DE19703025C2

DE19703025C2 - Verfahren zur Messung von Konzentrationen sowie zur kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Messung des Umsatzes und der Geschwindigkeit enzymatischer oder nichtenzymatischer Reaktionen von Pyrophosphaten und/oder linearen Polyphosphaten unter Ausschluß von zyklischen Polyphosphaten als auch von Orthophosphaten in einer Probe sowie Anwendung des Verfahrens

Info

Publication number: DE19703025C2
Application number: DE1997103025
Authority: DE
Inventors: Bernd Dr Lorenz; Werner E G Prof Dr Mueller; Heinz C Prof Dr Dr Schroeder
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-01-28
Filing date: 1997-01-28
Publication date: 1999-04-29
Anticipated expiration: 2017-01-29
Also published as: DE19703025A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren nach Anspruch 1 zur Messung von Konzentrationen sowie zur kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Messung des Umsatzes und der Geschwindigkeit enzymatischer oder nichtenzymatischer Reaktionen von Pyrophosphaten und/oder linearen Polyphosphaten unter Ausschluß von zyklischen Polyphosphaten als auch von Orthophosphaten, sowie Anwendung des Verfahrens nach den Ansprüchen 4 und 5.

Das Verfahren beruht auf der bekannten Eigenschaft von verschiedenen Kationen, die Fluoreszenz von bestimmten kationensensitiven Fluoreszenzfarbstoffen auszulöschen bzw. zu erhöhen. Als Beispiele seien nachfolgend einige genannt: Die Fluoreszenzintensität von Fura-2 wird durch Mn²⁺, Co²⁺, Ni²⁺, Fe²⁺; von Fura- Red durch Mn²⁺, Cu⁺, Hg²⁺, Co²⁺, Tb³⁺; von Calcein durch Cu⁺, Cu²⁺, Ni²⁺, Co²⁺, Tb³⁺; von Mag-Fura-Red durch Zn²⁺, Cu⁺, Cd²⁺, Hg²⁺, Ni²⁺ nahezu vollständig ausgelöscht. Demgegenüber steigt die Fluoreszenzintensität z. B. von Calcium-Green-1 bei Anwesenheit von Cd²⁺, Ca²⁺, Hg²⁺, Tb³⁺; die von Calcium Crimson bei Cd²⁺, Ca²⁺, Hg²⁺, Zn²⁺, Tb³⁺; die von Fluo-3 durch Cd²⁺, Ca²⁺, Hg²⁺, Tb³⁺ um ein Vielfaches an (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985); Thomas und Delaville "Ihe use of fluorescenct indicators for measurements of cytosolic-free calcium concentration in cell populations and single cells." In: J. G. McCormack und P. H. Cobbold (eds.) Cellular Calcium - A Practical Approach. IRL-Press, Oxford, S. 1-54 (1991); R. P. Hauglend "Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals", Sixth edition, Molecular Probes Inc., Eugene, USA, Kapitel 22, S. 503-540 (1996)). Da Polyphosphate, Pyrophosphate oder ähnliche Verbindungen eine hohe Affinität zu Metallkationen - insbesondere zu zweiwertigen - besitzen, konkurrieren sie mit den Fluoreszenzfarbstoffen um die Bindung dieser Kationen. Das führt dazu, dass der primäre Effekt der Kationen auf die Fluoreszenzfarbstoffe durch steigende Konzentrationen an den konkurrierenden Verbindungen in wachsendem Maße aufgehoben wird, was für den Nachweis und die Konzentrationsbestimmung dieser Substanzen ausgenutzt werden kann.

