DE4328279A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Messung von Verteilungen und Veränderungen der Konzentrationen von Ionen innerhalb der Zelle, die zur Steuerung usw. von Zellfunktionen beitragen.

Fluoreszenz-Sondenfarbstoffe wie beispielsweise Fura-2, Indo-1, usw. werden zur Bestimmung der Konzentration freier Ionen wie beispielsweise Calciumionen, usw. verwendet, die in lebenden Zellen zugegen sind. Verfahren zur Synthese dieser Farbstoffe und charakteristische Eigenschaften dieser Farbstoffe sind in den folgenden Druckschriften beschrieben: "The Journal of Biological Chemistry (1985), Band 260, Seiten 3340 bis 3450" und "Biophysical Journal, Band 54 (1988), Seiten 1089 bis 1104". Diese Sondenfarbstoffe haben die Eigenschaft, daß sich ihre charakteristischen Fluoreszenz-Eigenschaften in Abhängigkeit von Bindungsvorgängen und Dissoziationsvorgängen spezifischer Ionen verändern. Zur Messung der Ionenkonzentrationen innerhalb der Zelle unter Verwendung dieser Eigenschaft werden die Sondenfarbstoffe in Zellen eingeführt, und es werden Intensitäten der Fluoreszenz, die durch Anregungslicht bestimmter Wellenlängen erzeugt wird, gemessen.

Jedoch kann die Messung auf der Grundlage von Anregungslicht nur einer Wellenlänge und einer Fluoreszenz nur einer Wellenlänge keine exakten Meßwerte ergeben, wenn Konzentrationen von Sondenfarbstoff in der Zelle unbekannt sind oder Verteilungen von Sondenfarbstoff in der Zelle uneinheitlich sind. Es besteht auch eine Gefahr, daß Änderungen der Fluoreszenzintensitäten, die nicht von Ionenkonzentrationen abhängig sind, sondern durch einen Rückgang der Fluoreszenz hervorgerufen werden, auch gemessen werden.

Im Rahmen eines Verfahrens zur Beseitigung dieser Gefahr werden Fluoreszenzintensitäten für Anregungslicht zweier unterschiedlicher Wellenlängen und Fluoreszenzintensitäten zweier Wellenlängen für eine Art Anregungslicht jeweils gemessen, und ihre jeweiligen Verhältnisse werden gemessen. Dieses Verfahren ist in allen Einzelheiten beschrieben in "Atsuo Miyakawa et al., Bunseki Kagaku, Band 38 (1989), Nummer 11, Seiten 642 bis 649" und "Photomedicine und Photobiology, Band 13 (1991), Seiten 15 bis 19".

Das oben beschriebene, unter Verwendung zweier Wellenlängen erfolgende Fluoreszenz­ meßverfahren ist verwendbar bei Systemen nur in bezug auf ein bestimmtes Ion, mit dem der Sondenfarbstoff reagiert. Es ist jedoch in Betracht zu ziehen, daß die Sondenfarbstoffe Bindungen mit Proteinen und Diaphragma-Komponenten, die keine Ionen sind und in hohen Konzentrationen in Zellen zugegen sind, eingehen. Folglich werden die Fluoreszenz- Emissionsspektren und Chelat-Konstanten nachteilig verändert. Dieses auf der Verwendung zweier Wellenlängen basierende Fluoreszenz-Meßverfahren kann keine Fehler, die aufgrund der Wechselwirkungen zwischen den Farbstoffen und anderen Komponenten als Ionen auftreten, korrigieren. Exakte Ionenkonzentrationen können nicht bestimmt werden.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Messung der Konzentration von Ionen innerhalb der Zelle bereitzustellen, das die Arbeit zur Herstellung von Proben und zur Messung der Fluoreszenzintensitäten mit hoher Zuver­ lässigkeit verringern kann.

Das Verfahren zur Messung einer intrazellulären Ionenkonzentration gemäß der vorliegenden Erfindung dient zur Messung einer Ionenkonzentration innerhalb der Zelle durch Einführen eines Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs, z. B. Fura-2, Indo-1 oder andere, in eine Zelle und Angabe einer Konzentration eines freien Ions, z. B. Ca²⁺, Mg²⁺ oder andere, auf der Grundlage von Intensitäten der Fluoreszenz, die durch anregende Bestrahlung der Zelle mit Licht erzeugt wird. Dieses Verfahren umfaßt die folgenden Schritte 1 bis 5.

Im ersten Schritt werden die Intensitäten einer Fluoreszenz gemessen, die durch anregende Bestrahlung einer ersten Zahl von Mischlösungen eines Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs mit einem freien Ion, die unterschiedliche relative Konzentrationen aufweisen, mit Licht dreier verschiedener Wellenlängen erzeugt wird oder Intensitäten einer Fluoreszenz gemessen, die in drei Wellenlängenbereichen durch anregende Bestrahlung mit Licht einer Wellenlänge erzeugt wird. In diesem Schritt ist es bevorzugt, daß die erste Zahl 4 oder höher ist.

Im zweiten Schritt werden die Intensitäten einer Fluoreszenz gemessen, die durch Bestrahlung einer zweiten Zahl von Mischlösungen des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs mit einer störenden Biobsubstanz, z. B. einem Protein, die von dem zu messenden freien Ion verschieden ist und eine Bindung mit dem Fluoreszenz-Sondenfarbstoff und dem freien Ion unter Änderung der Fluoreszenzintensitäten eingeht, mit anregendem Licht der drei verschiedenen Wellenlängen erzeugt wird, wobei die Mischlösungen verschiedene relative Konzentrationen aufweisen, oder Intensitäten einer Fluoreszenz gemessen, die durch Bestrahlung der Mischlösungen mit anregendem Licht einer Wellenlänge erzeugt wird. Es ist bevorzugt, daß die zweite Zahl 3 oder höher ist.

Im dritten Schritt werden Intensitäten einer Fluoreszenz gemessen, die durch Bestrahlung einer dritten Zahl von Mischlösungen des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs mit der störenden Biosubstanz und dem freien Ion mit anregendem Licht der drei unterschiedlichen Wellenlängen erzeugt wird, oder Intensitäten einer Fluoreszenz gemessen, die in den drei Wellenlängenbereichen durch Bestrahlung der Mischlösungen mit anregendem Licht einer Wellenlänge erzeugt wird. Es ist bevorzugt, daß die dritte Zahl 3 oder höher ist.

Im vierten Schritt werden die Anfangswerte von drei Gleichgewichtskonstanten, die in drei unabhängigen Gleichgewichts-Reaktionsgleichungen von Reaktionen zwischen dem Fluoreszenz-Sondenfarbstoff, dem freien Ion, der störenden Biosubstanz und den Komplexen des freien Ions und der störenden Biosubstanz, die in der Zelle zugegen sind, zu verwenden sind, die Anfangswerte von zwölf Fluoreszenzkoeffizienten, die in Formeln zur Berechnung der Fluoreszenzintensität zu verwenden sind, die Beziehungen zwischen dem Fluoreszenz- Sondenfarbstoff, dem freien Ion, der störenden Biosubstanz und den Komplexen des freien Ions und der störenden Biosubstanz ausdrücken, festgesetzt, Fehlerwerte zwischen den Werten der Fluoreszenzintensitäten, die auf der Grundlage der Anfangswerte angegeben wurden, und den Werten der Fluoreszenzintensitäten, die im ersten bis dritten Schritt gemessen wurden, abgeschätzt und asymptotische Korrekturen der Anfangswerte werden sukzessive mit dem modifizierten Simplex-Verfahren wiederholt, bis die Fehlerabweichungen der Anfangswerte von den gemessenen Fluoreszenzintensitäten in einen erlaubten Bereich fallen.

Im fünften Schritt werden Intensitäten einer Fluoreszenz gemessen, die durch Bestrahlen der Zelle mit anregendem Licht dreier verschiedener Wellenlängen erzeugt wird, oder es werden Intensitäten einer Fluoreszenz gemessen, die in den drei Wellenlängenbereichen durch Bestrahlen der Zelle mit anregendem Licht einer Wellenlänge erzeugt wird, und es werden die gleichzeitigen Gleichungen der Formeln zur Berechnung der Fluoreszenzintensitäten, in die die gemessenen Fluoreszenzintensitäten eingesetzt sind, und die Formeln der Gleichge­ wichts-Reaktionsgleichungen unter Erhalt einer Konzentration des freien Ions gelöst.

Wenn in dem ersten bis dritten Schritt und im fünften Schritt der bereitgestellte Fluoreszenz- Sondenfarbstoff Fura-2 ist, ist es bevorzugt, daß Intensitäten der Fluoreszenz, die durch die Bestrahlung mit anregendem Licht dreier unterschiedlicher Wellenlängen erzeugt wird, gemessen werden. Wenn der bereitgestellte Fluoreszenz-Sondenfarbstoff Indo-1 ist, ist es bevorzugt, daß Intensitäten der Fluoreszenz, die durch die Bestrahlung mit anregendem Licht einer Wellenlänge erzeugt wird, gemessen werden.

Das Verfahren zur Messung von Fluoreszenzintensitäten bei anregendem Licht dreier unterschiedlicher Wellenlängen, wie es oben in dem fünften Schritt beschrieben wurde, und das Verfahren zur Messung von Fluoreszenzintensitäten dreier unterschiedlicher Wellenlän­ gen bei anregendem Licht einer Wellenlänge (nachfolgend bezeichnet als "Drei-Wellenlän­ gen-Fluoreszenz-Meßverfahren") sind beschrieben in der japanischen Patentanmeldung Nr. 304 832/1991 mit dem Titel: "A method for measurement of intracellular ion concentration using fluorescent probe dyes (Verfahren zur Messung einer intrazellulären Ionenkonzen­ tration unter Verwendung von Fluoreszenz-Sondenfarbstoffen)".

Dieses Drei-Wellenlängen-Fluoreszenz-Meßverfahren wird nachfolgend anhand eines Beispiels erläutert, in dem die Konzentration an Ca²⁺ unter Verwendung von Fura-2 als Fluoreszenz-Sondenfarbstoff gemessen wird. In diesem Beispiel ist die störende Biosubstanz ein Protein.

Fig. 1 zeigt eine näherungsweise Ansicht der Wechselwirkungen zwischen Fura-2 und einem Calciumion (Ca²⁺) oder einem Protein in einer Zelle. Fig. 1 zeigt einen Fall, in dem die Konzentration an Ca²⁺ unter Verwendung von Fura-2 gemessen wird; jedoch kann näherungsweise in gleicher Weise auch ein Fall wiedergegeben werden, in dem Ca²⁺ unter Verwendung von beispielsweise Indo-1 gemessen wird. In einer Zelle geht Fura-2 mit Ca²⁺ eine Bindung ein, wobei die Dissozationskonstante der entsprechenden Reaktionsgleichung K(FC) ist. Ebenfalls geht Fura-2 eine Bindung mit einem Protein ein, wobei die Dis­ soziationskonstante der entsprechenden Reaktionsgleichung K(PF) ist. Außerdem können auch drei Komponenten, nämlich Fura-2, Ca²⁺ und ein Protein eine Bindung miteinander eingehen, wobei die Dissoziationskonstante K(PFC) oder K′(PFC) ist. Für die Gleichge­ wichte zwischen den drei eine Bindung miteinander eingehenden Komponenten gelten dementsprechend die folgenden Gleichgewichts-Reaktionsgleichungen (1) bis (4):

K(FC) = [F] [C]/[FC] (1)
K(PF) = [P] [F]/[PF] (2)
K(PFC) = [P] [FC]/[PFC] (3)
K′(PFC) = [PF] [C]/[PFC] (4)

worin F für Fura-2 steht, C für Ca²⁺ und P für ein Protein steht und [ ] die Konzentration der jeweiligen Komponenten angibt.

