JPH07194393A - 生細胞内イオン濃度の３波長測光法のための定数最適化方法 - Google Patents
生細胞内イオン濃度の３波長測光法のための定数最適化方法Info
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- JPH07194393A JPH07194393A JP4224151A JP22415192A JPH07194393A JP H07194393 A JPH07194393 A JP H07194393A JP 4224151 A JP4224151 A JP 4224151A JP 22415192 A JP22415192 A JP 22415192A JP H07194393 A JPH07194393 A JP H07194393A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ３波長測光法による生細胞内イオン濃度測定
に必要な定数を、信頼性良く決定する定数の最適化方法
を提供する。 【構成】 濃度を変化させた、Ｆｕｒａ−２とＣａ2+と
の混合液を４種類以上と、Ｆｕｒａ−２と蛋白質との混
合液を３種類以上と、Ｆｕｒａ−２と蛋白質とＣａ2+と
の混合液を３種類以上とに関して、測定に使用する各波
長で励起したときの蛍光強度を計測する。つぎに、適当
に選んだ各定数の各初期値の組（１６組）から決まる蛍
光強度算出式に対する計測値の蛍光強度値の誤差を求
め、許容誤差範囲の組の存在を判断する。存在すれば、
最小の誤差の組を採用する。存在しなければ拡張シンプ
レックス法の手法を用い、新たな１６組の定数を生成
後、ステップ２１０とステップ２２０との処理を繰り返
し、各定数を決定する。
に必要な定数を、信頼性良く決定する定数の最適化方法
を提供する。 【構成】 濃度を変化させた、Ｆｕｒａ−２とＣａ2+と
の混合液を４種類以上と、Ｆｕｒａ−２と蛋白質との混
合液を３種類以上と、Ｆｕｒａ−２と蛋白質とＣａ2+と
の混合液を３種類以上とに関して、測定に使用する各波
長で励起したときの蛍光強度を計測する。つぎに、適当
に選んだ各定数の各初期値の組（１６組）から決まる蛍
光強度算出式に対する計測値の蛍光強度値の誤差を求
め、許容誤差範囲の組の存在を判断する。存在すれば、
最小の誤差の組を採用する。存在しなければ拡張シンプ
レックス法の手法を用い、新たな１６組の定数を生成
後、ステップ２１０とステップ２２０との処理を繰り返
し、各定数を決定する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、細胞機能の調節等に寄
与する細胞内のイオンなどの濃度分布や変動を測定する
方法に用いられるものである。
与する細胞内のイオンなどの濃度分布や変動を測定する
方法に用いられるものである。
【０００２】
【従来の技術】生きている細胞内に存在するカルシウム
イオン等の遊離イオン濃度の定量には、Ｆｕｒａ−２、
Ｉｎｄｏ−１などの蛍光性プローブ試薬が用いられてい
る。これらの試薬の合成法及び特性については、下記の
文献 “The Journal of Biological Chemistry(1985),Vol.26
0,p.3440-3450 ” “Biophysical Journal, Vol.54, (1988) p.1089-1104
” に示されている。これらのプローブ試薬は、特定のイオ
ンとの結合・解離によって、その蛍光特性が変化する性
質を持つ。したがって、プローブ試薬を細胞内に導入
し、ある波長の励起光により生じた蛍光の強度を測定す
ることにより、細胞内のイオン濃度を測定することがで
きる。
イオン等の遊離イオン濃度の定量には、Ｆｕｒａ−２、
Ｉｎｄｏ−１などの蛍光性プローブ試薬が用いられてい
る。これらの試薬の合成法及び特性については、下記の
文献 “The Journal of Biological Chemistry(1985),Vol.26
0,p.3440-3450 ” “Biophysical Journal, Vol.54, (1988) p.1089-1104
” に示されている。これらのプローブ試薬は、特定のイオ
ンとの結合・解離によって、その蛍光特性が変化する性
質を持つ。したがって、プローブ試薬を細胞内に導入
し、ある波長の励起光により生じた蛍光の強度を測定す
ることにより、細胞内のイオン濃度を測定することがで
きる。
【０００３】しかし、励起光、蛍光とも１波長のみの測
定では、細胞内でのプローブ試薬の濃度が不明、または
分布が不均一である場合には正確な測定値を得ることが
できない。また、蛍光の低減などのイオン濃度に依存し
ない蛍光強度の変化も合わせて測定している可能性もあ
る。
定では、細胞内でのプローブ試薬の濃度が不明、または
分布が不均一である場合には正確な測定値を得ることが
できない。また、蛍光の低減などのイオン濃度に依存し
ない蛍光強度の変化も合わせて測定している可能性もあ
る。
