供する対照分子であり、その他方が変化し得るレポー
ターシグナルを提供する環境感受性の分子である２つの部分を、連結することに
よってレシオメトリックレポーター分子を提供することである。該変化し得る分
子は、局地的な環境に感受性である蛍光プローブであり得る；すなわちその放射
スペクトルはｐＨ、イオン濃度又はある種の他の測定可能な変化によってもたら
され得る。両方のプローブの出力を関連づけることによって、レシオメトリック
読み出しを作成する。このアプローチは、したがって、変化についてプローブ周
辺の局地的環境を監視するとき、拡散及び濃縮要因を排除することができ、一方
、位置的に分離されたスペクトルを有する２つの連結された部分の使用は、現行
のレシオメトリックプローブを使用するときに必要な異なるスペクトルの複合の
分解を減少させる。

【００１５】よって、本発明の第１の側面は、式Ｉの化合物を提供する：

【化４】ここで、Ｄ_１及びＤ_２は、検出可能な分子であり、Ｄ_１は対照分子であり、Ｄ_２は環境感受性な分子であり、そしてＬはリンカー基である。

【００１６】好適には、対照分子又は環境感受性の分子は、任意の好適に検出方法、例えば
、比色、蛍光、りん光、発光、ＩＲ，ラマン、ＮＭＲ又はスピンラベル検出によ
って検出可能であり得る。別の実施態様では、Ｄ_１及びＤ_２のための適当な検出
方法は同じである必要はない。

【００１７】本発明の第１の側面の特に好ましい実施態様では、式Ｉの化合物を提供する：

【化５】ここで、Ｄ_１及びＤ_２は検出可能なフルオロホアであり、そしてＤ_１は対照分子であり、Ｄ_２は環境感受性な分子であり、Ｌはリンカー基であり、そしてここでＤ_１とＤ_２の間のエネルギー転移が本質的にないことを特徴とする。

【００１８】好適には、検出可能分子Ｄ_１及びＤ_２は、選択されたフルオロホアであり、そ
の結果放射スペクトルは位置的に分離されている。Ｄ_１及び／又はＤ_２はフルオ
レセイン、ローダミン、クマリン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）色素及びシアニン
色素から選択され得る。特に好ましい実施態様では、Ｄ_１及び／又はＤ_２は、シ
アニン色素であってよい。例えば、ＵＳ特許５２６８４８６に記載されているシ
アニン色素（時に「Ｃｙｄｙｅｓ（登録商標）」と称する）は、生物学的に両立
できるフルオロホアであって、高い蛍光放射、環境的安定性及び赤外線付近に及
ぶ放射波長の範囲を特徴とするものであって、該フルオロホアの内部分子骨格の
変化によって選択することができるものである。好ましいフルオロホアＤ_１及び
／又はＤ_２は、シアニン色素、例えば、Ｃｙ２ないしＣｙ７のいずれか又はそれ
らの誘導体である。未修飾色素分子の励起（Ａｂｓ）及び放射（Ｅｍ）特徴を以
下に示す：

【００１９】

【表１】又は、Ｄ_１及び／又はＤ_２は、発光分子、例えば、蛍光又は生物発光タンパク
質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びそのアナログであり得る。

【００２０】好適には、「対照」分子であるＤ_１は、式Ｉのレポーター分子によって検出さ
れるべき環境条件の存在下でその蛍光特性が変化しないものであり、一方、「環
境感受性な」分子であるＤ_２は、検出されるべき環境条件の存在下でその蛍光特
性が変化するものである。

【００２１】よって、式Ｉの化合物の、適当な環境条件ヘの導入は、環境感受性の分子の放
射スペクトルの変化につながり、一方、対象分子は一定の読み出しを提供する。
こうして、式Ｉの分子が２つの異なる波長で励起及び監視されるとき、Ｄ_１及び
Ｄ_２からの蛍光放射の比率は、環境条件にしたがって変化する。Ｄ_１及びＤ_２が
選択され、その結果二重の励起波長及び二重の放射波長の使用が、位置的に分離
された波長で観察されるべき２つの連結されたプローブからの蛍光をもたらし、
そしてこうして同時的になされるべきレシオメトリック測定を可能となることが
特に好ましい。特に好ましい実施態様では、したがって、Ｄ_１の励起波長は、Ｄ _２の励起波長と異なり、その結果Ｄ_１又はＤ_２の１つは、他方よりもより高い励
起波長を有する。

