DE2626367C2 - Analytisches Material für die analytische Bestimmung eines Stoffes in einer Flüssigkeitsprobe - Google Patents

Description

und in dem die beiden Reagenzien B und D π voneinander durch eine Sperre oder Trennschicht getrennt sind, dadurch gekennzeichnet, daß die Sperre oder Trennschicht, die die beiden Reagenzien B und D von einander trennt, (1) für das Zerfallsprodukt C gleichförmig permeabel, jedoch für Stoffe, Jie die durch Reaktion des Reagenzes D mit dem Zerfallsprodukt Coder einem Reaktionsprodukt hiervon herbeigeführten Änderung zu stören vermögen, impermeabel ist und (2) so angeordnet ist, daß das Zerfallsprodukt C oder ein Reaktionsprodiikt hiervon durch die Sperre oder Trennschicht hindurch wandert oder in sie hinein wandert, bevor es mit dem Reagenz D in Kontakt gelangt.

2. Analytisches Material nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Zerfallsprodukt C gasförmiges Ammoniak ist

3 Analytisches Material nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß aas erste Reagenz B aus Urease besteht und in einer ersten Schicht enthalten ist und daß das zweite Reagenz D a^s einer Verbindung besteht, die mit Ammoniak unter Erzeugung eines meßbaren Produktes zu reagieren vermag und in einer zweiten Schicht enthalten ist und daß die Sperre oder Trennschicht für Ammoniak permeabel, jedoch für Stoffe, die die Messung des Ammoniaks beeinträchtigen, impermeabel ist

4. Analytisches Material nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Sperre oder Trennschicht aus einem Cellulosepropionatvalerat, Celluloseacetatbutyrat. Celluloseacetat oder Poly-(methylmethacrylat) besteht.

5. Analytisches Material nach Anspruch !,dadurch gekennzeichnet, daß das erste Reagenz B oder das zweite Reagenz D in der Sperre oder Trennschicht verteilt vorliegen.

6. Analytisches Material nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Ausbreitschicht aufweist

Die Frfindung betrifft em analytisches Material für die anayltische Bestimmung eines Stoffes A in einer Flüssigkeitsprobe, das enthält: _fi0

1. ein erstes Reagenz B, das in Gegenwart des Stoffes A unter Bildung eines Zerfallsproduktes C zu reagieren vermag und

2. ein zweites Reagenz D, das mit dem Zerfallsprodukt Coder einem Reaktionsprodukt hiervon unter Herbeiführung einer meßbaren Änderung zu reagieren vermag,

und in dem die beiden Reagenzien Sund D voneinander durch eine Sperre oder Trennschicht getrennt sind.

Sogenannte »trockene« Verfahren zur Durchführung quantitativer oder halb-quantitativer Bestimmungen von Blutkomponenten sind allgemein bekannt Diese bekannten Verfahren beruhen primär auf der Einarbeitung von Reagenzien in aufsaugfähige Trägermaterialien, beispielsweise Papier oder poröse hydrophile Polymerschichten, die gegebenenfalls Deckschichten aus dialysierenden Materialien aufweisen können, um unerwünschte Blutkomponenten, beispielsweise rote Blutkörperchen, abzufiltrieren. So ist es bekannt beispielsweise aus den US-PS 31 45 086, 32 49 513 und

33 95 082 sowie der GB-PS 1 28 778, zur Bestimmung des Blutharnstoffstickstoffgehaltes (im folgenden kurz mit BHST bezeichnet) Urease in einem aufsaugfähigen Träger unterzubringen und diesen mit einer dialysierenden Membran zu versehen.

Bei den aus den genannten Patentschriften bekannten Verfahren bewirkt das Ammoniak, das durch Reaktion des Harnstoffes mit Sauerstoff in Gegenwart von Urease erzeugt wird, eine Farbänderung eines pH ind: kators. Die allgemeine Verwendbarkeit dieser bekannten Systeme wird jedoch durch die Gegenwart anderer basischer Komponenten, auf die der Indikator ansprechen kann, beeinträchtigt. Die dialysierende Membran, sofern eine solche verwendet wird, dient lediglich als eine Art Makrofiher über der äußersten Schicht Die bekannten analytischen Materialien können gegebenenfalls Sperr- oder Trennstreifen aufweisen, die die Aufgabe haben, die Teststreifen in Längsrichtung in Bereiche verschiedener Empfindlichkeit zu unterteilen. Diese Sperr- oder Trennstreifen wirken dabei nicht selektiv auf die Wanderung bestimmter Komponenten in das Innere der Schichten.

Aus der US-PS 30 11 874 ist es des weiteren ebenfalls bekannt Sperr- oder Trennstreifen in analytischen Testmaterialien für die Bestimmungvon BHST vorzusehen. Diese Sperr- oder Trennstreifen dienen jedoch als Sperre für alle Substanzer und .!as Ammoniak wird durch einen Gas freisetzenden Streifen freigesetzt und gelangt durch Diffusion zu dem Indikatorstreifen in einem geschlossenen Behälter.

Weitere Verfahren, die auf der Urease-Reaktion beruhen, jedoch auf Flüssigkeitsreaktionen beschränkt sind, sind beispielsweise aus den US-PS 34 09 508 sowie

34 85 723 bekannt. Mit der BHST Analyse beschäftigen sich weiter die US-PS 37 18 433, 36 55 416. 35 67 364.

35 Π 611 und 35 31 254.

Aus der US-PS 37 23 064 ist des weiteren ein schichtenförmiges analytisches Material für die klinische Analyse bekannt, das zwei Reagenzschichten aufweist die durch eine Zwischenschicht von einander getrennt sind. Eine dieser Schichten kann eine Art chemischer Sperre verschiedener Konzentration aufweisen, die spezifisch für das zu analysierende Endprodukt ist. Die Zwischenschichten können in Form einer Vielzahl von sich vertikal ausdehnenden Barrieren vorliegen, z. B. aus Celluloseacetat, um die Konzentrationsgradienten der durch die Zwischenschichten strömenden Flüssigkeit zu steuern. Diese Barrieren oder Sperren fangen jedoch keine störenden oder uner* wünschten Komponenten ab, die in der normalen Stfömungsfichtung von einer Reagenzschicht in die andere gelangen. Des weiteren ist ihre Konzentration innerhalb des Probenabschnittes des analytischen Materials verschieden.