【０００４】そこで、これらを補正するために等吸収点
を持つ蛍光プローブ試薬を用い、異なる波長をもつ２つ
の励起光における蛍光強度または１つの励起光における
２種類の波長の蛍光強度をそれぞれ測定し、その比を測
定する方法がとられている。
を持つ蛍光プローブ試薬を用い、異なる波長をもつ２つ
の励起光における蛍光強度または１つの励起光における
２種類の波長の蛍光強度をそれぞれ測定し、その比を測
定する方法がとられている。
【０００５】しかし、プローブ試薬が単に特定のイオン
とのみ反応する系であれば上述の方法でも良いが、細胞
内では、プローブ試薬はイオンの他にも細胞内に高濃度
で存在するタンパク質や膜成分などにも結合していると
考えられる。このため、プローブ試薬の蛍光スペクトル
やイオンとのキレート定数は変化してしまう。２波長蛍
光測定法では、このような試薬とイオン以外の成分との
相互作用による誤差までは補正できないため、イオン濃
度は正確に求めることはできない。
とのみ反応する系であれば上述の方法でも良いが、細胞
内では、プローブ試薬はイオンの他にも細胞内に高濃度
で存在するタンパク質や膜成分などにも結合していると
考えられる。このため、プローブ試薬の蛍光スペクトル
やイオンとのキレート定数は変化してしまう。２波長蛍
光測定法では、このような試薬とイオン以外の成分との
相互作用による誤差までは補正できないため、イオン濃
度は正確に求めることはできない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】そこで本発明者らは、
３つの波長での吸光度、または３つの励起波長あるいは
３つの蛍光波長での蛍光強度を測定することにより誤差
を補正する方法を考案した（特願平３−３０４８３２：
未公開）。この方法では、イオン濃度を算出するために
以下の１５種の定数をあらかじめ確定しておく必要があ
る。
３つの波長での吸光度、または３つの励起波長あるいは
３つの蛍光波長での蛍光強度を測定することにより誤差
を補正する方法を考案した（特願平３−３０４８３２：
未公開）。この方法では、イオン濃度を算出するために
以下の１５種の定数をあらかじめ確定しておく必要があ
る。
【０００７】・プローブ試薬の測定に使用する３波長で
の吸光係数あるいは蛍光係数（３種） ・プローブ試薬−目的生体物質複合体の測定に使用する
３波長での吸光係数あるいは蛍光係数（３種） ・妨害生体物質−プローブ試薬複合体の測定に使用する
３波長での吸光係数あるいは蛍光係数（３種） ・妨害生体物質−プローブ試薬−目的生体物質複合体の
測定に使用する３波長での吸光係数あるいは蛍光係数
（３種） ・プローブ試薬と目的生体物質との平衡定数（１種） ・妨害生体物質とプローブ試薬との平衡定数（１種） ・妨害生体物質とプローブ試薬−目的生体物質複合体と
の平衡定数（１種） 以下、これらの定数の従来の決定方法を、プローブ試薬
にＦｕｒａ−２を使用したカルシウムイオン（以後、Ｃ
ａ2+と記す）の測定の場合を例にして説明する。ここで
妨害生体物質は蛋白質で代表することにする。Ｆｕｒａ
−２のみの液、Ｆｕｒａ−２とＣａ2+との混合物液、Ｆ
ｕｒａ−２と蛋白質との混合物液、およびＦｕｒａ−２
とＣａ2+と蛋白質の混合物液の試料を様々な濃度で作製
し、測定に使用する３波長、たとえば３４０ｎｍ、３６
０ｎｍ、３８０ｎｍの各波長で励起したときの蛍光強度
を測定する。図２（ａ）は、Ｆｕｒａ−２と蛋白質との
混合物液において蛋白質濃度を変化させながら、各励起
波長での蛍光強度を測定したものである。また図２
（ｂ）は、Ｆｕｒａ−２とＣａ2+との混合物液において
Ｃａ2+濃度を変化させながら、各励起波長での蛍光強度
を測定したものである。また図２（ｃ）は、Ｆｕｒａ−
２−Ｃａ2+複合体と蛋白質との混合物液において蛋白質
濃度を変化させながら、各励起波長での蛍光強度を測定
したものである。
の吸光係数あるいは蛍光係数（３種） ・プローブ試薬−目的生体物質複合体の測定に使用する
３波長での吸光係数あるいは蛍光係数（３種） ・妨害生体物質−プローブ試薬複合体の測定に使用する
３波長での吸光係数あるいは蛍光係数（３種） ・妨害生体物質−プローブ試薬−目的生体物質複合体の
測定に使用する３波長での吸光係数あるいは蛍光係数
（３種） ・プローブ試薬と目的生体物質との平衡定数（１種） ・妨害生体物質とプローブ試薬との平衡定数（１種） ・妨害生体物質とプローブ試薬−目的生体物質複合体と
の平衡定数（１種） 以下、これらの定数の従来の決定方法を、プローブ試薬
にＦｕｒａ−２を使用したカルシウムイオン（以後、Ｃ
ａ2+と記す）の測定の場合を例にして説明する。ここで
妨害生体物質は蛋白質で代表することにする。Ｆｕｒａ
−２のみの液、Ｆｕｒａ−２とＣａ2+との混合物液、Ｆ
ｕｒａ−２と蛋白質との混合物液、およびＦｕｒａ−２
とＣａ2+と蛋白質の混合物液の試料を様々な濃度で作製
し、測定に使用する３波長、たとえば３４０ｎｍ、３６
０ｎｍ、３８０ｎｍの各波長で励起したときの蛍光強度
を測定する。図２（ａ）は、Ｆｕｒａ−２と蛋白質との