Die oben beschriebenen Proben werden dann mit anregendem Licht bestrahlt, und die emittierten Fluoreszenzspektren werden gemessen. Es wird anregendes Licht einer Wellenlänge von 340 nm, 360 nm und 380 nm verwendet. Da in einer Zelle vier Komponenten zugegen sind, nämlich freies Fura-2, ein Fura-2-Calciumion-Komplex, ein Fura-2-Protein-Komplex und ein Fura-2-Calciumion-Protein-Komplex, sind die Fluoreszenz­ intensitäten der Zelle bei den jeweiligen Wellenlängen die Gesamtsummen der Fluoreszenz­ intensitäten der jeweiligen Komponenten bei der jeweiligen Wellenlänge. Dementsprechend gelten die folgenden Gleichungen 5 bis 7:

I₃₄₀ = [F] I(F)₃₄₀ + [PF] I(PF)₃₄₀ + [FC] I(FC)₃₄₀ + [PFC] I(PFC)₃₄₀ (5)
I₃₆₀ = [F] I(F)₃₆₀ + [PF] I(PF)₃₆₀ + [FC] I(FC)₃₆₀ + [PFC] I(PFC)₃₆₀ (6)
I₃₈₀ = [F] I(F)₃₈₀ + [PF] I(PF)₃₈₀ + [FC] I(FC)₃₈₀ + [PFC] I(PFC)₃₈₀ (7)

In diesen Gleichungen sind folgende Werte bekannte Werte: die Dissoziationskonstante K(FC) der Gleichung der Reaktion zwischen Fura-2 und Ca²⁺; die Dissoziationskonstante K(PF) der Gleichung der Reaktion zwischen Fura-2 und einem Protein; die Dissoziations­ konstante K(PFC) der Gleichung der Reaktion zwischen dem Fura-2-Calciumion-Komplex und einem Protein; die Dissoziationskonstate K′(PFC) der Gleichung der Reaktion zwischen dem Fura-2-Protein-Komplex und dem Calciumion; die Fluoreszenzintensität I(F) von freiem Fura-2 bei den Wellenlängen 340 nm, 360 nm und 380 nm; die Fluoreszenzintensität I(FC) des Fura-2-Calciumion-Komplexes; die Fluoreszenzintensität I(PF) des Fura-2-Protein- Komplexes und die Fluoreszenzintensität I(PFC) des Fura-2-Calciumion-Protein-Komplexes.

Es werden also die jeweiligen Fluoreszenzintensitäten I₃₄₀, I₃₆₀ und I₃₈₀ einer Zelle, in die Fura-2 eingeführt wurde, bei einer Anregung bei den Wellenlängen 340 nm, 360 nm und 380 nm gemessen. Gleichzeitig werden die Gleichungen 1 bis 7 gelöst. Daraus ergibt sich die Konzentration an freiem Ca²⁺ in der Zelle.

In dem oben beschriebenen Verfahren ist es zur Berechnung einer Ionenkonzentration erforderlich, daß die folgenden fünfzehn Konstanten vorher festgesetzt werden:

• - Lichtabsorptions-Koeffizienten oder Fluoreszenzkoeffizienten (drei Konstanten) bei drei unterschiedlichen Wellenlängen, die zur Messung eines Sondenfarbstoffs her­ angezogen werden sollen;
• - Lichtabsorptions-Koeffizienten oder Fluoreszenzkoeffizienten (drei Konstanten) bei den drei unterschiedlichen Wellenlängen, die bei der Messung des Komplexes eines Sondenfarbstoffs mit einem freien Ion verwendet werden sollen;
• - Lichtabsorptions-Koeffizienten oder Fluoreszenzkoeffizienten (drei Konstanten) bei drei Wellenlängen, die bei der Messung des Komplexes der störenden Biosubstanz mit dem Sondenfarbstoff herangezogen werden sollen;
• - Lichtabsorptions-Koeffizienten oder Fluoreszenzkoeffizienten (drei Konstanten) bei drei verschiedenen Wellenlängen, die bei der Messung des Komplexes der störenden Biosubstanz mit dem Sondenfarbstoff und dem freiem Ion verwendet werden sollen;
• - Gleichgewichtskonstante (eine Konstante) des Gleichgewichts der Reaktion zwischen dem Sondenfarbstoff und dem freien Ion;
• - Gleichgewichtskonstante (eine Konstante) des Gleichgewichts der Reaktion zwischen der störenden Biosubstanz und dem Sondenfarbstoff; und
• - Gleichgewichtskonstante (eine Konstante) des Gleichgewichts der Reaktion zwischen der störenden Biosubstanz und dem Komplex aus Sondenfarbstoff und freiem Ion oder Gleichgewichtskonstante (eine Konstante) des Gleichgewichts der Reaktion zwischen dem Komplex aus störender Biosubstanz und Sondenfarbstoff und dem freien Ion (solange eine der Konstanten gegeben ist, kann die andere berechnet werden; erfahrungsgemäß ist die erstgenannte bequem erhältlich.)

Diese fünfzehn Konstanten sind Ergebnis der Messungen der oben beschriebenen Schritte 1 bis 4. Diese Konstanten ergeben sich aus dem modifizierten Simplex-Verfahren und werden sukzessiv asymptotisch angenähert. Dieses modifizierte Simplex-Verfahren ist in allen Einzelheiten beschrieben in "Kawaguchi, Optimization by Simplex Method; Analysis, Juni 1988, Seiten 397 bis 403" und in "J.A. Nelder, R. Mead; Computer J. 7 (1965), 308".

Die Vorgehensweise bei den Verfahren zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration, das die oben beschriebenen Schritte 1 bis 5 umfaßt, wird nachfolgend im einzelnen erläutert.

Zuerst werden vier oder mehr Mischlösungen eines Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs und eines freien Ions mit unterschiedlichen Konzentrationen, drei oder mehr Mischlösungen des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs und einer störenden Biosubstanz mit unterschiedlichen Konzentrationen und drei oder mehr Mischlösungen des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs, des freien Ions und der störenden Biosubstanz mit verschiedenen Konzentrationen hergestellt.

Als Fluoreszenz-Sondenfarbstoff werden Fura-2, Indo-1 oder andere Farbstoffe verwendet. Das freie Ion ist Ca²⁺, Mg²⁺ oder auch andere Ionen. Die störende Biosubstanz ist beispielsweise ein Protein.

Fig. 2 zeigt die Beziehungen zwischen Konzentrationen von Mischlösungen von Fura-2 als Fluoreszenz-Sondenfarbstoff, Ca²⁺ als freies Ion und eines Proteins als störende Biosubstanz sowie die Fluoreszenzintensitäten. Im Teil (a) von Fig. 2 werden die Fluoreszenz­ intensitäten bei den jeweiligen Anregungswellenlängen gemessen, wobei der Gehalt an Protein in den Mischlösungen aus Fura-2 und Protein verändert wird. In Teil (b) von Fig. 2 werden die Fluoreszenzintensitäten bei den jeweiligen Anregungswellenlängen gemessen, wobei die Inhaltsmengen an Ca²⁺ in den Mischlösungen aus Fura-2 und Ca²⁺ verändert werden. In Teil (c) von Fig. 2 werden die Fluoreszenzintensitäten bei den jeweiligen Anregungswellenlängen gemessen, wobei die Inhaltsmengen an Protein in den Misch­ lösungen aus Komplexen von Fura-2, Ca²⁺ und dem Protein geändert werden.

In Teil (b) von Fig. 2 stimmen die Fluoreszenzintensitäten bei den jeweiligen Wellenlängen des anregenden Lichts theoretisch miteinander überein, d. h. die den jeweiligen Anregungs­ licht-Wellenlängen entsprechenden Linien schneiden einander an einem bestimmten Punkt bei einer speziellen Ca²⁺-Konzentration. An diesem Punkt stimmt der Konzentrationswert des Ca²⁺ mit einer Gleichgewichtskonstanten der Reaktion zwischen Fura-2 und dem Ca²⁺ überein. In gleicher Weise schneiden sich in Teil (a) von Fig. 2 die den jeweiligen Anregungslicht-Wellenlängen entsprechenden Linien an einem Punkt, an dem der Protein- Konzentrationswert mit der Gleichgewichtskonstanten der Reaktion zwischen Fura-2 und dem Protein übereinstimmt. Außerdem schneiden sich in Teil (c) von Fig. 2 die den jeweiligen Anregungslicht-Wellenlängen entsprechenden Linien an einem Punkt, an dem der Protein-Konzentrationswert mit der Gleichgewichtskonstanten der Reaktion zwischen Fura-2, dem Ca²⁺ und dem Protein übereinstimmt.

Es werden Mischlösungen eines Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs mit dem freien Ion mit vier oder mehr unterschiedlichen Konzentrationen verwendet. Dies geschieht deswegen, weil - wie in Teil (b) von Fig. 2 gezeigt ist - Fluoreszenzintensitäten an insgesamt vier Punkten gemessen werden, an denen die Konzentration an freiem Ion (Ca²⁺) jeweils niedriger und höher ist, und an zwei Punkten zwischen den niedrigeren und höheren Punkten. Dadurch kann mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung eine Gleichgewichtskonstante angegeben werden. Mischlösungen des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs mit einer störenden Biosubstanz mit drei oder - mehr verschiedenen Konzentrationen werden verwendet. Dies geschieht deswegen, weil - wie in Teil (a) von Fig. 2 gezeigt ist - ein oberer Punkt, an dem die störende Biosubstanz (Protein) in einer höheren Konzentration vorliegt, denselben Wert aufweist wie ein unterer Punkt, in dem die Konzentration an freiem Ion (Ca²⁺) in Teil (b) von Fig. 2 niedriger ist und drei Mischlösungen verwendet werden können. Es werden Mischlösungen des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs, des freien Ions und der störenden Biosubstanz mit drei oder mehr unterschiedlichen Konzentrationen verwendet. Dies geschieht deswegen, weil - wie in Teil (c) von Fig. 2 gezeigt - ein unterer Punkt, an dem die störende Biosubstanz (Protein) eine niedrigere Konzentration aufweist, denselben Wert hat wie an einem höheren Punkt, an dem die Konzentration an freiem Ion (Ca²⁺) in Teil (b) von Fig. 2 höher ist und drei Mischlösungen verwendet werden können.

Danach werden die Fluoreszenzintensitäten bei drei Wellenlängen an diesen Mischlösungen mit dem Drei-Wellenlängen-Fluoreszenz-Meßverfähren gemessen. Wenn in dem vor­ liegenden Verfahren der verwendete Fluoreszenz-Sondenfarbstoff Fura-2 ist, wird Anregungslicht dreier unterschiedlicher Wellenlängen auf die jeweiligen Mischlösungen zur Messung der jeweiligen Fluoreszenzintensitäten eingestrahlt (nachfolgend bezeichnet als "Meßverfahren bei Anregung bei drei Wellenlängen und Fluoreszenz bei einer Wellenlän­ ge"). Wenn im Rahmen der vorliegenden Erfindung der bereitgestellte Fluoreszenz- Sondenfarbstoff Indo-1 ist, wird Anregungslicht einer Wellenlänge auf die Mischlösungen zur Messung der jeweiligen Fluoreszenzintensitäten bei drei Wellenlängen eingestrahlt (nachfolgend bezeichnet als "Meßverfahren bei Anregung mit Licht einer Wellenlänge und Fluoreszenz bei drei Wellenlängen").