Aus der US-PS 39 01 657 ist es auch bekannt,

zwischen einer ein Reagenz enthaltenden Schicht und einer Indikatorschicht eine Filterpapierschicht für die physikalische Trennung der beiden Schichten anzuordnen. Bei diesem analytischen Material gelangt die ganze Flüssigkeitsprobe durch das Filterpapier. In der Patentschrift findet sich kein Hinweis darauf, daß die Papierschicht nur einen Teil der aufgebrachten Probe passieren lassen soll oder ein Zerfallsprodukt der analytischen Reaktion.

Aus der BF-PS 8 01 742 sowie der DE-OS 23 32 760 ist ferner ein analytisches Material für die Blutanalyse bekannt, das aus einer Reagenzschicht, einer isotrop poröüen Ausbreitschicht sowie weiteren Schichten, beispielsweise einer Dialysierschicht, einer Filterschicht, einer reflektierenden Schicht oder einer Kombination von derartigen Schichten aufgebaut ist. Die Verwendbarkeit derartiger analytischer Materialien für die quantitative Blutanalyse beruht dabei auf einer Verschiebung der Energieabsorption oder einer Veränderung der Energiedurchlässigkeit als Folge der Gegenwart eines zu analysierenden Stoffes in der zu analysierenden Probe. Die Reagenzschicht befindet sich dabei in FIüssigkeites-Kontakt mit der Ausl.veitschicht, so daß die zu analysierende Komponente oder eine Vorläuferverbindung derselben oder ein Reaktionsprodukt derselben die Reagenzschicht zu erreichen vermag. Die Filter- oder Dialysierschicht oder Schichten haben dabei die Aufgabe, den Durchtritt von in der Probe vorhandenen filtrierbaren Materialien zu verhindern und Probenbestandteile passieren zu lassen, die in der Filterschicht nicht zurückgehalten wurden. Derartige Filter- oder Dialysierschichten haben dabei nicht die Aufgabe für einen Durchtritt eines Zerfallsproduktes zu sorgen, das direkt oder indirekt durch Stoffe in einer Reagenzschicht erzeugt worden ist, die sich bei normalem Fluß der Flüssigkeit über der Filterschicht befindet, und sie haben nicht die Aufgabe, den Durchtritt von möglicherweise bei den analytischen Bestimmungen störenden Substanzen zu verhindern. Im Falle dieses bekannten analytischen Materials sind die Filter- und Dialyi/.erschichten derart angeordnet, daß sie in Kontakt mit der zu analysierenden Substanz gelangen, bevor diese in die Reagenzschicht gelangt.

Aus den US-PS 38 38 033 sowie 38 96 008 ist des weiteren die Verwendung von Vorrichtungen mit »Enzym-Elektroden« unter Verwendung semipermeabler Membranen, die selektiv pe.-meabel für einen bestimmten Stoff sind, in Verbindung mit einer Enzymschicht und einer Elektrode für die poteptiometnsche Ermittlung eines Zerfallsproduktes, das durch das Enzym erzeugt .eird. beispielsweise das aus Harnstoff in Gegenwart von Urease erzeugte Ammoniak, beka.int.

Aus der DE-PS 12 45 619 ist schließlich ein zur Untersuchung biologischer Flüssigkeiten dienender Indikatorstreifen aus einem saugfähigen Träger, der auf gegeneinander abgegrenzte Querbänder verteilte verschiedenartige Reagenzsysteme aufweist, bekannt, bei dem an einem Streifenende beginnend, hintereinander drei Reaktionssysteme vorgesehen sind, von denen das erste mit dem in der biologischen Flüssigkeit nachzuweisenden Stoff unter Gasbildung und Lösung des Gases in der Flüssigkeit reagiert, das zweite das gelöste Gas freisetzt und das dritte mit Hilfe eines Farbindikators die gebildete Gasmenge meßbar macht, und der !wischen dem zweiten und dritten System eine Zone aufweist, durch welche Flüssigkeit nicht hindurchzudiffundieren vermag.

Die Durchführung von Messungen erfulgc mit dem bekannten Indikatorstreifen in der Weise, daß dieser in ein die zu analysierende Probe enthaltendes Prüfröhrchen eingeführt wird, worauf das Röhrchen verschlossen wird. Das zu untersuchende Grundfluidum wandert dann unter Kapillarwirkung im Streifen aufwärts, wobei es zunächst mit dem Reaktionsband in Berührung kommt, in dem die beschriebene Umsetzung unter Gasbildung vor sich geht. Das hierbei gebildete Gas wird zunächst in der Flüssigkeit gelöst, mit der der Streifen während des Versuches gesättigt wird. Die dieses Gas enthaltende Flüssigkeit wandert nunmehr unter Kapillarwirkung weiter im Streifen aufwärts und tritt in das Gasfreimachband ein, in dem sich sein pH-Wert unter der Wirkung des Stoffes, mit dem dieses Band getränkt ist, auf einen Wert ändert, der ein vollständiges Freimachen des in der Lösung gelöstes Gases gewährleistet. Das freigesetzte Gas steigt im Teströhrchen nach oben und wirkt auf das Indikatorband ein, in der Regel unter Veränderung des pH-Wertes in diesem Band, wodur<~'- sich die Farbe des Bandes verändert.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes »trockenes« analytisches Material für die Analyse komplexer Flüssigkeiten anzugeben, das vor dem Eindringen unerwünschter Komponenten, die das analytische Bestimmungsverfahren fehlerhaft gestalten würden, geschützt ist. Das Aufzeichnungsmaterial sollte dabei insbesondere für die quantitative Analyse vor. Blutkomponenten, beispielsweise Hprnstoff-Stickstoff. geeignet sein.

Die Lösung dieser Aufgabe ist im Anspruch 1 gekennzeichnet.

Das erfindungsgemäße analytische Material eignet sich insbesondere für die Analyse von BHST, in welchem Falle das Enzym Urease Harnstoff in NHj überführt.

Vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen analytischen Materials sind in den Patentansprüchen 2 bis 5 beschrieben.