混合物液において蛋白質濃度を変化させながら、各励起
波長での蛍光強度を測定したものである。また図２
（ｂ）は、Ｆｕｒａ−２とＣａ2+との混合物液において
Ｃａ2+濃度を変化させながら、各励起波長での蛍光強度
を測定したものである。また図２（ｃ）は、Ｆｕｒａ−
２−Ｃａ2+複合体と蛋白質との混合物液において蛋白質
濃度を変化させながら、各励起波長での蛍光強度を測定
したものである。
【０００８】図２（ｂ）のＣａ2+濃度＝０（すなわち、
Ｆｕｒａ−２−Ｃａ2+複合体が存在しない試料）での各
励起波長における蛍光強度値より、Ｆｕｒａ−２の各励
起波長での蛍光係数を求める。また、Ｃａ2+濃度の充分
高く、Ｃａ2+濃度をより高くしても各励起波長における
蛍光強度が変化しない状態（Ｃａ2+と結合していないＦ
ｕｒａ−２が存在しない試料）での蛍光強度値より、Ｆ
ｕｒａ−２−Ｃａ2+複合体の各励起波長での蛍光係数を
求める。また、図２（ａ）の蛋白質濃度の充分高く、蛋
白質濃度をより高くしても各励起波長における蛍光強度
が変化しない状態（蛋白質と結合していないＦｕｒａ−
２が存在しない試料）での蛍光強度値より、蛋白質−Ｆ
ｕｒａ−２複合体の各励起波長での蛍光係数を求める。
また、図２（ｃ）の蛋白質濃度の充分高く、蛋白質濃度
をより高くしても各励起波長における蛍光強度が変化し
ない状態（蛋白質と結合していないＦｕｒａ−２−Ｃａ
2+が存在しない試料）での蛍光強度値より、蛋白質−Ｆ
ｕｒａ−２−Ｃａ2+複合体の各励起波長での蛍光係数を
求める。
Ｆｕｒａ−２−Ｃａ2+複合体が存在しない試料）での各
励起波長における蛍光強度値より、Ｆｕｒａ−２の各励
起波長での蛍光係数を求める。また、Ｃａ2+濃度の充分
高く、Ｃａ2+濃度をより高くしても各励起波長における
蛍光強度が変化しない状態（Ｃａ2+と結合していないＦ
ｕｒａ−２が存在しない試料）での蛍光強度値より、Ｆ
ｕｒａ−２−Ｃａ2+複合体の各励起波長での蛍光係数を
求める。また、図２（ａ）の蛋白質濃度の充分高く、蛋
白質濃度をより高くしても各励起波長における蛍光強度
が変化しない状態（蛋白質と結合していないＦｕｒａ−
２が存在しない試料）での蛍光強度値より、蛋白質−Ｆ
ｕｒａ−２複合体の各励起波長での蛍光係数を求める。
また、図２（ｃ）の蛋白質濃度の充分高く、蛋白質濃度
をより高くしても各励起波長における蛍光強度が変化し
ない状態（蛋白質と結合していないＦｕｒａ−２−Ｃａ
2+が存在しない試料）での蛍光強度値より、蛋白質−Ｆ
ｕｒａ−２−Ｃａ2+複合体の各励起波長での蛍光係数を
求める。
【０００９】図２（ｂ）において、Ｃａ2+の濃度が特定
の値で各励起波長における蛍光強度が理論的には一致す
る（各励起波長に対応する線が一点で交わる）。このと
きのＣａ2+濃度値がＦｕｒａ−２とＣａ2+の平衡定数に
一致するので、図２（ｂ）よりＦｕｒａ−２とＣａ2+の
平衡定数を求める。同様に、図２（ａ）および図２
（ｂ）のグラフにおいて各励起波長に対応する線が一点
で交わるときの蛋白質濃度の値からＦｕｒａ−２と蛋白
質の平衡定数およびＦｕｒａ−２−Ｃａ2+複合体と蛋白
質の平衡定数が求める。
の値で各励起波長における蛍光強度が理論的には一致す
る（各励起波長に対応する線が一点で交わる）。このと
きのＣａ2+濃度値がＦｕｒａ−２とＣａ2+の平衡定数に
一致するので、図２（ｂ）よりＦｕｒａ−２とＣａ2+の
平衡定数を求める。同様に、図２（ａ）および図２
（ｂ）のグラフにおいて各励起波長に対応する線が一点
で交わるときの蛋白質濃度の値からＦｕｒａ−２と蛋白
質の平衡定数およびＦｕｒａ−２−Ｃａ2+複合体と蛋白
質の平衡定数が求める。
【００１０】以上のようにして、Ｆｕｒａ−２をプロー
ブ試薬に使用した場合の３波長測光によるＣａ2+濃度の
測定に必要な全ての定数を求めることができる。
ブ試薬に使用した場合の３波長測光によるＣａ2+濃度の
測定に必要な全ての定数を求めることができる。
【００１１】従来の定数決定法は以上のように行われる
が、通常の蛍光測定では、試料作製の不正確さや測定機
器の精度などの影響を受け、同一試料の測定であっても
測定した蛍光強度値が多少ばらつくことが普通である。
たとえば、平衡定数の決定は、３励起波長夫々のグラフ
の線は一点で交わらずに、グラフ中の２励起波長の線ご
とに３点の交点が生じ、平衡定数の候補が３値求まる。
この３値の内どの点が真値に最も近いかは決定不能であ
った。
が、通常の蛍光測定では、試料作製の不正確さや測定機
器の精度などの影響を受け、同一試料の測定であっても
測定した蛍光強度値が多少ばらつくことが普通である。
たとえば、平衡定数の決定は、３励起波長夫々のグラフ
の線は一点で交わらずに、グラフ中の２励起波長の線ご
とに３点の交点が生じ、平衡定数の候補が３値求まる。
この３値の内どの点が真値に最も近いかは決定不能であ
った。
【００１２】そこで、信頼度の高い蛍光係数および平衡
定数を得るためには、各試料、各励起波長での蛍光強度
の測定を何度も繰り返して行う必要があり、試料の作製