Im nächsten Schritt werden sechzehn Sätze von Anfangswerten von fünfzehn Konstanten, die zur Messung einer intrazellulären Ionenkonzentration erforderlich sind, festgesetzt. Dies geschieht deswegen, weil dann, wenn k Konstanten durch das modifizierte Simplex- Verfahren vorgegeben sind, (k + 1) Sätze von Anfangswerten festgesetzt werden. Eine Fluoreszenzintensität wird in jedem der Sätze berechnet. Ein Fehler zwischen diesen Werten und gemessenen Fluoreszenzintensitäten wird angegeben, um zu beurteilen, ob es Sätze von Werten gibt, deren Fehlerwerte innerhalb eines erlaubten Fehlerbereiches liegen. Wenn es solche gibt, wird einer dieser Sätze, dessen Fehlerwert am kleinsten ist, als optimaler Satz der Konstanten bewertet. Wenn es keinen derartigen Satz gibt, wird durch das modifizierte Simplex-Verfahren ein neuer Satz von Konstanten berechnet, der auf dem Satz mit dem größten Fehlerwert, dem Satz mit dem nächstgrößeren Fehlerwert und dem Satz mit dem kleinsten Fehlerwert basiert. Dieser neue Satz ersetzt den Satz mit dem größten Fehler und erzeugt so sechzehn neue Sätze von Konstanten. Unter Verwendung dieser sechzehn neuen Sätze von Konstanten wird derselbe Verfahrensweg durchgeführt, bis ein Satz gefunden ist, dessen Fehlerwert innerhalb des erlaubten Fehlerbereichs liegt.

Auf diesem Wege werden fünfzehn Konstanten optimiert, so daß sich daraus in hohem Maße verläßliche Konstanten ergeben. Danach werden die gegebenen Konstanten in die Gleichgewichts-Reaktionsgleichungen und die Formeln zur Berechnung der Fluoreszenz­ intensität eingesetzt.

Im nächsten Schritt wird ein Fluoreszenz-Sondenfarbstoff in eine Zelle eingeführt. Die Zelle wird danach mit anregendem Licht bestrahlt, und die Fluoreszenzintensität wird gemessen. In dem Fall, in dem Fura-2 den Fluoreszenz-Sondenfarbstoff darstellt, wird das Meßver­ fahren mit drei Wellenlängen bei der Anregung und einer Wellenlänge bei der Fluoreszenz herangezogen. In dem Fall, in dem Indo-1 den Fluoreszenz-Sondenfarbstoff darstellt, wird das Meßverfahren mit einer Anregungswellenlänge und drei Fluoreszenzwellenlängen herangezogen. Danach werden die gemessenen Fluoreszenzintensitätswerte in die Gleichgewichts-Reaktionsgleichungen und in die Formeln zur gleichzeitigen Berechnung der Fluoreszenzintensität eingesetzt. Daraus ergibt sich die intrazelluläre Ionenkonzentration.

In dem Verfahren zur Messung einer intrazellulären Ionenkonzentration gemäß der vorliegenden Erfindung werden also die Konstanten nicht durch analytisches Lösen einer Gleichung höherer Ordnung gegeben, sondern werden durch die sukzessive asymptotische Annäherung durch das modifizierte Simplex-Verfahren angegeben, dessen Rechnung leicht programmiert werden kann. Die Verwendung eines Computers kann die Effizienz einer Bestimmung der Konstanten verbessern. Was außerdem zur Bestimmung der Konstanten zu tun ist, ist die Herstellung von zehn Probensorten und die Messung der Fluoreszenz­ intensitäten. Dies kann drastisch die Arbeit einer Herstellung von Proben und Messung der Fluoreszenzintensitäten herabsetzen. Da außerdem die Ionenkonzentration in der Zelle auf der Grundlage von verläßlich angegebenen Konstanten angegeben wird, kann die resultierende Ionenkonzentration genauer sein.

Nachfolgend wird die Vorrichtung zur Messung der Ionenkonzentration in einer Zelle gemäß der vorliegenden Erfindung erklärt. Die Vorrichtung zur Bestimmung der intrazellulären Ionenkonzentration, die in dem oben beschriebenen Verfahren verwendet wird, wird nachfolgend erklärt.

Die Vorrichtung zur Messung einer intrazellulären Ionenkonzentration gemäß einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird verwendet für das Meßverfahren mit drei Wellenlängen bei der Anregung und einer Wellenlänge bei der Fluoreszenz. Die Vorrichtung umfaßt einen Behälter für das Meßobjekt, eine Einrichtung zur Bestrahlung mit anregendem Licht, eine Einrichtung zum Nachweis der Fluoreszenzintensität, eine erste Bearbeitungsein­ richtung und eine zweite Bearbeitungseinrichtung.

Der Behälter für das Meßobjekt enthält eine der Proben eines Meßobjekts, d. h. eine Zelle mit darin eingeführtem Fluoreszenz-Sondenfarbstoff und eine Vielzahl von Mischlösungen eines Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs, der zur quantitativen Erfassung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle verwendet werden soll, mit dem freien Ion, mit einer störenden Biosubstanz, die eine von dem zu messenden freien Ion verschiedene Substanz ist und eine Bindung mit dem Floureszenz-Sondenfarbstoff und dem freien Ion unter Änderung der Fluoreszenzintensität eingeht, und deren Komplexe, wobei die Mischlösungen unter­ schiedliche relative Konzentrationen aufweisen.

Die Einrichtung zur Bestrahlung mit Anregungslicht erzeugt Anregungslicht mit drei unterschiedlichen Wellenlängen und gibt die Strahlung des Anwendungslichts auf die Probe in dem Behälter mit dem Meßobjekt ab.

Die Einrichtung zur Bestrahlung mit anregendem Licht umfaßt drei Lichtquellen zur Emission von Anregungslicht unterschiedlicher Wellenlängen. Eine der Lichtquellen ist in Übereinstimmung mit einer festgesetzten Wellenlänge des Anregungslichts gewählt und emittiert das Anregungslicht der festgesetzten Wellenlänge aus einer gewählten Lichtquelle. Die Einrichtung zur Bestrahlung mit Anregungslicht umfaßt eine Lichtquelle zur Emission von Licht eines Wellenlängenbereichs, der die drei Wellenlängen des Anregungslichts einschließt, und drei Filter zum Durchtritt von Licht nur von Wellenlängenbereichen, die nahe den jeweiligen verschiedenen Wellenlängen des Anregungslichts sind, und einer der Filter ist in Übereinstimmung mit der festgesetzten Wellenlänge des gewählten Filters zum Durchtritt von Licht der Wellenlänge nahe der Wellenlänge des gewählten Filters gewählt.

Die Einrichtung zum Nachweis der Fluoreszenzintensität weist Intensitäten der Fluoreszenz nach, die durch die Bestrahlung mit dem Anregungslicht erzeugt wird.

Die erste Bearbeitungseinrichtung empfängt Ausgangssignale der Einrichtung zum Nachweis der Fluoreszenzintensität, speichert die Ausgangssignale, setzt Anfangswerte, die auf Fluoreszenzintensitäten im Fall von Mischlösungen basieren, drei Gleichgewichtskonstanten, die in drei unabhängigen Gleichgewichts-Reaktionsgleichungen über Konzentrationen des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs mit dem freien Ion, der störenden Biosubstanz und den Komplexen des freien Ions und der störenden Biosubstanz, die in der Zelle vorkommen, verwendet werden sollen, und Anfangswerte von zwölf Fluoreszenzkoeffizienten fest, die in Formeln zur Berechnung der Fluoreszenzintensität, die Beziehungen zwischen dem Fluoreszenz-Sondenfarbstoff, dem freien Ion, der störenden Biosubstanz und den Komplexen von freiem Ion und störender Biosubstanz ausdrücken, verwendet werden sollen, bewertet Fehlerwerte zwischen Fluoreszenzintensitäten, die auf den Anfangswerten basieren, und Fluoreszenzintensitäten, die als Ausgangssignale von der Vorrichtung zum Nachweis der Fluoreszenzintensitäten abgegeben werden, wiederholt sukzessive asymptotische Korrekturen der Anfangswerte mit dem modifizierten Simplex-Verfahren, bis die Fehlerwerte der Anfangswerte der Fluoreszenzintensitäten aus der Vorrichtung zum Nachweis der Fluoreszenzintensitäten in einen erlaubten Fehlerwertebereich fallen, und bestimmt die zwölf Fluoreszenzkoeffizienten und die drei Gleichgewichtskonstanten.

Die zweite Bearbeitungseinrichtung bestimmt eine Konzentration des freien Ions in der Zelle auf der Basis von Fluoreszenzintensitäten in dem Fall, daß der Fluoreszenz-Sondenfarbstoff in die Zelle eingeführt wurde, indem gleichzeitig die Gleichungen der Formeln zur Berechnung der Fluoreszenzintensität, in die die Fluoreszenzintensitäten eingesetzt wurden, und die Gleichgewichts-Reaktionsgleichungen gelöst werden, um eine Konzentration des freien Ions in der Zelle zu bestimmten.

Es ist bevorzugt, daß der Fluoreszenz-Sondenfarbstoff Fura-2 ist. Freie Ionen sind Ca²⁺, Mg²⁺, usw. Eine störende Biosubstanz ist typischerweise ein Protein.

Die Vorrichtung zur Messung einer intrazellulären Ionenkonzentration gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird für das oben beschriebene Meßverfahren bei einer Wellenlänge für die Einstrahlung und drei Wellenlängen für die Fluoreszenz verwendet und umfaßt einen Behälter für das Meßobjekt, eine Einrichtung zur Bestrahlung mit anregendem Licht, eine Einrichtung zum Nachweis der Fluoreszenzintensität, eine erste Bearbeitungseinrichtung und eine zweite Bearbeitungseinrichtung. Der Behälter für das Meßobjekt, die erste Bearbeitungseinrichtung und die zweite Bearbeitungseinrichtung sind dieselben wie diejenigen bei der ersten Ausführungsform. Nachfolgend werden die Einrichtung zur Bestrahlung mit Anregungslicht und die Einrichtung zum Nachweis der Fluoreszenzintensität erläutert, die verschieden von denen der ersten Ausführungsform sind.

Die Einrichtung zur Bestrahlung mit Anregungslicht erzeugt Anregungslicht mit einer Wellenlänge und strahlt diese auf eine Probe ab, die in dem Behälter für das Meßobjekt enthalten ist.

Die Einrichtung zur Bestrahlung mit Anregungslicht kann eine Lichtquelle zur Abgabe von Anregungslicht einer Wellenlänge einschließen. Die Einrichtung zur Bestrahlung mit Anregungslicht kann eine Lichtquelle zur Emission von Licht eines Wellenlängenbereichs, der die eine Wellenlänge des Anregungslichts einschließt, und ein Filter zum Durchtritt von Licht nur der Wellenlänge des Anregungslichts einschließen.

Die Einrichtung zum Nachweis der Fluoreszenzintensität weist Fluoreszenzintensitäten nach, die in drei Fluoreszenz-Wellenlängenbereichen erzeugt werden.

Die Einrichtung zum Nachweis der Fluoreszenzintensität schließt drei Filter zum Durchtritt von Fluoreszenz nur der drei unterschiedlichen Wellenlängenbereiche ein, wählt eines der Filter, die einem festgesetzten Wellenlängenbereich entsprechen und läßt das Fluoreszenz­ licht des festgelegten Fluoreszenz-Wellenlängenbereichs durchtreten.

Es ist bevorzugt, daß diese Vorrichtung Indo-1 als Fluoreszenz-Sondenfarbstoff verwendet. Ein freies Ion ist Ca²⁺, Mg²⁺ oder andere. Eine störende Biosubstanz ist typischerweise ein Protein.

Es wird nachfolgend der Vorgang zum Messen der intrazellulären Ionenkonzentration mit der Vorrichtung gemäß der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erläutert.