Im Falle eines jeden analytischen Materials, dessen Verwendbarkeit auf einer Reaktion zwischen einem Reagenz und einem zu analysierenden Stoff beruht, bereitet die Tendenz des Reagenz unerwünschte Reaktionen einzugehen, ein Problem. So kann das Reagenz beispielsweise eine unerwünschte meßbare Änderung dadurch herbeiführen, daß es mit Nebenprodukten aus der Reaktion zwischen dem Reagenz und dem zu analysierenden Stoff reagiert. Auch kann das Reagenz mit anderen Komponenten der zu analysierenden Flüssigkeitsprobe reagieren. Dadurch können die Analyseergebnisse verfälscht werden. Die erfindungsgemäß verwendete Sperre oder Trennschicht soll somit derartige, durch unerwünschte Nebenreaktionen erzeugte Verbindungen fernhalten.

Das erfindungsgemäße analytische Material weist einen vergleichsweise einfachen Aufbau auf. ist vergleichsweise leicht und billig herzustellen und ermöglicht die Analyse von Flüssigkeiten in einfacher und genauer Weise. Das erfindungsgemäße analytische Material kann in Form eines endlosen Streifens oder Bandes vorliegen, jedoch auch in Form von Blättern oder kurzen Streifen oder Abschnitten oder sogenannten »Chips«, die gegebenenfalls auf Karten oder anderen Haltevorrichtungen befestigt oder untergebracht werden kunnen. Die Form des analytischen Materials ist somit unwichtig. Obwohl das analytische Material nach der Erfindung vorzugsweise aus einem

mehrschichtigen Material besteht, ist doch allgemein kennzeichnend für ein erfindungsgemäßes Material die Trennung der beiden Reagenzien B und D durch eine Sperre mit der gewünschten selektiven Permeabilität während der Zeitspanne, die für die Analyse erforderlich ist. Der hier gebrauchte Ausdruck »pefrfieabel« bedeutet, daß sämtliches Zerfallsprodukt oder praktisch sämtliches Zerfallsprodukt C, das der Sperre oder der Sperrschicht zugeführt wird, tatsächlich innerhalb der für die Analyse angesetzten Zeitspanne durch die Sperre oder Sperrschicht gelangt.

Die quantitative Analyse des Stoffes A, beispielsweise durch Ermittlung des Harnstoff-Stickstoffgehaltes von Blutserum läßt sich leicht durch Verwendung üblicher Spektrophotometer erreichen oder nach anderen Methoden, die dazu geeignet sind, um in schneller Weise mit hoher Genauigkeit die Menge von durch Strahlungsenergie feststellbaren Produkten zu ermitteln, die bei der Bestimmungsmethode erzeugt werden.

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res Produkt« bezieht sich dabei auf ein Produkt, das entweder durch Erzeugung oder Verlust oder Verminderung eines Farbtones. Fluoreszenz oder anderer Charakteristiken die Strahlungsenergietransmission oder Strahlungsenergiedurchlässigkeit oder die Reflexionscharakteristiken des Materials verändert.

Unter einem »Zerfallsprodukt« sind beispielsweise Produkte zu verstehen, die durch Dissoziation, Dehydratation. Hydrolyse und dergleichen anfallen.

Unter einem Reaktionsprodukt eines Zerfallsproduktes C ist ein Stoff oder eine Substanz zu verstehen, die anfällt durch Reaktion des Produktes eines Zerfalles, z. B. durch Dissoziation. Dehydratation oder Hydrolyse mit einer anderen Substanz oder anderen Substanzen. z. B. einem Reagenz, das in dem analytischen Material vorliegt.

Unter einem »Reagenz« ist ein Stoff zu verstehen, der mit dem zu analysierenden Stoff zu reagieren vermag, einer Vorläuferverbindung dieses Stoffes, einem Zerfallsprodukt des Stoffes oder einem Reaktionsprodukt desselben. Der Ausdruck »Reaktion« ist dabei im weitesten Sinne zu interpretieren, d. h. er bezieht sich auf eine chemische Reaktionsfähigkeit, katalytische Aktivität, z. B. bei der Erzeugung eines Enzym-Substratkomplexes oder eine jede andere Form einer chemischen oder physikalischen Reaktion, die letztlich innerhalb des Materials zu einer meßbaren oder erkennbaren Veränderung führt und beispielsweise mittels Strahlungsenergie, normalerweise in Form von Lichtenergie, ermittelt werden kann.

Obgleich die Erfindung irr fügenden insbesondere anhand eines B"«piels beschrieben wird, in dem die Reagenzien aus einem Enzym, das das Zerfallsprodukt liefert und einem Indikator bestehen, der auf das Zerfallsprodukt anspricht und die Feststellung einer meßbaren Änderung ermöglicht, können doch auch die verschiedensten anderen Reagenzien zur Hersteilung eines erfindungsgemäßen analytischen Materials verwendet werden.

Ein erfindungsgemäßes analytisches Material weist vorzugsweise einen laminaren Aufbau auf, so daß bei einer Betrachtung eines Querschnittes des Materials die einzelnen Schichten übereinander liegen. Ein solcher A.ufbau ermöglicht es. daß ein Tropfen der zu analysierenden Flüssigkeit durch Einwirkung der Schwerkraft, durch Einwirkung von Kapillareffekten und Dochteffekten von der äußersten Schicht in eine oder mehrere Innenschichten diffundiert.

Eine jede Schicht weist eine sogenannte Proben-Abschnittsfläche auf. Der Ausdruck »Proben-Abschnittsfläche« bezieht sich dabei auf den gesamten Oberflächenbereich, der für eine Benetzung durch eine aufgebrachte Probe bestimmt ist oder ein Zerfallsprodukt einer Komponente der Probe bei der normalen Bewegung durch das Material bei jedem gegebenen Querschnitt des Materials quer zum Flüssigkeitssirom. Vorzugsweise liegt eine gleichförmige Verteilung der

ίο Komponente innerhalb einer jeden Proben-Abschnittsfläche einer jeden Schicht vor, so daß innerhalb der Schicht ein gleichförmiges Ergebnis erzielt wird.

Eine solche Gleichförmigkeit ist wichtig für quantitative Bestimmungen sofern das im Aufzeichnungsmaterial erzeugte Resultat auf radiometrischem Wege ermittelt werden soll, beispielsweise einem Reflektormeter. Der hier bei der Beschreibung der Schichten verwendete Ausdruck »gleichförmig« bedeutet, daß eine jede Volumeneinheit einer Schicht die gleiche oder

aufweist wie jede andere Volumeneinheit. Vorzugsweise wird eine solche Gleichförmigkeit dadurch erreicht, daß die in Frage stehende Schicht eine gleichförmige Dicke aufweist und eine gleichförmige Menge an Reagenz oder Material, aus dem die Sperre oder Trennsicht aufgebaut ist.