Verfahren, bei denen der zu bestimmende Analyt wie auch die Indikatorsubstanz eine spezifische Affinität zu einer dritten Substanz besitzen und das entsprechende Nachweissystem in der Art und Weise darauf aufbaut, dass das spezifische Bindungsverhalten für die Trennung bzw. Immobilisierung und den Nachweis der zu analysierenden Substanz genutzt wird oder durch die Konkurrenz des Analyten und des Indikators um die Bindungsstelle an der dritten Substanz ein verwertbares Meßsignal erzeugt wird, sind prinzipiell bekannt (DE 29 52 498 A1). Ferner wurde ein Verfahren zur Detektion von Polyanionen nach ihrer chromatografischen Trennung beschrieben, das darauf beruht, dass diese Anionen um die Bindung von mehrwertigen Kationen mit einem Kationenindikator konkurrieren und der Entzug der Kationen aus dem Kation-Indikator-Komplex eine Veränderung des Meßsignals verursacht (DE 38 23 996 A1). In Bezug auf die anorganischen Polyphosphate besitzt dieses Verfahren den Nachteil, dass es neben den linearen auch die zyklischen Polyphosphate sowie Orthophosphat erfasst. Diese Tatsache erlaubt keine Messung von Reaktionen, bei denen Orthophosphat von Pyrophosphat bzw. linearen Polyphosphaten abgespalten wird (z. B. Pyrophosphatase-, Exopolyphosphatasereaktion) bzw. bei denen Pyrophosphat entsteht (z. B. UDP-Glucose-pyrophosphorylase od. 2',5'- Oligoadenylatsynthetase), dessen Bildung über einen gekoppelten enzymatischen Test mit Pyrophosphatase verfolgt werden könnte. Daneben ist in o. g. Verfahren als Nachweislösung nach der chromatografischen Trennung der Polyphosphate ein Puffer mit sehr hoher Ionenstärke (1,3 M) im basischen Bereich verwendet worden. Die Elution der Polyphosphate erfolgte hingegen in saurer ungepufferter Lösung (0,2 mM HCl). Der pH-Wert dieser Lösung ist kritisch, da Polyphosphate im sauren pH- Bereich leicht hydrolysiert werden. Außerdem erlaubt die Zusammensetzung der in diesem Verfahren verwendeten Lösungen erstens keine Durchführung von enzymatischen Reaktionen im Versuchsansatz und ist außerdem sehr störanfällig gegenüber Verunreinigungen oder interferieren Substanzen, wie sie gerade in Proben aus biologischem Material auftreten können: z. B. andere Polyanionen als die zu analysierenden Polyphosphate (z. B. Nukleinsäuren, Glukosaminoglykane), andere mehrwertigen Kationen als das Indikatorkation (z. B. Mg²⁺, Ca²⁺, Zn²⁺) oder andere Substanzen mit einer signifikanten Affinität zum Kationenindikator (z. B. Proteine, Chelatoren).

Aufgabe der Erfindung ist es deshalb, ein stabiles Nachweissystem mit einem physiologischen Milieu zu entwickeln, das erstens nur die linearen Polyphosphate erfaßt (was auch ohne vorherige chromatografische Auftrennung möglich sein sollte), das zweitens die Durchführung von enzymatischen Reaktionen erlaubt und das drittens die Stabilität der Polyphosphate gewährleistet.

Die Lösung der Aufgabe erfolgte dadurch, dass bei dem entwickelten Verfahren aufgrund der spezifischen Zusammensetzung des Bestimmungsansatzes - wie in denen im Anspruch 1 formulierten Merkmalen definiert - der Effekt auf die Veränderung des kationenspezifischen Indikatormeßsignals durch Orthophosphat bzw. zyklische Polyphosphate mehr als tausendfach geringer ist als der von linearen Polyphosphaten. Außerdem wird durch das vorhandene Milieu neben der Beständigkeit der Polyphosphate auch das Durchführen von enzymatischen Reaktionen gewährleistet. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Ansprüchen 2-3 beschrieben. Vorteilhafte Anwendungen sind in den Ansprüchen 4 und 5 angegeben.

Erläuterungen zu den Abbildungen

Im nachfolgenden sind die erläuternden Legenden zu abgebildeten Grafiken aufgeführt:

In der Abb. 1a sind die Excitationsspektren von Fura-2 in Puffer A in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen von MnCl₂ gezeigt: (a) 0; (b) 0,005; (c) 0,02; (d) 0,05; (e) 0,1; (f) 0,2; (g) 0,5; (h) 1; (i) 10 und (j) 100 µM MnCl₂. Die Spektren wurden bei variierender Excitationwellenlänge von 300 bis 420 nm aufgenommen. Abb. 1b zeigt die Excitationsspektren von Fura-2 in Puffer A in Anwesenheit verschiedenen Konzentrationen von MnCl₂ und steigenden Konzentrationen an Poly(P) mit einer durchschnittlichen Kettenlänge von 15: (a-h) Zusatz von 0,5 µM MnCl₂ und 0 (a), 1 (b), 2 (c), 3 (d), 4 (e), 5 (f), 10 (g) und 20 µM Poly(P) (h), (i) kein Zusatz; F_F; Fluoreszenzintensität der Fura-Lösung in Abwesenheit von Poly(P) und MnCl₂; F₀, Fluoreszenzintensität der Fura-Lösung in Anwesenheit von 0.5 µM MnCl₂ aber Abwesenheit von Poly(P).

In der Abb. 2 ist die Abhängigkeit der relativen Erhöhung der Fura-2- Fluoreszenzintensität bei 360 nm in Anwesenheit von MnCl₂ dargestellt: in Abb. 2a von der Konzentration an Poly(P) einer durchschnittlichen Kettenlänge von 15 bzw. in der Abb. 2b vom Logarithmus der Konzentration an Poly(P). Die willkürlichen Einheiten wurden berechnet aus der relativen Fluoreszenz der Fura- Lösung in Abwesenheit (F_F) und in Anwesenheit von 0,5 µM MnCl₂ (F₀), sowie bei Zusatz von Poly(P) in Anwesenheit von 0,5 µM MnCl₂ (F_S) nach der Formel (F_S - F₀)/(F_F - F₀).

In der Abb. 3 ist die Abhängigkeit der Anstiege der Kalibrierkurven von Polyphosphaten mit verschiedener Kettenlänge demonstriert: Die Anstiege der Kalibrierkurven von Pyrophosphat, Tripolyphosphat, Tetrapolyphosphat und Poly(P) mit der durchschnittlichen Kettenlänge von 5, 15, 25, 35 wurden gegen den Logarithmus der Kettenlänge aufgetragen. Die Daten wurden aus den Kalibrierkurven für Poly(P)- Konzentrationen von 4-80 µM ermittelt. Die Anstiege sind in willkürlichen Einheiten angegeben.

Die Abb. 4 stellt die Zeitkinetik der Aktivität der anorganischen Pyrophosphatase dar: Vergleich der Fura-Methode (o) mit der Orthophosphatbestimmung mit Ammoniummolybdat ("). Die Menge an Orthophosphat nach kompletter Hydrolyse des Polyphosphats wurde 100% gesetzt. Die Ergebnisse sind Durchschnittswerte von jeweils zwei unabhängigen Experimenten mit jeweils Dreifachbestimmungen.

In der Abb. 5 ist der kontinuierliche enzymatische Abbau von Pyrophosphat veranschaulicht: Die Reaktion wurde mit (a) 50, (b) 75 und (c) 100 ng Enzym gestartet und die Fluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 360 nm ununterbrochen verfolgt.

Die Abb. 6 zeigt den thermischen Abbau von Poly(P) mit einer Kettenlänge von 15: bei pH 3 (Abb. 6a) und bei pH 1 (Abb. 6b). Der Prozentsatz des abgebauten Poly(P) ist in Abhängigkeit von der Zeit aufgetragen.

Die Abb. 7 sind die Effekte verschiedener Konzentrationen an Tripolyphosphat und Trimetaphosphat auf die Fura-2 Fluoreszenzintensität bei 360 nm in Anwesenheit von 0,5 µM MnCl₂ dargestellt. Die Erhöhung der Fluoreszenzintensität ist in willkürlichen Einheiten angegeben und wurde gegen den Logarithmus der Konzentration von Trimetaphosphat (o) und Tripolyphosphat (.) aufgetragen.

In den nachfolgend beschriebenen Beispielen für das erfindungsgemäße Verfahren werden der Fluoreszenzindikator Fura-2 und Mn²⁺ benutzt. Wie oben bereits erwähnt, löschen Mn²⁺-Ionen Fluoreszenz von Fura-2 sehr stark aus (Abb. 1A). Durch Zugabe von Polyphosphat kann dieser Effekt bei steigenden Konzentrationen in wachsenden Maße aufgehoben werden (Abb. 1B).