【００２２】検出可能な環境条件は、ｐＨの変化、イオン濃度の変化及び酵素の存在を含む
。好適には、環境感受性の分子であるＤ_２は、ｐＨ変化により蛍光が変化する色
素、例えばｐＨ感受性Ｃｙdyes（Cooper et al. J. Chem. Soc. Chem. Comm. 20
00, 2323-2324）、酵素活性により蛍光が変化する色素、イオン濃度により蛍光
が変化する色素（例えばキレート化色素、Ｆｕｒａ２、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ
−４、Ｑｕｉｎ２、Sodium Green、Magnesium Green、Calcium Crimson、Mag-Fl
uo-4、Newport Green(K⁺)、Ｎ−（６−メトキシ−８−キノイル）−ｐトルエン
スルホンアミド（Ｚｎ^２＋のためのＴＳＱ）、PhenGreen OL(Cu²⁺)、ＳＰＱ（Ｃ
ｌ⁻検出のための６−メトキシ−Ｎ−（３−スルホプロピル）キノリニウム）、
１，２ジアミノアントラキノン及びＤｉＢＡＣ_４及び共有的修飾、例えば、ホス
ホリル化、脂質修飾及びその他により蛍光が変化する色素、から選択される。

【００２３】Ｄ_２はまた、特定の環境条件にしたがってその特性を変化させるように修飾さ
れた既知の蛍光色素であり得る。好適には、Ｄ_２は酵素基質として作用する基の
包含によって修飾することができ、その結果Ｄ_２の蛍光特性は酵素の存在によっ
て影響を受ける。

【００２４】リンカー基Ｌは、Ｄ_１及びＤ_２の両方を共有的に連結する化学的付加として特
徴付けられ得る。好ましくはこれは、２つの色素を測定可能な距離に、色素の分光学的特性に影
響がない様に、保持する基として作用し得る。測定可能な距離内にプローブを保
つことは、濃度の関数としてなされるべきプローブ間のスペクトル比較を可能と
し、そしてこうしてレシオメトリック測定を可能とする。リンカー基は、２つの色素の双極分子−双極分子相互作用、その結果のエネル
ギー転移が最小化され、そして色素が互いに独立的に作用するように、特定の配
向のエネルギー転移が可能である２つの区別できる色素を保持するために作用し
得る。

【００２５】好適なリンカー基Ｌは、アミノ酸、例えばリジン又はオルニチンであって、保
護基化学を使用してマスクすることのでき、こうしてアミノ酸の部位特異的標識
及びステップ式の様式でのタンデムカセットの確立を可能とする、幾つかの標識
部位を含むものを含む。好適な標識部位は、アミンを含む。ある実施態様では、
基を連結することは、ポリアミノ酸、例えば、ポリプロリンであって好ましくは
６ないし１２プロリン単位を含むものである。

【００２６】又は、該リンカー基は、エネルギー転移が可能である２つの色素を、Ｒ_０より
ずっと大きい有限な距離に保持するように作用し得、ここで、Ｒ_０はFoester半
径、すなわちエネルギー転移の効率が５０％と同等である２つのフルオル（fluo
rs）間の距離であり、したがってエネルギー転移は起こらない。Ｒ_０値は、典型
的には、３０−６０オングストロームの範囲内である。リンカーはまた、剛直で、こうして衝突消光を制限する配向のプローブを保持
し得る。これはポリプロリン残基又はステロイドリンカーのようなリンカーを含
み得る。

【００２７】式Ｉのレポーター化合物のためのリンカー基はまた、有限な距離内で２つのプ
ローブを保持するように作用し得るが、１つの色素から他方へのエネルギー転移
は制限され、これは異なるスピンパリティーである放射励起状態のためである。
例えば、励起された一重項状態色素を励起された三重項状態色素と対にすること
は、２つのプローブがFoesterエネルギー転移について両立しないという結果と
なり、すなわちパリティー禁止され、したがって励起状態エネルギーを転移し、
又は受け入れることはできない。

【００２８】特に好ましい実施態様では、リンカーＬはまた、生物分子、例えば、抗体、タ
ンパク質、ペプチド又はオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることができる
反応性基を含み得る。好適な基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、イソチオシ
アネート、マレイミド、ヨードアセトアミド及びヒドラジドを含む。

【００２９】好適には、リンカー基Ｌは、２−３０結合長であり得る。例えば、リンカー基
がアルキル鎖−（ＣＨ_２）_ｎ−を含むならば、炭素数「ｎ」は１ないし約１５で
ある。リンカー基はフルオロクロームから伸長する構成要素の一部を含み得る。
他の言葉では、リンカー基は色素クロモホアに付着されるがその一部ではない。

【００３０】好適なリンカー基は、１ないし２０炭素原子を含むアルキル鎖からなる基から
選択され得る非コンジュゲート基であり、これらは所望によりポリエーテル結合
として１ないし８酸素原子、又はポリアミン結合として１ないし８窒素原子、又
はポリアミド結合として１ないし４ＣＯ−ＮＨ基を含み得る。

【００３１】リンカー基を経由するフルオロクロームを共有的に連結するための方法は、当
業者に周知である。

【００３２】例えば、リンカー基がアミド又はエステルを含むばあい、レシオメトリックレ
ポーター分子を式（Ｖ）の化合物の式（ＶＩ）の化合物との反応によって調製し
得る；