Vorzugsweise soll die Proben-Abschnittsfläche der Sperre oder Trennschicht, die sich in Kontakt mit der Reage*.-ischicht befindet und die zuvor mit der

jo Flüssigkeit zusammentrifft, mindestens praktisch vom gleichem Umfang sein wie die Proben-Abschnittsfläche der Reagenzschicht, auf die di? Flüssigkeit zunächst auftrifft, um zu gewährleisten, doß unerwünschte Stoffe von der Proben-Abschnittsfläche der Indikatorschicht während der Zeitdauer des Testes ferngehalten oder ausgeschlossen werden. Selbstverständlich jedoch kann die Proben-Abschnittsfläche der Sperre oder Trennschicht auch beträchtlich größer sein, d. h. die Proben-Abschnittsfläche der Sperre oder Sperrschicht kann einen beträchtlich größeren Umfang haben als die Proben-Abschnittsfläche der Reagenzschicht

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung besteht das anayltische Material aus einem Schichtträger und auf eine Seite des Schichtträgers aufgetragenen Schichten, wovon mindestens eine Schicht aus einer Indikatorschicht besteht eine Schicht eine Sperre oder Trennschicht ist und eine Schicht ein Enzym enthält und wobei über den Schichten eine Ausbreitschicht angeordnet ist welche die auf das

so analytische Material aufgebrachte Probe ausbreitet und verteilt. Die Enzymschicht kann dabei ein oder mehrere Enzyme enthalten, je nach der durchzufüh ;nden Bestimmung.

Die Zeichnungen stellen Ausführungsbeispiele dar, die zur näheren Erläuterung der Erfindung im Folgenden beschrieben werden.

Im Falle der in den F i g. 1 bis 5 dargestellten Materialien stellen die einzelnen Schichten jeweils Proben-Abschnittsflächen dar. Die Abschnittsflächen einer jeden Schicht hat dabei den gleichen Umfang wie die Abschnittsfläche der benachbarten Schicht Jede Schicht kann über die dargestellten Proben-Abschnittsflächen hinaus jedoch verlängert sein, wobei diese Abschnitte des Materials nicht notwendigerweise Reagenzien zu enthalten brauchen und/oder eine Trenn- oder Sperrschicht da die Flüssigkeitsprobe, der zu anaiysierende Stoff and/oder das oder die Zerfallsprodukte nicht mit diesen Abschnitten in Kontakt

gelangen oder sie durchdringen.

Das in Fig. I dargestellte analytische Material 10 besteht aus einem Schichtträger 12, einer hierauf aufgetragenen Indikalorschichl 14, einer Sperr- oder Trennschicht 16, einer Enzymschicht 18 und einer Ausbreilschichl 20, \velche die Oberfläche des Materials bildet, auf die die zu analysierenden Flüssigkeitsprobe aufgebracht wird. Die Schicht 20 kann des weiteren ander? Funktionen erfüllen, sofern dies erwünscht ist, beispielsweise eine filtrierende Funktion und/oder eine reflektierende Funktion, wie es später genauer beschrieben werden wird. Die Schicht 20 stellt eine von der Schicht 18 getrennte, besondere Schicht dar.

Bei den in den F i g. 2 bis 5 dargestellten analytischen Materialien handelt es sich um verschiedene Ausgestaltungen eines erfindungsgemäßen analytischen Materials Im Falle der Fig. 2 bis 5 sind Schichten, die Schichten der Fig. 1 entsprechen, durch zusätzliche Buchstaben »a«bis »d« gekennzeichnet.

Das in Fig. 2 dargestellte analytische Material 10a besteht aus einem Schichtträger 12a, einer Ausbreitschicht 20a und einer Enzymschicht 18a. Im Falle dieses analytischen Materials enthält die Sperr· oder Trennschicht den Indikator. Sperrschicht und Indikatorschicht sind somit zu einer Schicht 30 kombiniert worden.

Das in Fig. 3 dargestellte analytische Material 106 besteht aus einem Schichtträger 126, einer Indikatorschicht 146 und einer Trennschicht 166 wie im Falle des in Fig. 1 dargestellten Materials. Im vorliegenden Falle wurde jedoch die Enzymschicht 18 mit der Ausbreitschicht 20 zur Schicht 40 kombiniert.

Im Falle der Fig.4 besteht das analytische Material 10c aus einem Schichtträger 12c und lediglich zwei hierauf aufgetragenen Schichten 30c und 40c. und zwar einer kombinierten Sperr-Indikatorschicht 30c und einer kombinierten Ausbreit- und Enzymschicht 40c.

Das in Fig. 5 dargestellte analytische Material 10c/ besteht aus einem Schichtträger \2d sowie einer Ausbreitschicht 2Od (entsprechend Schicht 20 von Fig. 1) sowie einer mittleren Schicht 50. Diese mittlere Schicht 50 bildet die Sperre oder Sperr- oder Trennschicht, wobei jedoch die beiden Oberflächenanteile der Schicht 50 zusätzliche Bestandteile enthalten, nämlich: Der Anteil der mittleren Schicht, der dem Schichtträger 12c/zugewandt ist, enthält einen Indikator für die Erkennung des Zerfallsproduktes, während der Teil 18t/der Sperre oder Sperr- oder Trennsicht, der an die Ausbreitschicht 20c/angrenzt. ein Enzym enthält.

Bei der in F i g. 5 dargestellten analytischen Element weist die mittlere Schicht 50 einen Mittelabschnitt 52 auf, der weder Enzym noch Indikator enthält Ein solcher Mittelabschnitt 52 braucht jedoch nicht vorhanden zu sein, sofern sich die Schichtteile 14c/ und 18c/nicht überlappen.

Bei dieser in Fi g. 5 dargestellten Ausgestaltung eines analytischen Elementes wirkt die Sperre oder Trennschicht gleichzeitig als Bindemittel für das Enzym und den Indikator.

