JP2003501540A

JP2003501540A - 反応性蛍光試薬としてのｐＨ官能性シアニン染料

Info

Publication number: JP2003501540A
Application number: JP2001502512A
Authority: JP
Inventors: ラットネイカー・ムジュムダー; ジョン・アンソニー・スミス
Original assignee: カーネギーメロンユニヴァーシティ; アマーシャムバイオサイエンセスユーケーリミテッド
Priority date: 1999-06-09
Filing date: 2000-06-08
Publication date: 2003-01-14
Also published as: CA2375740A1; WO2000075237A3; AU5728400A; WO2000075237A2; WO2000075237A9; EP1212375A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、ｐＨ感受性シアニン染料及びこれを蛍光指示薬として使用する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本出願は、ここにその全体を参照のために取り込むこととする、１９９９年６
月９日に出願された米国仮出願６０／１３８，２９７号の利益を主張するもので
ある。本発明は、ｐＨ感受性シアニン染料及びこれを蛍光試薬として使用する方法を
提供する。

【０００２】

【従来の技術】

吸光特性を有するシアニン及び関連ポリメチン染料は、写真フィルム、光学記
録媒体において、及び最近では生物学研究のためのルミネッセンス（蛍光及び燐
光）染料として、利用されている。下記の通り、幾つかの概説文献が、シアニン
染料の合成及び応用に関して著されている。

【参考文献１】

【０００３】典型的なシアニンは、式１に示されるように、ポリメチン鎖が接合した二つの
窒素含有複素芳香族環（Ａ及びＡ’）を有する分子として定義することができる
。Ｒ¹及びＲ²基は、本質的にアルキルまたは置換アルキル基であり、「ｍ」は０
、１、２、３、及び４からなる群より選択される整数である。これらの染料は、
発色団上に非局在化した陽電荷によって、カチオン特性を有する。この非局在化
の理由はまた、シアニン染料の非常に高い吸光係数にもある。

【０００４】

【化５】式中、Ｒ¹及びＲ²基は、アルキルまたは置換アルキル基であり、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、及びＲ⁷は、Ｈ、水溶性基、ハロゲン、アルコキシ、ヒド
ロキシ、アミン、アミド、カルボン酸、またはカルボン酸エステルである。典型的な「Ａ」及び「Ａ’」は、下記の複素芳香環から選択される。

【０００５】

【化６】

【０００６】式中、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、及びＸは、ここに定義したものである。Ｗは、水素、-（
ＣＨ₂）_nＲより選択され、ここではｎは１乃至２６の整数であり、Ｒは水素、ア
ミノ、アルデヒド、アセタール、ケタール、ハロ、シアノ、アリール、ヘテロア
リール、スルホネート、スルフェート、カルボキシレート、置換アミノ、ニトロ
、第一級アミド、置換アミド、並びにアミノ、ヒドロキシル、カルボニル、ホス
ホリル、及びスルフィドリル基と反応性の基から選択される。

【０００７】以下は、既知のｐＨ感受性シアニン染料の例である。シアニン染料のスペクトル特性は、溶媒の変更に対して僅かに感受性であるの
みであり、一般的にｐＨ感受性染料と見なされる。しかしながら、数種のみのシ
アニンがｐＨ依存性を示すことが知られている。複素芳香系の芳香環に直接結合
したアミンまたはカルボン酸基は、窒素間のカチオン非局在化に影響する。アミ
ノ−シアニン染料（式２）の吸光バンドは非常にブロードであって、中性のｐＨ
における主たる電子項遷移と振電サイドバンドとがほとんど完全に混合している
。穏やかな酸性の溶液中またはアセチル基によってアミンが遮蔽されている場合
には、遷移はより鮮明に、より強くなり、青色にシフトする。これらのアミノ−
シアニンは、中性溶液中においては、目視では非蛍光性である（R. B. Mujumdar
, L. E. Ernst, S. R. Mujumdar, and A. S. Waggoner, "Cyanine Dye Labeling
Reagents containing Isothiocyanate Groups", Cytometry vol. 10, pp 11-19
(1989)）。

【０００８】

【化７】

【０００９】スクアランは、通常はｐＨ感受性であるが、その誘導体（式３）は生物学的ｐ
Ｈ範囲（ｐＨ６−ｐＨ９）においては非感受性であり、したがって生物学研究の
ためのｐＨ感受性染料として有効に使用することは不可能である（E. Terpetsch
ing, H. Szmacinski, A. Ozinskas, and J. R. Lakowicz, "Synthesis of squar
aine-N-Hydroxysuccinimide Esters and Their Biological Application as Lon
g-Wavelength Fluorescent Labeling", Analytical Biochemistry vol. 217, pp
197-204 (1994)）。

【００１０】

【化８】

【００１１】 Kolesnikov and Povolotskii (1986)は、単純なモノＮ-アルキル化シアニン（
式４）の¹ＨＮＭＲを研究しているが、その合成及びスペクトル特性（吸光、発
光）は議論されていない（A. M. Kolesnikov, and M. I. Provolotskii, Teor.
Eksp. Khim, vol. 24, pp 225-227 (1986）。Brooker et al (1940)はモノアル
キル化シアニン（式５）の合成を報告している。これらの化合物（アンヒドロニ
ウム塩基と呼称）は不安定で、その吸光を測定しようとする間にさえひどく色あ
せる（L. G. S. Brooker, R. H. Spague, C. P. Smyth, and G. L. Lewis."Halo
chromism of Anhydronium Bases Related to the Cyanine Dyes", J. Chem. Soc
., Vol. 62, pp 1116-1124 (1940）。Zubaroviskil(1972)は、チアカルボシアニ
ン（式５）の合成を記載しているが、そのスペクトル特性は議論していない（V.
M. Zubarvotskii "Synthesis of thiacarbocyanines without alkyls at the n
itrogen atoms of their benzothiazole nuclei", Khim. Geterotsikl. Soedi.,
Vol. 11, pp 1579-80 (1972）。

【００１２】

【化９】

【００１３】式４及び５の染料は、一つの窒素上に交換可能な水素を有するが、これらは水
不溶性であって反応性基をもたず、不安定であって、生物学的応用には不適当と
なっている。

【００１４】蛍光染料は、一般的に既知であって、蛍光顕微鏡検査操作、蛍光イムノロジー
及びフローサイトメトリー等による様々な生物学的及び非生物学的物質の蛍光標
識及び検出に使用される。蛍光染料はまた、例えば細胞内及び細胞外のイオン濃
度を同時に測定するためのトレーサとして使用しても良い。この方法では、膜内
外のイオン勾配を測定しても良い。さらにまた、二つの異なる蛍光プローブを使
用して、同時に二つのイオンをモニターすることも可能である。

【００１５】四つの一般的に使用される蛍光染料は、フルオレセイン（緑色蛍光）及びロー
ダミン（橙色蛍光）、クマリン及びピレン（青色蛍光）発色団に基づくものであ
る。広く入手可能な蛍光ｐＨ標識は、一般的にフルオレセインまたはピレン誘導
体である。フルオレセインに基づく染料は、多くの欠点を有しており、これには
強い励起光源で照明された際に退色する傾向を有することが含まれる。結果とし
て時間と共に迅速に映像が喪失することにより、検出及び計量がより困難である
。フルオレセイン誘導体もまた、ｐＨ感受性吸光スペクトルを有し、フルオレセ
イン収量はｐＨ８未満では著しく減少する。ピレン誘導体、例えばピレントリス
ルホネートは、ブロードな吸光及び発光スペクトル、並びに比較的に低い吸光係
数を有する。一連の広範な蛍光ｐＨ指示薬が、Molecular Probes, Portland OR
より入手可能であり、これらに関する情報は、"Molecular Probes-Handbook of
Fluorescent Probes and Research Chemicals (Ed. R. P. Haugland(1996))"に
記載されている。これに記載された蛍光ｐＨ指示薬のほとんどが、中性またはア
ルカリ性溶液中においてのみ蛍光性である。

【００１６】酸性ｐＨ環境向けに推奨される、Molecular Probesより入手可能な染料が５つ
ある。これらには、酸性環境中においてより蛍光性になる弱塩基である、LYSOSE
NSORプローブと呼称される染料が含まれている。これらの中には、以下の式を有
するLYSOSENSOR YELLOW/BLUEがあり、これは、その励起等吸光点近傍（〜３６０
nm）で照射された場合には、酸性環境中においてより長い波長へのｐＨ依存性発
光シフトを、並びにその発光等吸光点近傍（〜４９０）で検出された場合には、
ｐＨ依存性励起シフトを起こすことが報告されている。これらの変化には、酸性
オルガネラまたは他の酸性環境中における、比率的ｐＨ測定が必要である。

【００１７】

【化１０】

【００１８】他のLYSOSENSOR ｐＨ感受性性蛍光指示薬には、LYSOSENSOR BLUE DND-167が含
まれ、これは非酸性環境中において非蛍光性であり、ＤＭＳＯ中に可溶性であり
、５．１のｐＫａを有し、ｐＨ４．５−６にて蛍光を発するが３７３nmにて励起
された場合の発光波長は４２５nmであり、下記の構造を有する。

【００１９】

【化１１】

【００２０】 LYSOSENSOR GREEN DND-189もまた、非酸性環境中において非蛍光性であり、Ｄ
ＭＳＯ中に可溶性であり、５．２のｐＫａを有し、ｐＨ４．５−６にて蛍光を発
するが４４３nmにて励起された場合の発光波長は５０５nmであり、下記の構造を
有する。

【００２１】

【化１２】

【００２２】 LYSOSENSOR BLUE DND-192は、中性ｐＨにて明るく蛍光を発し、ＤＭＳＯ中に
可溶性であり、７．５のｐＫａを有し、ｐＨ６．５−８にて蛍光を発するが３７
４nmにて励起された場合の発光波長は４２５nmであり、下記の構造を有する。

【００２３】

【化１３】

【００２４】 LYSOSENSOR GREEN DND-153もまた、中性ｐＨにて明るく蛍光を発し、ＤＭＳＯ
中に可溶性であり、７．５のｐＫａを有し、ｐＨ６．５−８にて蛍光を発するが
４４２nmにて励起された場合の発光波長は５０５nmであり、下記の構造を有する
。

【００２５】

【化１４】

【００２６】 LYSOSENSORプローブが水性媒質中によりもむしろ膜中に局在化しうるために、
おそらくは上記のｐＫａ値が細胞環境では相違するであろうこと及び細胞ｐＨの
定性的または準定性的比較が可能であろうことは、注目に値する。