Beispiel für die Durchführung des Assays Materialien

Bei den nachfolgend beschriebenen Experimenten wurden heterogene Gemische von Polyphosphaten mit einer durchschnittlichen Kettenlänge von 5, 10, 15, 25, 35 verwendet (Poly(P)-Glas Typ 5, 15, 25, 35; Sigma Chemical Co., St. Luis, USA). Pyrophosphat, Tripolyphosphat, Tetrapolyphosphat, Trimetaphosphat sowie die anorganische Pyrophosphatase (Hefe) wurden ebenfalls von Sigma Chemical Co. bezogen. Die Konzentrationsangaben der Polyphosphate beziehen sich, wenn nicht anders angegeben, auf die relative Molekülmasse des Gesamtmoleküls. Das Fura-2- pentakaliumsalz wurde von Molecular Probes, Leiden, Niederlande erworben. Die Fluoreszenzmessungen wurden mit einem Zweistrahlphotometer (Sigma ZWS, Eppendorf) durchgeführt. Für die Emission wurde ein Cut-off-Filter (KV-500, Schott) verwendet.

Durchführung des Assays

Eine 0,625 µM Lösung von Fura-2 in Puffer A (30 mM Tris-HCl pH 7,2; 30 mM NaHCO₃; 150 mM NaCl; 12 mM KCl) wird frisch hergestellt. Für jede Messung werden 1,6 ml dieser Lösung in eine Quarzküvette überführt. 200 µl einer 5 µM Lösung und 200 µl der polyphosphathaltigen Probe werden hinzugefügt und das emittierte Licht im Fluoreszenzspektrophotometer bei einer Anregung von 360 nm gemessen. Die Endkonzentrationen von Fura-2 und MnCl₂ betragen in diesem Beispiel 0,5 µM.

Um die Vergleichbarkeit der Werte zu gewährleisten, wird die initiale Fluoreszenz der Fura-2-Lösung immer auf einen festen Wert eingestellt (hier 1,0) unter Abwesenheit von Poly(P) beim Anregungsmaximum bezogen auf einen 2 ml Assay (Endkonz. 0,5 µM). Die Differenz zwischen der initialen Fluoreszenz der Fura-2- Lösung ohne und der mit MnCl₂ wurden als eine willkürliche Einheit festgelegt. Die Abhängigkeit der willkürlichen Einheiten (alternativ auch der Fluoreszenzintensität bei 360 nm) von der Pyrophosphat- bzw. Polyphosphatkonzentration ergibt eine hyperbole Funktion, die vom Logarithmus der Konzentration einen sigmoiden Verlauf im Konzentrationbereich von 0-150 µM mit einem weiten praktisch linearen Bereich. (Abb. 2).

Die Detektion kann auch mit anderen Systemen, die Fluoreszenz erfassen können, erfolgen: z. B. Fluoreszenz-ELISA-Platten-Reader, HPLC-Fluoreszenzdetektor.

Beeinflussende Faktoren

Die Dissoziationskonstanten der Fluoreszenzfarbstoff Kationen-Komplexe werden von einer Reihe von Faktoren wie pH-Wert, Ionenstärke, Temperatur, Proteinen und konkurrierenden Ionen beeinflusst. Dementsprechend wird auch der entwickelte Assay von diesen Faktoren beeinflusst:

1. pH-Wert:
Der Test kann in einem weitem pH-Bereich durchgeführt werden, der geeignete Bereich liegt zwischen pH 7,2-8,0.
2. Ionenstärke
Mit steigender Ionenstärke nimmt die Sensitivität des Assays ab.
3. Proteine
Proteine stören in höheren Konzentrationen den Assay und müssen deshalb gegebenenfalls vorher entfernt (z. B. mit dem StrataClean-Austauschharz, Stratagene, La Jolla, USA)
4. Konkurrierende Ionen, wie z. B. Magnesium-Ionen stören den Assay und müssen gegebenenfalls vorher aus den Extrakten oder Enzymassays entfernt werden (z. B. durch den Kationenaustauscher Dowex 50Wx4; Roth, Karlsruhe).
5. Temperatur
Der Assay wird gewöhnlich bei Raumtemperatur durchgeführt. Wenn erforderlich, sind auch höhere Temperaturen möglich, z. B. 37°C.