および蛍光強度の測定に多くの労力を必要としていた。
定数を得るためには、各試料、各励起波長での蛍光強度
の測定を何度も繰り返して行う必要があり、試料の作製
および蛍光強度の測定に多くの労力を必要としていた。
【００１３】本発明は、上記の問題点を解消するために
なされたもので、３波長測光法による生細胞内イオン濃
度測定のために必要な定数を、試料の作製および蛍光強
度の測定の労力を低減しつつ信頼性良く決定する定数の
最適化方法を提供することを目的とする。
なされたもので、３波長測光法による生細胞内イオン濃
度測定のために必要な定数を、試料の作製および蛍光強
度の測定の労力を低減しつつ信頼性良く決定する定数の
最適化方法を提供することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明の生細胞内イオン
濃度の３波長測光法のための定数最適化方法は、（ａ）
プローブ試薬と目的生体物質との濃度が異なる第１の数
の種類の混合液を３波長測光する第１のステップと、
（ｂ）妨害生体物質とプローブ試薬との濃度が異なる第
２の数の種類の混合液を３波長測光する第２のステップ
と、（ｃ）妨害生体物質とプローブ試薬と前記目的生体
物質の濃度が異なる第３の数の種類の混合液を３波長測
光する第３のステップと、（ｄ）適当に定めた定数初期
値から出発し、定数初期値の場合の前記第１〜３のステ
ップでの計測値との誤差を評価し、公知の拡張シンプレ
ックス法（河口：「シンプレックス法による最適化」；
ぶんせき、１９８８年６月、ｐ３９７）により定数初期
値に漸近的補正を順次繰り返して行い、計測値との誤差
を許容範囲内になるまで続行する第４のステップと、を
有し、生細胞内イオン濃度を測定するにあったて必要な
１５個の定数を求めることを特徴とする。
濃度の３波長測光法のための定数最適化方法は、（ａ）
プローブ試薬と目的生体物質との濃度が異なる第１の数
の種類の混合液を３波長測光する第１のステップと、
（ｂ）妨害生体物質とプローブ試薬との濃度が異なる第
２の数の種類の混合液を３波長測光する第２のステップ
と、（ｃ）妨害生体物質とプローブ試薬と前記目的生体
物質の濃度が異なる第３の数の種類の混合液を３波長測
光する第３のステップと、（ｄ）適当に定めた定数初期
値から出発し、定数初期値の場合の前記第１〜３のステ
ップでの計測値との誤差を評価し、公知の拡張シンプレ
ックス法（河口：「シンプレックス法による最適化」；
ぶんせき、１９８８年６月、ｐ３９７）により定数初期
値に漸近的補正を順次繰り返して行い、計測値との誤差
を許容範囲内になるまで続行する第４のステップと、を
有し、生細胞内イオン濃度を測定するにあったて必要な
１５個の定数を求めることを特徴とする。
【００１５】ここで、第１の数が４以上、第２の数が３
以上、および第３の数が３以上であることを特徴とす
る。また、第４のステップにおける拡張シンプレックス
法の適用にあたり、初期値として１６組の適当な定数の
組を設定することを特徴とする。
以上、および第３の数が３以上であることを特徴とす
る。また、第４のステップにおける拡張シンプレックス
法の適用にあたり、初期値として１６組の適当な定数の
組を設定することを特徴とする。
【００１６】
【作用】本発明では、まず、濃度を変化させたプローブ
試薬と目的生体物質との混合液を４種類以上と、濃度を
変化させた妨害生体物質とプローブ試薬との混合液を３
種類以上と、および濃度を変化させた妨害生体物質とプ
ローブ試薬と目的生体物質の混合液を３種類以上との混
合液に関して３波長測光を実施する。次いで、その計測
データを基に、拡張シンプレックス法にて適当に設定し
た１６組以上の初期値を適用した場合の計測データ対応
の算出値値に関して一種の誤差検定を行いつつ、漸近的
補正を順次繰り返し、許容誤差範囲内となるまで続行す
る最適化を行う。したがって、本発明によれば、３波長
測光法による生細胞内イオン濃度測定のために必要な１
５種の定数の決定にあたって、高々十数種類の試料溶液
に関してのみ３波長測光を行えばよいので、従来に比べ
て試料の作製および３波長測光に掛かる労力を大幅に低
減できるとともに信頼度の高い１５種の定数を得ること
ができる。
試薬と目的生体物質との混合液を４種類以上と、濃度を
変化させた妨害生体物質とプローブ試薬との混合液を３
種類以上と、および濃度を変化させた妨害生体物質とプ
ローブ試薬と目的生体物質の混合液を３種類以上との混
合液に関して３波長測光を実施する。次いで、その計測
データを基に、拡張シンプレックス法にて適当に設定し
た１６組以上の初期値を適用した場合の計測データ対応
の算出値値に関して一種の誤差検定を行いつつ、漸近的
補正を順次繰り返し、許容誤差範囲内となるまで続行す
る最適化を行う。したがって、本発明によれば、３波長
測光法による生細胞内イオン濃度測定のために必要な１
５種の定数の決定にあたって、高々十数種類の試料溶液
に関してのみ３波長測光を行えばよいので、従来に比べ