【００２７】蛍光ｐＨ測定のためにMolecular Probesから入手可能な他の化合物群は、フル
オレセイン誘導体であり、ここでは電子吸引基が導入されてフェノール基のｐＫ
ａが５以下に低減されている。製品説明にはフッ化フルオレセインが穏やかな酸
性溶液中においても依然ｐＨ感受性であり、約４．７のｐＫａ値を有する旨が報
告されている。

【００２８】蛍光ｐＨ観察のためにMolecular Probesから入手可能な化合物の最後の群は、
ロドール（rhodol）誘導体であって、これはフルオレセインとローダミン染料と
の構造ハイブリッドであってフェノール性ヒドロキシ基によって得られるｐＨ感
受性特性を維持する一方で、更にｐＫａ値を低減するアミン置換基を含む。これ
らの染料には、以下の構造を有するＣ-ＮＥＲＦがある。

【００２９】

【化１５】

【００３０】この染料によれば、５４０nmにて報告される発光を有するアルゴンイオンレー
ザーの二つの主要な可視線（５１４nm及び４８８nm）を使用して、比率的ｐＨ測
定を行うことができる。酸性のｐＨ条件中で蛍光発光する化合物が少数である一方で、本発明によって
提供されるような、４００−８００nm領域において蛍光発光する酸性ｐＨ指示薬
として使用可能な、水溶性の、非フルオレセイン誘導体が求められている。本発
明に記載するシアニンは、好ましくは水溶性を向上させる官能基を有する。該シ
アニンは少なくとも一のスルホネート基を有することが好ましく、これらはアリ
ールスルホネートまたはアラルキルスルホネートであってよい。あるいは、本発
明の水溶性基は、ホスホネートまたはホスフェートであってよい。

【００３１】

【発明が解決しようとする課題】

本発明の目的は、水溶性であって、スペクトルの４００−８００nm領域内にお
いて蛍光発光するような、酸性ｐＨ指示薬であるシアニン誘導体を提供すること
である。本発明の別の目的は、水素イオン濃度または約ｐＨ３乃至ｐＨ１０の範囲内の
ｐＨを検出する、蛍光方法を提供することである。本発明の別の目的は、水素イオン濃度または約ｐＨ３乃至ｐＨ１０の範囲内、
好ましくは約ｐＨ３−６の範囲内のｐＨを検出するために使用しても良い、蛍光
試薬を提供することである。

【００３２】

【課題を解決するための手段】

一つの実施態様においては、本発明は、下式（Ｉ）：

【化１６】 [式中、Ｘ及びＹは、＞Ｃ（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）₂、硫黄及び酸素から選択され；
Ｒ¹及びＲ²は、Ｈ、ＣＨ₂ＮＨ₂、ホスフェート、ホスホネート、第四級アンモニ
ウム、ＮＯ₂、（ＣＨ₂）_qＣＯＯＨ、ＳＯ₃ ^-、ＣＨ₂ＣＯＯＨ、ＮＣＳ、ＣＨ₂Ｎ
Ｈ-ＣＯＲ⁷から個別に選択され、ここではＲ⁷は、Ｃ₁−Ｃ₂₀直鎖状もしくは分枝
状アルキルまたは-（ＣＨ₂）_q-ＣＯＯＨであり、ここではｑは、０、１、２、３
、４、５、６、７、８、９、または１０の整数であり；Ｒ³は、Ｈまたは-Ｌ-Ｐ
であり、ここではＬは、アルケニル、アルキニル、及びアリールから選択される
、０、１、または２の不飽和基を任意に含むＣ₁−Ｃ₂₀直鎖状もしくは分枝状ア
ルキルから選択され、Ｐは、反応性基、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₂₀直鎖状もしくは分枝状ア
ルキル、ＳＯ₃ ^-、ＮＨ₂、第四級アンモニウム、ＣＨ₂ＮＨ-ＣＯＲ⁸から選択され
、ここではＲ⁸は、Ｃ₁−Ｃ₂₀直鎖状もしくは分枝状アルキル、-（ＣＨ₂）_m-ＣＯ
ＯＨ、ＮＨＲ⁹であり、ここではＲ⁹は、Ｃ₁−Ｃ₂₀直鎖状もしくは分枝状アルキ
ル、またはＣＯＯＨであり；ｎは０、１、２、または３であり；ｐ及びｒは個別
に０、１、２、３、または４であって、ｐ及び／またはｒが１より大である場合
には、各Ｒ¹及びＲ²は相違しても良く、ｍは１、２、３、４、５、６、７、８、
９、または１０である] のシアニン誘導体及びこれらの塩及びプロトン化誘導体を提供する。各Ｒ¹及び
Ｒ²は相違し、対応するそれぞれの環の周囲で多数置換されていてもよく、これ
によって各環は多数のＲ¹及びＲ²置換基を含み、各置換基は相違しても良い。

【００３３】更にまた、Ｒ¹、Ｒ²、またはＲ³のいずれかまたは全ては、Ｃ₁−Ｃ₂₀直鎖状も
しくは分枝状アルキル鎖、Ｃ₂−Ｃ₂₀モノエーテルまたはポリエーテル、及び四
つまでの第二級アミド結合を含むＣ₂−Ｃ₂₀の原子から選択される、リンカーま
たはスペーサー基Ｌを介して、エネルギー移動関係にある蛍光パートナーに結合
しても良い。Ｌは、上述のような標的結合基または反応性基または反応性部分で
あるＰに結合しても良く、これは例えばスクシンイミジルエステル、イソチオシ
アネート、チオシアネート、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン、無水
物、ハロアセタミド、マレイミド、スルホニルハライド、ホスファアミダイト、
酸ハライド、アルキルイミデート、ヒドラジド、及びカルボジイミド；並びにア
ミノ、ヒドロキシル、アルデヒド、ホスホリル、またはスルフィドリル基と反応
性の基から選択される。Ｌは、例えば鎖中に分散されたものでもよいアルケニル
、アルキニル、及びアリールから選択される、上限二の不飽和基を含んでいて良
い。あるいはまた、標的結合基は、直接、または蛍光分子のいずれかにおいて置
換されていてもよく、例えばここに記載のＲ¹-Ｒ⁶である。

【００３４】本発明のこうした実施態様においては、本発明の染料もしくは誘導体は、それ
ぞれの記載をその全体として参照のためにここに取り込むこととする、欧州特許
出願第７４７７００号、国際特許出願９９／３９２０３号及び国際特許出願００
／１３０２６号に記載されているように、エネルギー移動錯体の一つの染料であ
る。該錯体は、第一の（または供与体）蛍光色素、第二の（または受容体）蛍光
色素、及び、供与体及び受容体の蛍光色素を共有結合的に結合させるための少な
くとも一のリンカーを含む。好ましくは、本発明のエネルギー移動錯体は、標的
物質と共有結合を形成可能な、標的結合基を含む。あるいは、エネルギー移動錯
体は、細胞浸透性を助長するための官能性を含んでも良い。例には、アセトキシ
メチルエステルが含まれる。

【００３５】好適には、この実施態様では、エネルギー移動錯体を、系のｐＨにおける変化
を伴う比率的測定に使用しても良く、ここでは供与体または受容体種がここに記
載したｐＨ感受性シアニン染料であっても良い。ｐＨ感受性シアニン染料が供与
体である場合には、受容体染料の蛍光発光の強度は、供与体及び受容体染料種の
両方を個別に励起させた後に測定される。ｐＨ感受性シアニン染料が受容体であ
る場合には、供与体種のみを励起させ、供与体及び受容体染料の両方の発光の強
度を個別に、連続的または同時に測定しても良い。したがって、該方法は、エネ
ルギー移動関係にある二つの染料が、生物学的及び他の系中におけるｐＨ変化に
関する濃度非依存性情報の提供に利用可能である、比率的測定を規定するもので
ある。

【００３６】

【発明の実施の形態】

本発明は、置換シアニン染料を提供するが、これは該染料の塩基性によって、
酸性または塩基性の条件下においてインドール窒素のプロトン化の際に蛍光性と
なる。すなわち、例えば、酸性条件下では、式（Ｉ）のプロトン化シアニンは以
下の構造式を有して、蛍光性である。

【００３７】

【化１７】

【００３８】別の実施態様においては、本発明は、下式（Ｉａ）のｐＨ感受性染料を提供す
る。

【化１８】 [式中、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³は、以下に示すとおりである。]

【００３９】

【表１】

【００４０】更に別の実施態様においては、本発明は、式（Ｉ）及び（Ｉａ）の誘導体を提
供するが、これらは、アミン、ヒドロキシル、アルデヒド、及びスルフヒドリル
基と共有結合的に反応性とするような置換基を含む。これらの置換基は、式（Ｉ
）及び（Ｉａ）のシアニン染料を、生物学的物質、非生物学的な分子及び高分子
及び粒子に共有結合的に結合させて、これらの物質を蛍光検出方法によって蛍光
的に標識；検出及び／または定量できるようにするために有用である。

【００４１】この実施態様において、式（Ｉ）及び（Ｉａ）の誘導体には、そのプロトン化
形態を含む下記の式（II）、（III）、及び（IV）の化合物、及びこれらの塩及
びプロトン化誘導体が含まれる。

【００４２】

【化１９】

【００４３】式中、Ｘ及びＹは、＞Ｃ（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）₂、硫黄及び酸素から選択され
；Ｚ_a及びＺ_bは、それぞれ個別に、６の炭素原子を有して０、１、または２の窒素
原子を含む１または２の縮合芳香環の完成に必要な原子を表し；Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ⁵
、及びＲ⁶は、Ｈ、ＣＨ₂ＮＨ₂、ＳＯ₃ ^-、ホスフェート、ホスホネート、第四級
アンモニウム、ＮＯ₂、（ＣＨ₂）_qＰ、（ＣＨ₂）_qＣＯＯＨ、ＣＨ₂ＮＨ-ＣＯＲ⁷ から個別に選択され、ここではＲ⁷は、Ｃ₁−Ｃ₂₀直鎖状もしくは分枝状アルキル
または-（ＣＨ₂）_m-ＣＯＯＨであり、ここではｑは、０乃至１０の整数であり；
Ｒ³は、Ｈまたは-Ｌ-Ｐであり；ここではＬは、アルケニル、アルキニル、及び
アリールから選択される、０、１、または２の不飽和基を任意に含むＣ₁−Ｃ₂₀
直鎖状もしくは分枝状アルキルから選択され、更にＰは、反応性基、Ｈ、ＳＯ₃ ^- 、ＮＨ₂、第四級アンモニウム、ＣＨ₂ＮＨ-ＣＯＲ⁸から選択され、ここではＲ⁸
は、Ｃ₁−Ｃ₂₀直鎖状もしくは分枝状アルキル、-（ＣＨ₂）_m-ＣＯＯＨ、ＮＨＲ⁹ であり、ここではＲ⁹は、Ｃ₁−Ｃ₂₀直鎖状もしくは分枝状アルキル、またはＣＯ
ＯＨであり；Ｒ⁴は、Ｈ、または（ＣＨ₂）_mＰであり；ｎは０乃至３の整数であ
り；ｐ、ｒ、ｕ、及びｖは個別に０、１、２、３、または４であって、ここでｐ
、ｒ、ｕ、及び／またはｖが１より大である場合には、各Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ⁵、及び
Ｒ⁶は相違しても良く、ｍは１乃至１０の整数である。ここに記載のように、反
応性基は該染料を、標識しようとする成分に結合させることができる。