Zuerst werden vier oder mehr Mischlösungen eines Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs mit einer zu messenden Biosubstanz mit unterschiedlichen Konzentrationen hergestellt. Drei oder mehr Mischlösungen des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs mit einer störenden Biosubstanz mit unterschiedlichen Konzentrationen werden hergestellt. Drei oder mehr Mischlösungen des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs mit der zu messenden Biosubstanz und der störenden Biosubstanz mit unterschiedlichen Konzentrationen werden hergestellt. Der Fluoreszenz- Sondenfarbstoff ist Fura-2, und die zu messende Biosubstanz ist Ca²⁺, Mg²⁺ oder andere. Die störende Biosubstanz ist typischerweise ein Protein.

Danach ist eine der Mischlösungen in dem Behälter für das Meßobjekt enthalten. Die Vorrichtung zur Bestrahlung mit Anregungslicht wird unter Bestrahlen mit dem Anregungs­ licht einer der drei Wellenlängen betrieben. Die Intensität der durch die Bestrahlung mit dem Anregungslicht erzeugten Fluoreszenz wird durch die Einrichtung zum Nachweis der Fluoreszenz gemessen. Ein Meßwert der gemessenen Fluoreszenzintensität dient als Ausgangssignal der Einrichtung zum Nachweis der Fluoreszenzintensität an die erste Bearbeitungseinrichtung. Die erste Bearbeitungseinrichtung empfängt und speichert das Ausgangssignal. Das Anregungslicht der beiden anderen Wellenlängen wird nachfolgend ebenfalls auf die Mischlösung in dem Behälter zum Nachweis von Intensitäten der erzeugten Fluoreszenz eingestrahlt. Danach werden die restlichen Mischlösungen aufeinanderfolgend in dem Behälter zum Nachweis der Fluoreszenzintensitäten entsprechend dem Anregungslicht der beiden Wellenlängen angeordnet. Alle Werte der nachgewiesenen Fluoreszenzintensitäten werden an die erste Bearbeitungseinrichtung geleitet und dort gespeichert.

Im Anschluß an den Nachweis der Fluoreszenzintensitäten aller Mischlösungen führt die erste Bearbeitungseinrichtung die folgende Verfahrensfolge auf der Grundlage der gespeicherten Werte der Fluoreszenzintensitäten durch:
Zuerst werden sechzehn Sätze der Anfangswerte von fünfzehn Konstanten festgesetzt, die zur Messung der Ionenkonzentration in der Zelle erforderlich sind. Eine Fluoreszenz­ intensität jedes Satzes wird angegeben, und ein Fehlerwert zwischen dem Wert und einer nachgewiesenen Fluoreszenzintensität wird angegeben. Es wird beurteilt, ob es Sätze gibt, deren Fehlerwerte innerhalb einer Bandbreite der erlaubten Fehlerwerte liegen. Wenn es diese gibt, wird ein derartiger Satz, der den kleinsten Fehlerwert aufweist, als optimaler Satz von Konstanten angesehen. Wenn es keinen solchen Satz gibt, wird ein neuer Satz der Konstanten auf der Grundlage des Satzes mit dem größten Fehler, des Satzes mit dem nächstgrößten Fehler und des Satzes mit dem kleinsten Fehler mit dem modifizierten Simplex-Verfahren berechnet, und der neue Satz ersetzt den Satz mit dem größten Fehlerwert unter Schaffung von sechzehn neuen Sätzen von Konstanten. Derselbe Verfahrensschritt wird an den sechzehn Sätzen von Konstanten wiederholt, bis ein Satz gefunden wurde, dessen Fehlerwert innerhalb des erlaubten Fehlerbereichs liegt.

Die erste Bearbeitungseinrichtung führt die oben beschriebene Verfahrensweise zur Optimierung der fünfzehn Konstanten durch. Es können so in hohem Maße verläßliche Konstanten erhalten werden. Die gegebenen fünfzehn Konstanten werden in die Gleichge­ wichts-Reaktionsgleichungen und die Formeln zur Berechnung der Fluoreszenzintensitäten eingesetzt, und die mit den neuen Werten versehenen Gleichgewichts-Reaktionsgleichungen und Formeln zur Berechnung der Fluoreszenzintensitäten werden in der ersten Bearbeitungs­ einrichtung gespeichert.

Danach wird ein Fluoreszenz-Sondenfarbstoff in eine Zelle eingeführt, und die Zelle wird in den Behälter für das Meßobjekt gegeben. Danach wird die Einrichtung zur Bestrahlung mit Anregungslicht unter Bestrahlung der Zelle mit Anregungslicht einer der drei Wellenlängen betrieben. Die Einrichtung zum Nachweis der Fluoreszenzintensität mißt eine Fluoreszenzintensität der Zelle, und ein Wert der Fluoreszenzintensität wird als Ausgangs­ signal an die zweite Bearbeitungseinrichtung abgegeben. Danach wird das Anregungslicht der beiden anderen Wellenlängen schrittweise eingestrahlt und so Werte der Fluoreszenz­ intensitäten entsprechend dem Anregungslicht gemessen. Alle Werte der Fluoreszenz­ intensitäten, die für die jeweiligen Wellenlängen gemessen werden, werden in der zweiten Bearbeitungseinrichtung gespeichert.

Danach setzt die zweite Bearbeitungseinrichtung die Werte der Fluoreszenz in die Gleichgewichts-Reaktionsgleichungen und die Formeln zur Berechnung der Fluoreszenz­ intensität ein und löst gleichzeitig die Gleichungen unter Erhalt eines Wertes für die Ionenkonzentration in der Zelle.

Nachfolgend wird die Verfahrensweise der Messung der intrazellulären Ionenkonzentration durch die Vorrichtung entsprechend der zweiten Ausführungsform erläutert.

Es werden dieselben Mischlösungen wie bei der ersten Ausführungsform hergestellt. Indo-1 oder andere Verbindungen dienen als Fluoreszenz-Sondenfarbstoff.

Im nächsten Schritt wird eine der Mischlösungen in dem Behälter für die Meßobjekte angeordnet. Die Einrichtung für die Anregungsbestrahlung wird unter Einstrahlen des Anregungslichts einer Wellenlänge betrieben. Danach werden Fluoreszenzintensitäten, die in den drei Wellenlängenbereichen erzeugt wurden, mit der Einrichtung zum Nachweis der Intensität gemessen. Werte der gemessenen Fluoreszenzintensitäten sind Ausgangssignale der Einrichtung zum Nachweis der Fluoreszenzintensität, und die Ausgangssignale werden zu der ersten Bearbeitungseinrichtung weitergeleitet. Die erste Bearbeitungseinrichtung nimmt die Ausgangssignale auf und speichert sie. Danach werden die restlichen Mischlösungen nacheinander in dem Behälter für die Meßobjekte angeordnet, und Fluoreszenzintensitäten der Mischlösungen in den drei Wellenlängenbereichen werden gemessen. Alle Werte der gemessenen Fluoreszenzintensitäten werden als Eingangssignale der ersten Bearbeitungsein­ richtung zugeführt und dort gespeichert.

Im Anschluß an den Nachweis der Fluoreszenzintensitäten aller Mischlösungen wird dieselbe erste Verfahrensweise wie in der ersten Ausführungsform auf der Grundlage der gespeicherten Fluoreszenzintensitäten durchgeführt, und zwölf Fluoreszenzkoeffizienten und drei Gleichgewichtskonstanten werden bestimmt.

Danach wird ein Fluoreszenz-Sondenfarbstoff in eine Zelle eingeführt, und die Zelle wird in dem Behälter für die Meßobjekte angeordnet. Danach wird die Einrichtung zur Anregungsstrahlung unter Bestrahlung mit Anregungslicht einer Wellenlänge betrieben.

Fluoreszenzintensitäten, die durch die Zelle in den drei Wellenlängenbereichen erzeugt wurden, werden durch die Einrichtung zum Nachweis der Fluoreszenzintensität gemessen, und die Meßwerte der Fluoreszenzintensitäten werden als Ausgangssignale der zweiten Bearbeitungseinrichtung zugeführt. Alle Werte der Fluoreszenzintensitäten, die in den jeweiligen Wellenlängenbereichen gemessen wurden, werden durch die zweite Bearbeitungs­ einrichtung gespeichert.

Im nächsten Schritt setzt die zweite Bearbeitungseinrichtung die Werte der Fluoreszenz­ intensitäten in die Gleichgewichts-Reaktionsgleichungen und die Formeln zur Berechnung der Fluoreszenzintensität ein. Gleichzeitig werden die Gleichungen gelöst, und es wird eine intrazelluläre Ionenkonzentration angegeben.

So werden in der Vorrichtung zur Messung einer intrazellulären Ionenkonzentration gemäß der vorliegenden Erfindung Konstanten durch asymptotische sukzessive Annäherung unter Verwendung des modifizierten Simplex-Verfahrens ermittelt. Dementsprechend sind die gegebenen Konstanten in hohem Maße zuverlässig. Werte der intrazellulären Ionenkonzen­ trationen, die auf der Basis von in derart hohem Maße zuverlässigen Konstanten gemessen werden, können exakt sein.

Die vorliegenden Erfindung läßt sich noch besser aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung und den beigefügten Figuren verstehen, die nur zur Veranschaulichung der Erfindung angegeben werden und damit nicht als die vorliegende Erfindung beschränkend anzusehen sind.

Der weitere Umfang der Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung wird aus der detaillierten nachfolgenden Beschreibung offensichtlich. Es versteht sich jedoch, daß die detaillierte Beschreibung und die speziellen Beispiele auch im Hinblick darauf, daß sie bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung angeben, nur zur Veranschaulichung der Erfindung angegeben werden, da verschiedene Änderungen und Modifikationen im Hinblick auf den Geist und den Umfang der Erfindung für Fachleute aus der folgenden detaillierten Beschreibung offensichtlich werden.

Fig. 1 ist eine optische Zusammenstellung der Wechselwirkungen zwischen Fura-2, einem nachzuweisenden Ion (z. B. Ca²⁺) und einem Protein.

Fig. 2 ist eine optische Zusammenstellung der Beziehungen zwischen den Fluoreszenz­ intensitäten und Konzentrationen von Fura-2, Protein und Ca²⁺ sowie ihren Komplexen.

Fig. 3 ist ein Fließbild des Verfahrens zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration gemäß einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wobei Fura-2 verwendet wird.

Fig. 4 ist ein Fließbild des Verfahrens zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration gemäß der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, in der Indo-1 verwendet wird.

Fig. 5 ist eine Ansicht der Vorrichtung zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration gemaß der dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.

Fig. 6 ist eine Ansicht der Vorrichtung zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration gemäß der vierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.

Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden nun unter Bezugnahme auf die Zeichnungen erläutert.

Im Verfahren und in der Vorrichtung gemäß einer ersten Ausführungsform ist der Fluoreszenz-Sondenfarbstoff Fura-2, und Anregungslicht dreier unterschiedlicher Wellenlängen wird eingestrahlt, um die Fluoreszenzintensitäten unter Erhalt eines Wertes der Ca²⁺-Konzentration zu messen.

Zuerst wird das Verfahren gemäß der ersten Ausführungsform erläutert. Fig. 3 zeigt das Fließbild des Verfahrens gemäß der ersten Ausführungsform.

Es werden fünf Mischlösungen von Fura-2 und Ca⁺² mit unterschiedlichen Konzentrationen hergestellt. Die Fluoreszenzintensitäten der fünf Mischlösungen werden nach Anregung bei drei unterschiedlichen Wellenlängen gemessen, nämlich λ₁ = 340 nm, λ₂ = 360 nm und λ₃ = 380 nm (Schritt 100 in Fig. 3). Danach werden vier Mischlösungen von Fura-2 und Protein mit unterschiedlichen Konzentrationen hergestellt, und die Fluoreszenzintensitäten der vier Mischlösungen werden nach Anregung bei den drei unterschiedlichen Wellenlängen gemessen (Schritt 110 in Fig. 3). Vier Mischlösungen von Fura-2, Protein und Ca²⁺ mit unterschiedlichen Konzentrationen werden hergestellt, und die Fluoreszenzintensitäten der vier Mischlösungen werden nach Anregung bei den drei Wellenlängen gemessen (Schritt 120 in Fig. 3).