て試料の作製および３波長測光に掛かる労力を大幅に低
減できるとともに信頼度の高い１５種の定数を得ること
ができる。
【００１７】さらに、定数を算出する演算に高次方程式
を解析的に解く手法ではなく、拡張シンプレックス法に
よる漸近的な逐次近似なので、この演算手法は簡単にプ
ログラム化が可能であり、計算機を導入することにより
定数決定の効率を向上させることができる。
を解析的に解く手法ではなく、拡張シンプレックス法に
よる漸近的な逐次近似なので、この演算手法は簡単にプ
ログラム化が可能であり、計算機を導入することにより
定数決定の効率を向上させることができる。
【００１８】
【実施例】以下、本発明の実施例について図を参照しな
がら説明する。本実施例は、プローブ試薬としてＦｕｒ
ａ−２を使用し、生細胞内のＣａ2+濃度を３励起波長１
蛍光波長の３波長測光法によって測定するための各蛍光
係数および各平衡定数である１５種の定数を決定する方
法であり、図１にこの方法のフローチャートを示す。
がら説明する。本実施例は、プローブ試薬としてＦｕｒ
ａ−２を使用し、生細胞内のＣａ2+濃度を３励起波長１
蛍光波長の３波長測光法によって測定するための各蛍光
係数および各平衡定数である１５種の定数を決定する方
法であり、図１にこの方法のフローチャートを示す。
【００１９】まず、濃度を変化させたＦｕｒａ−２とＣ
ａ2+との混合液を５種類用意し、夫々の混合液につい
て、測定に使用する３波長、すなわち３４０ｎｍ、３６
０ｎｍ、および３８０ｎｍの各波長で励起したときの蛍
光強度を計測する（図１のステップ１００参照）。つぎ
に、濃度を変化させたＦｕｒａ−２と蛋白質との混合液
を４種類用意し、上記の３波長の夫々で励起したときの
蛍光強度を計測する（図１のステップ１１０参照）。次
いで、濃度を変化させたＦｕｒａ−２と蛋白質とＣａ2+
との混合液を４種類用意し、上記の３波長の夫々で励起
したときの蛍光強度を計測する（図１のステップ１２０
参照）。
ａ2+との混合液を５種類用意し、夫々の混合液につい
て、測定に使用する３波長、すなわち３４０ｎｍ、３６
０ｎｍ、および３８０ｎｍの各波長で励起したときの蛍
光強度を計測する（図１のステップ１００参照）。つぎ
に、濃度を変化させたＦｕｒａ−２と蛋白質との混合液
を４種類用意し、上記の３波長の夫々で励起したときの
蛍光強度を計測する（図１のステップ１１０参照）。次
いで、濃度を変化させたＦｕｒａ−２と蛋白質とＣａ2+
との混合液を４種類用意し、上記の３波長の夫々で励起
したときの蛍光強度を計測する（図１のステップ１２０
参照）。
【００２０】引き続き、適当に選んだ各蛍光係数および
各平衡定数の初期値を１６組設定する（図１のステップ
２００参照）。ただし、各定数は解析的には３次方程式
の解の一つなので、物理的に意味のない解に落ち込まな
いように初期値を選ぶ。この各初期値の組から決まる蛍
光強度算出式に対する計測値の蛍光強度値の分散から誤
差を求め、許容誤差範囲の組が存在するかを判断する
（図１のステップ２１０）。もし、存在すれば、それら
の組の内で最小の誤差の組を最適化された定数の組と判
断する（図１のステップ２３０参照）。もし、そのよう
な組が存在しなければ、拡張シンプレックス法の手法を
用いて、最も誤差の大きい組と次ぎに誤差の大きな組と
最も誤差の小さな組とから演算し導出した新たな組を、
最も誤差の大きい組と交換して新たな１６組を生成する
（図１のステップ２２０参照）。この後、ステップ２１
０に遷移し、誤差が許容範囲内の組が出現するまでステ
ップ２１０とステップ２２０との処理を繰り返す。
各平衡定数の初期値を１６組設定する（図１のステップ
２００参照）。ただし、各定数は解析的には３次方程式
の解の一つなので、物理的に意味のない解に落ち込まな
いように初期値を選ぶ。この各初期値の組から決まる蛍
光強度算出式に対する計測値の蛍光強度値の分散から誤
差を求め、許容誤差範囲の組が存在するかを判断する
（図１のステップ２１０）。もし、存在すれば、それら
の組の内で最小の誤差の組を最適化された定数の組と判
断する（図１のステップ２３０参照）。もし、そのよう
な組が存在しなければ、拡張シンプレックス法の手法を
用いて、最も誤差の大きい組と次ぎに誤差の大きな組と
最も誤差の小さな組とから演算し導出した新たな組を、
最も誤差の大きい組と交換して新たな１６組を生成する
（図１のステップ２２０参照）。この後、ステップ２１
０に遷移し、誤差が許容範囲内の組が出現するまでステ
ップ２１０とステップ２２０との処理を繰り返す。
【００２１】以上のようにして、１５種の定数を最適化
し、信頼性の高い各蛍光係数および各平衡定数を決定す
る。
し、信頼性の高い各蛍光係数および各平衡定数を決定す
る。
【００２２】上述の最適化方法では、蛍光プローブ試薬
としてＦｕｒａ−２を用いたが、他のプローブ試薬、例
えばＩｎｄｏ−１を用いる場合は、その蛍光特性から、
１波長励起３波長蛍光測定を行うことが望ましい。この
場合は、前述の３波長励起１波長蛍光測定法と同様に調