【００４４】Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ⁴のいずれであっても、上述のようにスペーサーもしくはリ
ンカーＬを個別に含んでよく、更に／または、ここに記載のように標的結合基ま
たは反応性基または反応性部分、例えばスクシンイミジルエステル、イソチオシ
アネート、無水物、ハロアセタミド、マレイミド、スルホニルハライド、ホスフ
ァアミダイト、酸ハライド、アルキルイミデート、ヒドラジド、およびカルボジ
イミド；並びにアミノ、ヒドロキシル、アルデヒド、ホスホリル、またはスルフ
ィドリル基と反応性の基等を含んで良い。所定の試薬については、さらに各分子
上のＰ（Ｒ³が-（ＣＨ₂）_m-Ｐである場合）、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ⁴基の少なくとも
一つが、発色団の溶解度を増大させる、または標識成分の標識の選択性に影響す
る、または該染料によって標識成分の標識の位置に影響する基であってよい。各
Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ⁵、及びＲ⁶の一以上が、あらゆる環上に含まれていてよく、各置換
基は同一でも相違しても良い。

【００４５】本発明の好ましい実施態様においては、Ｒ¹、Ｒ²、またはＰ（Ｒ³が-（ＣＨ₂
）_m-Ｐである場合）の少なくとも一つが、スルホネートを含む。

【００４６】一つの実施態様においては、Ｒ⁵及びＲ⁶の少なくとも一つは、存在するならば
、少なくとも一のスルホネート基であり；ここでは、スルホネート基が単にイオ
ン化されたスルホン酸であることから、スルホネートはスルホン酸を含む。Ｒ⁵
またはＲ⁶は反応性部分であって良く、例えば第一級アミン、例えばＮＨＲ¹⁰で
あって、ここではＲ¹⁰はＣ₁−Ｃ₂₀直鎖状もしくは分枝状アルキルである。直接
的または間接的に発色団に結合して、反応性部分を含有可能なＰ（Ｒ³が-（ＣＨ ₂ ）_m-Ｐである場合）、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ⁴基のいずれでも形成することのできる
反応性基は、イソチオシアネート、イソシアネート、モノクロロトリアジン、ジ
クロロトリアジン、モノ-もしくはジ-ハロゲン置換ピリジン、モノ-もしくはジ-
ハロゲン置換ジアジン、マレイミド、アジリジン、スルホニルハライド、酸ハラ
イド、ヒドロキシスクシンイミドエステル、ヒドロキシスルホスクシンイミドエ
ステル、イミドエステル、アルキルイミデート、ヒドラジドカルボジイミド、ヒ
ドラジン、アジドニトロフェニル、アジド、３-（２-ピリジルジチオ）-プロピ
オンアミド、グリオキサール及びアルデヒドを含んで良い。

【００４７】標的結合基、反応性基、または反応性部分、例えばここに記載のＲ¹、Ｒ²、及
びＲ⁴基のうちいずれでもが、米国特許第６，０４８，９８２号に記載のように
、例えば、共有結合的にタンパク質、核酸、炭水化物、糖、細胞、及びこれらの
コンビネーション、並びに他の生物学的または非生物学的物質に結合して、これ
らの物質を蛍光性及び検出可能にするような、アミン、ヒドロキシ、及び／また
はスルフヒドリル基に反応性の基であってよい。したがって、記載の通り、本発
明の染料は例えばアビジン、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはレシチンを標識して
、これによって例えばビオチニル化物質、抗原、ハプテン、炭化水素基、ＤＮＡ
、ＲＮＡ、及び相補ＤＮＡもしくはＲＮＡを検出、測定、及び／または定量する
ために使用しても良い。入手可能なアミノ、ヒドロキシル、及びスルフヒドリル
基を用いる、成分の標識のために特に有用なＰ、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ⁴基の特定例
には、以下のものが含まれる。

【００４８】

【化２０】

【００４９】

【化２１】 [式中、ＱまたはＷの少なくとも一つは、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ等の脱離基である。]

【００５０】

【化２２】

【００５１】入手可能なスルフヒドリルを用いて成分を標識するために特に有用であり、二
工程の処理において抗体を標識するために使用可能なＰ（Ｒ³が-（ＣＨ₂）_m-Ｐ
である場合）、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ⁴基の特定例には以下のものが含まれる。

【００５２】

【化２３】 [式中、Ｑは、ＩまたはＢｒ等の脱離基である。]

【００５３】

【化２４】 [式中、ｎは０または１乃至８の整数である。]

【００５４】光によって活性化された架橋による成分の標識のために特に有用である、Ｐ（
Ｒ³が-（ＣＨ₂）_m-Ｐである場合）、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ⁴基の特定の例には、以下
のものが含まれる。

【化２５】

【００５５】標識成分の、水溶性の増大または、サンプル中の不適当な成分への望ましから
ぬ非特定的結合の低減の目的のため、あるいは、蛍光の消光を引き起こしうる、
標識成分上におけるより反応性の発色団二つの間の相互作用を低減するために、
Ｐ（Ｒ³が-（ＣＨ₂）_m-Ｐである場合）、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ⁴基は、周知の電気的
に帯電した化学基から選択可能である。例はＥ-Ｆであって、ここではＦは、ヒ
ドロキシル、ホスフェート、ホスホネート、スルホネート、スルフェート、カル
ボキシレート、置換アミノまたは第四級アミノであり、ここではＥは、-（ＣＨ₂ ）_t-基等のスペーサー基であって、ここではｔは０、１、２、３、４、または５
である。有用な例には低級アルキルスルホネート、例えば-（ＣＨ₂）₄-ＳＯ₃ ^-が
含まれる。

【００５６】別の実施態様においては、本発明は下式（IIIa）及び（IIIb）：

【化２６】 [式中、Ｘ、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、及びＲ₄基は、以下（表２）に示される通りである
。] のｐＨ感受性染料を提供する。

【００５７】

【表２】

【００５８】別の実施態様においては、本研究は下式（IVa）及び（IVb）：

【化２７】のｐＨ感受性染料を提供する。

【００５９】

【表３】

【００６０】別の実施態様においては、本発明は、式（Ｉ）、（Ia）、（II）、（III）、
（IIIa）、（IIIb）、（IV）、（IVa）、及び（IVb）のアセトキシメチルエステ
ル及びアセテートエステルの誘導体を提供する。こうしたエステルは、生物学的
膜等の膜に対して浸透性であり、細胞中に見られるようにエステラーゼによって
加水分解される。本発明の化合物は、細胞浸透性とする誘導または変性を必要と
しない。当業者であれば、本発明の化合物の細胞浸透性の変異性を高く評価し、
これを定法により試験することが出来るであろう。

【００６１】本発明の染料のポリメチン鎖はまた、該ポリメチン鎖の二以上の炭素原子の間
に架橋を形成する、一以上の環状化学基を含んでいても良い。これらの架橋は該
染料の化学的または光安定性の増大に役立ち、該染料の吸光及び発光波長の改変
に、あるいはその吸光係数または量子収量の変更に使用できる。水性環境中にお
ける溶解度特性の改善は、この改変によって得ることができる。

【００６２】別の実施態様においては、本発明は、成分標識された複合体であって、該標識
が式（Ｉ）、（II）、（III）、及び（IV）の化合物であり、該成分が抗体、タ
ンパク質、ペプチド、酵素基質、ホルモン、リンフォカイン、代謝物、受容体、
抗原、ハプテン、レクチン、アビジン、ストレプタビジン、トキシン、炭水化物
、オリゴ糖、多糖類、核酸、誘導デオキシ核酸、ＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフ
ラグメント、誘導ＤＮＡフラグメント、誘導ＲＮＡフラグメント、天然薬剤、合
成薬剤、ウィルス粒子、細菌粒子、ウィルス成分、酵母成分、血液細胞、血液細
胞成分、血漿成分、血清成分、生物学的細胞、単細胞血液成分、細菌、細菌成分
、天然または合成の脂質小胞、毒物、環境汚染物質、ポリマー、ポリマー粒子、
硝子粒子、硝子表面、プラスチック粒子、プラスチック表面、ポリマー膜、導体
または半導体である。

【００６３】本発明のシアニン染料またはその誘導体は、吸収が、好ましくはｐＨ３−１０
にて、更に好ましくはｐＨ３−６にて、４００−８００nmの領域内で最大となる
もの、あるいは５２０−５８０nmまたは６５０−６７０nmの領域内、好ましくは
５３０−５５０nmの範囲内、更に好ましくは５４０−５５０nmの範囲内、最も好
ましくは約５４８nmで最大となり、等吸収点が、４９５−５００nmの範囲内、好
ましくは約４９８nmのものである。

【００６４】本発明のシアニン染料またはその誘導体は、酸性条件下（ｐＨ４−７、好まし
くはｐＨ４−５、最も好ましくはｐＨ４）で最大の蛍光発光をするが、本発明の
化合物には、５０５−５２０nm、好ましくは５１０−５１５、最も好ましくは５
１４nmの波長によって励起された場合に、ｐＨ７．２−１０の範囲内等の塩基性
条件下にて、約５６０−５８０nm、好ましくは５６０−５６５、最も好ましくは
５６４nmで蛍光発光するものがある。当業者には、本発明の染料において、ｎが
増大するにつれて蛍光発光の波長が増大し、同様にｎが減少する場合には蛍光波
長が減少することが認識されるであろう。

【００６５】本発明の染料または誘導体には、好ましくはアルゴンイオンレーザーの５１４
nmのスペクトル系列で最大に励起されうるものがある。しかしながら、本発明の
範疇においては、励起され、一定範囲の波長に亘って蛍光発光しうる染料を設計
することができる。本発明の染料または誘導体の吸光係数は、好ましくは１３０
，０００cm^-1Ｍ^-1より大である。本発明の染料及び誘導体の蛍光は、好ましくは
ｐＨ４とｐＨ１０との間のｐＨに対して感受性であり、水溶性である。