Der beschriebene Effekt der ist außerdem von ihrer Kettenlänge abhängig. Trägt man die Anstiege der Kalibriergeraden, die sich bei der Abhängigkeit der willkürlichen Einheiten der Fluoreszenzintensität vom Logarithmus der Konzentration der Polyphosphate verschiedener Kettenlängen ergibt, gegen den Logarithmus der Kettenlänge auf, so erhält man eine lineare Abhängigkeit (Abb. 3). Somit kann die Methode auch zur Bestimmung der Kettenlänge von Polyphosphaten und zur Konzentrationsbestimmung von Proben unbekannter Konzentration eingesetzt werden im letzteren Fall wird eine Verdünnungsreihe der unbekannten Probe hergestellt. Anschließend wird die Fluoreszenzerhöhung der einzelnen Probenverdünnungen gemessen und anhand des erhaltenen Anstieges die Kettenlänge ermittelt sowie die entsprechende Konzentration berechnet.

Der Einfluss von Orthophosphat auf den Quenching-Effekt der Mn²⁺-Ionen auf die Fura-2-Fluoreszenz ist bis zu Konzentrationen von 10 mM vernachlässigbar. Diese Tatsache ermöglicht, dass Enzymreaktionen bei denen von Pyrophosphat oder Polyphosphaten Orthophosphat abgespalten wird zu verfolgen.

Anwendung der Methode

Um die Anwendbarkeit und Sensitivität der neuen Methode (hier im speziellen Fall Fura-Methode im weiteren genannt) zu demonstrieren, wurde sie für die Konzentrationsbestimmung von Polyphosphaten aus verschiedenen Geweben, für die Bestimmung der Enzymaktivitäten der anorganischen Pyrophosphatase und der Exopolyphosphatase aus der Hefe sowie für den Nachweis nichtenzymatischen Abbaus bei Hitzeeinwirkung eingesetzt und mit anderen bisher bekannten Methoden verglichen:

a) Bestimmung mit dem basischen Farbstoff Toluidin-Blau (auch als metachromatische Reaktion von Polyphosphaten bezeichnet; Leitão et al., Mar. Ecol. Prog. Ser. 121, 279-288 (1995))
b) Orthophosphatbestimmung mit Ammoniummolybdat (Fiske und Subbarow, J. Biol. Chem. 66, 375-400 (1925).

Bestimmung der Konzentration von Polyphosphaten aus verschieden Geweben Beispiel I Durchführung:

Poly(P) wurde aus Hefe und HeLa-Zellen und aus Geweben der Ratte nach bekannten Methoden isoliert (Leitão et al., Mar. Ecol. Prog. Ser. 121, 279-288 (1995); Clark et al. J. Bacteriol. 168, 1212-1219 (1986)). Fraktion 1 enthält die säurelöslichen kurzkettigen Polyphosphate, wohingegen Fraktion 2 aus dem leicht extrahierbaren Teil des längerkettigen Polyphosphats und Fraktion 3 aus dem verbleibenden unlöslichen Teil besteht. Kerne wurden nach der Methode von Blobel und Potter, Science 154, 1662-1665 (1966) isoliert.

Der Poly(P) Gehalt wurde parallel mit a) Fura-Methode und b) Toluidin-Blau- Methode bestimmt. Standards geeigneter Kettenlänge wurden für die Eichkurven verwendet.

Ergebnis:

Die Tabelle 1 zeigt, dass die Bestimmung der Konzentration mit den beiden Methoden vergleichbare Ergebnisse liefert.

TABELLE 1

Poly(P) Konzentrationen aus verschiedenen Zellen und Geweben^a

Die durchgehend höheren Werte bei der Toluidin-Blau-Methode der Fraktionen 1 sind darauf zurückzuführen, dass durch kurzkettige Polyphosphate (n < 10) die metachromatische Reaktion nicht oder nur geringem Maße stattfindet (Leitão et al., Mar. Ecol. Prog. Ser. 121, 279-288 (1995)) und sich somit für diese Fraktionen höhere Werte als real ergeben. Die Fura-Methode erfasst im Gegensatz dazu auch die kurzkettigen Polyphosphate.