製した細胞に、Ｉｎｄｏ−１が最も励起されやすい励起
波長（３５５ｎｍ）の光を照射し、生ずる蛍光の３波長
域での蛍光強度を測定する。
としてＦｕｒａ−２を用いたが、他のプローブ試薬、例
えばＩｎｄｏ−１を用いる場合は、その蛍光特性から、
１波長励起３波長蛍光測定を行うことが望ましい。この
場合は、前述の３波長励起１波長蛍光測定法と同様に調
製した細胞に、Ｉｎｄｏ−１が最も励起されやすい励起
波長（３５５ｎｍ）の光を照射し、生ずる蛍光の３波長
域での蛍光強度を測定する。
【００２３】その後、３波長励起１波長蛍光測定法と同
様の測定・演算段階を経て各蛍光係数および各平衡定数
を最適化することにより信頼度の高い定数をに決定する
ことができる。
様の測定・演算段階を経て各蛍光係数および各平衡定数
を最適化することにより信頼度の高い定数をに決定する
ことができる。
【００２４】なお、蛍光プローブ試薬、及び励起波長に
ついては本実施例で用いた値に限る必要はなく、試薬の
蛍光特性により変更しても、本発明の目的を充分達成す
ることができる。
ついては本実施例で用いた値に限る必要はなく、試薬の
蛍光特性により変更しても、本発明の目的を充分達成す
ることができる。
【００２５】
【発明の効果】本発明によれば、漸近的な逐次近似法で
ある拡張シンプレックス法により、各蛍光係数および各
平衡定数の１５種の定数を最適化することによって決定
するので、高々十数種類の試料の作製および蛍光強度測
定ですみ、従来の定数決定法に比べて試料作製および蛍
光強度計測の労力を大幅に低減できる。
ある拡張シンプレックス法により、各蛍光係数および各
平衡定数の１５種の定数を最適化することによって決定
するので、高々十数種類の試料の作製および蛍光強度測
定ですみ、従来の定数決定法に比べて試料作製および蛍
光強度計測の労力を大幅に低減できる。
【図１】本発明の実施例の定数最適化法のフローチャー
トである。
トである。
【図２】従来の定数最適化法の説明図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 平野 雅彦 静岡県浜松市市野町1126番地の１ 浜松ホ トニクス株式会社内 (72)発明者 神谷 清 静岡県浜松市市野町1126番地の１ 浜松ホ トニクス株式会社内
Claims (3)
- 【請求項１】 プローブ試薬と目的生体物質との濃度が
異なる第１の数の種類の混合液を３波長測光する第１の
ステップと、 妨害生体物質と前記プローブ試薬との濃度が異なる第２
の数の種類の混合液を３波長測光する第２のステップ
と、 前記妨害生体物質と前記プローブ試薬と前記目的生体物
質の濃度が異なる第３の数の種類の混合液を３波長測光
する第３のステップと、 適当に定めた定数初期値から出発し、前記定数初期値の
場合の前記第１〜３のステップでの計測値との誤差を評
価し、拡張シンプレックス法により前記定数初期値に漸
近的補正を順次繰り返して行い、前記計測値との誤差を
許容範囲内になるまで続行する第４のステップと、 を有し、生細胞内イオン濃度を測定するにあたって必要
な１５個の定数を求めることを特徴とする生細胞内イオ
ン濃度の３波長測光法のための定数最適化方法。 - 【請求項２】 前記第１の数が４以上、前記第２の数が
３以上、および前記第３の数が３以上であることを特徴
とする請求項１記載の生細胞内イオン濃度の３波長測光
法のための定数最適化方法。 - 【請求項３】 前記第４のステップにおける前記拡張シ
ンプレックス法の適用にあたり、初期値として１６組の
適当な定数の組を設定することを特徴とする請求項１記
載の生細胞内イオン濃度の３波長測光法のための定数最
適化方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4224151A JPH07194393A (ja) | 1992-08-24 | 1992-08-24 | 生細胞内イオン濃度の３波長測光法のための定数最適化方法 |
| DE4328279A DE4328279C2 (de) | 1992-08-24 | 1993-08-23 | Verfahren zur Messung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle unter Verwendung eines Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens |
| US08/309,317 US5550031A (en) | 1992-08-24 | 1994-09-20 | Method of optimizing equilibrium constants and fluorescence coefficients for measuring intracellular ion concentration using fluorescence probe dyes with triple wave length photometry |