【００６６】別の実施態様においては、本発明は、ｐＨの定性及び／または定量的検出のた
めの蛍光方法を提供する。こうした方法には、本発明の少なくとも一の染料を、
細胞、組織、または生物学的流体の組成物と接触または混合する工程が含まれ、
ここでは蛍光の存在が、酸性の、もしくはことによると塩基性の環境を示す。一
つの実施態様においては、本発明は、準細胞画分、またはオルガネラまたは構造
に包含されるものなどの、細胞内酸性環境の検出方法を提供する。本発明の化合
物または誘導体は、細胞中に能動的または受動的に吸収されても良く、これらは
蛍光検出によって検出可能である。

【００６７】更に別の実施態様においては、本発明は、蛍光検出の方法を提供し、ここでは
本発明の染料または誘導体が示差条件等の酸性条件中において検出され、あるい
は多数の蛍光染料が使用される場合には、本発明の染料または誘導体は、酸性条
件中において発光せず、及び／または現在提供される染料または誘導体の波長に
発光しない染料と共に使用しても良い。

【００６８】上述の通り、本発明はまた、ｐＨ感受性の、濃度依存性の比率的測定方法を提
供し、ここでは、記載の通り少なくとも一組の蛍光染料が、エネルギー移動配置
にて、好ましくはリンカーＬを介して結合しており、ここには任意の標的結合基
が含まれる。こうした複合体染料の少なくとも一つは、本発明のｐＨ感受性染料
の一つである。当業者であれば、こうした染料複合体は、最低でもエネルギー供
与体である染料及びエネルギー受容体である染料を含むことを認識するであろう
。本発明のｐＨ感受性染料がエネルギー供与体である場合、本発明の比率的測定
には、供与体および受容体のそれぞれを励起した後の、受容体発光の蛍光強度の
比率の測定が含まれる。本発明のｐＨ感受性染料がエネルギー受容体である場合
は、供与体および受容体の双方の最大蛍光強度の比率を、供与体種の最大吸収に
おける励起から決定する。

【００６９】本発明の方法は、離して規定された波長、例えば第一及び第二波長にて、それ
ぞれ照明及び検出のための既知の装置を使用しても良い。こうした装置には、こ
れらに限定されるものではないが、蛍光分光計、吸収分光計、蛍光顕微鏡、透過
光顕微鏡、フローサイトメーター、光ファイバセンサー、イムノアッセイ器具、
及びビデオ蛍光造影装置が含まれる。本発明の方法には、以下に記載のものが含
まれる。

【参考文献２】特に、酸性条件で測定が行われる方法が好ましく、ここでは本発明の染料及び
／または誘導体が使用される。

【００７０】本発明の方法はまた、化学分析法を利用して、本発明の染料または誘導体の標
識成分への結合を検出することができる。化学分析方法には、赤外線スペクトル
、ＮＭＲスペクトル、吸収スペクトル、蛍光スペクトル、マススペクトル、及び
クロマトグラフィー方法が含まれる。

【００７１】本発明の染料及び誘導体は、参照のためにその全内容をここに取り込むことと
する、米国特許第５，４８６，２６８号、米国特許第５，４８６，６１６号、及
び米国特許第４，９８１，９７７号に記載の方法等の、当業界において周知の方
法によって調製可能である。本発明の下記の例は、好ましい実施態様を更に説明する。

【００７２】

【実施例】

（実施例１：Ｃｙ３．３９．ＯＨ（化合物１）、その中間体及び誘導体の合成）

【化２８】（１．１：５-スルホ-２，３，３-トリメチルインドレニン（Ｉ）の合成）従来のフィッシャー・インドール合成を、以下のように用いた。メカニカルス
ターラー及び還流コンデンサーを取り付けた２Ｌの三口フラスコに、酢酸（３０
０mL）、３-メチル-２-ブタノン（１６８mL、１．５９mol）、及びｐ-ヒドラジ
ノベンゼンスルホン酸（１００g、０．５３mol）を仕込んだ。該混合物を、３時
間加熱還流させた後、数時間冷却したところピンク色の固体が分離した。２-メチルのシングレットは、Ｄ₂Ｏ中では見られなかったが、nmrをＤＭＳＯ
ｄ₆中で記録した場合には現れた。

【００７３】メタノール中スルホインドレニンの撹拌溶液に、イソプロパノール中、水酸化
カリウムの飽和溶液を添加した。該アルカリ溶液は黄変し、スルホインドレニン
のカリウム塩が、黄色固体として、ほぼ定量的に沈殿した。

【００７４】（１．２：塩を含まないスルホインドレニンの調製）スルホインドレニンのカリウム塩を、水中に溶解し、Dowexの強酸性水素イオ
ン交換樹脂のカラムに通した。カリウムを含まないスルホインドレニンが、褐色
粉末として得られた。このことは、スルホインドレニンが内部塩であり、窒素が
プロトン化されていることを保証するために必須である。

【００７５】（１．３：５-スルホ-１-（γ-カルボキシペンチニル）-２，３，３-トリメチル
インドレニン（II））５-スルホ-２，３，３-トリメチルインドレニン（Ｉ）のカリウム塩と６-ブロ
モヘキサン酸（１．２当量）とを、１．２-ジクロロベンゼン中で混合し、１１
０℃にて１２時間加熱した。混合物を冷却し、１，２-ジクロロベンゼンをデカ
ントし、該固体を、遊離粉末が得られるまでイソプロパノールで擦り込み（trit
urate）した。２-メチルのプロトンは、Ｄ₂Ｏ中では見られなかった。Ｒｆ＝０．２７（逆相
、水）

【００７６】（１．４：中間体４１５（III）の調製）インドレニンの第四級塩（II、５．３g、０．０１５mol）とＮ，Ｎ’ジフェニ
ルホルムアミジン（３．３g、０．０１７mol）との酢酸（２０mL）中の混合物を
、加熱還流させた。反応の完了を、メタノール中における吸収スペクトルでモニ
ターしたところ、これは反応が進むにつれ、２８６nmでの吸収極大がほとんど消
失点まで下降し、４１５nmにおける吸収が、相応じて上昇したことを示した（約
３−４時間）。加熱を延長すると、対称的な染料がいくらか産生した（＞５％）
。酢酸を回転エバポレーターで除去し、粗製の橙色粉末を即座に次の反応に使用
した。λmax（水）＝４１５nmであり、反応混合物の少量部を、溶離剤として水
−メタノールを使用し、逆相１８Ｃカラムで精製した。

【００７７】（１．５：染料Ｃｙ３．３９．ＯＨの調製）中間体（III、５．９g、０．０１３mol）を無水酢酸（２５mL）及びピリジン
（２５mL）中に再溶解させた。該混合物を４１５nmにおける吸収がほとんど即時
に喪失するまで加温したところ、更なるバンドが３８５nmに現れた。インドレニ
ン（カリウムを含まない）（５．３g、０．０１５mol）を添加し、該混合物を、
３８５nmにおける吸収極大がほとんど消失するまで、１１０℃に加熱した。これ
を冷却し、染料をエチルエーテルで沈殿させた。イソプロパノール（×１０mL）
で洗浄した後、濾過によって固体を回収し、溶離剤として水：メタノール混合物
を使用して逆相１８Ｃで精製した（２．３g、収率２８％）。

【００７８】二つの対称的な染料、Ｃｙ３．１８．ＯＨ（スルホインドレニン（II）から）
及びジスルホ-ＤｉＩ-（３）（スルホインドレニン（Ｉ）から）もまた、副生成
物として得られた。ＴＬＣＲＰ-Ｃ１８（水：メタノール-８．５：１．５）Ｒｆ＝０．６５、Ｃｙ３．１８．ＯＨ０．５０、Ｃｙ３．３９．ＯＨ０．４４、ジスルホ-ＤｉＩ-（３）

【００７９】（１．６：Ｃｙ３．３９．ＯＨのスクシンイミジルエステル）典型的実験においては、カルボキシアルキルスルホシアニンを無水ＤＭＦ（２
mL／染料１００mg）と無水ピリジン（０．１mL／染料１００g）との混合物中に
溶解させた。ジスクシンイミジルカルボネート（ＤＳＣ）（１．５当量）を添加
し、該混合物を、窒素下、５５−６０℃にて９０分間撹拌した。該混合物を無水
エチルエーテルで希釈した後、上澄み液をデカントした。生成物をエチルエーテ
ルで繰り返し洗浄し、濾過した。シアニン活性エステルが、ほぼ定量的収量で得
られた。

【００８０】（１．７：Ｃｙ３．３９．ＯＳｕの抗体との反応）Ｃｙ３．３９活性エステルの原液を、無水ＤＭＦ中に調製した（１mg／１００
μL）。１mgのヒツジＩｇＧ（６．４５mM）を２５０μLの０．１M炭酸水素塩緩
衝液（ｐH９．４）中に溶解させ、渦状に激しく撹拌しつつ所望の量の染料を添
加した。反応混合物を、室温に１５分間維持した。非縮合染料を、溶離剤として
ｐＨ７の緩衝溶液を使用し、Sephadex G-50（０．７×２０cm カラム）を用い
たゲル浸透クロマトグラフィーによって、タンパク質から分離した。

【００８１】（実施例２：Ｃｙ３．１（化合物２）の合成）

【化２９】ピリジン（５mL）中、２，３，３-トリメチルインドレニン-５-スルホネート
（２mmoL）とエチルオルトフォルメート（１mmoL）との混合物を、１０分間加熱
還流させた。反応混合物を冷却し、数体積の無水エーテルで希釈し、アイスバス
中で冷却した。硝子ロッドでスクラッチすることにより生成物が赤色粉末として
固化し、これを濾紙で回収して乾燥させた（収率６０％）。生成物は、ＴＬＣに
よってほとんど純粋であることが示された（Ｒｆ＝０．４４、Ｃ１８逆相プレー
ト、水／メタノール、８：２v/v）。Ｃｙ３．１のピリジニウム塩を水中に溶解
させ、Dowexの強酸性水素イオン交換樹脂のカラムに通した。

【００８２】あるいはまた、該染料はスルホインドレニン（Ｉ）をエチルオルトフォルメー
トと共に酢酸中で２時間加熱することによっても得られる。酢酸を、減圧下、回
転エバポレーターにて除去し、残留物に無水エチルエーテルを擦り込みしたとこ
ろ、赤色固体を得、これをＣ１８逆相フラッシュカラムクロマトグラフィーで精
製した（収率２５％）。

