DE2846967C2

DE2846967C2 - Mehrphasen-Prüfmittel

Info

Publication number: DE2846967C2
Application number: DE2846967A
Authority: DE
Inventors: William I. Elkhart Ind. White
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1977-10-28
Filing date: 1978-10-27
Publication date: 1982-05-27
Also published as: AU3913378A; GB2006957A; DE2846967A1; IT1109285B; CA1100024A; AU515162B2; JPS5467495A; US4129417A; CS216810B2; IT7851460A0; FR2407474B1; FR2407474A1; GB2006957B

Description

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Die Erfindung liegt allgemein auf dem Gebiet von Testreagentien und betrifft ein Mehrphasen-Prüfmittel zum Nachweis und zur Bestimmung eines Bestandteils in einer flüssigen Probe, das eine Mehrzahl von Komponenten enthält, die mit mindestens zwei unterschiedlichen Reaktionssystemen verbunden sind, wobei diese Reaktionssysteme jeweils unter verschiedenen Reaktionsbedingungen wirksam sind und eine einem ersten Reaktionssystem zugeordnete Komponente bei Berührung mit der Probe auf den nachzuweisenden Bestandteil anspricht

Es sind viele Prüfmittel zur Bestimmung spezifischer Bestandteile in Flüssigkeiten, wie Urin und Blut, bekannt. Diese Prüfmittel haben sehr unterschiedliche Formen, wobei mit dem Reagens imprägnierte Teststreifen vom »dip-and-read-Typ« besonders vorteilhaft sind. Einige dieser Prüfmittel sind geeignet zur Bestimmung von Bestandteilen, wie Glucose, Protein, okkuUem Blut u.a. in Körperflüssigkeiten, während andere geeignet sind zur Bestimmung verschiedener Bestandteile in anderen Flüssigkeiten, wie Wasser von Schwimmbecken, Schneideflüssigkeiten u. ä.

Diese bekannten Testsysteme sind im allgemeinen vom Einphasen-Typ und enthalten in dem Reagens eine oder mehrere Komponenten, z. B. einen Puffer, um die Reaktionsbedingungen für die Testreaktion in einem speziellen Bereich zu halten, wie einem einzigen speziellen pH-Bereich, der erforderlich ist, damit die gewünschte Reaktion stattfindet

Solche Testsysteme umfassen solche, bei deien mehr als eine Reaktion stattfindet und soweit diese Reaktionen unter den gleichen Reaktionsbedingungen ablaufen können, waren diese Systeme zufriedenstellend. Es gibt jedoch eine Reihe von Situationen, bei denen mehr als eine Reaktion eintritt, wobei die einzelnen Reaktionen notwendigerweise oder optimal unter verschiedenen Reaktionsbedingungen ablaufen, z. B. bei verschiedenen pH-Werten. Die Anwendung von Mitteln zur Aufrechterhaltung einer bestimmten Reaktionsbedingung oder Umgebung in einem solchen System, z. B. eines pH-Werts in einem spezifisch begrenzten Bereich führt dazu, daß eine oder mehrere der Reaktionen des Systems unter schlechteren als den optimalen Bedingungen durchgeführt werden.

Die bekannten Systeme, bei denen eine Mehrzahl von Reaktionen unter einer einheitlichen Kombination von Reaktionsparametern durchgeführt wird, besitzen den weiteren Nachteil, daß bestimmte, sonst mögliche Reaktionskomponenten, die eine bessere Wirksamkeit besitzen würden, nicht angewandt werden können, da sie als Komponente einer Reaktion unter solchen Reaktionsbedingungen, wie sie für ein anderes Reaktionssystem erforderlich sind, nicht wirksam sind.