【化６】

【００３３】ここでＲ及びＲ’は異なるフルオロクロームである；ＣＯＡは活性化又は活性
化可能カルボキシル基である；ＢはＮＨ_２又はＯＨである；そしてＭ及びＮは独
立的に、Ｃ_１−１２アルキルを含み、所望により１又は２以上の連結フェニル、
ナフチル、アミド、エステル又はエーテル機能基を含む、脂肪族部分である。例
えば、Mujumdar, R.B. et al, Bioconjugate Chemistry, Vol. 4, pp105-111(19
93); 及び米国特許番号５２６８４８６参照。好適な基Ａは、ハロ、例えばクロ
ロ又はブロモ、パラニトロフェノキシル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、又は
ＯＣＯＲ’’を含み、ここでＲ’’はＣ_１−６アルキルである。

【００３４】ここで、リンカー基がアミノ、エーテル又はチオエーテル基を含む、本発明の
複合体は、式（ＶＩＩ）の化合物の、式（ＶＩＩＩ）の化合物との反応によって
調製し得る；

【化７】

【００３５】ここで、Ｒ，Ｒ’、Ｍ及びＮは前記で定義した通りである；Ｂ’はＯＨ、ＮＨ _２又はＳＨである；及びＣは置換可能な基、例えば、ヨード、又はパラ−トルエ
ンスルホネートである。反応を好適には塩基の存在下で実施する。

【００３６】別の実施態様では、リンカーは、切断可能、例えば化学的に切断可能、光切断
可能（例えば、ニトロベンジルアルコール）又は酵素、例えばプロテーゼによっ
て酵素的に切断可能（例えばエステル、アミド、ホスホジエステル、アザ）であ
りうる。そのようなリンカーを切断する好適な方法は周知で、そして例えば、Ge
rard Marriott et al., Preparation and photoactivation of caged fluoropho
res and caged proteins using a new cross-linking reagent, Bioconjugate C
hemistry; (1998); 9(2); 143-151に記載される。

【００３７】エネルギー転移は、２つのプローブの間の励起状態エネルギーの転移であって
互いの短い距離内であるものである。エネルギー転移が電気的に励起された分子
から基底状態分子に起こる場合、又は短い範囲内の２つの分子、例えば２つの隣
接する色素の間で光量子が放射されそして再吸収される場合、これは、衝突転移
によってFoesterエネルギー転移によって起こり得る。

【００３８】「本質的にエネルギー転移がない」によって、Ｄ_１及びＤ_２が選択され、そし
て連結され、その結果２つの間のエネルギー転移の量が最小であることを意味す
る。好ましくは、Ｄ_１及びＤ_２は分光学的特徴、すなわち励起及び放射スペクト
ルを有し、その結果１つの放射スペクトル及び他の吸収スペクトルの間のオーバ
ーラップが本質的にない。こうして２つの構成要素の間の転移の量が最小である
。ある実施態様では、２つの構成要素の間のエネルギー転移の量は、およそ２５
％又はそれ以下である。好ましい実施態様では、構成要素の間の転移の量は、お
よそ１０％以下である。

【００３９】好ましい実施態様では、式Ｉの化合物はｐＨ感受性でそして、したがって酸小
胞を介して容易化される細胞表面レセプターのアゴニスト誘導性インターナリゼ
ーションの測定に好適であり得る。これは幾つかのやり方で実施することができ
る。これらやり方のひとつは、細胞表面（特定のレセプターを発現している細胞
の）を式Ｉの化合物で、反応性エステル、例えば、ＮＨＳを介して、又は他の手
段によって標識し、それから細胞をレセプターのインターナリゼーションを誘導
するアゴニスト又は他のリガンドによって処理することによるものである。式Ｉ
の化合物は、こうしてアゴニスト処理及び構成要素Ｄ_２の蛍光特性への修飾につ
ながるｐＨの変化を経由して評価されるインターナリゼーションにおいてインタ
ーナリゼーションされる。Ｄ_１の蛍光測定は、任意の濃度（又は他の）依存性の
蛍光の変化を監視し、そして収集されるべきレシオメトリック測定を可能とする
。

【００４０】アゴニスト介在性色素インターナリゼーションを測定する別のやり方は、レセ
プター特異的態様におけるものである。所望の細胞表面レセプターは、好ましく
はｐＨ感受性である式Ｉの化合物で直接的にそれを標識することによって分析す
ることができる。標識を、例えば、レセプター特異的エピトープに向かって指向
化された標識された抗体を使用し、それから細胞をアゴニスト又はリガンドで処
理してインターナリゼーションを誘導することによって達成することができる。
アンタゴニスト効果を、直接的競合実験によって測定することができる。さらな
る実施態様では、レセプターに作用するリガンドを色素で標識し、そしてインタ
ーナリゼーションを、リガンドがレセプターといっしょにインターナリゼーショ
ンされるので、ｐＨの変化によって監視することができる。