【００８３】（実施例３：Ｃｙ３．３９．ＯＨ（化合物３）及びそのスクシンイミジルエステ
ルの合成）

【化３０】該染料及びそのスクシンイミジルエステルを、Ｃｙ３．３９．ＯＨについて記
載された操作に従って調製した。該染料は水に不溶性であった。その水溶性デキ
ストラン複合体を下記の通り調製した。

【００８４】０．０２Mのカーボネート緩衝液中のアミノデキストラン（Ｍｒ４０，０００
、デキストラン分子当たりおよそ７．２のアミノ基）（８．５mg、０．２mmoL）
の溶液に無水ＤＭＦ中の活性エステル（２mg）の溶液を添加した。該混合物を室
温にて３０分間撹拌した。染料−デキストラン複合体を、非複合染料から、溶離
緩衝液として酢酸アンモニウム（５０mM）を使用し、Sephadex G-50ゲル浸透ク
ロマトグラフィーによって分離した。平均２．２の染料分子が、各デキストラン
分子に共有結合的に結合した。

【００８５】（実施例４：５-（カルボキシメチル）-２-[１Ｅ，３Ｅ）-５-（３，３-ジメチ
ル-５-スルホ-１，３-ジヒドロ-２Ｈ-インドール-２-イリデン）-１，３-ペンタ
ジエニル]-３，３-ジメチル-１-（４-スルホブチル）-３Ｈ-インドリウム（化合
物４））

【化３１】

【００８６】（４．１：５-カルボキシメチル-２，３，３-トリメチル-１-（４-スルホブチル
）-３Ｈ-インドリウム）５-カルボキシメチル-２，３，３-トリメチル=インドール（１００mg、０．３
８mmol）及び１，４-ブタンスルトン（４３μl、０．４１８mmol）を、１mlのブ
チロニトリル中に溶解させ、１２０℃にて２４時間加熱した。ピンク色の固体が
、溶液から析出した。該溶液を冷却し、固体を濾過によって除去した。新たに準
備したブチロニトリルで洗浄し、乾燥させることで生成物を得た（１２２mg、９
１％）。

【００８７】（４．２：５-（カルボキシメチル）-２-[１Ｅ，３Ｅ）-５-（３，３-ジメチル-
５-スルホ-１，３-ジヒドロ-２Ｈ-インドール-２-イリデン）-１，３-ペンタジ
エニル]-３，３-ジメチル-１-（４-スルホブチル）-３Ｈ-インドリウム５-カルボキシメチル-２，３，３-トリメチル-１-（４-スルホブチル）-３Ｈ-
インドリウム（１００mg、０．２７mmol）、５-スルホ-２，３，３-トリメチル
インドレニン（６９．３mg、０．２７mmol）及びマロンアルデヒド=ビス（フェ
ニルイミン）モノヒドロクロライド（７０mg、０．２７mmol）を、Ｎ，Ｎ-ジメ
チルホルムアミドに溶解させた。この溶液に、安息香酸（６６mg、０．５４mmol
）及び無水安息香酸（１２２mg、０．５４mmol）を添加した。この溶液を、９０
℃にて３時間加熱したところ、暗青色の溶液を生じた。該反応を、アニル中間体
の吸収（４５４nm）が観察されなくなるまでＵＶでモニターした。該溶液を冷却
し、真空中で溶媒を除去した。染料を、Rainin Dynamax ６０Å Ｃ１８カラムを
使用し、１０ml/分にて、１５％のＢを５分間から、７５分間に亘って１５％乃
至５０％のＢに傾斜させる溶媒勾配で、逆相ＨＰＬＣにより精製したが、ここで
はＡ＝Ｈ₂Ｏ（０．１％酢酸）及びＢ＝アセトニトリル（０．１％酢酸）である
。カラム持続時間は３３分間であった（６５０nmのＵＶ）。

【００８８】（４．３：化合物４（Ｎ-ヒドロキシスクシンイミジルエステル））遊離酸（１mg、１．５μmol）を、無水ＤＭＳＯ（１００μL）中に溶解させた
。この溶液に、ベンゾトリアゾール-１-イル-オキシ-トリス-ピロリジノホスホ
ニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）（０．７８mg、１．５μmol
）、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド（０．２mg、１．５μmol）及びジイソプロピ
ルエチルアミン（０．２５μl、１．５μmol）を添加した。該溶液は赤変した。
該溶液を、１時間室温にて撹拌した。反応混合物を、遊離酸の場合と同様の条件
を利用してＨＰＬＣによって精製した。スクシンイミジルエステルのカラム持続
時間は、４５分間であった（ＵＶ６５０nm）。ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ m/z＝７２５
（１００％）、Ｃ₃₅Ｈ₄₁Ｎ₃Ｏ₁₀Ｓ₂についてＭ⁺＝７２７。

【００８９】（実施例５：２-｛１Ｅ，３Ｅ）-５[５-（カルボキシメチル）-３，３-ジメチル
-１，３-ジヒドロ-２Ｈ-インドール-２-イリデン]-１，３-ペンタジエニル｝-１
-エチル-３，３-ジメチル-５-スルホ-３Ｈ-インドリウム（化合物５））

【化３２】

【００９０】（５．１：１-エチル-２，３，３-トリメチル-３Ｈ-インドリウム-５-スルホネ
ート）５-スルホ-２，３，３-トリメチルインドレニン（カリウム塩）（１１g、０．
０４mol）をヨウ化エチル（４０ml）中に懸濁させ、該反応物を２４時間還流さ
せた。該混合物を冷却し、過剰のヨウ化エチルをデカントした。明紫色の固体に
アセトンを擦り込みし（３×５０ml）、ヨウ化カリウムを除去した。該粉末を乾
燥させた。

【００９１】（５．２：２-｛１Ｅ，３Ｅ）-５[５-（カルボキシメチル）-３，３-ジメチル-
１，３-ジヒドロ-２Ｈ-インドール-２-イリデン]-１，３-ペンタジエニル｝-１-
エチル-３，３-ジメチル-５-スルホ-３Ｈ-インドリウム）１-エチル-２，３，３-トリメチル-３Ｈ-インドリウム-５-スルホネート（２
０mg；０．０７４５mmol）、マロンアルデヒド=ビス（フェニルイミン）（２１
．２２mg；０．０８２mmol）及び無水酢酸（１ml）を１２０℃にて２４時間。減
圧下で溶媒を除去し、アニルが赤色固体として得られた。そこで５-カルボキシ
メチル-２，３，３-トリメチルインドール（１６．２mg；０．０７４５mmol）を
添加し、粗製の混合物をピリジン、酢酸、無水酢酸の溶液（比４．５：４．５：
０．５）に溶解させた。該溶液を、７０℃にて一晩撹拌した。これを冷却し、減
圧下で溶媒を除去したところ、青色固体が得られ、これを逆相ＨＰＬＣによって
精製して、複合体５を得た（６０％）。ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦm/z＝５１８（１００
）、Ｃ₂₉Ｈ₃₂Ｎ₂Ｏ₅ＳについてＭ⁺＝５２０、ＵＶ（Ｈ₂Ｏ／Ｈ⁺）λ_max６５０nm
。

【００９２】（５．３：化合物５（Ｎ-ヒドロキシスクシミジルエステル））遊離酸（１mg、２．２μmol）をＤＭＦ（１００μl）中に溶解させた。この溶
液に、ジイソプロピルエチルアミン（１μl）及びＯ-（Ｎ-スクシンイミジル）-
Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’-ビス（テトラメチレン）-ウロニウムヘキサフルオロホスフ
ェート(１．４当量)を添加した。該溶液を３０分間撹拌して１０mgが得られた。
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦm/z＝６１８（１００％）、Ｃ₃₃Ｈ₃₅Ｎ₃Ｏ₇ＳについてＭ⁺＝
６１７。

【００９３】（実施例６：２-｛[（Ｅ）-５-（カルボキシメチル）-３，３-ジメチル-１，３-
ジヒドロ-２Ｈ-インドール-２-イリデン]-１-プロペニル｝-３-（４-スルホブチ
ル）-１，３-ベンゾチゾール-３-イウム（化合物６））

【化３３】

【００９４】（６．１：２-メチル-３-（４-スルホブチル）-１，３-ベンゾチアゾール-３-イ
ウム）２-メチル-ベンゾチアゾール（１００μl、０．５７mmol）及び１，４-ブタン
スルトン（５９μl、０．５７mmol）を、ブチロニトリル（２ml）中に溶解した
。該混合物を１２０℃にて２４時間撹拌したところ、ピンク色の沈殿物が生成し
た。固体を濾過し、新たに準備したブチロニトリル及びジエチルエーテルで洗浄
した。

【００９５】（６．２：２-[（Ｅ）-５-（カルボキシメチル）-３，３-ジメチル-１，３-ジヒ
ドロ-２Ｈ-インドール-２-イリデン]-１-プロペニル｝-３-（４-スルホブチル）
-１，３-ベンゾチゾール-３-イウム）２-メチル-３-（４-スルホブチル）-１，３-ベンゾチアゾール-３-イウム（１
０mg、３５μmol）、５-カルボキシメチル-２，３，３-トリメチルインドール（
８mg；３５μmol）、及びＮ，Ｎ’-ジフェニルホルムアミジン（７．５mg、３８
．５μmol）を、アセトニトリル中７０℃にて撹拌した。ここに、安息香酸（８m
g、７０μmol）及び無水安息香酸（１５mg、７０μmol）を添加した。該溶液を
４時間加熱した後に冷却した。アセトニトリルを真空中で除去したところ、暗い
ピンク色のゴムが生成した。これを、Rainin Dynamax ６０Å Ｃ１８カラムを使
用し、１０ml/分にて、１５％のＢを５分間から、７５分間に亘って１５％乃至
５０％のＢに傾斜させる溶媒勾配で、逆相ＨＰＬＣによって精製したが、ここで
はＡ＝Ｈ₂Ｏ（０．１％酢酸）及びＢ＝アセトニトリル（０．１％酢酸）である
。ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦＭ⁺＝５１１（１００％）。

【００９６】（実施例７：３-（５-（カルボキシペンチル）-２[１Ｅ，３Ｅ）-５-（３，３-
ジメチル-５-スルホ-１，３-ジヒドロ-２Ｈ-インドール-２-イリデン）-１，３-
ペンタジエニル]-１，３-ベンゾチアゾール-３-イウム（化合物７））