| US08/656,826 US5866355A (en) | 1992-08-24 | 1996-06-03 | Device for measuring an intracellular ion concentration |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4224151A JPH07194393A (ja) | 1992-08-24 | 1992-08-24 | 生細胞内イオン濃度の３波長測光法のための定数最適化方法 |
| US08/309,317 US5550031A (en) | 1992-08-24 | 1994-09-20 | Method of optimizing equilibrium constants and fluorescence coefficients for measuring intracellular ion concentration using fluorescence probe dyes with triple wave length photometry |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07194393A true JPH07194393A (ja) | 1995-08-01 |
Family
ID=26525874
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4224151A Pending JPH07194393A (ja) | 1992-08-24 | 1992-08-24 | 生細胞内イオン濃度の３波長測光法のための定数最適化方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5550031A (ja) |
| JP (1) | JPH07194393A (ja) |
| DE (1) | DE4328279C2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115452751A (zh) * | 2022-10-26 | 2022-12-09 | 杭州泽天春来科技有限公司 | 余氯检测方法及装置 |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07194393A (ja) * | 1992-08-24 | 1995-08-01 | Hamamatsu Photonics Kk | 生細胞内イオン濃度の３波長測光法のための定数最適化方法 |
| DE19703025C2 (de) * | 1997-01-28 | 1999-04-29 | Bernd Dr Lorenz | Verfahren zur Messung von Konzentrationen sowie zur kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Messung des Umsatzes und der Geschwindigkeit enzymatischer oder nichtenzymatischer Reaktionen von Pyrophosphaten und/oder linearen Polyphosphaten unter Ausschluß von zyklischen Polyphosphaten als auch von Orthophosphaten in einer Probe sowie Anwendung des Verfahrens |
| JP4168557B2 (ja) * | 1999-11-25 | 2008-10-22 | 三浦工業株式会社 | 硬度測定用指示薬および硬度測定方法 |
| JP2003522247A (ja) * | 2000-02-02 | 2003-07-22 | アマシャム バイオサイエンス ユーケイ リミテッド | 検出試薬 |
| JP3686898B2 (ja) * | 2003-01-09 | 2005-08-24 | 独立行政法人理化学研究所 | 蛍光エネルギー移動解析装置 |
| RU2680519C1 (ru) * | 2017-11-07 | 2019-02-22 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Уральский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО УГМУ Минздрава России) | Способ оценки комплексообразующих свойств лекарственных веществ по отношению к соединениям магния |
| CN111103272B (zh) * | 2018-10-26 | 2022-08-05 | 山东大学 | 细胞特异性光敏效应的实时筛查与测量系统及方法 |