【００４１】よって、特に好ましい実施態様では、本発明の第１の側面に従う化合物は、式
ＩＩの化合物である：

【化８】

【００４２】この実施態様では、対照分子Ｄ_１はピレンであり、一方環境感受性の分子Ｄ_２はｐＨ感受性Ｃｙ５色素（水中でｐＫａ＝６．１）であり、これはｐＨの変化に
感受性である。リンカー基Ｌは、メチル−アミド連結、ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯであ
る。第１の側面の別の実施態様では、式Ｉの化合物は、酵素活性、好適にはニトロ
レダクターゼ酵素活性の測定をなすために好適である。

【００４３】ニトロレダクターゼと呼ばれる細菌性酵素は、反応スキーム２に以下に示す一
般反応を触媒することが示された：反応スキーム２

【化９】ここで、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの存在下、有機分子上の１又は２以上の−ＮＯ _２基は、ヒドロキシアミン基に還元され、これは、その後にアミン基に変換され
得る。

【００４４】Ｃｙ−Ｑ又は「dark色素」は、ＷＯ９９／６４５１９に記載される。Ｃｙ−Ｑ
色素へのニトロレダクターゼ作用から生じる蛍光の変化は、式Ｉのレシオメトリ
ック蛍光レポーターの構成において開発することができ、ここでＤ_２は、Ｃｙ−
Ｑ色素である。

【００４５】Ｃｙ−Ｑの構造に定義された放射特徴は、それを式Ｉの対にされたフルオロホ
アレシオメトリックレポーター化合物における包含のために好適とし、ここで、
Ｃｙ−Ｑに対するニトロレダクターゼ作用は、２つの異なる波長で励起し、そし
て監視するとき、対にされたフルオルからの蛍光放射の比率の変化につながる。
そのようなレシオメトリックレポーター分子は、レポーター分子の濃度に独立で
ある、なされるべき酵素活性の測定を可能とする。

【００４６】よって、本発明のある実施態様では、Ｄ_２へのニトロレダクターゼ酵素活性が
、２つの異なる波長で励起され、そして監視されるとき、式Ｉの化合物からの蛍
光放射の比率の変化につながる。

【００４７】特に好ましい実施態様では、Ｄ_１はＣｙ色素分子であり、そしてＤ_２は、Ｃｙ
−Ｑ分子である。好ましくは、Ｄ_１はＣｙ２であり、そしてＤ_２はＣｙ５−Ｑで
あり、その結果対となったフルオロホアは、Ｃｙ２／Ｃｙ５−Ｑを含む（Ｃｙ２
Ａｂｓ４８９／Ｅｍ５０６；Ｃｙ５−ＱＡｂｓ６４９／Ｅｍ−；Ｃｙ５Ａｂｓ６
４９／Ｅｍ６７０）。

【００４８】別の好ましい実施態様では、式Ｉ又は式ＩＩの化合物は、細胞に透過可能であ
る。好ましくは、式Ｉ又は式ＩＩの化合物は、さらに、細胞膜透過基を含む。膜
透過化合物は、より疎水性化合物を提供するために親水性基をマスクすることに
よって生成する事ができる。基をマスクすることは、細胞内でフルオロ発生性基
質から切断され、細胞内的に誘導される基質を生成するように設計することがで
きる。基質が、膜透過誘導体よりもより親水性であるから、それはついで細胞で
トラップされる。好適な細胞膜透過基は、内在性哺乳動物細胞内エステラーゼに
よって容易に切断されるアセトキシメチルエステル（Jansen, A.B.A.and Russel
l, T.J.,J. Chem Soc.2127-2132(1965)and Daehne W. et al. J. Med- Che,.13,
697-612(1970))）及びピバロイルエステル（Madhu et al., J. Ocul. Pharmacol
. Ther. 1998, 14,5,pp389-399）から選択され得るが、他の好適な基が当業者に
よって認識される。

【００４９】本発明の第２の側面では、環境条件での変化を検出する方法を提供する。好適には当該方法は以下のステップを含む：ａ）検出されるべき環境シグナルの存在又は想定される存在下で、式Ｉの化合物
の蛍光放射を測定するステップ；及びｂ）当該環境シグナルの不存在下での、式Ｉの化合物の蛍光放射と比較するステ
ップ。

【００５０】好ましい実施態様では、式Ｉのレシオメトリックレポーター化合物の励起は、
２つの異なる波長λ１及びλ２の光により、ここで、波長はフルオロホアＤ_１及
びＤ_２に対応するフルオロホアからの蛍光放射を発する（elicit）のに適当であ
るように選択される。この励起は、波長λ３のＤ_１からの蛍光放射をもたらすが
、波長λ４のＤ_２からの低い又はゼロの放射のみをもたらす。