Danach werden sechzehn Sätze von Anfangswerten wahlfrei gewählter Fluoreszenzkoeffi­ zienten und Gleichgewichtskonstanten angefertigt (Schritt 200 in Fig. 3). Anfangswerte der jeweiligen Konstanten werden so gewählt, daß physikalisch bedeutungslose Lösungen nicht gewählt werden, da die jeweiligen Konstanten synthetische Konstanten von Lösungen kubischer Gleichungen sind. Auf der Grundlage von Streubreiten gemessener Fluoreszenz­ intensitätswerte der jeweiligen Sätze von Anfangswerten, die in den Formeln zur Berechnung der Fluoreszenzintensitäten verwendet werden sollen, werden Fehlerwerte angegeben, und es wird abgeschätzt, ob es Sätze gibt, deren Fehlerwerte in einem erlaubten Fehler­ wertebereich liegen (Schritt 210 in Fig. 3). Wenn es solche Sätze gibt, wird einer dieser Sätze, der den kleinsten Fehler aufweist, als optimaler Satz der Konstanten beurteilt (Schritt 230 in Fig. 3). Wenn es keinen derartigen Satz gibt, ersetzt ein neuer Satz, der durch das modifizierte Simplex-Verfähren auf der Grundlage des Satzes mit dem größten Fehler, des Satzes mit dem nächstgrößten Fehler und des Satzes mit dem kleinsten Fehler berechnet wird, den Satz mit dem größten Fehler unter Erzeugung neuer sechzehn Sätze der Konstanten (Schritt 220 in Fig. 3). Es folgt danach Schritt 210, und die Schritte 210 und 220 werden wiederholt, bis ein Satz mit einem Fehler innerhalb des erlaubten Fehlerbereichs gefunden ist.

So werden fünfzehn Arten von Konstanten unter Bestimmung der jeweils höchst zuver­ lässigen Fluoreszenzkoeffizienten und Gleichgewichtskonstanten optimiert (Schritt 230 in Fig. 3).

Danach wird Fura-2 in eine Zelle eingeführt (Schritt 240 in Fig. 3). Es werden Fluoreszenzintensitäten, die durch Bestrahlung mit anregendem Licht bei den drei oben genannten Wellenlängen erzeugt werden, gemessen (Schritt 250 in Fig. 3). Diese gemessenen Fluoreszenzintensitäten werden in die Gleichgewichts-Konstantengleichungen und die Formeln zur Berechnung der Fluoreszenzintensitäten unter Lösung dieser gleichzeitigen Gleichungen eingesetzt (Schritt 260 in Fig. 3). So ergibt sich ein Wert der Ca²⁺-Konzentration (Schritt 270 in Fig. 3).

Auf diesem Wege kann die Ionenkonzentration in der Zelle mit hoher Zuverlässigkeit gemessen werden.

In der ersten Ausführungsform stellt Fura-2 den Fluoreszenz-Sondenfarbstoff dar. Wenn jedoch andere Sondenfarbstoffe wie beispielsweise Indo-1 als Fluoreszenz-Sondenfarbstoffe verwendet werden, ist es wegen der Fluoreszenzcharakteristika von Indo-1 bevorzugt, daß eine Messung unter Anregung bei einer Wellenlänge und Fluoreszenz bei drei Wellenlängen durchgeführt wird.

Fig. 4 ist ein Fließbild des Verfahrens zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, in der der Fluoreszenz- Sondenfarbstoff Indo-1 ist.

Fünf Mischlösungen von Indo-1 und Ca²⁺ mit unterschiedlichen Konzentrationen werden hergestellt. Die Intensitäten von Fluoreszenz, die in drei Fluoreszenz-Wellenlängenbereichen erzeugt wird, und zwar in den Bereichen λ₄ = 400 nm, λ₅ = 440 nm und λ₆ = 480 nm, wenn Anregungslicht einer Wellenlänge λ = 355 nm auf die Mischlösungen eingestrahlt wird, werden gemessen (Schritt 300 in Fig. 4). Vier Mischlösungen von Indo-1 mit einem Protein mit unterschiedlichen Konzentrationen werden hergestellt, und die Fluoreszenz­ intensitäten, die in den oben beschriebenen drei Wellenlängenbereichen erzeugt wurden, wenn Anregungslicht einer Wellenlänge auf die Mischlösungen eingestrahlt wird, werden gemessen (Schritt 310 in Fig. 4). Vier Mischlösungen von Indo-1, Protein und Ca²⁺ werden hergestellt, und die Fluoreszenzintensitäten, die in den oben beschriebenen drei Wellenlängenbereichen erzeugt wurden, wenn Anregungslicht einer Wellenlänge auf die Mischlösungen eingestrahlt wird, werden gemessen (Schritt 320 in Fig. 4).

Danach werden sechzehn Sätze von Anfangswerten wahlfrei gewählter Fluoreszenzkoeffi­ zienten und Gleichgewichtskonstanten angefertigt (Schritt 330 in Fig. 4). Auf der Grundlage der Streubreiten der gemessenen Fluoreszenzintensitätswerte der jeweiligen Sätze von Anfangswerten, die in den Formeln zur Berechnung der Fluoreszenzintensität verwendet werden sollen, werden Fehlerwerte angegeben. Es wird abgeschätzt, ob es Sätze gibt, deren Fehlerwerte in einem erlaubten Fehlerwertebereich liegen (Schritt 340 in Fig. 4). Wenn es solche Sätze gibt, wird ein derartiger Satz, der den kleinsten Fehlerwert aufweist, als optimaler Satz der Konstanten bewertet (Schritt 360 in Fig. 4). Wenn es solche Sätze nicht gibt, ersetzt ein neuer Satz, der mit dem modifizierten Simplex-Verfahren auf der Grundlage des Satzes mit dem größten Fehler, des Satzes mit dem nächstgrößten Fehler und des Satzes mit dem kleinsten Fehler berechnet wird, den Satz mit dem größten Fehler unter Erzeugung neuer sechzehn Sätze der Konstanten (Schritt 350 in Fig. 4). Danach folgt Schritt 340, und die Schritte 340 und 350 werden wiederholt, bis ein Satz mit einem Fehlerwert innerhalb des erlaubten Fehlerwertebereichs gefunden wurde.

So werden fünfzehn Arten von Konstanten unter Bestimmung der jeweiligen höchstzuver­ lässigen Fluoreszenzkoeffizienten und Gleichgewichtskonstanten optimiert (Schritt 360 in Fig. 4).

Danach wird Indo-1 in eine Zelle eingeführt (Schritt 370 in Fig. 4). Fluoreszenz­ intensitäten, die in den oben angegebenen drei Wellenlängenbereichen erzeugt wurden, wenn Anregungslicht einer Wellenlänge auf die Zelle eingestrahlt wird, werden gemessen (Schritt 380 in Fig. 4). Die gemessenen Fluoreszenzintensitäten werden in die Gleichgewichts-Kon­ stantengleichungen und die Formeln zur Berechnung der Fluoreszenzintensität unter Lösung dieser gleichzeitigen Gleichungen eingesetzt (Schritt 390 in Fig. 4). Hieraus ergibt sich ein Wert der Ca²⁺-Konzentration (Schritt 400 in Fig. 4).

Auf diesem Wege kann die Ionenkonzentration in der Zelle mit hoher Zuverlässigkeit gemessen werden.

Nachfolgend wird nun die Vorrichtung zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration, die in dem Verfahren zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration gemäß einer dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet wird, näher erläutert.

Die Vorrichtung zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration gemäß der dritten Ausführungsform der Erfindung wird verwendet bei der Durchführung des Verfahrens zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration gemäß der ersten Ausführungsform der Erfindung. Sie wird nachfolgend unter Bezugnahme auf Fig. 5 erläutert. Die Vorrichtung gemäß dieser Ausführungsform ist geeignet zur Durchführung des Meßverfahrens bei Anregung in drei Wellenlängenbereichen und Fluoreszenz in einem Wellenlängenbereich. Der Fluoreszenz-Sondenfarbstoff zur Messung der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration ist Fura-2. Eine störende Biosubstanz ist typischerweise ein Protein. Das Anregungslicht der drei Wellenlängen hat die Wellenlängen 340 nm, 360 nm und 380 nm.

Die in Fig. 5 gezeigte Vorrichtung umfaßt einen Behälter 3 für das Meßobjekt zum Zweck des Enthaltens der Probe, nämlich einer der Mischlösungen, die in dem Verfahren gemäß der ersten Ausführungsform verwendet werden, und eine Zelle mit darin eingeführtem Fura- 2, eine Anregungslicht-Bestrahlungseinheit 1 zur Bestrahlung der Probe in dem Behälter 3 mit dem erforderlichen Anwendungslicht, eine Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinheit 2 zum Nachweis von Fluoreszenzintensitäten, die von der Probe emittiert werden, erste und zweite Bearbeitungseinrichtungen zur Aufnahme von Werten der Fluoreszenzintensitäten von der Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinheit 2. Die erste und die zweite Bearbeitungsein­ richtung sind in eine Bearbeitungseinheit 4 eingebaut.

Die Anregungslicht-Bestrahlungseinheit 1 schließt eine Lichtquelle 11 zur Emission von Licht bestimmter Wellenlängenbereiche einschließlich der drei Wellenlängenbereiche des Anregungslichts, eine Bündelungslinse 12 zum Bündeln der Lichtstrahlung aus der Lichtquelle 11 und eine Filtereinheit 13 zum Durchtritt von Anregungslicht der erforderli­ chen Wellenlänge ein. Die Filtereinheit 13 schließt drei Filter 131, 132 und 133 ein, die entsprechend der erforderlichen Wellenlängen des Anregungslichts geschaltet werden können. Die Filter 131, 132 bzw. 133 lassen Licht der Wellenlängen nahe 340 nm, 360 nm und 380 nm durchtreten.

Die Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinheit 2 schließt eine Bündelungslinse 22 zur Bündelung der Lichtstrahlung, die das Filter 23 durchlaufen hat, und eine Fluoreszenzintensitäts- Nachweisvorrichtung 21 zum Nachweis der Fluoreszenzintensität ein, die durch die Bündelungslinse 22 hindurchgetreten ist.

Der Meßvorgang mit Hilfe dieser Vorrichtung verläuft wie folgt: Fünf Mischlösungen von Fura-2 mit Ca²⁺ mit unterschiedlichen Konzentrationen werden hergestellt. Eine der Mischlösungen ist in dem Behälter 3 enthalten. Die Filtereinheit 13 wird eingeschaltet, um das Filter 131 zu betreiben. Die Lichtquelle 11 wird betrieben, um durch das Filter 131 Anregungslicht eines Wellenlängenbereichs nahe 340 nm hindurchzuschicken und dieses auf die Mischlösung in dem Behälter 3 einzustrahlen.

Fluoreszenzlicht von der Mischlösung, die mit dem Anregungslicht bestrahlt wurde, tritt durch ein Filter 23 hindurch und wird als Eingangssignal an die Fluoreszenzintensitäts- Nachweisvorrichtung 21 durch die Bündelungslinse 22 geleitet. Die Fluorszenzintensitäts- Nachweisvorrichtung 21 mißt die Intensität der Eingangsfluoreszenz und sendet einen Wert der gemessenen Intensität an die Bearbeitungseinheit 4 als Ausgangssignal. Die Be­ arbeitungseinheit 4 speichert den Wert.