Während diese bekannten einphasigen Systeme sich weitgehend als nützlich erwiesen haben, sind die chemischen Verfahren, auf die sie anwendbar sind, begrenzt Weite Analysebereiche konnten bisher mit üblichen Testsystemen noch nicht abgedeckt werden aufgrund der Begrenzungen, die durch Einhaltung von Reaktionsparametern in einem einzigen relativ engen Bereich auftreten. Die Analysebereiche, auf die bekannte Testsysteme nicht anwendbar sind, umfassen eine Vielzahl analytischer Verfahren, wie Mehrfach-Reaktionen, die optimal oder notwendigerweise unter unterschiedlichen Reaktionsbedingungen oder Parametern, z. B. bei verschiedenem pH-Wert, verschiedener Ionenstärke, verschiedenen vorhandenen Reaktionsteilnehmern u. a. ablaufen. Dazu gehören das Vorhandensein von störenden Substanzen, die inaktiviert werden müssen, um zuverlässige Bestimmung des Bestandteils zu ermöglichen, und eine spätere Zugabe von Komponenten, die entweder unter bestimmten Bedingungen nicht stabil oder schädlich sind.

In der US-PS 30 11 874 ist ein Prüfmittel beschrieben, bei dem in einzelnen aufeinanderfolgenden Streifen unterschiedliche Reaktionskomponenten enthalten sind, die durch allmähliches Aufsteigen der zu untersuchenden Flüssigkeit durch Kapillarkräfte nacheinander reagieren. Bei der Herstellung und Anwendung dieser Prüfmittel muß sorgfältig darauf geachtet werden, daß die einzelnen Komponenten ausreichend weit voneinander getrennt sind und nicht vorzeitig, z. B. durch zu tiefes Eintauchen des Prüfmittels in die Probe, miteinander in Berührung kommen. Außerdem sind die dort beschriebenen Prüfmittel auf die Abgabe eines Gases zur

Änderung der Reaktionsbedingungen beschränkt

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Mehrphasen-Prüfmittel zur Bestimmung eines Bestandteils in einer Probe zu entwickeln, bei dem nacheinander die unterschiedlichen Reaktionsbedingungen, die zur Wirksamkeit der verschiedenen Reaktionssysteme erforderlich sind, eingestellt werden.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Mehrphasen-Prüfmittel der eingangs genannten Art, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es ein System zur Änderung der Reaktionsbedingungen enthält, das bei Berührung mit der Probe aktiviert wird und nach einer vorher bestimmten Zeit die Reaktionsbedingungen so ändert, daß ein zweites Reaktionssystem wirksam wird.

Bei einer ersten Ausführungsform der Erfindung umfaßt das System zur Änderung der Reaktionsbedingungen mindestens eine Komponente die eingekapselt ist. Mikrokapseln sind zum Einkapseln bevorzugt und können hergestellt werden nach üblichen Verfahren zur Herstellung von Mikrokapseln, um eine Komponente zu erhalten, die imstande ist, die Reaktionsparameter zu ändern. Die Mikrokapseln sind vorzugsweise osmotisch empfindlich, wodurch bei Berührung mit der zu untersuchenden Flüssigkeit eine Freisetzung ihres Inhalts erfolgt Sie können auch aus einem Material hergestellt werden, das in der Probe löslich ist Außer der Komponente zur Änderung der Reaktionsbedingungen können auch andere Komponenten eingekapselt sein, z. B. solche, die unter Reaktionsbedingungen des zweiten Reaktionssystems optimal wirksam sind.

Bei einer anderen Ausführungsform des Mehrphasen-Prüfmittels umfaßt das System zur Änderung der Reaktionsbedingungen einen Katalysator, wie ein Enzym, und dessen Substrat. Eine oder beide der miteinander reagierenden Komponenten können gegebenenfalls in Mikrokapseln eingeschlossen sein.

Die Prüfmittel können in einem Träger, wie einer saugfähigen oder nichl-saugfähigen Matrix enthalten sein und andere Bestandteile, wie Bindemittel, enthalten.

Die Prüfmittel können andererseits die Form einer Tablette besitzen. Irgend ein geeignetes Verfahren zur Herstellung von Tabletten, wie ein Verpressen oder Formen kann angewandt werden, um die Mittel in eine übliche Tablette zu formen. Bindemittel, besonders solche, die in dem Lösungsmittel der zu untersuchenden Probe zerfallen oder löslich sind, können angewandt werden, um eine strukturelle Stabilität vor der Anwendung zu erreichen.