【００５１】Ｄ_２において、適当な環境シグナル、たとえばｐＨ、イオン濃度、酵素活性等
の存在下でのレシオメトリックレポーターのその後の反応は、λ４の変化した（
増加又は減少した）蛍光放射をもたらす。これらの条件下で、λ３：λ４の強度
の比率の決定及び未反応レポーターのλ３：λ４比率との比較は、レシオメトリ
ックレポーターの、Ｄ_２の減少した形態を含む分子ヘの変換の程度の測定を与え
、それゆえに、関連した環境シグナルの存在の測定を与える。

【００５２】これは、反応スキーム１（図１）において要約する。よって、第２の側面の好ましい実施態様では、ａ）λ１及びλ２の２つの異なる波長の光で式Ｉの化合物を励起し、ここで該波
長は、フルオロホアＤ_１及びＤ_２に対応するフルオロホアからの蛍光放射を発す
る（elicit）のに好適であるように選択されている、ステップ、ｂ）波長λ３のＤ_１からの蛍光放射及び波長λ４のＤ_２からの蛍光放射を測定す
るステップ、ｃ）式Ｉの化合物を適当な環境シグナルに導入するステップ、ｄ）励起ステップａ）及び測定ステップｂ）を反復するステップ、ｅ）λ３：λ４の強度の比率を決定し、そしてそれを、環境シグナルの不存在下
での式Ｉの化合物のλ３：λ４比率と比較するステップ、のステップを含む方法を提供する。

【００５３】蛍光の測定を、蛍光顕微鏡（例えば、ＬＳＭ４１０, Zeiss）、ミクロプレー
トリーダー（例えば、CytoFluor 4000,Perkin Elmer）、共焦点顕微鏡、ＣＣＤ
イメージングシステム（例えば、LEADseeker（登録商標）, Amersham Pharmacia
Biotech）及びフローサイトメトリー（例えば、FACScalibur,Becton Dickinson
）を含む検出装置の範囲の使用によって容易に達成し得る。検出技術の最近の発
展により、迅速で同時的な放射及び励起測定（例えばＷＯ９９／４７９６３参照
）を可能とする。ある例は、LEADseeker(登録商標)Cell Analysis System(Amers
ham Pharmacia Biotech)であって、細胞又はビーズと会合される、区別可能な波
長の多重色素の同時的な励起を可能とするものである。

【００５４】多重ＣＣＤカメラの存在は、これらの同じ色素からの多重放射波長の検出を可
能とする。よって、第２の側面の特に好ましい実施態様では、同時的な二重励起
を使用する。同時的二重励起に好適なシステムは、LEADseeker(登録商標)Cell A
nalysis Systemを含む。

【００５５】好ましい実施態様では、環境条件の経時的変化を追跡するために、蛍光放射を
経時的に連続的に監視し得る。本発明の先の側面のいずれかのある実施態様では、シアニン色素分子の高い蛍
光を、５００ないし９００ｎｍ及びより好ましくは６６５−７２５ｎｍの範囲で
蛍光放射の分析によって同定する。

【００５６】ある実施態様では、試験されるべき環境における組成物は、細胞又は細胞エキ
ストラクトを含む。原理的には、細胞の任意のタイプ、すなわち原核又は真核（
細菌、哺乳動物及び植物細胞を含む）を使用することができる。適当な場合には
、蛍光を測定するに先立ち、当業者に既知の標準的方法（Molecular Cloning, A
Laboratory Manual 2nd Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press 198
9）を使用して、細胞エキストラクトを細胞から調製することができる。

【００５７】細胞に基づくアッセイは、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）におけ
る使用のために、インビトロ生化学アッセイにおいてますます魅力的である。こ
れは、細胞に基づくアッセイが、最小の操作を要し、通常の生理学的状況をより
忠実に模倣する生物学的事情で読み出しを試験することができるからである。一
次的スクリーニングで使用される細胞に基づくアッセイは、信頼できる毒性デー
タを提供し、それによって細胞に対して単に毒性である化合物からアンタゴニス
トを区別することができる。そのようなインビボアッセイは、細胞内プロセスを
測定する能力及びその出力を測定する手段を要求する。例えば、多くの遺伝子の
転写のパターンの変化を、引き出される細胞内シグナルによって、例えば、アゴ
ニストのその細胞表面レセプターとの相互作用によって、又は内部細胞事象、例
えば、ＤＮＡ損傷によって誘導することができる。転写の誘導された変化は、レ
ポーター遺伝子を特定の活性化シグナルに応答性であると知られるプロモーター
領域に融合することによって同定することができる。

【００５８】蛍光に基づく酵素基質システムでは、蛍光の増加は、レポーター遺伝子の発現
の活性化の測定を与える。典型的には、ある種の環境条件の存在について、そしてしたがって、研究中の
調節配列を経由する細胞内応答を活性化する物質の活性をアッセイするために、
細胞を試験物質とインキュベートし、次いで式Ｉの細胞透過性レシオメトリック
レポーター分子の添加をし得る。レポーター分子の、異なる蛍光特性を示す形態
への変換に要求される適当な時間の後、細胞からの蛍光放射を選択されたレポー
ターについて適当な波長で測定する。