Danach wird die Filtereinheit 13 umgeschaltet, um Anregungslicht eines Wellenlängenbe­ reichs nahe 360 nm durch das Filter 132 hindurchtreten zu lassen und dieses Licht auf die Mischlösung in dem Behälter 3 einzustrahlen. Die Fluoreszenzintensität wird durch die Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinheit 21 gemessen. Im nächsten Schritt wird die Fil­ tereinheit 13 umgeschaltet, um Anregungslicht eines Wellenlängenbereichs nahe 380 nm durch das Filter 133 hindurchtreten zu lassen und dieses auf die Mischlösung einzustrahlen. Die Fluoreszenzintensität wird gemessen. Danach wird dieselbe Verfahrensweise an den restlichen vier Mischlösungen durchgeführt, und Fluoreszenzintensitäten, die durch das Anregungslicht der oben beschriebenen drei Wellenlängen erzeugt wurden, werden gemessen.

Im nächsten Schritt werden vier Mischlösungen von Fura-2 mit Protein mit unterschiedlichen Konzentrationen hergestellt. Auf dieselbe Weise, wie sie oben beschrieben wurde, werden Fluoreszenzintensitäten bei Anregungslicht der oben genannten drei Wellenlängen gemessen. Danach werden vier Mischlösungen von Fura-2 mit Protein und Ca²⁺ hergestellt. In derselben Weise, wie dies oben beschrieben wurde, werden Fluoreszenzintensitäten bei den oben beschriebenen drei Wellenlängen gemessen.

Alle Werte der Fluoreszenzintensitäten dieser dreizehn Mischlösungen werden in der Bearbeitungseinheit 4 gespeichert.

Im Anschluß an die Messung der Fluoreszenzintensität der dreizehn Mischlösungen führt die in die Bearbeitungseinheit 4 eingebaute erste Bearbeitungseinrichtung die folgende Verfahrensweise durch: Als erstes werden sechzehn Sätze von Anfangswerten der zwölf Fluoreszenzkoeffizienten und drei Gleichgewichtskonstanten, die im Zusammenhang mit den Ausführungsformen des Verfahrens beschrieben wurden, festgesetzt. Die Anfangswerte werden so gewählt, daß die jeweiligen Konstanten, die analytische Konstanten von Lösungen von kubischen Gleichungen sind, nicht physikalisch unsinnig sind.

Danach werden Fehlerwerte der gemessenen Fluoreszenzintensitätswerte gegenüber berechneten Werten, die auf der Grundlage der Anfangswerte mit Hilfe der Formeln zur Berechnung der Fluoreszenzintensität angegeben werden, angegeben, und es wird abgeschätzt, ob es Sätze gibt, deren Fehlerwerte im erlaubten Fehlerwertebereich liegen. Wenn es solche Sätze gibt, wird der Satz dieser Sätze mit dem kleinsten Fehler als Optimalsatz der Konstanten bewertet. Wenn es einen solchen Satz nicht gibt, wird ein neuer Satz auf der Grundlage des Satzes mit dem größten Fehler, des Satzes mit dem nächst­ größten Fehler und des Satzes mit dem kleinsten Fehler mit Hilfe des modifizierten Simplex- Verfahrens berechnet, und der neue Satz ersetzt den Satz mit dem größten Fehler unter Bildung neuer sechzehn Sätze von Konstanten.

Danach wird dieselbe Verfahrensweise wiederholt, bis ein Satz gefunden wird, dessen Fehler innerhalb des erlaubten Fehlerbereichs liegt, so daß optimale drei Gleichgewichtskonstanten und zwölf Fluoreszenzkoeffizienten gebildet werden. Die so bestimmten drei Gleichgewichts­ konstanten und zwölf Fluoreszenzkoeffizienten werden in die Gleichgewichts-Reaktions­ gleichungen und die Formeln zur Berechnung der Fluoreszenzintensität unter Speicherung in der Bearbeitungseinheit 4 eingesetzt.

Danach wird Fura-2 in eine Zelle eingeführt, und die Zelle wird in den Behälter 3 für das Meßobjekt gegeben. Die Filtereinheit 13 wird umgeschaltet, um nacheinander Anregungs­ licht einer Wellenlänge von 340 nm, 360 nm und 380 nm durchtreten und auf die Zelle einstrahlen zu lassen. Fluoreszenzintensitäten, die in der Zelle erzeugt werden, werden nacheinander mit der Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinheit 2 gemessen. Werte der gemessenen Fluoreszenzintensitäten werden zu der Bearbeitungseinheit 4 geleitet, und alle Werte der Fluoreszenzintensitäten für das Anregungslicht der drei Wellenlängen werden gespeichert.

Die zweite Bearbeitungseinrichtung, die in die Bearbeitungseinheit 4 eingebaut ist, setzt die gespeicherten Werte der Fluoreszenzintensitäten in die Gleichgewichts-Reaktionsgleichungen und Formeln zur Berechnung der Fluoreszenzintensität unter Lösen der gleichzeitigen Gleichungen ein. So wird ein Wert der Konzentration an Ca²⁺ ermittelt.

Auf dem genannten Weg wird in der vorliegenden Vorrichtung ein Konzentrationswert für Ca²⁺ auf der Basis von in hohem Maße zuverlässigen Fluoreszenzkoeffizienten und Gleichgewichtskonstanten angegeben. Die erhaltenen Werte sind daher in hohem Maße zuverlässig.

In der Vorrichtung gemäß der dritten Ausführungsform, die in dem Verfahren gemäß der ersten Ausführungsform eingesetzt wird, wird die Filtereinheit 13 umgeschaltet, um Anregungslicht einer erforderlichen Wellenlänge einzustrahlen. Es ist jedoch auch möglich, daß die Lichtquelle 11 drei Lichtquellen zum Einstrahlen von Anregungslicht der jeweiligen Wellenlängen einschließt und daß eine der drei Lichtquellen entsprechend der erforderlichen Wellenlänge des Anregungslichts gewählt wird, damit Anregungslicht der erforderlichen Wellenlänge von der gewählten Lichtquelle emittiert wird.

Nachfolgend wird unter Bezugnahme auf Fig. 5 die Vorrichtung zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration gemäß einer vierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die in dem Verfahren gemäß der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet wird, erläutert. Die Vorrichtung gemäß dieser Ausführungsform wird für das Meßverfahren bei Anregung durch Licht einer Wellenlänge und Emission von Fluoreszenzintensität dreier Wellenlängen verwendet. Zur Messung der Ca²⁺-Konzentration dient Indo-1 als Fluoreszenz-Sondenfarbstoff. Eine störende Biosubstanz ist typischerweise ein Protein. Die drei Fluoreszenz-Wellenlängen, die gemessen werden sollen, liegen bei 400 nm, 440 nm und 480 nm.

Die Vorrichtung zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration, die in dem Verfahren gemäß der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, schließt einen Behälter 3 für das Meßobjekt zum Enthalten einer Probe, nämlich einer der Mischlösungen und einer Zelle mit darin eingeführtem Indo-1, eine Anregungslicht- Bestrahlungseinheit 5 zum Abstrahlen von Anregungslicht einer erforderlichen Wellenlänge an die Probe in dem Behälter 3, eine Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinheit 6 zur Messung der Fluoreszenzintensität der Probe und erste und zweite Bearbeitungseinrichtungen zum Aufnehmen, Speichern und Verarbeiten von Fluoreszenzintensitätswerten ein, die als Ausgangssignale von der Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinheit stammen. Die erste und die zweite Bearbeitungseinrichtung sind in eine Bearbeitungseinheit 4 eingebaut.

Die Anregungslicht-Bestrahlungseinheit 5 schließt eine Lichtquelle 51 zur Emission von Licht von bestimmten Wellenlängenbereichen einschließlich einer Wellenlänge des Anregungslichts und eine Bündelungslinse 52 zum Bündeln von Lichtstrahlen aus der Lichtquelle 51 sowie ein Filter 53 zum Durchtretenlassen von Anregungslicht eines festgesetzten Wellenlängenbereichs ein.

Die Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinheit 6 schließt eine Filtereinheit 63 zum Durch­ tretenlassen von Fluoreszenz von festgesetzten Wellenlängenbereichen, eine Bündelungslinse 62 zum Bündeln von Licht, das durch das Filter 63 hindurchtritt, und eine Fluoreszenz­ intensitäts-Nachweisvorrichtung 61 zur Aufnahme von Licht durch die Bündelungslinse 62 und Messung der Fluoreszenzintensität ein. Die Filtereinheit 63 schließt drei Filter 631, 632 und 633 ein, die jeweils Fluoreszenz von Wellenlängen nahe 400 nm, 440 nm und 480 nm passieren lassen.

Die Arbeitsweise der Vorrichtung zum Messen der intrazellulären Ionenkonzentration ist wie folgt: Zuerst werden fünf Mischlösungen von Indo-1 mit Ca²⁺ mit unterschiedlichen Konzentrationen hergestellt. Eine der Mischlösungen wird in dem Behälter 3 für das Meßobjekt angeordnet. Die Anregungslicht-Bestrahlungseinheit 5 wird unter Bestrahlen der Mischlösung in dem Behälter 3 mit Anregungslicht betrieben. Danach wird die Filtereinheit 63 eingeschaltet, um durch das Filter 631 Fluoreszenz einer Wellenlänge von 400 nm aus der Mischlösung hindurchtreten zu lassen, die mit Anregungslicht bestrahlt wurde. Die Fluoreszenz wird durch die Bündelungslinse 62 an die Fluoreszenzintensitäts-Nachweisvor­ richtung 61 geleitet. Die Fluoreszenzintensitäts-Nachweisvorrichtung 61 mißt die Intensität der einlaufenden Fluoreszenz und gibt als Ausgangswert einen Wert der Intensität an die Bearbeitungseinheit 4 ab. Die Bearbeitungseinheit 4 speichert diesen Wert. Danach wird die Filtereinheit 63 der Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinheit 6 umgeschaltet, um durch das Filter 632 Fluoreszenz eines Wellenlängenbereichs nahe 440 nm hindurchtreten zu lassen, und die Nachweiseinheit mißt die Intensität der Fluoreszenz. Danach wird die Filtereinheit 63 umgeschaltet, um durch das Filter 633 Fluoreszenz eines Wellenlängenbereichs nahe 480 nm hindurchtreten zu lassen, und die Nachweiseinheit mißt die Intensität der Fluoreszenz. Danach wird diese Verfahrensweise an den verbleibenden vier Mischlösungen durchgeführt, und die Fluoreszenzintensitäten werden in den drei Wellenlängenbereichen gemessen.

Danach werden vier Mischlösungen von Indo-1 mit Protein mit unterschiedlichen Konzentrationen hergestellt. In derselben Weise, wie dies oben angegeben wurde, werden Fluoreszenzintensitäten in den drei Wellenlängenbereichen gemessen. Als nächstes werden vier Mischlösungen von Indo-1 mit Protein und Ca²⁺ mit unterschiedlichen Konzentrationen hergestellt. In derselben Weise, wie dies oben beschrieben wurde, werden Fluoreszenz­ intensitäten in den drei Wellenlängenbereichen gemessen.

Alle Fluoreszenzintensitätswerte, die an den dreizehn Mischlösungen gemessen wurden, werden durch die Bearbeitungseinheit 4 gespeichert.

Im Anschluß an die Messung an den dreizehn Mischlösungen wird dasselbe Verfahren wie das, was in der ersten Bearbeitungseinrichtung in der Vorrichtung gemäß der dritten Ausführungsform durchgeführt wurde, mit der ersten Bearbeitungseinrichtung durchgeführt, die in die Bearbeitungseinheit 4 eingebaut ist, und es werden zwölf Fluoreszenzkonstanten und drei Gleichgewichtskonstanten bestimmt.