Das Mehrphasen-Prüfsystem kann auch ohne Matrizes, Tablettierungsmittel und andere Träger angewandt werden zur Untersuchung von flüssigen Proben, indem man es direkt mit der Probe zusammenbringt. Das Ansprechen auf den in der Probe enthaltenen zu bestimmenden Bestandteil kann durch Bildung eines chromophoren Komplexes, eine Oxidations-Reduktions-Reaktion, eine Antigen-Antikörper- oder Enzym-Substrat-Komplex-Reaktion oder eine andere nachweisbare Veränderung erfolgen.

Bei der zweiten Ausführungsform können der Katalysator und das Substrat vor, gleichzeitig mit oder anschließend an das Ansprechen der auf den Bestandteil der Probe ansprechenden Komponente miteinander in Wechselwirkung treten. Die Wechselwirkung zwischen Enzym und Substrat kann sogar beginnen, bevor der Bestandteil nachgewiesen ist, um daraufhin eine Änderung der Reaktionsbedingungen herbeizuführen, vorausgesetzt, daß sie (Enzym und Substrat) in solchen relativen Mengen vorliegen, daß sie die Reaktionsbedingungen erst nach einer bestimmten Zeit verändern.

Die Ausführungsform unter Verwendung von Mikrokapseln ergibt eine verzögerte Freisetzung der Komponente, die imstande ist die Reaktionsbedingungen zu verändern oder die auf den zu bestimmenden Bestandteil anspricht Nach einer vorbestimmten Zeit tritt das Lösungsmittel der Probe, für das die Kapselwand durchlässig ist aufgrund osmotischer Kräfte ^;n die Kapsel ein. Es entsteht ein ausreichender osmotischer Gradient der zu einer Freisetzung des Kapselinhalts führt Die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Freisetzung des Kapselinhalts sind eine Funktion des anfänglichen osmotischen Gradienten und der Eigenschaften der Kapselwand.

Mikrokapseln, wie sie für die erfindungsgemäßen Prüfmittel geeignet sind, können nach einer Vielzahl bekannter Methoden hergestellt werden (US-PS 40 15 462; Angew. Chem. Internat Edith. 14 :539 (1975) und US-PS 30 92 463). Solche Methoden umfassen chemische Einkapselungs-Verfahren, wie die Zwischenschicbtpolykondensation oder Koazerierung und physiomechanische Verfahren, wie Zentrifugieren oder Sprühtrocknen.

Grenzschichtpolykondensation, Phasentrennung und Polymerisationsverfahren sind wegen der Leichtigkeit der Herstellung von Mikrokapseln bevorzugt

Die Aktivität der in den Beispielen angewandten Eiizymzubereitungen wird angegeben in Anzahl der Einheiten pro mg Trockengewicht Die »Commission on Enzymes of the International Union of Biochemistry« hat eine internationale Einheit (IE) der Enzymaktivität definiert als 1 μΜοΙ Substrat, das pro Minute unter speziellen pH- und Temperaturbedingungen verbraucht wird. Diese Definition gilt in der folgenden Beschreibung, soweit nichts anderes angegeben.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiele 1 und 2

Beim Nitritnachweis mit Hilfe eines einphasigen Prüfmittels muß die Diazotierung eines aromatischen Amins bei einem niedrigen pH-Wert, stattfinden und das diazotierte Amin muß dann mit einer anderen Substanz bei dem gleichen niedrigen pH-Wert gekuppelt werden. Dadurch tritt eine wesentliche Beschränkung der anwendbaren Kupplungskomponenten auf eine verhältnismäßig kleine Anzahl aromatischer Amine und ihrer Derivate ein.

Wenn der Versuch jedoch bei einem sauren pH-Wert beginnt, der anschließend ins Alkalische geht, wird die Anzahl der Kupplungskomponenten, die angewandt werden können, wesentlich größer und es kommen z. B. zahlreiche Phenole und Naphthole in Frage. Diese pH-Änderung kann bei einer einzigen Testoperation nur mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Prüfmittels durchgeführt werden, wie es zum Vergleich anhand der folgenden Mittel bzw. Zubereitungen gezeigt wird.