【００５９】測定された蛍光を、試験物質に曝露されていないコントロール細胞からの蛍光
と比較し、そしてもしあれば、試験物質の、調節配列を経由して調節された遺伝
子発現に及ぼす影響を、試験細胞での蛍光の、コントロール細胞での蛍光に対す
る比率から決定する。適当な場合、細胞エキストラクトを慣行方法を使用して調製することができる
。

【００６０】明確の目的のために、本発明のある種の実施態様をここで例示のために、以下
の図を引用して記載する：図１は、レシオメトリックレポーター分子の概略ダイヤグラムである、反応スキ
ーム１を示す。図２は、エネルギー転移のないタンデム色素カセットの合成のための反応スキー
ムである、反応スキーム２を示す。図３は、ｐＨ４．５及びｐＨ７．４での化合物ＺのＵＶ／可視吸収スペクトルを
示す。図４は、ｐＨ４．５での化合物Ｚの放射スペクトルを示す。図５は、ｐＨ７．４での化合物Ｚの放射スペクトルを示す。

【００６１】実施例１−ｐＨ感受性レシオメトリックレポーター分子の合成図２は、ｐＨ感受性タンデム色素カセットの合成のための反応スキームである
反応スキーム２を示す。ａ）化合物Ｘ（２−[１Ｅ，３Ｅ）−５−（３，３−ジメチル−５−スルフォ−
１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イルイデン）−１，３−ペンタジエ
ニル]−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドール−５−カルボン酸の合成５−スルフォ−２，３−トリメチルインドレニン（６９．３ｍｇ、０．２７ｍ
ｍｏｌ）、マロンアルデヒドビス（フェニルイミン）モノヒドロクロリド（７０
ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）安息香酸（６６ｍｇ０．５４ｍｍｏｌ）及び安息香酸
無水物（１２２ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）中に溶解し、そし
て溶液を６０℃で１０分間撹拌した。２，３，３−トリメチルインドールニウム
−５−カルボン酸（４７．４ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．５ｍｌ）
中の溶液を添加し、そして反応混合物を６０℃でさらに４時間加熱した。得られ
た青色溶液を冷却し、Rainin Dynamax 60Å C18カラムを、５分間１５％Ｂで、
７５分間で１５％から５０％Ｂの溶媒勾配で、１０ｍｌ／分で使用して、逆相Ｈ
ＰＬＣによって精製し、ここでＡ＝Ｈ_２Ｏ（０．１％酢酸）及びＢ＝アセトニト
リル（０．１％酢酸）である。ＸＩＩの保持時間は５５．４分間（ＵＶ／可視、
６５０ｎｍで検出）である。収率は７４ｍｇ、５８％である。

【表２】Ｃ_２６Ｈ_２５Ｎ_２Ｏ_５Ｓについて正確な質量分析Ｍ−Ｈ⁻）＝４７７．１４５６

【００６２】ｂ）化合物Ｙの合成；化合物ＸのＮ−ヒドロキシ−スクシンイミジルエステル化合物ＸをＤＭＳＯ中に、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−
ピロリジノホスフォニウムヘキサフルオロフォスフェート（ｐｙＢＯＰ）（１当
量）、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（１当量）及びジイソプロピルエチルア
ミン（１当量）と溶解した（ステップ（ｉ））。溶液を１時間撹拌し、ＴＬＣ分
析によってＮＨＳエステルへの定量的変換を得た。得られた青色溶液を、Rainin
Dynamax 60Å C18カラムを、１０ｍｌ／分で、５分間１５％Ｂ、５ないし１５
分は１５％から２０％Ｂ、１５ないし２５分は２０％ないし３０％Ｂ、そして２
５ないし８０分は３０％ないし５０％の溶媒勾配で使用して、逆相ＨＰＬＣによ
って精製し、ここでＡ＝Ｈ_２Ｏ（０．１％酢酸）及びＢ＝アセトニトリル（０．
１％酢酸）である。ＮＨＳエステルの保持時間は４５分間であった（ＵＶ／可視
、６５０ｎｍでの検出）。収率１００％。ＭＡＬＤ−ＴＯＦ質量分析Ｃ_３０Ｈ_３ _０Ｎ_３Ｏ_７Ｓ（Ｍ^＋＋Ｈ）についてｍ／ｚ＝５７８（１００％）。