| RU2712048C1 (ru) * | 2019-07-09 | 2020-01-24 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Уральский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО УГМУ Минздрава России) | Способ оценки взаимодействия лекарственных препаратов с катионами магния |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4603209A (en) * | 1984-09-07 | 1986-07-29 | The Regents Of The University Of California | Fluorescent indicator dyes for calcium ions |
| US4900934A (en) * | 1987-07-15 | 1990-02-13 | University Of Utah | Apparatus for simultaneous visualization and measurement of fluorescence from fluorescent dye-treated cell preparations and solutions |
| US5049673A (en) * | 1987-10-30 | 1991-09-17 | The Regents Of The University Of California | Fluorescent indicator dyes for calcium working at long wavelengths |
| US4849362A (en) * | 1988-05-19 | 1989-07-18 | Smithkline Beckman Corporation | Fluorescent intracellular calcium indicators |
| JP2799191B2 (ja) * | 1989-08-24 | 1998-09-17 | オリンパス光学工業株式会社 | 細胞内イオンの２次元濃度分布像を形成する方法 |
| US5149972A (en) * | 1990-01-18 | 1992-09-22 | University Of Massachusetts Medical Center | Two excitation wavelength video imaging microscope |
| JP2970967B2 (ja) * | 1991-11-20 | 1999-11-02 | 浜松ホトニクス株式会社 | 蛍光性プローブ試薬を用いた細胞内イオン濃度測定法 |
| JPH07194393A (ja) * | 1992-08-24 | 1995-08-01 | Hamamatsu Photonics Kk | 生細胞内イオン濃度の３波長測光法のための定数最適化方法 |
-
1992
- 1992-08-24 JP JP4224151A patent/JPH07194393A/ja active Pending
-
1993
- 1993-08-23 DE DE4328279A patent/DE4328279C2/de not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-09-20 US US08/309,317 patent/US5550031A/en not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-06-03 US US08/656,826 patent/US5866355A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115452751A (zh) * | 2022-10-26 | 2022-12-09 | 杭州泽天春来科技有限公司 | 余氯检测方法及装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5866355A (en) | 1999-02-02 |
| US5550031A (en) | 1996-08-27 |
| DE4328279C2 (de) | 1996-08-14 |
| DE4328279A1 (de) | 1994-03-03 |
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040616 |
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| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20041207 |