【化３４】

【００９７】（７．１：３-（５-カルボキシペンチル）-２-メチル-１，３-ベンゾチアゾール
-イウム=ブロミド）２-メチルベンゾチアゾール（１００μl、０．５７mmol）を、トルエン（１ml
）中に６-ブロモヘキサン酸（１２３mg、０．６３mmol）と共に溶解させた。該
溶液を２４時間還流させた。該溶液を冷却したところ、淡色固体を生成した。こ
れを濾過し、冷温トルエンで、次いでジエチルエーテルで洗浄した。収率５８％
。

【００９８】（７．２：３-（５-（カルボキシペンチル）-２[１Ｅ，３Ｅ）-５-（３，３-ジ
メチル-５-スルホ-１，３-ジヒドロ-２Ｈ-インドール-２-イリデン）-１，３-ペ
ンタジエニル]-１，３-ベンゾチアゾール-３-イウム）５-スルホ-２，３，３-トリメイチルインドレニン（１２０mg、０．４６mmol
）を、ピリジン：酢酸：及び無水酢酸の１：１：０．２混合物中、１２０℃にて
撹拌した。マロンアルデヒド=ビス（フェニルイミン）モノヒドロクロライド（１２０mg
、０．４６mmol）をゆっくりと添加し、反応物を３０分間撹拌した。１-（５-カ
ルボキシペンチル）-２-メチル-ベンゾチアゾール-３-イウムブロミド（１２２m
g、０．４６mmol）を、ピリジン：酢酸：及び無水酢酸の１：１：０．２混合物
（１ml）中に溶解させ、これを反応混合物に、３０分毎に１００μlずつ添加し
た。反応物を一晩加熱し、冷却したところ暗青色の溶液を得た。ＴＬＣ（２０％
メタノール／ＣＨ₂Ｃｌ₂）により、ｐＨ感受性Ｃｙ５の存在が示された。該溶液
を、Rainin Dynamax ６０Å Ｃ１８カラムを使用し、１０ml/分にて、１５％の
Ｂを５分間から、７５分間に亘って１５％乃至５０％のＢに傾斜させる溶媒勾配
で、逆相ＨＰＬＣによって精製したが、ここではＡ＝Ｈ₂Ｏ（０．１％酢酸）及
びＢ＝アセトニトリル（０．１％酢酸）である。カラム持続時間は５０．６分間
であった。ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ m/z＝５３７（１００％）、Ｃ₂₈Ｈ₃₂Ｎ₂Ｏ₅Ｓ₂に
ついてＭ⁺＝５４０。

【００９９】（実施例８：５-（アミノメチル）-２-[１Ｅ，３Ｅ）-５-（３，３-ジメチル-５
-スルホ-１，３-ジヒドロ-２Ｈ-インドール-２-イリデン）-１，３-ペンタジエ
ニル]-１，３，３-トリメチル-３Ｈ-インドリウム（化合物８））

【化３５】

【０１００】（８．１：５-[１，３-ジオキソ-１，３-ジヒドロ-２Ｈ-イソインドール-２-イ
ル）メチル]-１，２，３，３-テトラメチル-３Ｈ-インドリウム）２-メチレン-１，３，３-トリメチルインドレニン（１００g、０．５７５mmol
）を０℃にてゆっくりと濃硫酸（５００ml）に添加した。これを１時間撹拌し、
Ｎ-（ヒドロキシメチル）-フタルイミド（１００g、０．５６５mol）を０℃にて
２時間に亘って１０gずつ添加した。反応物を７０時間撹拌したところ、橙色溶
液を得た。これを５００gの氷上に注いだ。濃アンモニア溶液（７５０ml）を蒸
留水（７５０ml）で希釈し、０℃にてクエンチした反応混合物にゆっくりと添加
した。中和に際して、該水溶液は黄変した。これをクロロホルムで抽出し、有機
層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して減圧下で溶媒を除去した。生成物をメ
タノール／クロロホルムから再結晶し、１３０gの生成物を得た。収率６８％。

【０１０１】（８．２：２-[１Ｅ，３Ｅ）-５-（３，３-ジメチル-５-スルホ-１，３-ジヒド
ロ-２Ｈ-インドール-２-イリデン）-１，３-ペンタジエニル]-５-[（１，３-ジ
オキソ-１，３-ジヒドロ-２Ｈ-イソインドール-２-イル）メチル]-１，３，３-
トリメチル-３Ｈ-インドリウム）５-[１，３-ジオキソ-１，３-ジヒドロ-２Ｈ-イソインドール-２-イル）メチ
ル]-１，２，３，３-テトラメチル-３Ｈ-インドリウム（２０mg、０．０６mmol
）、５-スルホ-２，３，３-トリメチルインドレニン（１５．４mg、０．０６mmo
l）及びマロンアルデヒド=ビス（フェニルイミン）モノヒドロクロライド（１７
mg、０．０６６mmol）を、Ｎ，Ｎ’-ジメチルホルムアミジン中、９０℃にて撹
拌した。ここに、安息香酸（８mg、０．０６６mmol）及び無水安息香酸（１５mg
、０．０６６mmol）を添加した。該溶液を３時間加熱した後に冷却したところ、
暗青色の溶液を得た。逆相分析ＨＰＬＣ（流速１ml/分）により精製した。溶媒
勾配は１５％のＢを５分間から、７５分間に亘って１５％乃至５０％のＢへの傾
斜とし、ここではＡは水（０．１％酢酸）及びＢはアセトニトリル（０．１％酢
酸）である。該生成物についてのカラム持続時間は、４２．７分間であった。収
率２３％。ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ m/z＝６０９（１００％）、Ｃ₃₅Ｈ₃₅Ｎ₃Ｏ₅Ｓに
ついてＭ⁺＝６０９。

【０１０２】（８．３：５-（アミノメチル）-２-[１Ｅ，３Ｅ）-５-（３，３-ジメチル-５-
スルホ-１，３-ジヒドロ-２Ｈ-インドール-２-イリデン）-１，３-ペンタジエニ
ル]-１，３，３-トリメチル-３Ｈ-インドリウム）フタルイミド保護生成物（セクション８．２参照）を、エタノール中に溶解さ
せた。四倍過剰のヒドラジン水和物を添加したところ、即座に該溶液は赤色とな
った。反応混合物を室温にて２時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、藤色固体
を蒸留水中に溶解した。これを逆相分析ＨＰＬＣ（流速１ml/分）により精製し
た。溶媒勾配は１５％のＢを５分間から、７５分間に亘って１５％乃至５０％の
Ｂへの傾斜とし、ここではＡは水（０．１％酢酸）及びＢはアセトニトリル（０
．１％酢酸）である。該生成物についてのカラム持続時間は、３７分間であった
。収率４０％。ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ m/z ４７９（１００％）、Ｃ₂₇Ｈ₃₃Ｎ₃Ｏ₃Ｓ
についてＭ⁺＝４７９。

【０１０３】（実施例９：１-（５-カルボキシペンチル）-２-[１Ｅ，３Ｅ）-５-（１，１-ジ
メチル-６-８-ジスルホ-１，３-ジヒドロ-２Ｈ-ベンゾ[エ]インドール-２-イリ
デン）-１，３-ペンタジエニル]-３，３-ジメチル-５-スルホ-３Ｈ-インドリウ
ム（化合物９））

【化３６】

【０１０４】（９．１：６-ヒドラジノナフタレン-１，３-ジスルホネート）２-ナフチルアミン-５，７-ジスルホン酸（１０g、０．０３３mol）を、５０
％塩酸（２００ml）中に懸濁させた。これを０−５℃にて撹拌した。蒸留水（１
５ml）中の硝酸ナトリウム（２．５g、０．０３６mmol）を滴々と添加した。ス
タンノスクロライド（１０ml c.ＨＣｌ中、８．２g、０．０３６mol）を、撹拌
した混合物に、５℃より高温にて滴々と添加した。反応混合物を１時間撹拌した
。生成物を減圧下で濃縮し、高温の２-プロパノールで擦り込みしたところ淡色
粉末を得た。

【０１０５】（９．２：１，１，２-トリメチル-６，８-ジスルホ-ベンゾ[エ]インドール）６-ヒドラジノナフタレン=１，３-ジスルホネート（６．２g、０．０２mol）
、メチルイソプロピルケトン（６．４ml、０．０６mol）、酢酸カリウム（５．
８８g、０．０６mol）および氷酢酸（３５ml）を、１３５℃にて２４時間還流さ
せた。酢酸を真空中で除去し、該固体を２-プロパノールと共に撹拌したところ
、淡黄色粉末を得た。

【０１０６】（９．３：１-（５-カルボキシペンチル）-２-[１Ｅ，３Ｅ）-５-（１，１-ジメ
チル-６-８-ジスルホ-１，３-ジヒドロ-２Ｈ-ベンゾ[エ]インドール-２-イリデ
ン）-１，３-ペンタジエニル]-３，３-ジメチル-５-スルホ-３Ｈ-インドリウム
）１，１，２-トリメチル-６，８-ジスルホ-ベンゾ[エ]インドール（２０mg、０
．０５４mmol）、１-（５-カルボキシペンチル）-５-スルホ-２，３，３-トリメ
チルインドール（１９mg、０．０５４mmol）及びマロンアルデヒド=ビス（フェ
ニルイミン）（１５mg、０．０６mmol）を、酢酸、ピリジン、及び無水酢酸の１
：１：０．２混合物中、７０℃にて４時間撹拌し、暗青色溶液を得た。この溶液
を冷却した。染料を逆相分析ＨＰＬＣ（流速１ml/分）により精製した。溶媒勾
配は１５％のＢを５分間から、７５分間に亘って１５％乃至５０％のＢへの傾斜
とし、ここではＡは水（０．１％酢酸）及びＢはアセトニトリル（０．１％酢酸
）である。該生成物についてのカラム持続時間は、３１分間であった（６５５nm
でのＵＶ）。ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ m/z＝７５８（１００％）、Ｃ₃₅Ｈ₃₈Ｎ₂Ｏ₁₁Ｓ ₃ についてＭ⁺＝７５８。

【０１０７】（実施例１０：２-[１Ｅ，３Ｅ）-５-（３，３-ジメチル-５-スルホ-１，３-ジ
ヒドロ-２Ｈ-インドール-２-イリデン）-１，３-ペンタジエニル]-１-（６-ヒド
ラジノ-６-オキソヘキシル）-３，３-ジメチル-５-スルホ-３Ｈ-インドリウム（
化合物１０））