1. (a) Eine Imprägnierlösung mit einem pH-Wert von ungefähr 2 wurde in 75 ml Methanol hergestellt durch Zugabe der folgenden Bestandteile:

1. 0,13 g p-Arsanilsäure (aromatisches Amin)

2. 3,0 g Malonsäure

3. 25 ml 2,0°/oige Lösung von hydrolysiertem Poly(maleinsäureanhydrid-Methylvinyläther)

4. 0,75 g Natriumlaurylsulfat

5. 0,3 g l-Naphthol-3,6-disulfonsäure-natriumsalz (Kupplungsmittel).

Filterpapier-Stücke 10 cm χ 10 cm wurden bis zur Sättigung mit der oben angegebenen Imprägnierlösung imprägniert, 10 min bei 95° C getrocknet und in Stücke von 1 χ 1 cm geschnitten.

(b) Ein anderes einphasiges Prüfmittel wurde genau wie unter (a) angegeben, hergestellt mit der Ausnahme, daß der pH-Wert der Imprägnierlösung durch Zugabe von 15 ml 2 m Citratpuffer zu der Lösung und Weglassen der Malonsäure auf ungefähr 6 eingestellt wurde.

(c) Ein Mehrphasen-Prüfmittel wurde folgendermaßen hergestellt: 10 χ 10 cm große Filterpapierstücke wurden mit der Imprägnierlösung entsprechend la imprägniert und wie oben getrocknet. Sie wurden dann mit einer einfachen Schicht (Monolayer) von 0,177 mit 0,210 mm (70 bis 80 mesh) großen Polyamid-Mikrokapseln beschichtet, die hergestellt worden waren durch Verkapseln einer wäßrigen Lösung, enthaltend 13,2 g/dl wäßriges NaOH und Trocknen.

Die entsprechend (a), (b) und (c) erhaltenen Prüfmittel wurden untersucht durch Aufbringen von drei Tropfen Probe auf ein 1x1 cm großes Prüfmittel. Die Probe enthielt 10 mg/dl NaNC>2 in destilliertem Wasser und die Ergebnisse wurden nach 3 min beobachtet. Mit Hilfe der entsprechend (a) und (b) hergestellten Prüfmittel war es nicht möglich, 10 mg/dl Nitrit nachzuweisen, während das Prüfmittel (c) einen deutlichen Nachweis ergab, indem es leuchtend orange wurde.

Ein Mittel wurde hergestellt durch Zusammengeben von 0,13 g p-Arsanilsäure, 3,0 g Malonsäure und 0,3 g l-Naphthol-3,6-disulfonsäuredinatriumsalz mit den unter l(a) beschriebenen Polyamidkapseln. Der Anteil der verkapselten und nicht-verkapselten Bestandteile kann entsprechend der Geschwindigkeit und Stärke der gewünschten pH-Änderung variiert werden und es werden vorzugsweise ungefähr 10,0 g Mikrokapseln verwendet

Das wie oben hergestellte Prüfmittel wurde untersucht durch Zusammenbringen mit drei Tropfen der oben erwähnten Probe in 2 ml große Vertiefungen einer Tüpfelplatte. Mit Hilfe des Prüfmittels konnte Nitrit leicht nachgewiesen werden, wie sich durch eine Farbänderung zeigte.

hergestellt

(c) Ein Mehrphasen-Prüfmittel wurde folgendermaßen hergestellt: ein 1Ox 10 cm großes Stück Filterpapier wurde bis zur Sättigung mit einer entsprechend l(a) hergestellten Lösung imprägniert mit der Ausnahme, daß das l-Naphthol-3,6-disulfonsäuredinatriumsalz weggelassen wurde und anschließend wie oben getrocknet Diese Stücke wurden dann mit einer Einfach-Schicht von 0,177 bis O^lOmm großen Polyamidkapseln überzogen, die hergestellt worden waren durch Verkapseln einer wäßrigen Lösung, enthaltend 33% l-Naphthol-3,6-disuh^ronsäuredinatriumsalz und 13,2 g/dl wäßriges NaOH und anschließendes Trocknen. Diese Filterpapierstücke wurden in 1 χ 1 cm große Quadrate geschnitten.