【００６３】ｃ）ピレン−１コンジュゲート（化合物Ｚ）の合成化合物ＹをＤＭＳＯにピレン−メチルアミン（１当量）及びジイソプロピルエ
チルアミン（１当量）と溶解する（ステップ（ｉｉ））そして反応物を室温で３
時間撹拌した。溶液を、以下の条件を使用して逆相ＨＰＬＣによって精製した。
勾配は５分間１５％Ｂ、次いで７５分間１５％から５０％、次いで２５分間５０
％から１００５ｂであった。ここでＡ＝Ｈ_２Ｏ（０．１％酢酸）及びＢ＝アセト
ニトリル（０．１％酢酸）。未反応Ｃｙ５は４５分で溶出し、そして化合物Ｚは
８８分で溶出した。ＴＬＣ２０％メタノール／ジクロロメタンは、１青色スポッ
トを観察した。Ｒｆ＝０．２５。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析Ｃ_４３Ｈ_３７Ｎ_３Ｏ_４についてｍ／ｚ＝６９１（１００％）。ＵＶ（Ｈ_２Ｏ／Ｈ^＋）λａｂｓ＝３
３０ｎｍ、３４３ｎｍ、６５０ｎｍ。ＵＶ（Ｈ_２Ｏ／ＯＨ⁻）λａｂｓ＝３３０
ｎｍ、３４３ｎｍ、５００ｎｍ、６５０ｎｍ。

【００６４】実施例２−化合物Ｚの分光学的特徴ＺのＵＶ／可視吸収プロファイルを、２つの異なるｐＨで測定した。Ｚの２つ
の等モル溶液を、ｐＨ４．５及び７．４のリン酸バッファー中で作成した（〜１
０^−６Ｍ）。これらを１時間平衡させた。キュベットを１ＭＨＣｌで酸洗浄し
、蒸留イオン交換水ですすぎ、そしてそれそれの測定の間乾燥した。ＵＶ及び可
視吸収測定を、ダイオードアレイディテクターを有するHewlett Packard 8453Ｕ
Ｖ／可視スペクトロフォトメーターで実施した。データをHP Vectra XA PCを使
用して収集し、そしてHP 845 x UV/可視ソフトウェアを使用して解析した。図３は、ｐＨ４．５及び７．４での化合物ＺのＵＶ／可視吸収スペクトルを示
す。

【００６５】実施例３−酸及び塩基での化合物Ｚの蛍光放射スペクトルＺの蛍光特徴を、１０ｎｍ放射及び放射スリット幅を使用する蛍光モードでPe
rkin-Elmer LS50Bを使用して特性把握した。すべての測定を１ｃｍ経路幅の２ｍ
ｌクオーツキュベット中で実施した。キュベットを１ＭＨＣｌで酸洗浄し、蒸
留イオン交換水ですすぎ、そしてそれぞれの測定の間乾燥した。

【００６６】すべてのスペクトルをGateway 2000 PS-120 PCを使用して収集し、そしてPErk
in-Elmer Winlabソフトウェアを使用して解析した。Ｚの２つの等モル溶液をｐ
Ｈ４．５及び７．４のリン酸バッファー中で作成した（〜１０^−６Ｍ）。これら
を、１時間平衡させた。蛍光放射スペクトルを、３４３ｎｍ（ピレン）及び６３
３（Ｃｙ５）の両方の励起波長を使用して測定した。図４はｐＨ４．５での化合物Ｚの放射スペクトルを示す。図５は、ｐＨ７．４での化合物Ｚの放射スペクトルを示す。

【００６７】ｐＨ４．５で３４３ｎｍで化合物Ｚの励起すると、６５０−７００ｎｍでＣｙ
５から放射がないことを、図４及び５から見ることができる。したがってエネル
ギー転移はFoester機構又は衝突ＥＴのいずれかによって発生することはなさそ
うである。さらに６３３ｎｍでプローブ化合物Ｚを励起するとき、放射はＣｙ５
から発生する。

【００６８】ｐＨ７．４で３４３ｎｍでプローブ化合物Ｚを励起すると、放射特徴は変化せ
ず、そしてＣｙ５へのエネルギー転移はない。例えば６５０ｎｍでシグナルはな
く、そしてまたピレン放射スペクトルは変化せず、このことは、このｐＨでは５
００ｎｍで展開された、特徴的Ｃｙ５吸収ピークによって消光しないことを指摘
している。さらにｐＨ７．４バッファー中での６３３ｎｍでのプローブ化合物Ｚ
の励起は、Ｃｙ５からの放射がほとんどないことを示している。これは予測され
たことであり、このｐＨでのｐＨ感受性Ｃｙ５プローブの蛍光放射は大きく減少
しているからである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、レシオメトリックレポーター分子の概略ダイヤグラムで
ある、反応スキーム１を示す。