【化３７】

【０１０８】（１０．１：１-（５-カルボキシペンチル）-２-[１Ｅ，３Ｅ）-５-（３，３-ジ
メチル-５-スルホ-１，３-ジヒドロ-２Ｈ-インドール-２-イリデン）-１，３-ペ
ンタジエニル]-３，３-ジメチル-５-スルホ-３Ｈ-インドリウム）１-（５-カルボキシ-ペンチル-１，３，３-トリメチル-インドリウム-５スル
ホネート（１００mg、０．２８mmol）を、アセトニトリル中に５-スルホ-２，３
，３-トリメチルインドレニン（７３mg、０．２８mmol）及びマロンアルデヒド=
ビス（フェニルイミン）（７９mg、０．３１mmol）と共に溶解させた。安息香酸
（６８mg、５６mmol）及び安息香酸無水物（１２７mg、０．５６mmol）を該溶液
に添加し、反応混合物を８０℃にて２時間撹拌した。暗青色溶液を冷却し、減圧
下で溶媒を除去した。残留固体をＤＭＳＯ中に溶解させ、溶液を、Rainin Dynam
ax ６０Å Ｃ１８カラムを使用し、１０ml/分にて、１５％のＢを５分間から、
７５分間に亘って１５％乃至５０％のＢに傾斜させる溶媒勾配で、逆相ＨＰＬＣ
によって精製したが、ここではＡ＝Ｈ₂Ｏ（０．１％酢酸）及びＢ＝アセトニト
リル（０．１％酢酸）である。カラム持続時間は４１分間であった（Vis.６５０
nm）。ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ m/z＝６２７．５（１００％）、Ｃ₃₁Ｈ₃₈Ｎ₂Ｏ₈Ｓ₂に
ついてＭ⁺＝６３０。

【０１０９】（１０．２：２-[１Ｅ，３Ｅ）-５-（３，３-ジメチル-５-スルホ-１，３-ジヒ
ドロ-２Ｈ-インドール-２-イリデン）-１，３-ペンタジエニル]-１-（６-ヒドラ
ジノ-６-オキソヘキシル）-３，３-ジメチル-５-スルホ-３Ｈ-インドリウム）１-（５-カルボキシペンチル）-２-[１Ｅ，３Ｅ）-５-（３，３-ジメチル-５-
スルホ-１，３-ジヒドロ-２Ｈ-インドール-２-イリデン）-１，３-ペンタジエニ
ル]-３，３-ジメチル-５-スルホ-３Ｈ-インドリウム（５mg、７．９μmol）をＤ
ＭＳＯ（２００μl）中に溶解させた。この溶液に、ジイソプロピルエチルアミ
ン（５μl）、ベンゾトリアゾール-１-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホ
ニウム=ヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）（４．４mg、７．９μmol）
、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド（１mg、７．９μmol）およびヒドラジンヒドレ
ート（０．２μl、２当量）を添加した。明赤色溶液を１時間撹拌した。該プロ
ーブを、逆相分析ＨＰＬＣ（流速１ml/分）により精製した。溶媒勾配は１５％
のＢを５分間から、７５分間に亘って１５％乃至５０％のＢへの傾斜とし、ここ
ではＡは水（０．１％酢酸）及びＢはアセトニトリル（０．１％酢酸）である。
該生成物についてのカラム持続時間は、１８分間であった（６５０nmでのＵＶ）
。ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ m/z＝６４１（１００％）、Ｃ₃₁Ｈ₄₀Ｎ₄Ｏ₇Ｓ₂についてＭ ⁺ ＝６４４。

【０１１０】（実施例１１：ｐＨ感受性Ｃｙ３−Ｃｙ５エネルギー移動カセット（化合物１１
））

【化３８】

【０１１１】（１１．１：Ｃｙ５（登録商標）：１-（５-カルボキシペンチル）-２-[１Ｅ，
３Ｅ）-５-（１-エチル-３，３-ジメチル-５-スルホ-１，３-ジヒドロ-２Ｈ-イ
ンドール-２-イリデン）-１，３-ペンタジエニル]-３，３-ジメチル-５-スルホ-
３Ｈ-インドリウム）Ｃｙ５を、Bioconjugate Chemistry, Volume 4, Number 2, page 105, (1993)
に記載の方法に従って調製した。１-エチル-２，３，３-トリメチル-３Ｈ-イン
ドリウム-５-スルホネート（４g、０．０１５mol）及びマロンアルデヒド=ビス
（フェニルイミン）モノヒドロクロライド（４．４g、０．０１７mol）を酢酸（
２０ml）及び無水酢酸（２０ml）中で４時間還流させた。ピリジン（２０ml）及
び１-（５-カルボキシペンチル-１，３，３-トリメチルインドレンイニウム-５-
スルホネート（５．３g、０．０１５mol）を該溶液に添加し、該反応物を更に３
時間加熱した。生成物を２-プロパノールで洗浄し、逆相クロマトグラフィーに
より精製した。

【０１１２】（１１．２：Ｃｙ５-リシン-ｆｍｏｃ）Ｃｙ５（５０mg、０．０７２mmol）をジメチルスルホキシド（２ml）中に溶解
させた。Ｎ，Ｎ-ジイソプロピルエチルアミン（４０ml）及びＯ-，-Ｎ-スクシン
イミジル-Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’-ビス（テトラメチレン）ウロニウム=ヘキサフル
オロホスフェート（７４mg、０．１８mmol）を添加し、反応物を３０分間撹拌し
た。反応混合物を、ジエチルエーテルでクエンチし、濾過して酢酸エチルで擦り
込みして、細かい青色粉末として生成物を得た。該固体をジメチルスルホキシド
（２ml）中に溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（４０ml）及びＮ-（９-フ
ルオレニルメトキシカルボニル）-Ｌ-リシン（４０mg、０．１mmol）を添加した
。これを室温にて一晩撹拌した。生成物を、Ｃ₁₈ＶＹＤＡＣカラムを使用し、３
０分間に亘ってＢを２０％乃至４０％に傾斜させて分析逆相ＨＰＬＣによって精
製したが、ここではＡは水／０．１％トリフルオロ酢酸、Ｂはアセトニトリル／
０．１％トリフルオロ酢酸である。該生成物についてのカラム持続時間は、３３
分間であった。ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ m/z＝１００７（１００％）、Ｍ⁺＝Ｃ₅₄Ｈ₆₃ Ｎ₄Ｏ₁₁Ｓ₂。

【０１１３】（１１．３：Ｃｙ５-Ｌｙｓ）Ｃｙ５-Ｌｙｓ-ｆｍｏｃ（５mg、４．９μmol）を、４：１ＤＭＳＯ／ピペリ
ジン（２００μl）中に溶解させた。これを２時間撹拌した。該染料を、逆相分
析ＨＰＬＣ（流速１ml/分）により精製した。溶媒勾配は１５％のＢを５分間か
ら、７５分間に亘って１５％乃至５０％のＢへの傾斜とし、ここではＡは水（０
．１％酢酸）及びＢはアセトニトリル（０．１％酢酸）である。該生成物につい
てのカラム持続時間は、２６分間であった（６５５nmでのＵＶ）。ＭＡＬＤＩ-
ＴＯＦ m/z＝７８４（１００％）、Ｃ₃₉Ｈ₅₄Ｎ₄Ｏ₉Ｓ₂についてＭ⁺＝７８６。

【０１１４】（１１．４：ｐＨ感受性Ｃｙ３−Ｃｙ５エネルギー移動カセット）Ｃｙ５-Ｌｙｓ（１mg、１．２μmol）及びＣｙ３．３９のＮＨＳエステル（化
合物３、表１）（０．８９mg、１．２μmol）を、２００μlのＤＭＳＯ及びジイ
ソプロピルエチルアミン（１μl）中で２時間撹拌した。該溶液を、逆相分析Ｈ
ＰＬＣ（流速１ml/分）により精製した。溶媒勾配は１５％のＢを５分間から、
７５分間に亘って１５％乃至５０％のＢへの傾斜とし、ここではＡは水（０．１
％酢酸）及びＢはアセトニトリル（０．１％酢酸）である。該生成物についての
カラム持続時間は、３３．５分間であった（６５５nmでのＵＶ）。ＭＡＬＤＩ-
ＴＯＦ m/z＝１３７６（１００％）、Ｃ₆₈Ｈ₈₈Ｎ₆Ｏ₁₆Ｓ₄についてＭ⁺＝１３７
４。

【０１１５】（実施例１２：ｐＨ感受性シアニン染料の蛍光特性）化合物Ｃｙ３．３９及び化合物４−１０の等モル溶液を、リン酸緩衝液（ｐＨ
５．８５−９．８６）の範囲に調製した。各染料の蛍光及びＵＶ吸収特性を、様
々なｐＨにて観察した。これらの特性を、表４に示した。

【０１１６】

【表４】

【０１１７】ｐＫａを、測定したｐＨにおける発光強度と、最大発光についての発光強度と
の比、もしくはＩ／Ｉ₀として測定した。これを、Ｓ字形曲線適合を使用し、実
施例７について図５に示した。ｐＫａは、Ｉ／Ｉ₀＝０．５、または蛍光プロー
ブが５０％プロトン化された際に算出できた。

【０１１８】（実施例１３：ｐＨ感受性エネルギー移動プローブの蛍光特性）リシンリンカーを介して有限距離に保たれたｐＨ感受性供与体Ｃｙ３と蛍光受
容体Ｃｙ５とからなる、タンデム染料エネルギー移動カセットの蛍光特性を調査
した。等モル濃度のプローブを、様々なｐＨのリン酸緩衝液中に調製した。図６
は、様々なｐＨにおけるプローブの、５３０nmにて励起された際の蛍光スペクト
ルを示す。該プローブがより酸性の弱い、または塩基性の強い環境中にある場合
に、ｐＨ感受性供与体の蛍光発光（Ｃｙ３、５６０nm）が低減されることが観察
された。このように、Ｃｙ３ｐＨ感受性供与体から非ｐＨ感受性Ｃｙ５受容体染
料（６６０nmにて増感）へのエネルギー移動の有効性もまた、５．８−９．２の
生理学的ｐＨ範囲に亘って低減された。このプローブを、受容体の励起波長（６
３０nm）にて励起することにより、５．８−９．２の生理学的ｐＨ範囲に亘って
、強度にほとんど変化のない（±５０nm）の発光が、６６０nmにて観察された（
図７）。