Die entsprechend 2(a), (b) und (c) hergestellten Prüfmittel wurden untersucht durch Aufbringen von drei Tropfen einer Probe, enthaltend 10 mg/dl NaNO₂ in destilliertem Wasser auf ein 1 χ 1 cm großes PrüfmitteL Die Ergebnisse wurden nach 3 min abgelesen. Mit Hilfe der entsprechend (a) und (b) hergestellten Prüfmittel war es nicht mögüch, 10 mg/dl Nitrit nachzuweisen, während mit dem Prüfmittel (c) der Nachweis durch Bildung einer leuchtend orangen Färbung leicht möglich war.

Wie aus den obigen Beispielen hervorgeht kann, wenn der pH-Wert ständig niedrig ist zwar die Diazotierung stattfinden, jedoch keine Kupplung. Wenn der pH-Wert ständig hoch ist kann eine Kupplung eintreten, aber keine Diazotierung. Nur wenn der pH-Wert zunächst zur Diazotierung niedriger ist und dann zur Kupplung erhöht wird, ist es möglich, mit dem Prüfmittel Nitrit nachzuweisen.

Beispiele 3bis5

Bei der Analyse von saurer Phosphatase, wie sie bei krankhaften Zuständen, v/ie metastasierenden Carcinomen der Prostata auftritt muß die hydrolytische Wirkung des Enzyms bei pH 4,5 untersucht werden, während einige der günstigen Substrate nur bei basischem pH-Wert beobachtbar sind. Dadurch wird die Anzahl von Substraten, die auf diese Weise nachgewiesen werden können, stark verringert

2. Bei diesem Versuch wurden Einphasenprüfmittel 45 3. Das kann durch das folgende Testsystem gezeigt (a) und (b) genau wie unter l(a) bzw. l(b) angegeben, werden:

p-Nitrophenyl-phosphat
OH"

pH 4,5

p-Nitrophenol

saure Phosphatase -> p-Nitrophenolatanion (gelb).

p-Nitrophenol + Phosphat (farblos)

Diese Reaktionsfolge kann mit einer einzigen Testoperation nur mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Prüfmittels durchgeführt werden, wie durch eine vergleichsweise Untersuchung der folgenden drei Teststreifen gezeigt werden kann.

(a) Ein Einphasen-Prüfmittel wurde folgendermaßen hergestellt Ein Stück Filterpapier von 10—10 cm wurde zunächst bis zur Sättigung in 25 ml 0,02 m Natriumcitratpuffer (pH 5,0) imprägniert und bei 6O⁰C getrocknet. Es wurde dann in 20 ml einer methanolischen Lösung, enthaltend 0,3 g p-Nitrophenylphosphatnatriumsalz gesättigt und bei 6O⁰C getrocknet. Die imprägnierten Filterpapierstücke wurden in 1 χ 1 cm große Stücke geschnitten-.

(b) Bei der Herstellung eines Mehrphasen-Prüfmittels wurden die gleichen ersten Tauchstufen durchgeführt wie oben unter 3(a) angegeben. Die Stücke wurden dann mit einer Einfachschicht Polyamidmikrokapseln (0,177 bis 0,210 mm) beschichtet, die erhalten worden waren durch Verkapseln einer wäßrigen Lösung, enthaltend 13,2 g/dl wäßriges NaOH und Trocknen. Die Filterpapierstücke wurden wie oben angegeben zerschnitten.

(c) Bei der Herstellung der dritten Prüfmittel wurde das Filterpapier zunächst bis zur Sättigung mit 0,1 m

Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS) Puffer, pH 8,0, imprägniert und bei 60⁰C getrocknet. Die zweite Tauchstufe war die gleiche wie unter 3(a) angegeben. Die so imprägnierten Papierstücke wurden wie oben angegeben, zerschnitten.