Messung von Enzymaktivitäten, die Reaktionen katalysieren, an denen die Umsetzung von Pyrophosphat bzw. Polyphosphaten erfolgt Beispiel I: Pyrophosphatase aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae Diskontinuierlicher Assay Durchführung:

Die Bestimmung der anorganischen Pyrophosphatase wurde entsprechend einer Methode von Heppel Methods Enzymol. 2, 570-576 (1955) durchgeführt. Der Nachweis der Enzymaktivität wurde parallel mit 2 Methoden erfasst:

a) Fura-Methode
b) Orthophosphatbestimmung mit Ammoniummolybdat.

Ergebnis:

Wie aus der Abb. 4. zu entnehmen ist, stimmen die Ergebnisse der enzymatischen Aktivität mit den beiden Methoden nahezu überein.

Kontinuierlicher Assay

Bemerkenswerterweise ist es mit der neuen Fura-Methode möglich, den Abbau von Pyrophosphat kontinuierlich zu verfolgen, was einen deutlichen Vorteil gegenüber der bisher allgemein verwendeten Orthophosphatbestimmung darstellt.

Durchführung:

Der 2 ml Assay hat folgende Zusammensetzung: 80 µM Pyrophosphat; 80 µM MgCl₂; 0,5 µM Fura 2; 0,5 µM MnCl₂ in Puffer A. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Pyrophosphatase gestartet. Die Inkubation erfolgte bei 22°C.

Ergebnis:

Die Abb. 5 zeigt die kontinuierliche Abnahme der Fluoreszenz als Maß für den Substratumsatz und die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Enzymkonzentration. Wenn das Substrat vollständig abgebaut worden ist, bleibt die Fluoreszenz auf dem Restlevel konstant (Kurve a und b).

Beispiel II: Exopolyphosphatase aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae Durchführung:

Die Kultivierung der Hefe und die Herstellung des Heferohextrakts für die Bestimmung der Enzymaktivität wurde - wie in Lorenz et al. (J. Biol. Chem. 269, 22198-22204 (1994)) beschrieben - durchgeführt. Die Exopolyphosphataseaktivität wurde parallel mit 3 Methoden bestimmt:

a) Fura-Methode
b) Orthophosphatbestimmung mit Ammoniummolybdat
c) Toluidin-Blau-Methode.

Ergebnis:

Folgende spezifischen Aktivitäten (in µmol abgespaltenes Orthophosphat je Stunde je mg Protein) wurden gefunden:

a) 16,7 µmol/h/mg
b) 21,4 µmol/h/mg
c) 25,1 µmol/h/mg

Die Werte sind Mittelwerte von jeweils zwei unabhängigen Experimenten mit jeweils Dreifachbestimmungen. Es wurden die Initialgeschwindigkeiten der ersten 10 min zur Berechnung verwendet. Die Methoden a) und b) ergeben gut übereinstimmende Werte. Die höheren Werte bei Methode c) lassen sich wiederum mit der Tatsache erklären, dass kurzkettige Polyphosphate keine oder nur eine schwache metachromatische Reaktion von Toluidin-Blau bewirken, was zu einer scheinbar höheren Abbaugeschwindigkeit führt.

Messung nichtenzymatischen Abbaus von Polyphosphaten sowie Differenzierung zwischen linearen und zyklischen Polyphosphaten Beispiel I: Thermische Zersetzung bei pH 3 Durchführung:

Der Abbau wurde in einer Lösung, die 10 mM Citronensäure/NaOH und 0,8 mM Poly(P) einer durchschnittlichen Kettenlänge von 15 enthielt, gemessen. Die Reaktion wurde durch Zugabe des Polyphosphates zur vortemperierten Pufferlösung gestartet. Nach verschiedenen Inkubationszeiten bei 95°C wurden 100-µl-Aliquote entnommen, sofort mit NaOH neutralisiert, in 10 mM Tris/HCl Puffer pH 7,5 aufgenommen und dann der Abbau gemessen mit a) der Fura-Methode und b) der Orthophosphatbestimmung mit Ammoniummolybdat.