【０１１９】（実施例１４：ｐＨ感受性Ｃｙ５（登録商標）（化合物４）を使用した細胞内在
化アッセイ）（１４．１：方法）ＣＨＯＭ１細胞を、３cmのガラス底で組織培養を５０％の集密度で被覆したデ
ィッシュに接種した。該細胞を、１０％胎子牛血清及び２mMグルタミンを含有す
るＦ１２ハム媒体中で培養した。該細胞を２０分間氷上でインキュベートし、血
清を含まないＦ１２中で二度洗浄した後、０．１mg/mlの化合物４Ｎ-ヒドロキ
シスクシンイミジルエステルと共に４℃にて１．５時間インキュベートした。該
細胞を血清を含まない媒体で洗浄し、即座にZeiss LSM410 共焦点形顕微鏡（６
３倍油浸レンズ）を使用して、６３３nm励起及び６６５nm発光（内在化前）を分
析した。該細胞を、構成エンドサイトーシスにより内在化するように、３７℃に
て１時間インキュベートすることによって刺激した。これらを同様の共焦点形顕
微鏡条件を使用して分析した（内在化後）。

【０１２０】（４．２：結果）ｐＨ感受性染料が中性の周囲媒体（およそｐＨ７．４）から、細胞内の酸性小
胞（ｐＨ５．５−６．０）中に内在化するにつれ、細胞蛍光において、著しい増
大が観察された。同様の方法でＣｙ３-ＮＨＳエステルと共にインキュベートさ
れた細胞は、内在化を伴う蛍光において、平行して増大を示さない。染料の細胞
中への内在化を、Zeiss LSM410 共焦点形顕微鏡を使用し、細胞中で連続的にｚ
セクションを検査することにより明らかにした。

【０１２１】ここに挙げた全ての参考文献は、その全体を参照のためにここに取り込むこと
とする。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明による例示化合物Ｃｙ３．３９のｐＨ３からｐ
Ｈ９．５までにおける吸光スペクトルを示す。

【図２】図２は、本発明による例示化合物Ｃｙ３．３９のｐＨ４．０か
らｐＨ９．５までの範囲に亘り、励起波長が５１４nmである吸光スペクトルを示
す。

【図３】図３は、本発明による例示化合物Ｃｙ３．３９のｐＨ４．０か
らｐＨ９．５までの範囲に亘り、５６４nm発光にて測定された励起スペクトルを
示す。

【図４】図４は、例示化合物Ｃｙ３．３、Ｃｙ３．９９、Ｃｙ３．３９
のｐＨ４からｐＨ９までにおける吸光を示す。

【図５】図５は、化合物７のｐＫａを示す。

【図６】図６は、ｐＨ感受性タンデム染料エネルギー移動カセット化合
物１１についての、波長に対するＲＦＵを示す。

【図７】図７は、励起６３０nmにおける図６の詳細を示す。

【図８】図８は、ここに記載した、感受性Ｃｙ５の内在化の例を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｄ 417/06 Ｃ０７Ｄ 417/06 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ラットネイカー・ムジュムダーアメリカ合衆国・ペンシルヴェニア・ 15116・グレンショー・ノースエイヴン・サークル・624 (72)発明者ジョン・アンソニー・スミスイギリス・カーディフ・ＣＦ14・６ＪＳ・ライウビナ・ロン−ワイ−ライド・１Ｆターム(参考） 4C063 AA01 BB03 CC62 DD06 EE10 4C204 BB09 CB03 CB13 DB13 EB03 FB01 FB03 FB15 FB23 FB24 GB17 GB30 4H056 CA01 CA05 CB06 CC02 CC08 CE03 DD03 DD19

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の構造：【化１】 [式中、Ｘ及びＹは、＞Ｃ（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）₂、硫黄及び酸素から個別に選択
され；Ｒ¹及びＲ²は、Ｈ、ＣＨ₂ＮＨ₂、ＳＯ₃ ^-、ホスフェート、ホスホネート、
第四級アンモニウム、ＮＯ₂、（ＣＨ₂）_qＣＯＯＨ、ＮＣＳ、ＣＨ₂ＮＨ-ＣＯＲ⁷ から個別に選択され、ここではＲ⁷は、Ｃ₁−Ｃ₂₀直鎖状もしくは分枝状アルキル
及び-（ＣＨ₂）_q-ＣＯＯＨであり、ここではｑは、０乃至１０の整数であり；Ｒ ³ は、Ｈまたは-Ｌ-Ｐであり、ここではＬは、アルケニル、アルキニル、及びア
リールから選択される、０、１、または２の不飽和基を任意に含むＣ₁−Ｃ₂₀直
鎖状もしくは分枝状アルキルから選択され、Ｐは、反応性基、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₂₀直
鎖状もしくは分枝状アルキル、ＳＯ₃ ^-、ＮＨ₂、第四級アンモニウム、ＣＨ₂ＮＨ
-ＣＯＲ⁸から選択され、ここではＲ⁸は、Ｃ₁−Ｃ₂₀直鎖状もしくは分枝状アルキ
ル、-（ＣＨ₂）_m-ＣＯＯＨ、ＮＨＲ⁹であり、ここではＲ⁹は、Ｃ₁−Ｃ₂₀直鎖状
もしくは分枝状アルキル、またはＣＯＯＨであり；ｎは０乃至３の整数であり；
ｐ及びｑは個別に０、１、２、３、または４であって、ｐ及び／またはｒが１よ
り大である場合には、各Ｒ¹及び各Ｒ²は相違しても良く、ｍは１乃至１０の整数
である] を有するシアニン及びこれらの塩及びプロトン化誘導体からなる水溶性染料。
【請求項２】下記の構造：【化２】または【化３】 [式中、Ｘ及びＹは、＞Ｃ（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）₂、硫黄及び酸素から選択され；
Ｚ_a及びＺ_bは、それぞれ個別に、６の炭素原子を有して０、１、または２の窒素
原子を含む、１または２の縮合芳香環の完成に必要な原子を表し；Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ ⁵ 、及びＲ⁶は、Ｈ、ＣＨ₂ＮＨ₂、ＳＯ₃ ^-、ホスフェート、ホスホネート、第四級
アンモニウム、ＮＯ₂、（ＣＨ₂）_qＰ、（ＣＨ₂）_qＣＯＯＨ、ＣＨ₂ＮＨＣＯＲ⁷
から個別に選択され、ここではＲ⁷は、Ｃ₁−Ｃ₂₀直鎖状もしくは分枝状アルキル
または-（ＣＨ₂）_m-ＣＯＯＨであり、ここではｑは、０乃至１０の整数であり；
Ｒ³は、Ｈまたは-Ｌ-Ｐであり；ここではＬは、アルケニル、アルキニル、及び
アリールから選択される、０、１、または２の不飽和基を任意に含むＣ₁−Ｃ₂₀
直鎖状もしくは分枝状アルキルから選択され、更にＰは、反応性基、Ｈ、ＳＯ₃ ^- 、ＮＨ₂、第四級アンモニウム、ＣＨ₂ＮＨ-ＣＯＲ⁸から選択され、ここではＲ⁸
は、Ｃ₁−Ｃ₂₀直鎖状もしくは分枝状アルキル、-（ＣＨ₂）_m-ＣＯＯＨ、ＮＨＲ⁹ であり、ここではＲ⁹は、Ｃ₁−Ｃ₂₀直鎖状もしくは分枝状アルキル、またはＣＯ
ＯＨであり；Ｒ⁴は、Ｈ、または（ＣＨ₂）_mＰであり；ｎは０乃至３の整数であ
り；ｐ、ｒ、ｕ、及びｖは個別に０、１、２、３、または４であって、ここでｐ
、ｒ、ｕ、及び／またはｖが１より大である場合には、各Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ⁵、及び
Ｒ⁶は相違しても良く、ｍは１乃至１０の整数である] を有するシアニン及びこれらの塩及びプロトン化誘導体からなる水溶性染料。
【請求項３】反応性基が、スクシンイミジルエステル、無水物、ハロアセ
タミド、マレイミド、スルホニルハライド、ホスファアミダイト、酸ハライド、
アルキルイミデート、ヒドラジド、カルボジイミド、イソチオシアネート、イソ
シアネート、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン、モノ-もしくはジ-ハ
ロゲン置換ピリジン、モノ-もしくはジ-ハロゲン置換ジアジン、マレイミド、ア
ジリジン、スルホニルハライド、酸ハライド、ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル、ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、イミドエステル、ヒドラジン、
アジドニトロンフェニル、アジド、３-（２-ピリジルジチオ）-プロピオンアミ
ド、グリオキサール及びアルデヒド、並びにアミノ、ヒドロキシル、アルデヒド
、ホスホリル、またはスルフィドリル基と反応性の基から選択される、請求項２
の染料。
【請求項４】反応性基Ｐが、下式：【化４】から選択され、式中ＱまたはＷの少なくとも一が脱離基である、請求項２の染料
。
【請求項５】酸性または塩基性状態を検出する方法であって、請求項１ま
たは２の化合物を、酸性または塩基性であることが疑われる組成物と混合する工
程、及び前記酸性または塩基性の状態を示す、前記化合物の蛍光発光を検出する
工程を含む方法。
【請求項６】前記酸性または塩基性状態が、細胞内環境である、請求項５
の方法。
【請求項７】前記検出が、蛍光顕微鏡、蛍光計、蛍光細胞選別機、または
蛍光装備プレートリーダー（fluorescence equipped plate reader）を用いて行
われる、請求項６の方法。
【請求項８】請求項１または２の染料を含み、該染料が任意に標的結合基
Ｐを含む結合基Ｌを介して蛍光染料に結合し、これによって請求項１または２の
染料と前記蛍光染料とが結合してエネルギー移動関係にある、複合染料。
【請求項９】Ｐが、スクシンイミジルエステル、無水物、ハロアセタミド
、マレイミド、スルホニルハライド、ホスファアミダイト、酸ハライド、アルキ
ルイミデート、ヒドラジド、カルボジイミド、イソチオシアネート、イソシアネ
ート、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン、モノ-もしくはジ-ハロゲン
置換ピリジン、モノ-もしくはジ-ハロゲン置換ジアジン、マレイミド、アジリジ
ン、スルホニルハライド、酸ハライド、ヒドロキシスクシンイミドエステル、ヒ
ドロキシスルホスクシンイミドエステル、イミドエステル、ヒドラジン、アジド
ニトロンフェニル、アジド、３-（２-ピリジルジチオ）-プロピオンアミド、グ
リオキサール及びアルデヒド、並びにアミノ、ヒドロキシル、アルデヒド、ホス
ホリル、またはスルフィドリル基と反応性の基から選択される、請求項８の複合
染料。
【請求項１０】環境のｐＨを測定するための、比率、濃度依存性方法であ
って、前記環境に請求項８の複合染料を添加する工程、及び比率的方式において
蛍光強度比を測定する工程を含む方法。
【請求項１１】分析または検出のための、請求項１乃至４のいずれか一項
に記載のｐＨ染料または請求項８に記載の複合染料の使用。
【請求項１２】前記検出が、光学的手段による、請求項１０に記載の使用
。