Die in Fig.5 dargestellte Ausführungsform eignet sich für die Durchführung von solchen Bestimmungen, in denen der zu bestimmende Stoff A. wie auch das Zerfallsprodukt C das aus dem Stoff A erhalten wurde, in die Sperre oder Trennschicht einzudringen vermögen. Dringt der Stoff A nicht in letztere ein, so muß ein Teil des Enzyms in der Schicht 20c/ untergebracht werden, in F i g. 5 als Teil 54 dargestellt

Wie sich aus der vorstehenden Beschreibung ergibt müssen — was für eine Form eines analytischen Materials auch immer verwendet wird — bestimmte Funktionen erfüllt werden: Zunächst muß die auf das Material aufgebrachte Flüssigkeitsprobe gleichförmig ausgeteilt werden, vorzugsweise mittels einer Ausbreit-

Ϊ schicht. Der zu analysierende Stoff muß zersetzt werden, vorzugsweise mittels eines Enzymes. Das Zerfallsprodukt muß selektiv über eine Sperre oder Trennschicht zum Indikator gelangen können, und es muß schließlich eine bestimmte Menge an Zerfallsprodukt erzeugt werden, die der Menge an Stoff A entspricht, die in der aufgebrachten Probe vorhanden ist.

Vorzugsweise liegt der Indikator in Form einer Farbsloffvorläuferverbindung oder eines ausbleichba-

B ren Farbstoffes vor.

Im folgenden sollen diese verschiedene Funktionen der Reihe nach näher erläutert werden.

Eine auf ein analytisches Material aufgebrachte Probe einer Flüssigkeit wird zunächst gleichförmig verteilt.

iö vorzugsweise durch eine oder mehrere Schichten, welche die Funktion der Ausbreitung der Probe ausüben. Die Ausbreitung erfolgt dabei in der Weise, daß auf der Oberfläche der Ausbreitschicht, die sich in Flüssigkeitskontakt mit der oder den benachbarten Schichten befindet, eine gleichförmige Konzentralion der Flüssigkeilsprobe erhalten wird. Die Ausbrsitschicht eines mehrschichtigen analytischen Materials ist im allgemeinen die Schicht, auf welche die zu analysierende Flüssigkeitsprobe aufgebracht wird, bei-

jo spielsweise eine Probe Blut oder Blutserum. In typischer Weise wird die Flüssigkeitsprobe dabei auf die Äusbreitschicht in Form eines Tropfens aufgebracht.

Der hier gebrauchte Ausdruck »Flüssigkeitskontakt« bedeutet einen Kontakt, der es einer Flüssigkeit oder einer oder mehreren Komponenten der Flüssigkeit, gleichgültig, ob in flüssiger oder gasförmiger Form vorliegend, ermöglicht die Schichten zu passieren oder zwischen den Schichten transportiert zu werden.

Die Ausbreitschicht kann dabei innerhalb der Schicht eine Substanz oder mehrere Substanzen einschließlich mindestens einer Komponente einer Flüssigkeitsprobe, die auf das Maierial aufgebracht worden ist. verteilen, so daß zu jeder gegebenen Zeit eine gleichförmige Konzentration der Substanz an der Oberfläche der Ausbreitschicht vorliegt, die der Enzymschicht gegenüberliegt, d. h. der Enzymsehicht näher ist. Die auf das Material aufgebrachte Probe braucht nicht begrenzt zu sein. Natürlich kann die Konzentration, die zunächst gleichförmig ist. sich innerhalb einer bestimmten Zeitspanne ohne nachteilige Effekte verändern. Konzentrationsgradienten können auch in der Schicht vom oberen Teil zum unteren Teil existieren.

Die Ausbreitschicht ist dabei in vorteilhafter Weise eine isotrop poröse, d. h. nach allen Richtungen poröse, Schicht Der Aufbau vorteilhafter Ausbreitschichten ist aus den bereits erwähnten BE-PS 8 01 742 und DE-OS 23 32 760 bekannt

Damit der umzusetzende oder zu zersetzende Stoff A in ein für eine Bestimmung geeignetes Produkt

so überführt werden kann, wird die Probe in vorteilhafter Weise durch die Ausbreitschicht ausgebreitet oder verteilt und dem ersten Reagenz B zugeführt z. B. einem Enzym. Das Reagenz B, d. h. beispielsweise das Enzym, kann in einer besonderen Schicht untergebracht sein, z. B. einer besonderen Enzymschicht oder in der Ausbreitschicht enthalten sein.

Das im Einzelfalle verwendete Reagenz B, z. B. das im Einzelfalle verwendete Enzym, hängt von der ange-

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wandten Bestimmungsmethode ab. Zur Bestimmung des Blut-Hamstoff-Sticksloffes unter Erzeugung von Ammoniak hat es sich als vorteilhaft erwiesen, als Enzym Urease zu verwenden.

Im folgenden soll ein Ausführungsbeispiel für ein Enzym enthaltendes analytisches Material näher beschrieben werden.

Die Enzymschicht ist vorzugsweise aus einem Bindemittel, beispielsweise in einer Beschichtiingsstärke von 3,0 g/m² bis etwa 30,0 g/m², einer geeigneten Enzymmenge und einem Puffersystem zur Aufrechterhaltung eines pH-Wertes aufgebaut. Im allgemeinen ist das Enzym lediglich innerhalb eines vergleichsweise $ngen pH-Wertbereiches wirksam. Infolgedessen ist es Im allgemeinen erforderlich, die Schicht mit dem Enzym »uf einen geeigneten pH-Wertbereich abzupuffern. indem das Enzym wirksam ist. Dies muß jedoch unter Berücksichtigung der pH-Erfordernisse der Glcichgewichtsbedingungen des zu erzeugenden Zerfallsprodukt

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us guauiiuifuir. r\ta rui luiiuai ι nut u.3 aiuii Ui ITiUJbIi₁ utu Enzymschicht mit der Urease auf einen pH-Wert von ttwa 5 bis 9,5, insbesondere 7,5 bis 9,0. abzupuffern. »bgleich auch außerhalb des Bereiches von 5 bis 9,5 eine gewisse enzymatische Aktivität zu beobachten ist. Das Abpuffern der Schicht kann nach üblichen bekannten Methoden erfolgen, indem die Puffersubstanzen in der ßeschichtungsmassc vor der Beschichtung des Schicht-Irägers gelöst oder dispergiert werden.

Die Enzymschicht kann gegebenenfalls weitere Zusätze enthalten, z. B. einem Enzymaktivator. z. B. Dithiothreitol.