【図２】図２は、エネルギー転移のないタンデム色素カセットの合成のた
めの反応スキームである、反応スキーム２を示す。

【図３】図３は、ｐＨ４．５及びｐＨ７．４での化合物ＺのＵＶ／可視吸
収スペクトルを示す。

【図４】図４は、ｐＨ４．５での化合物Ｚの放射スペクトルを示す。

【図５】図５は、ｐＨ７．４での化合物Ｚの放射スペクトルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者マイケル・イー・クーパーイギリス、シーエフ14・７ワイティ、カーディフ、ホイットチャーチ、フォレスト・ファーム・エステイト、カーディフ・ラボラトリーズ、アマシャム・ファルマシア・バイオテック・ユーケイ・リミテッド (72)発明者エレイン・エイディイギリス、シーエフ14・７ワイティ、カーディフ、ホイットチャーチ、フォレスト・ファーム・エステイト、カーディフ・ラボラトリーズ、アマシャム・ファルマシア・バイオテック・ユーケイ・リミテッドＦターム(参考） 2G043 AA01 BA16 DA01 EA01 FA02 FA03 JA01 KA01 KA02 KA03 LA01 LA03 4H056 CA01 CC02 CC08 CE03 DD03 FA08

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式Ｉの化合物であって：【化１】式中、Ｄ_１及びＤ_２は、検出可能な分子であり、そしてＤ_１は対照分子であり、Ｄ_２は環境感受性な分子であり、そしてＬはリンカー基である、化合物。
【請求項２】式Ｉの化合物であって：【化２】ここで、Ｄ_１及びＤ_２は検出可能なフルオロホアであり、そしてＤ_１は対照分子であり、そしてＤ_２は環境感受性な分子であり、Ｌはリンカー基であり、そしてＤ_１とＤ_２の間のエネルギー転移が本質的にないことを特徴とする、化合物。
【請求項３】Ｄ_１及びＤ_２が分光学特徴を有し、その結果放射スペクトル
Ｄ_１及びＤ_２の吸収スペクトルの間のオーバーラップが本質的にない、請求項１
又は請求項２に記載の化合物。
【請求項４】Ｄ_２が、環境感受性のＣｙdye、Ｆｕｒａ２、Ｆｌｕｏ−３
、Ｆｌｕｏ−４、Ｑｕｉｎ２、Sodium Green、Magnesium Green、Calcium Crims
on、Mag-Fluo-4、Newport Green(K⁺)、Ｎ−（６−メトキシ−８−キノイル）−
ｐトルエンスルホンアミド（Ｚｎ^２＋のためのＴＳＱ）、PhenGreen OL(Cu²⁺)、
ＳＰＱ（Ｃｌ⁻検出のための６−メトキシ−Ｎ−（３−スルホプロピル）キノリ
ニウム）、１，２ジアミノアントラキノン及びＤｉＢＡＣ_４から選択される、請
求項１ないし３のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】Ｌが、幾つかのアミノ酸標識部位を含むアミノ酸から選択さ
れる、請求項１ないし４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】Ｒ_０が３０−６０の範囲内である、請求項１ないし５のいず
れかに記載の化合物。
【請求項７】Ｌが、生物分子にコンジュゲートされることができる、反応
性基をさらに含む、請求項１ないし６のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】当該反応性基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、イソチオ
シアネート、マレイミド、ヨードアセトアミドおよびヒドラジドから選択される
、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】Ｌが切断可能基である、請求項１ないし８のいずれかに記載
の化合物。
【請求項１０】式ＩＩを有する請求項２に記載の化合物。【化３】
【請求項１１】当該化合物が細胞透過性である、請求項１ないし１０のい
ずれかに記載の化合物。
【請求項１２】請求項１ないし１１のいずれかに記載の化合物を使用する
環境条件の変化を検出する方法。
【請求項１３】ａ）検出されるべき環境シグナルの存在又は想定される存
在下での、式Ｉの化合物の蛍光放射を測定するステップ；及びｂ）当該環境シグナルの不存在下での、式Ｉの化合物の蛍光放射と比較するステ
ップのステップを含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】ａ）λ１及びλ２の２つの異なる波長の光で式Ｉの化合物
を励起し、ここで該波長は、フルオロホアＤ_１及びＤ_２に対応するフルオロホア
からの蛍光放射を発する（elicit）のに好適であるように選択されている、ステ
ップ、ｂ）波長λ３のＤ_１からの蛍光放射及び波長λ４のＤ_２からの蛍光放射を測定す
るステップ、ｃ）式Ｉの化合物を適当な環境シグナルに導入するステップ、ｄ）励起ステップａ）及び測定ステップｂ）を反復するステップ、ｅ）λ３：λ４の強度の比率を決定し、そしてそれを、環境シグナルの不存在下
での式Ｉの化合物のλ３：λ４比率と比較するステップ、のステップを含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】蛍光放射の測定が、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、ミクロプ
レートリーディング、ＣＣＤイメージング又はフローサイトメトリーによるもの
である、請求項１２ないし１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】区別可能な波長のＤ_１及びＤ_２での励起が、同時的に実施
される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】環境条件の変化を追跡するために、蛍光放射を経時的に連
続的に監視する、請求項１２ないし１６のいずれかに記載の方法。