Als nächstes wird Indo-1 in eine Zelle eingeführt, und die Zelle wird in den Behälter 3 für das Meßobjekt gegeben. Die Anregungslicht-Bestrahlungseinheit 5 wird unter Bestrahlen der Zelle in dem Behälter 3 mit dem Anregungslicht betrieben. Die Filtereinheit 63 wird so geschaltet, daß die Fluoreszenz der drei Wellenlängenbereiche, die von der Zelle durch Bestrahlen mit dem Anregungslicht erzeugt werden, die jeweiligen Filter 631, 632 und 633 durchläuft, und die Fluoreszenzintensitäts-Nachweisvorrichtung 61 mißt die jeweiligen Fluoreszenzintensitäten in den jeweiligen Wellenlängenbereichen. Werte der gemessenen Fluoreszenzintensitäten werden als Eingangssignal an die Bearbeitungseinheit 4 geleitet, und die Bearbeitungseinheit 4 speichert Fluoreszenzintensitätswerte in allen drei Wellenlängenbe­ reichen.

Die zweite Bearbeitungseinrichtung, die in die Bearbeitungseinheit 4 eingebaut ist, setzt die gespeicherten Werte der Fluoreszenzintensitäten in die Gleichgewichts-Reaktionsgleichungen und die Formeln zur Berechnung der Fluoreszenzintensitäten unter Lösung der gleichzeitigen Gleichungen ein. So wird ein Wert der Ca²⁺-Konzentration erhalten.

Auf diesem Weg werden in der Vorrichtung gemäß der vierten Ausführungsform Werte für die Konzentration des Ca²⁺ auf der Basis hochzuverlässiger Fluoreszenzkoeffizienten und Gleichgewichtskonstanten angegeben. Die Werte sind dementsprechend sehr zuverlässig.

In der Vorrichtung gemäß der dritten Ausführungsform emittiert die Lichtquelle 51 Licht eines Wellenlängenbereichs einschließlich einer erforderlichen Wellenlänge. Es kann jedoch auch eine Lichtquelle verwendet werden, die Anregungslicht der einen erforderlichen Wellenlänge emittiert.

In den Vorrichtungen zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration gemäß der dritten und vierten Ausführungsform der Erfindung können die Fluoreszenzintensitäts-Nachweisvor­ richtungen Spektofluoreszenz-Meßgeräte (Spektrofluoreszenz-Meter) sein. Der Fluoreszenz­ koeffizient ändert sich in Abhängigkeit von der Dicke einer Probe eines Meßobjekts, d. h. der optischen Weglänge. Es ist also erforderlich, die optischen Weglängen der Proben zu vereinheitlichen. In den Spektrofluoreszenz-Meßgeräten der dritten und vierten Ausführungs­ form ist die Dicke einer der Messung zu unterwerfenden Zelle die optische Weglänge, und der Wert der optischen Weglänge kann immer konstant sein. Die Fluoreszenzintensitäts- Nachweisvorrichtung kann mit Fluoreszenz-Mikroskopen mit Photometern versehen sein. Zur Messung mit diesen Fluoreszenz-Mikroskopen ist es erforderlich, konische fokale optische Systeme einzubauen, mit denen sich Teilbilder einer bestimmten Dicke erzeugen lassen.

Durch das Verfahren und die Vorrichtung zur Messung der intrazellulären Ionenkonzen­ tration gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Konzentration des freien Ions Mg²⁺ gemessen werden. Für diese Messung kann der Fluoreszenz-Sondenfarbstoff ein Farbstoff sein, der zur Messung der Konzentration von Mg²⁺ geeignet ist.

Fluoreszenz-Sondenfarbstoffe und Wellenlängen des Anregungslichts sind nicht notwendiger­ weise auf diejenigen beschränkt, deren Benutzung im Zusammenhang mit den einzelnen Ausführungsformen offenbart wurde. Selbst dann, wenn die Wellenlängen des Anregungs­ lichts in Abhängigkeit von den charakteristischen Eigenschaften der Fluoreszenzfarbstoffe verändert werden, kann die Aufgabe der vorliegenden Erfindung immer noch gelöst werden.

Aus der obigen Beschreibung der Erfindung ist es offensichtlich, daß die Erfindung auf viele Arten variiert werden kann. Solche Variationen sollten jedoch nicht als Abweichen vom Geist und vom Umfang der Erfindung angesehen werden. Alle diese Modifikationen sind - wie dies einem mit dem Gebiet vertrauten Fachmann klar ist - in den Bereich der folgenden Patentansprüche eingeschlossen.

Claims (31)

1. Verfahren zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration unter Verwendung eines Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs einschließlich des Einführens des Fluoreszenz-Sondenfarb­ stoffs in eine Zelle und Messung der freien Ionenkonzentration in der Zelle auf der Grundlage der Intensitäten der durch Bestrahlung der Zelle mit Anregungslicht erzeugten Fluoreszenz, wobei das Verfahren umfaßt:

• - den ersten Schritt einer Messung von Intensitäten der durch Bestrahlung einer ersten Zahl von Mischlösungen der Fluoreszenz-Sondenfarbstoffe und des freien Ions mit verschiedenen relativen Konzentrationen mit Anregungslicht dreier unterschiedlicher Wellenlängen erzeugten Fluoreszenz;
• - den zweiten Schritt einer Messung von Intensitäten der durch Bestrahlung einer zweiten Zahl von Mischlösungen einer störenden Biosubstanz, die eine von dem freien Ion verschiedene Substanz ist, ein Meßobjekt ist und Bindungen mit dem Fluoreszenz-Sondenfarbstoff und dem freien Ion eingeht und die Fluoreszenzintensität ändert, und dem Sondenfarbstoff mit Anregungslicht dreier unterschiedlicher Wellenlängen erzeugten Fluoreszenz, wobei die Mischlösungen unterschiedliche relative Konzentrationen aufweisen;
• - einen dritten Schritt einer Messung von Intensitäten der durch Bestrahlung einer dritten Zahl von Mischlösungen der störenden Biosubstanz, des Fluoreszenz- Sondenfarbstoffs und des freien Ions mit Anregungslicht dreier unterschiedlicher Wellenlängen erzeugten Fluoreszenz, wobei die Mischlösungen unterschiedliche relative Konzentrationen aufweisen;
• - einen vierten Schritt des Festsetzens von Anfangswerten dreier Arten von Gleichge­ wichtskonstanten, die in drei Arten unabhängiger Gleichgewichts-Reaktions­ gleichungen von Reaktionen zwischen dem Fluoreszenz-Sondenfarbstoff, dem freien Ion, der störenden Biosubstanz und ihren in der Zelle vorhandenen Komplexen zu verwenden sind, und Anfangswerten von zwölf Arten von Fluoreszenzkoeffizienten, die in Formeln zur Berechnung der Fluoreszenzintensitäten zu verwenden sind, die Beziehungen zwischen dem Fluoreszenz-Sondenfarbstoff, dem freien Ion, der störenden Biosubstanz und ihren Komplexen ausdrücken; Abschätzens der Fehler- Werte zwischen den auf der Grundlage der Anfangswerte angegebenen Fluoreszenz­ intensitäten und den in den Schritten 1 bis 3 gemessenen Fluoreszenzintensitäten und sukzessiven Wiederholens asymptotischer Korrekturen der Anfangswerte mittels des modifizierten Simplex-Verfahrens, bis die Fehlerwerte der Anfangswerte von den gemessenen Fluoreszenzintensitäten in einen erlaubten Bereich fallen; und
• - den fünften Schritt der Messung von Intensitäten der durch Bestrahlen der Zelle mit Anregungslicht dreier verschiedener Wellenlängen erzeugten Fluoreszenz und Lösen der gleichzeitigen Gleichungen der Formeln zur Berechnung der Fluoreszenz­ intensität, in die die gemessenen Fluoreszenzintensitäten eingesetzt sind, und der Gleichgewichts-Reaktionsgleichungen unter Erhalt der Konzentration des freien Ions.

2. Verfahren zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration nach Anspruch 1, worin die erste Zahl 4 oder höher ist, die zweite Zahl 3 oder höher ist und die dritte Zahl 3 oder höher ist.

3. Verfahren zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration nach Anspruch 1, worin sechzehn Sätze von drei Arten von Gleichgewichtskonstanten und sechzehn Sätze der Anfangswerte von zwölf Arten von Fluoreszenzkoeffizienten bei Anwendung des modifizierten Simplex-Verfahrens festgesetzt werden.

4. Verfahren zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration nach Anspruch 1, worin der Fluoreszenz-Sondenfarbstoff Fura-2 ist.

5. Verfahren zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration nach Anspruch 1, worin das freie Ion Ca²⁺ ist.

6. Verfahren zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration nach Anspruch 1, worin das freie Ion Mg⁺² ist.

7. Verfahren zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration nach Anspruch 1, worin die störende Biosubstanz ein Bioprotein ist.

8. Verfahren zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration unter Verwendung eines Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs, einschließlich des Einführens des Fluoreszenz-Sondenfarb­ stoffs in eine Zelle und Messen der freien Ionenkonzentration in der Zelle auf der Grundlage von Intensitäten der durch Bestrahlung der Zelle mit Anregungslicht erzeugten Fluoreszenz, wobei das Verfahren umfaßt:

• - den ersten Schritt einer Messung von Intensitäten der in drei Fluoreszenz-Wellenlän­ genbereichen durch Bestrahlung einer ersten Zahl von Mischlösungen der Fluo­ reszenz-Sondenfarbstoffe und des freien Ions mit unterschiedlichen reiativen Konzen­ trationen mit Anregungslicht erzeugten Fluoreszenz;
• - den zweiten Schritt einer Messung von Intensitäten der durch Bestrahlung einer zweiten Zahl von Mischlösungen einer störenden Biosubstanz, die eine von dem freien Ion verschiedene Substanz ist, ein Meßobjekt ist und Bindungen mit dem Fluoreszenz-Sondenfarbstoff und dem freien Ion eingeht und die Fluoreszenzintensität ändert, und des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs mit Anregungslicht der einen Wellenlänge erzeugten Fluoreszenz, wobei die Mischlösungen unterschiedliche relative Konzentrationen aufweisen;
• - einen dritten Schritt einer Messung von Intensitäten der in den drei Fluoreszenz- Wellenlängenbereichen durch Bestrahlung einer dritten Zahl von Mischlösungen der störenden Biosubstanz, des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs und des freien Ions mit Anregungslicht der einen Wellenlänge erzeugten Fluoreszenz, wobei die Misch­ lösungen unterschiedliche relative Konzentrationen aufweisen;
• - einen vierten Schritt des Festsetzens von Anfangswerten dreier Arten von Gleichge­ wichtskonstanten, die in drei Arten unabhängiger Gleichgewichts-Reaktions­ gleichungen von Reaktionen zwischen dem Fluoreszenz-Sondenfarbstoff, dem freien Ion, der störenden Biosubstanz und ihren in der Zelle vorhandenen Komplexen zu verwenden sind, und Anfangswerten von zwölf Arten von Fluoreszenzkoeffizienten, die in Formeln zur Berechnung der Fluoreszenzintensitäten zu verwenden sind, die Beziehungen zwischen dem Fluoreszenz-Sondenfarbstoff, dem freien Ion, der störenden Biosubstanz und ihren Komplexen ausdrücken; Abschätzens der Fehler­ werte zwischen den auf der Grundlage der Anfangswerte angegebenen Fluoreszenz­ intensitäten und den in den Schritten 1 bis 3 gemessenen Fluoreszenzintensitäten und sukzessiven Wiederholens asymptotischer Korrekturen der Anfangswerte mittels des modifizierten Simplex-Verfahrens, bis die Fehlerwerte der Anfangswerte von den gemessenen Fluoreszenzintensitäten in einen erlaubten Bereich fallen; und
• - den fünften Schritt der Messung von Intensitäten der durch Bestrahlen der Zelle mit Anregungslicht der einen Wellenlänge erzeugten Fluoreszenz und Lösen der gleichzeitigen Gleichungen der Formeln zur Berechnung der Fluoreszenzintensität, in die die gemessenen Fluoreszenzintensitäten eingesetzt sind, und der Gleichge­ wichts-Reaktionsgleichungen unter Erhalt der Konzentration des freien Ions.