Im Falle eines analytischen Materials für die Bestimmung von Blut-Harnstoff-Stickstoff (BHST) kann die Enzymschicht somit beispielsweise aufgebaut lein aus einem Bindemittel, z. B. Gelatine, Agarose, Polyvinylalkohol und dergl.. einer geeigneten Menge an Urease, z. B. 4000 U/m² bis etwa 50 000 U/m², vorzugsweise 10 000 U/m² bis 30 000 U/m², einem Salz der Älhylendiamintetraessigsäure als Komplexbildner und «inem ortho-Phosphat-Puffer.

Erfindungsgemäß wird während der Dauer der Bestimmung der Indikator vor störenden Verbindungen Isoliert, indem verhinde.*) wird, daß derartige störende Verbindungen zum Indikator gelangen können. Dies wird durch eine selektiv permeable Sperre oder ■Trennschicht erreicht, die das Enzymreagenz vom Indikator trennt. Der Ausdruck »Sperre oder Trennichicht, die die Reagenzien trennt«, bedeutet daß eine Sperre oder Trennschicht vorhanden ist. die das Enzymreagenz physikalisch vom Indikatorreagenz feoliert

Vorzugsweise liegt die Sperre in Form einer diskreten Schicht vor, zwischen benachbarten Schichten, welche die Reagenzien in einer Proben-Abschnittsfläche enthalten oder aber die Sperre liegt in Form einer Dispersion oder Verteilung in der Schicht vor oder einem Teil der Schicht, die das Enzym enthält und/oder in der Schicht, die den Indikator enthält

Die Sperren haben dabei die Aufgabe, den Indikator, der ein durch Strahlungsenergie bestimmbare Produkt liefert vor störenden Verbindungen oder Stoffen zu isolieren.

Die Sperre oder Trennschicht ist dabei nicht mit üblichen Filterschichten zu verwechseln, die unwirksam bezüglich der Femhaltung störender Stoffe sind. Eine erfindungsgemäße Sperre oder Trennschicht ist gleichförmig impermeabel für störende Stoffe.

Der Ausdruck »gleichförmig impermeabel« bedeutet daß die Sperre oder Trennschicht impermeabel oder praktisch impermeabel während der Durchführung der Analyse ist, dahingehend, daß der Indikator vor störenden Verbindungen geschützt wird, die in der zu j analysierenden Probe enthalten sein können oder in dieser erzeugt werden können. Die Zeitspanne der Analyse hängt dabei von dem zu analysierenden Stoff A ab und den Reagenzien, die für die Bestimmung verwendet werden.

ι» Vorzugsweise liegt die Sperre in Form einer Schicht vor mit einer Proben-Abschnittsfläche, in der die Sperre gleichförmig und mindestens von gleichem Umfang ist wie die Proben-Abschnittsfläche der Enzymschicht. Die Sperre kann somit aus einer separaten Schicht bestehen (Trennschicht), die sich zwischen der das Enzym enthaltenden Schicht und der Schicht mit dem Indikator befindet. Andererseits kann die Sperre aber auch in dzr Enzymschicht und/oder der Indikatorschicht oder Teilen hiervon enthalten sein. Schließlich können das

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£U UlUjIIl UIIUUbI 1 I lUirVU ll/f Ill UUII WL/bl liaUllblltbllUII UIIIbI Von der Sperre erzeugten Schicht enthalten sein, in welchem Falle gegebenenfalls ein zentraler, die Sperre bildender Teil vorliegt, der praktisch frei von Indikator Und/oder Enzym ist.

Die im Einzelfalle verwendete Sperre oder Trennschicht sowie die Mengen der zum Aufbau der Sperre bzw. Trennschicht verwendeten Stoffe hängen von der Art des Zerfallsproduktes ab. das durch die Sperre oder Trennschicht gelangen soll. Im Falle der Analyse von Blut-Harnstoff-Stickstoff soll die Sperre oder Trennschicht unter atmosphärischem Druck impermeabel sein für flüssige Basen, die im Blut oder Blutserum Vorhanden sind, jedoch permeabel für Ammoniakdämpfe. Bei Verwendung von Urease als Enzym ist die Sperre oder Trennschicht in idealer Weise impermeabel für Wasser und impermeabel für wäßrige Basen, jedoch permeabel für Ammoniakdämpfe. Aus diesem Grund soll sich mindestens ein Teil der Urease außerhalb der Schicht befinden, die durch die Sperre oder Trennschicht erzeugt wird. Auf diese Weise werden andere Basen, die mit dem Inikator reagieren und das Analysenergebnis verfälschen könnten, aufgeschlossen. Die Sperre oder Trennschicht kann aus einer Lage verschiedener Dicke bestehen, die einen Durchtritt von Ammoniak in mindestens einer Richtung ermöglicht, während gleichzeitig der Durchtritt von wäßrigen Basen in dem Zeitraum verhindert wird, der für die Durchführung der Bestimmungsmethode benötigt wird.

In typischer Weise wird für die Durchführung einer

so Analyse, beispielsweise der Durchführung einer Blut-Harnstoff-Stickstoffanalyse, eine Zeit von etwa 5 bis 20 Minuten benötigt

Besonders vorteilhafte Stoffe für den Aufbau von Sperren und Trennschichten, die für Ammoniak permeabel sind, jedoch impermeabel für Wasser und wäßrige Lösungen sind, sind Polymere, wie beispielsweise Cellüloseacetatbutyrate mit einem Butyrylgruppengehalt von 10 bis 60 Gew.-°/o und einem Acetylgruppengehalt von 5 bis 30 Gew.-%, ferner Cellulosepropionatvalerate mit einem Valerylgruppengehalt von 20 bis

50 Gew.-%, ferner Poly(methyimethacryiate) sowie Celluloseacetate, acetyliert und auf einen Acetylgnippengehalt von über 19%, vorzugsweise bis zu etwa 40%.

Aus derartigen Polymeren aufgebaute Sperren oder Trennschichten ermöglichen den Durchtritt von Ammoniakdämpfen während der Zeitspanne der Durchführung des Testes, ermöglichen die Reaktion des Ammoniaks mit dem Indikator unter Erzeugung einer

uuci ucaiiiiiiiiuai cn /υ r\.uii£cim

Far^veränderung, während störende Reaktionen, die das analytische Ergebnis verfälschen könnten, ausgeschaltet werden.