Die so hergestellten Prüfmittel wurden untersucht durch Aufbringen von zwei Tropfen einer Lösung, enthaltend 10 mg/ml (20 Einheiten*)/mg) saurer Weizensamenphosphatase in 0,02 m Citratpuffer und nach 5 min beobachtet.

Bei den Streifen (a) und (c) wurde keine Farbänderung

Phenolphthaleindiphosphat

Phenolphthalein (farblos) pH 4,5

beobachtet, während der Streifen (b) sich gelb färbte. Das zeigt, daß bei pH 5 zwar Hydrolyse eintritt, aber das p-Nitrophenol farblos bleibt (Streifen a). Bei pH 8 tritt keine Hydrolyse ein (Streifen c). Nur wenn der pH-Wert zunächst niedrig ist, damit die Hydrolyse eintreten kann und dann erhöht wird, um eine Farbbildung zu ermöglichen, entsteht eine Farbe, die die saure Phosphatase nachweist.

4. Ein anderes System zum Nachweis von saurer Phosphatase folgt dem folgenden Reaktionsschema:

saure Phosphatase

Phenolphthalein + Phosphat (farblos)

OH" Phenolphthalein (rosa).

Bei diesem Versuch wurden Einphasen- und Mehrphasen-Prüfmittel (a), (b) bzw. (c) entsprechend 3(a), (b) bzw. (c) hergestellt mit der Ausnahme, daß das p-Nitrophenylphosphat ersetzt wurde durch Phenolphthaleindiphosphat.

Die entsprechend 4(a), 4(b) und 4(c) hergestellten Prüfmittel wurden wie in Beispiel III untersucht. Die entsprechend (a) und (c) hergestellten Prüfmittel zeigten keine saure Phosphatase an, während das Mehrphasen-Prüfmittel sich rosa färbte und dadurch das Vorhandensein von Phosphatase anzeigte.

5. Die Analyse von saurer Phosphatase kann auch durchgeführt werden mit Hilfe einer einzigen Testoperation unter Verwendung eines Prüfmittels, das entsprechend einer anderen Ausführungsform gemäß der Erfindung hergestellt worden ist bei der keine Mikrokapseln verwendet werden. Im folgenden sind Vergleichsversuche von drei Prüfmitteln angegeben.

(a) Ein Einphasen-Prüf mittel wurde folgendermaßen hergestellt: Ein 10,16 χ 10,16 cm großes Stück Filterpapier wurde zunächst zur Sättigung in 25 ml 0,02 m Citratpuffer (pH 5,0) imprägniert und bei 60⁰C getrocknet. Es wurde dann mit 20 m! einer methanolischen Lösung, enthaltend 0,3 g p-Nitrophenylphosphatnatriumsalz gesättigt, bei 60⁰C getrocknet und in 1 χ 1 cm große Quadrate geschnitten.

(b) Zur Herstellung eines Mehrphasen- Prüfmittels wurde ein Stück Filterpapier von 10,16 χ 10,16 cm bis zur Sättigung in 20 ml 0,02 m Citratpuffer, pH 5,0, enthaltend Urease (2000 IE/ml)**) imprägniert und bei 60⁰C getrocknet Das Filterpapier wurde dann mit 20 ml Methanol, enthaltend 0,3 g p-Nitrophenylphosphatnatriumsalz und 3,0 g Harnstoff gesättigt bei 60⁰C getrocknet und wie oben zerschnitten.

(c) Bei dem dritten Prüfmittel wurde das Filterpapier zunächst zur Sättigung mit 0,01 m TRIS-Puffer, pH 8,0, imprägniert und dann bei 60⁰C getrocknet. Die zweite Tauchstufe war die gleiche wie oben unter (a) angegeben.

Die so hergestellten Prüfmittel wurden wie in den Beispielen 3 und 4 untersucht. Die Prüfmittel (a) und (c) ergaben keine Färbung, während das Prüfmittel (b) gelb

jo wurde.