9. Verfahren zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration nach Anspruch 8, worin der Fluoreszenz-Sondenfarbstoff Indo-1 ist.

10. Verfahren zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration nach Anspruch 8, worin die erste Zahl 4 oder höher ist, die zweite Zahl 3 oder höher ist und die dritte Zahl 3 oder höher ist.

11. Verfahren zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration nach Anspruch 8, worin sechzehn Sätze von drei Arten von Gleichgewichtskonstanten und sechzehn Sätze der Anfangswerte von zwölf Arten von Fluoreszenzkoeffizienten bei Anwendung des modifizierten Simplex-Verfahrens festgesetzt werden.

12. Verfahren zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration nach Anspruch 8, worin das freie Ion Ca²⁺ ist.

13. Verfahren zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration nach Anspruch 8, worin das freie Ion Mg²⁺ ist.

14. Verfahren zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration nach Anspruch 8, worin die störende Biosubstanz ein Bioprotein ist.

15. Vorrichtung zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration, umfassend

• - einen Meßobjekt-Behälter zum Enthalten einer Zelle mit einem darin eingeführten Fluoreszenz-Sondenfarbstoff und einer Vielzahl von Mischlösungen eines Fluo­ reszenz-Sondenfarbstoffs zur Verwendung zur quantitativen Erfassung der Konzentration eines freien Ions, einer zu messenden Probe in einer Zelle, des freien Ions und einer störenden Biosubstanz, die eine von dem zu messenden freien Ion verschiedene Substanz ist und eine Bindung mit dem Fluoreszenz-Sondenfarbstoff und dem freien Ion unter Änderung der Fluoreszenzintensität eingeht, und ihrer Komplexe, wobei die Mischlösungen unterschiedliche reiative Konzentrationen aufweisen;
• - eine Anregungslicht-Bestrahlungseinrichtung zur Erzeugung von Anregungslicht mit drei unterschiedlichen Wellenlängen und zur Einstrahlung des Anregungslichts auf die Probe in dem Meßobjekt-Behälter;
• - eine Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung zum Nachweis von Fluoreszenz­ intensitäten, die durch Einstrahlung des Anregungslichts erzeugt werden;
• - eine erste Bearbeitungseinrichtung zur Aufnahme eines Ausgangssignals der Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung, Speicherung des Ausgangssignals, Festsetzen von Anfangswerten auf der Grundlage der Fluoreszenzintensitäten in dem Fall der Mischlösungen, drei Arten von Gleichgewichtskonstanten zur Verwendung in drei unabhängigen Gleichgewichts-Reaktionsgleichungen über Konzentrationen des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs, des freien Ions, der störenden Biosubstanz und ihrer Komplexe, die in der Zelle zugegen sind, und von Anfangswerten von zwölf Fluoreszenzkoeffizienten zur Verwendung in Formeln zur Berechnung der Fluoreszenzintensität, die Beziehungen zwischen dem Fluoreszenz-Sondenfarbstoff, dem freien Ion, der störenden Biosubstanz und ihren Komplexen ausdrücken, Abschätzen von Fehlern zwischen Fluoreszenzintensitäten auf der Grundlage der Anfangswerte und Fluoreszenzintensitäten, die als Ausgangssignale aus der Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung stammen, sukzessives Wiederholen asymptotischer Korrekturen der Anfangswerte mit dem modifizierten Simplex- Verfahren, bis ein Fehler der Anfangswerte der Fluoreszenzintensitäten von der Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung in einen erlaubten Fehlerwertebereich fällt, und Bestimmung der zwölf Fluoreszenzkoeffizienten und der drei Gleichge­ wichtskonstanten; und
• - eine zweite Bearbeitungseinrichtung zur Bestimmung der Konzentration des freien Ions in der Zelle auf der Grundlage der Fluoreszenzintensitäten im Fall einer Zelle, in die der Fluoreszenz-Sondenfarbstoff eingeführt wurde, durch Lösen der gleichzeitigen Gleichungen der Formeln zur Berechnung der Fluoreszenzintensität, in die die Fluoreszenzintensitäten eingesetzt sind, und der Gleichgewichts-Reaktions­ gleichungen unter Bestimmung der Konzentration des freien Ions in der Zelle.

16. Vorrichtung zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration nach Anspruch 15, worin die Anregungslicht-Bestrahlungseinrichtung eine Lichtquelle zur Emission von Licht eines Wellenlängenbereichs einschließlich dreier Wellenlängen des Anregungslichts und drei Filter zum Durchtritt von Licht nur eines Wellenlängenbereichs nahe der verschiedenen Wellenlängen des Anregungslichts umfaßt, wobei eines der drei Filter gewählt ist in Übereinstimmung mit einer festgesetzten Wellenlänge des Anregungslichts unter Durchtritt von Licht einer Wellenlänge nahe der festgesetzten Wellenlänge des Anregungslichts.

17. Vorrichtung zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration nach Anspruch 15, worin die Anregungslicht-Bestrahlungseinrichtung drei Lichtquellen zur Emission von Anregungsficht verschiedener Wellenlängen umfaßt, wobei eine der Lichtquellen gewählt wird in Übereinstimmung mit einer festgesetzten Wellenlänge des Anregungslichts unter Emission des Anregungslichts der festgesetzten Wellenlänge von der gewählten Lichtquelle.

18. Vorrichtung zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration nach Anspruch 15, worin sechzehn Sätze der Anfangswerte der drei Arten von Gleichgewichtskonstanten und die zwölf Fluoreszenzkoeffizienten bei Anwendung des modifizierten Simplex-Verfahrens in der ersten Bearbeitungseinrichtung festgesetzt werden.

19. Vorrichtung zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration nach Anspruch 15, worin der Fluoreszenz-Sondenfarbstoff Fura-2 ist.

20. Vorrichtung zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration nach Anspruch 15, worin das freie Ion Ca²⁺ ist.

21. Vorrichtung zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration nach Anspruch 15, worin das freie Ion Mg²⁺ ist.

22. Vorrichtung zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration nach Anspruch 15, worin die störende Biosubstanz ein Bioprotein ist.

23. Vorrichtung zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration, umfassend

• - einen Meßobjekt-Behälter zum Enthalten einer Zelle mit einem darin eingeführten Fluoreszenz-Sondenfarbstoff und einer Vielzahl von Mischlösungen eines Fluo­ reszenz-Sondenfarbstoffs, der zur quantitativen Erfassung der Konzentration eines freien Ions verwendet werden soll, einer zu messenden Probe in einer Zelle, des freien Ions und einer störenden Biosubstanz, die eine von dem zu messenden freien Ion verschiedene Substanz ist und eine Bindung mit dem Fluoreszenz-Sondenfarbstoff und dem freien Ion unter Änderung der Fluoreszenzintensität eingeht, und deren Komplexen, wobei die Mischlösungen verschiedene relative Konzentrationen aufweisen;
• - eine Anregungslicht-Bestrahlungseinrichtung zur Erzeugung von Anregungslicht mit einer Wellenlänge und zum Einstrahlen des Anregungslichts auf die Probe in dem Meßobjekt-Behälter;
• - eine Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung zum Nachweis der Intensitäten von in drei Wellenlängenbereichen durch Einstrahlung des Anregungslichts erzeugter Fluoreszenz;
• - eine erste Bearbeitungseinrichtung zur Aufnahme eines Ausgangssignals der Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung, Speicherung des Ausgangssignals, Festsetzen von Anfangswerten auf der Grundlage der Fluoreszenzintensitäten in dem Fall der Mischlösungen, drei Arten von Gleichgewichtskonstanten zur Verwendung in drei unabhängigen Gleichgewichts-Reaktionsgleichungen über Konzentrationen des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs, des freien Ions, der störenden Biosubstanz und ihrer Komplexe, die in der Zelle zugegen sind, und von Anfangswerten von zwölf Fluoreszenzkoeffizienten zur Verwendung in Formeln zur Berechnung der Fluoreszenzintensität, die Beziehungen zwischen dem Fluoreszenz-Sondenfarbstoff, dem freien Ion, der störenden Biosubstanz und ihren Komplexen ausdrücken, Abschätzen von Fehlern zwischen Fluoreszenzintensitäten auf der Grundlage der Anfangswerte und Fluoreszenzintensitäten, die als Ausgangssignale aus der Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung stammen, sukzessives Wiederholen asymptotischer Korrekturen der Anfangswerte mit dem modifizierten Simplex- Verfahren, bis ein Fehler der Anfangswerte der Fluoreszenzintensitäten von der Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung in einen erlaubten Fehlerwertebereich fällt, und Bestimmung der zwölf Fluoreszenzkoeffizienten und der drei Gleichge­ wichtskonstanten; und
• - eine zweite Bearbeitungseinrichtung zur Bestimmung der Konzentration des freien Ions in der Zelle auf der Grundlage der Fluoreszenzintensitäten im Fall einer Zelle, in die der Fluoreszenz-Sondenfarbstoff eingeführt wurde, durch Lösen der gleichzeitigen Gleichungen der Formeln zur Berechnung der Fluoreszenzintensität, in die die Fluoreszenzintensitäten eingesetzt sind, und der Gleichgewichts-Reaktions­ gleichungen unter Bestimmung der Konzentration des freien Ions in der Zelle.

24. Vorrichtung zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration nach Anspruch 23, worin die Anregungslicht-Bestrahlungseinrichtung eine Lichtquelle zur Emission von Licht eines Wellenlängenbereichs einschließlich einer Wellenlänge des Anregungslichts und ein Filter zum Durchtritt von Licht eines Wellenlängenbereichs nahe der Wellenlänge des Anregungslichts umfaßt.

25. Vorrichtung zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration nach Anspruch 23, worin die Anregungslicht-Bestrahlungseinrichtung eine Lichtquelle zur Emission des Anregungslichts einer Wellenlänge einschließt.

26. Vorrichtung zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration nach Anspruch 23, worin die Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung drei Filter zum Durchtritt von Fluoreszenzlicht unterschiedlicher Wellenlängenbereiche umfaßt und man einen der drei Filter in Übereinstimmung mit einem festgesetzten Fluoreszenz-Wellenlängenbereich auswählt und Fluoreszenz des festgesetzten Fluoreszenz-Wellenlängenbereichs durch das ausgewählte Filter passieren läßt.

27. Vorrichtung zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration nach Anspruch 23, worin sechzehn Sätze der Anfangswerte der drei Arten von Gleichgewichtskonstanten und die zwölf Fluoreszenzkoeffizienten bei Anwendung des modifizierten Simplex-Verfahrens in der ersten Bearbeitungseinrichtung festgesetzt werden.

28. Vorrichtung zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration nach Anspruch 23, worin der Fluoreszenz-Sondenfarbstoff Indo-1 ist.

29. Vorrichtung zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration nach Anspruch 23, worin das freie Ion Ca²⁺ ist.

30. Vorrichtung zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration nach Anspruch 23, worin das freie Ion Mg²⁺ ist.

31. Vorrichtung zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration nach Anspruch 23, worin die störende Biosubstanz ein Bioprotein ist.