Im Falle der Analyse von BHST kann die Sperre, gleichgültig ob sie in Form einer besonderen Trennschicht angewandt wird, die von der Indikatorschicht getrennt ist oder in diese eingearbeitet oder mit dieser vermischt ist, eine Beschichtungsstärke von z. B. 0,10 g/m² bis 3,5 g/m², vorzugsweise von 0,20 g/m² bis I₁O g/m² haben.

Zur Verbesserung der Haftung von auf eine Sperre enthaltende Schicht oder eine Trennschicht aufgebrachten Deckschichten, beispielsweise aus einem Celluloseester, kann die Oberfläche der Sperre oder Trennschicht Ichwach hydrolysiert werden.

Der Indikator stellt mindestens einen Teil der Testmaterialien dar, die mit Bestandteilen oder Zerfellsprodukten von Bestandteilen der zu analysierenden ttobe zu reagieren vermögen. Es ist der Indikator, der I UIU l.l£CU^UIIg UIIICI IIIUUL

Veränderung verantwortlich ist, in Abhängigkeit von dem erzeugten Zerfallsprodukt (oder Reaktionsprodukt fciervon) und der selektiv in der beschriebenen Weise Ibgeschirmt wird.

In vorteilhafter Weise kann ein erfindungsgemäßes Analytisches Material ein oder mehrere reaktionsfähige Ihdikatoren aufweisen, die in einem hydrophilen Kolloid intergebracht sein können, das als Bindemittel dient, leispielsweise deionisierter Gelatine, Polyvinylalkohol ■nd Agarose. Auch können die Indikatoren in lydrophoben Bindemitteln untergebracht werden, beitiielsweise Celluloseacetat, Celluloseacetatbutyrat und thylcellulose, die für einen gewünschten Bestandteil tder ein Zerfallsprodukt eines Bestandteiles permeabel Und. Des weiteren kann beispielsweise, wie sich aus f i g. 2 ergibt, die Sperre auch als Bindemittel dienen, in Welchem Falle die Verwendung eines weiteren Bindetiittels für den Indikator nicht erforderlich ist.

Der im Einzelfalle zu verwendende Indikator hängt telbstverständlich von der Art der zu analysierenden Hüssigkeitsprobe ab sowie der im Einzelfalle durchzufchrenden Bestimmungsmethode.

Im Falle der Verwendung eines analytischen Materials für die Bestimmung von Harnstoff über einen iiittels Urease katalysierten Zerfall unter Erzeugung ton Ammoniak werden Indikatoren benötigt, die in Gegenwart von Ammoniak ihr Absorptionsspektrum Indern. Als besonders vorteilhafte Indikatoren haben Mch ausbleichbare Farbstoffe und Farbstoffvorläuferterbindungen erwiesen.

Der Ausdruck »Farbstoffvorläuferverbindung« steht iir jede Verbindung, die einen Farbstoff durch Strukturelle Veränderung ihrer Molekularstruktur zu erzeugen vermag, beispielsweise durch Eliminierung von einem oder mehreren Atomen, z.B. durch Deprotonisierung oder durch Kombination von modifizierten oder veränderten Molekülen miteinander (Autokupplung) oder durch Reaktion mit einem Farbkuppler. Beispiele für die zuerst erwähnten Verbindungen sind durch Basen aktivierbare Chromogene, wohingegen Beispiele für die zuletzt erwähnten Verbindungen Diazoniumsalze sind.

Geeignete Indikatoren sind beispielsweise Leucocyaninfarbstoffε und Phthaleinfarbstoffe.

Als Indikatoren des weiteren verwendbare bleichbare Farbstoffe sind Farbstoff vom Styryltyp wie auch pH-wertsempruidliche Pyryliumfarbstoffe.

Im Falle der Verwendung von Diazoniumsalzen ist das Vorhandensein eines Farbkupplers zur Erzeugung eines Farbstoffes in basischer Umgebung, wie sie beispielsweise durch NH3 hervorgerufen wird, erforderlich. Erfindungsgemäß verwendbar sind die verschiedensten bekannten Diazoniumsalze, die als Farbbildner verwendbar sind. Typische geeignete Diazoniumsalze sind Benzoldiazoniumsalze.

Mit den Diazoniumsalzen könnün die verschiedensten Azofarbstoffkuppler unter Erzeugung von Azofarbstoffen umgesetzt werden. Geeignete Azofarbstoffkuppler sind beispielsweise bekannt aus dem Buch von Kosar, »Light-Sensitive Systems«, Verlag John Wiley & Sons, Inc.. New York (1965), Seiten 220—240. Als besonders geeignet haben sich dabei phenolische Kuppler erwiesen.

Die Indikatorschicht kann somit aus einem Bindemittel und einem Indikator aufgebaut sein, wobei das Bindemittel in vorteilhafter Weise in einer Konzentration von 1,0 bis 20,0 g/m² vorliegt, insbesondere in einer

äiiöfi Von 5,0 ui5 l5,0g/rn-. Die iiTi

günstigste Konzentration an Bindemittel hängt natürlich von efer in: Einzelfalle vorteilhaftesten Dicke des analytischen Materials ab. Die Konzentration des Indikators muß ausreichen, um die Konzentration de' zu

η analyiserenden Stoffes innerhalb des zu erwartenden Konzentrationsbereiches anzeigen zu können.

Im Falle der Blut-Harnstoff-Stickstoffanalyse liegt der zu erwartende BHST-Bereich bei 0 bis 150 mg· pro dl Probe. Der Indikator muß auf diesen Bereich ansprechen können, was bedeutet, daß der Katalysator zweckmäßig in einer Konzentration von 3,0 χ ΙΟ⁴ Molen/m² bis I χ 10-^? Molen/m², insbesondere in einer Konzentration von 5 χ 10-⁴ und 9,0 χ 10-⁴ Molen/m² vorliegen soll.