Es wurde ein Mittel hergestellt durch Lyophilisieren der ureasehaltigen Citratpufferlösung und Vermischen mit einem Träger (nicht imprägnieren). Bei Untersuchung des Prüfmittels durch Zusammenbringen mit einer Testprobe war die auftretende Farbänderung nach gelb identisch mit der bei dem Prüfmittel des Beispiels (5) beobachteten.

Daraus geht hervor, daß nur, wenn der pH-Wert zunächst niedrig ist um die Hydrolyse zu ermöglichen und dann hoch, um die Farbbildung zu ermöglichen, eine Farbe entsteht die saure Phosphatase anzeigt

Beispiele 6 und 7

Mehrphasen-Prüfmittel zur Untersuchung auf /J-GIucuronidase wurden wie in den folgenden Beispielen angegeben, hergestellt

6. Ein Mehrphasen-Prüf mittel gemäß der Erfindung so wurde für das folgende Reaktionsschema hergestellt:

p-Nitrophenyl-^S-glucuronid

QTJ-

p-Nitrophenol »

pH 4,8

jS-Glucuronidase
p-Nitrophenolat (gelb).

p-Nitrophenol + Glucuronat

Ein 1Ox 10 cm großes Stück Filterpapier wurde bis zur Sättigung imprägniert in 2OnJ einer Lösung von 60 mg p-Nitrophenyl-0-glucuronid in 20 ml Wasser und

*) Die Enzymmenge, die die Freisetzung von p-Nitrophenol pro h bei 37° C und pH 4,8 katalysiert

**(IE Urease ist definiert als Anzahl μΜοΙ Ammoniak, die pro min gebildet werden.

10 min bei 60° C getrocknet Die Stücke wurden dann mit einer einfachen Schicht Polyamid-Mikrokapseln (0,177 bis 0,210 mm) überzogen, die hergestellt worden waren durch Verkapseln einer wäßrigen Lösung, enthaltend 13,2 g/dl wäßriges NaOH und Trocknen. Die μΜοΙ 65 so hergestellten Stöcke wurden in 1 χ 1 cm große Stücke geschnitten.

Die so hergestellten Prüfmittel wurden untersucht durch Eintauchen in 1 ml einer Lösung, enthaltend

4 mg/dl /J-Glucuronidase (0,25 ΙΕ/mg)*) in 0,01 m Acetatpuffer, pH 4,8 bei 40⁰C und dann 5 min lang beobachtet, während sie auf einem Heizblock bei 37° C gehalten wurde. Mit Hilfe dieses Prüfmittels kann das Vorhandensein von j9-Glucuronidase leicht nachgewiesen werden, wie aus dem Auftreten einer gelben Farbe hervorgeht.

7. Ein anderes erfindungsgemäßes Mehrphasen-Prüfmittel wurde wie unter 6 angegeben hergestellt mit der Ausnahme, daß das Papier mit 20 ml einer Lösung, enthaltend 100 mg Phenolphthalein-jS-glucuronid in 20 ml destilliertem Wasser imprägniert wurde. Das ist angegeben durch das folgende Reaktionsschema:

Phenolphthalein-j8-glucuronid

pH 4,8

(farblos) Glucuronat

Phenolphthalein + /J-Glucuronidase

Phenolphthalein (farblos)

OH

Phenolphthalein (rosa).

Mit Hilfe der so hergestellten Prüfmittel war es, wenn sie entsprechend Beispiel 6 untersucht wurden, leicht möglich, das Vorhandensein von jS-Glucuronidase nachzuweisen durch Auftreten einer rosa Farbe.

Beispiel 8

Bestimmte Nachweissysteme, wie solche für Hämoglobin in Urin werden leicht durch das Vorhandensein anderer Substanzen, wie Ascorbat, gestört. Wirksame, die Störung entfernende Mittel, wie Ascorbatoxidase, werden jedoch durch die Mittel zum Nachweis von Hämoglobin inaktiviert.

Mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Mehrphasen-Prüfmittels ist es möglich, daß Ascorbatoxidase das störende Ascorbat in einem ersten Reaktionssystem entfernt, während die das Hämoglobin nachweisenden Reagentien von der Ascorbatoxidase durch Verkapselung ferngehalten werden. Die verzögerte Freisetzung der zum Nachweis von Hämoglobin geeigneten Reagentien ermöglicht anschließend einen nicht-gestörten Nachweis von Hämoglobin in einem zweiten Reaktionssystem. Das wird durch dieses Beispiel verdeutlicht.

Ein 10 χ 10 cm großes Filterpapierstück wurde in 20 ml 0,1m Phosphatpuffer, pH 7, enthaltend 2 mg Ascorbatoxidase (500 ΙΕ/mg) eingetaucht und bei 60°C getrocknet. Es wurde dann mit 20 ml einer Suspension von Mikrokapseln (37 bis 200 μτη) überzogen, die hergestellt worden waren aus Celluloseacetatbutyrat,

2(i enthaltend 0,35 g Cumolhydroperoxid, 1,35 g Triäthanolaminborat, 0,08 g Toluidinhydrochlorid und 0,08 g 6-Methoxychinolin. Das Papier wurde dann mit doppelseitigem Klebband auf Polystyrolstreifen aufgeklebt.

Diese Streifen färbten sich, wenn sie in Urin, enthaltend 0,03 mg/dl Hämoglobin und 50 mg/dl Ascorbat getaucht wurden, blau, was das Vorhandensein von Hämoglobin im Urin anzeigt, während Streifen, die die gleichen Bestandteile enthielten, aber wie oben aus

jo einer einzigen homogenen Lösung, die alle Bestandteile enthielt, imprägniert worden waren, kein Hämoglobin anzeigten. Nur wenn die Ascorbatoxidase die Oxidation von Ascorbat zu Dehydroascorbat katalysieren kann vor der Freisetzung der Bestandteile für den Hämoglobinnachweis ist es möglich. Hämoglobin mit dem Streifen nachzuweisen. Im anderen Falle wird die Ascorbatoxidase durch die Nachweisreagentien inaktiviert und der Hämoglobinnachweis wird durch das Vorhandensein von 50 mg/dl Ascorbat unmöglich.

*) IE j3-Glucuronidase ist definiert durch Umsetzung mit Phenolphthalein-^-glucuronid.

Claims

Patentansprüche:

1. Mehrphasen-Prüfmittel zum Nachweis und zur Bestimmung eines Bestandteiles in einer flüssigen Probe, das eine Mehrzahl von Komponenten enthält, die mit mindestens zwei unterschiedlichen Reaktionssystemen verbunden sind, wobei diese Reaktionssysteme jeweils unter verschiedenen Reaktionsbedingungen wirksam sind und eine einem ersten Reaktionssystem zugeordnete Komponente bei Berührung mit der Probe auf den nachzuweisenden Bestandteil anspricht, dadurch gekennzeichnet, daß es ein System zur Änderung der Reaktionsbedingungen enthält, daß bei Berührung !5 mit der Probe aktiviert wird und nach einer vorher bestimmten Zeit die Reaktionsbedingungen so ändert, daß ein zweites Reaktionssystem wirksam wird.

2. Prüfmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das System zur Änderung der Reaktionsbedingungen mindestens eine Komponente umfaßt, die eingekapselt ist

3. Prüfmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das System zur Änderung der Reaktionsbedingungen einen Katalysator und dessen Substrat umfaßt

4. Prüfmittel nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Komponenten, die zur Änderung der Reaktionsbedingungen wirksam sind, imstande ist, den pH-Wert des ersten Reaktionssystems zu verändern.

5. Prüfmittel nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Komponente, die zur Änderung der Reaktionsbedingungen wirksam ist, imstande ist, eine Substanz zu inaktivieren, die die auf den Bestandteil ansprechende Komponente stören würde.

6. Prüfmittel nach Anspruch 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Kapseln, in die die Komponente (n) eingeschlossen sind, durch Osmose aufbrechen.

7. Prüfmittel nach Anspruch 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Katalysator ein Enzym ist

8. Prüfmittel nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die angegebenen Komponenten sich auf einem festen Träger befinden.