Ergebnis:

Die Auswertung mit der Methode b) ergibt eine wesentlich niedrigere Abbaugeschwindigkeit verglichen mit der Fura-Methode (Abb. 6a). Ursache für dieses Ergebnis ist die Tatsache, dass bei der thermischen Degradation von linearen Polyphopshaten ein beträchtlicher Teil zuerst in zyklische Polyphosphate, vorwiegend Trimetaphosphat, umgewandelt und dann erst langsam zu Orthophosphat abgebaut wird (Van Wazer Phosphorus and its compounds. Interscience Publishers Inc., New York. (1958)). Trimetaphosphat hat aber im Vergleich zum linearen Tripolyphosphat nur einen sehr schwachen Effekt auf die Mn²⁺-Auslöschung des Fura-2 (Abb. 7). Als weiterer Vorteil der Fura-Methode ergibt sich somit, dass sie in der Lage ist, auch den Abbau von linearen Polyphosphaten zu zyklischen Polyphosphaten zu erfassen.

Beispiel II: Thermische Zersetzung bei pH 1 Durchführung:

Die Reaktion wurde analog zu Beispiel 1 durchgeführt mit dem Unterschied, dass anstelle des Citronensäure/NaOH-Puffers 0,1 M HCl-Lösung für den Reaktionsansatz verwendet wurde.

Ergebnis:

Im Gegensatz zum thermischen Abbau bei pH 3 entstehen bei der Degradation bei pH 1 nur in geringem Maße zyklische Polyphosphate. Die Abbaugeschwindigkeiten, die mit den beiden Methoden ermittelt wurden, sind nahezu gleich (Abb. 6b).

Claims

1. Verfahren zur Messung von Konzentrationen sowie zur kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Messung des Umsatzes und der Geschwindigkeit enzymatischer oder nichtenzymatischer Reaktionen von Pyrophosphaten und/oder linearen Polyphosphaten unter Ausschluß von zyklischen Polyphosphaten als auch von Orthophosphaten in einer Probe mit den Schritten:

1. Herstellen einer Indikatorlösung bestehend aus einer stabilisierenden physiologischen Pufferlösung aus 30 mM Tris-HCl pH 7,2; 30 mM NaHCO₃; 150 mM NaCl sowie 12 mM KCl, einem kationensensitivem Fluoreszenzfarbstoff und dem entsprechenden Kation,
2. Zugeben der Probe mit den gelösten Pyrophosphaten und/oder linearen Polyphosphaten zu der Indikatorlösung,
3. Messen der Änderung des Fluoreszenzsignals aufgrund der Bindung der Kationen durch die Pyrophosphate und/oder linearen Polyphosphate.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Fluoreszenzsignal der Indikatorlösung sowohl ohne als auch mit dem entsprechenden Kation bestimmt wird, anschließend eine Kalibrierkurve von Polyphosphat einer definierten Kettenlänge aufgenommen wird und nach der Formel (F_S - F₀)/(F_F - F₀) standardisierte Fluoreszenzeinheiten ermittelt werden, um die Vergleichbarkeit verschieden Meßreihen durch dieses Kalibrierungsverfahren zu gewährleisten, wobei gilt:
F_F-Fluoreszenzintensität der Fura-Lösung in Abwesenheit von Polyphosphaten und MnCl₂,
F₀-Fluoreszenzintensität der Fura-Lösung in Anwesenheit von 0.5 µM MnCl₂ aber Abwesenheit von Polyphosphaten
F_S-Fluoreszenzintensität der Fura-Lösung in Anwesenheit von 0.5 µM MnCl₂ und der entsprechenden Konzentration an Polyphosphaten.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung der unbekannten Kettenfänge von linearen Polyphosphaten die Fluoreszenz einer Verdünnungsreihe der Probe mit unbekannter Kettenlänge bestimmt wird und die Steigung der mit dieser Messung erhaltenen Kurve mit der Steigung von Kalibrierkurven linearer Polyphosphate bekannter Kettenlänge verglichen wird und so die Kettenlänge der linearen Polyphosphate der Probe ermittelt wird.

4. Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-3 in Verbindung mit einem Fluoreszenz-ELISA-Platten-Reader.

5. Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-3 in Verbindung mit einem HPLC-Fluoreszenzdetektor.