Gegebenenfalls kann das analytische Material einen Schichtträger aufweisen, sofern die einzelnen Schichten des Materials selbst kein selbsttragendes Material bilden

Weisl das analytische Material einen Schichtträger auf, so kann dieser aus Mnem strahlungsdurchlässigen (vorzugsweise lichtdurchlässigen), für Flüssigkeiten impermeablen Schichtträger bestehen. Der Schichtträger kann aus einem der verschiedensten üblichen bekannten Schichtträgermaterialien bestehen heispielsweise aus Celluloseacetat, Poly(äthylenterephthalat), einem Polyc&rbonat oder Polystyrol. Der Schichtträger kann von verschiedener Stärke sein. Vorzugsweise liegt die Schichtträgerstärke bei 0,05 bis 0.25 mm. Als vorteilhaft hat es sich erwiesen, wenn der Schichtträger mindestens bestimmte Wellenlängen des elektromagnetischen Spektrums des Bereiches von 200 bis 900 nm durchläßt Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, wenn der Schichtträger eine selektive Durchlässigkeit für einen speziellen, relativ engen Wellenlängenbereich aufweist und gegenüber allen anderen Wellenlängen undurchlässig ist In dem Fall, in dem der zu bestimmende Stoff fluoresziert, soll der Schichtträger nach Möglichkeit nicht in unerwünscht starker Weise fluoreszieren.

en Die erwähnten Schichten können direkt auf den Schichtträger aufgetragen werden. Andererseits kann der Schichtträger jedoch auch eine Haftschicht aufweisen, die vorzugsweise Energie-Durchlässigkeits-Charakteristika aufweist die ähnlich sind den entsprechenden Charakteristika des Trägers, um die Indikatorschicht fest auf den Schichtträger zu verankern.

Wie bereits dargelegt, kann der Schichtträger jedoch auch weggelassen.werden, insbesondere in den Fällen, in

denen mindestens eine der Schichten selbsttragend ist. Bei der Herstellung des beschriebenem analytischen Materials können die einzelnen Schichten getrennt vorgebildet werden und unter Erzeugung des analytischen Materials zusammenlaminiert werden. In diesem Falle werden die t inzelnen Schichten in typischer Weise aus einer Lösung oder Dispersion auf eine Oberfläche aufgetragen, von der die erzeugten Schichten auf physikalischem Wege abgestreift werden können.

Um derartige Abstreif- und Laminierungsstufen zu vermeiden, hat es sich als vorteilhaft erwiesen, eine Schicht auf eine Oberfläche oder einen Schichtträger aufzutragen und auf diese Schicht successive die anderen Schichten aufzutragen. Ein solcher Beschichtungsprozeß kann von Hand erfolgen oder unter Verwendung üblicher bekannter Beschichtungsvorrichtungen und Beschichtungsmethoden, beispielsweise durch Tauchbeschichtung oder Bettbeschichtung. Bei der maschinellen Beschichtung ist es oftmals möglich, mehrere Schichten gleichzeitig aufzutragen, beispielsweise unter Verwendung der üblichen bekannten Beschiel.tungsverfahren. wie sie zur Herstellung lichtempfindlicher photographischer Aufzeichnungsr.aterialien angewandt werden. Die Haftung der einzelnen Schichten miteinander kann gegebenenfalls durch Oberflächenbehandlung verbessert werden, z. B. auch durch Aufbringen extrem dünner Haftschichten, wie sie auch im Falle photographischer Aufzeichnungsmateria-I· ;n verwendet werden.

Werden die einzelnen Schichten aus Lösungen oder Dispersionen erzeugt, so kann es vorteilhaft sein, den Beschichtungsmassen Beschichtungshilfsmittel zuzusetzen.

Dabei sind selbstverständlich solche Beschichtungshilfsmittel auszuwählen, welche das Enzym der Enzyrr.-schicht nicht inhibieren oder den Indikator in der Indikatorschicht beeinträchtigen. Als besonders vorteilhafte Beschichtungshilfsmittel haben sich nicht-ionogene oberflächenaktive Stoffe, z. B. Octylphenoxylpolyäthoxyläthanole. (p-Nonylphenoxy)glycerin sowie Polyäthylenglykole erwiesen.

Gegebenenfalls kann es vorteilhaft sein, wenn das analytische Material Schichten aufweist, die zunächst nicht aneinander anstoßen und die voneinander getrennt werden können, z. B. durch Verwendung von Zwischenschichten oder Zwischenblättern, oder durch Verwendung eines erschütterungsfreien oder federnden absorbierenden Materials oder eines deformierbaren Trägers. Weist das analytische Material zunächst nicht aneinanderstoßende Schichter auf. so kann es erforderlich sein, die ein/einen Schichten des Materials durch Einwirkung von Druck in Flüssigkeitskontakt miteinander zu bringen, wenn es zur Durchführung einer analytischen Bestimmung verwendet werden soll

Bei der Verwendung eines erfindungsgemäßen analytischen Materials für die Blutanalyse können die Blutkörperchen zunächst vom Serum abgetrennt we-den. beispielsweise durch Zentrifugieren, worauf das Serum /uv Durchführung der Analyse verwendet wird. Ein besonderer Vorteil des beschriebenen analytischen Materials beruht darauf, daß es sowohl zur Analyse von Serum als Blut geeignet ist.

In den Fällen, in denen Energie^Transmissionsmethoden angewandt werden, müssen die Ausbreitschichl und die anderen Schichten gleichförmig permeabel für die Meßstrahlung sein und wenn nicht Vorsorge für die Entfernung unerwünschter Rückstände oder Bestandteile des Blutes getroffen wird (z. B. Abstreifen oder Abwischen der Ausbreitschicht vor der eigentlichen Messung), so ist es zweckmäßig, zur Durchführung des Bestimmungsverfahrens Blutserum zu verwenden.
Ein typisches automatisiertes Analysegerät, in dem ein solches analytisches Material verwendet werden kann, weist eine Dosiereinrichtung auf, durch die ein Tropfen der zu analysierenden Flüssigkeit, beispielsweise ein Blut- oder Serumtropfen, auf die Oberfläche des analytischen Materials gebracht wird, worauf das

ίο Material durch eine oder mehrere »Entwickiungs«-Zonen geführt wird. Die analytische Bestimmung erfolgt in typischer Weise dadurch, daß das Material durch eine Zone geführt wird, in welcher eine quantitative Bestimmung mittels Reflexions-, Transmissions- oder Fluoreszenz-Spektrophotometrie erfolgen kann.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.

Beispiele 1 bis 3

Es wurde eine Reihe von 3 Testrnaterialien für die Bestimmung von Blut-Harnstof'-Stickstoff des in F i g. 1 dargestellten Aufbaues hergestellt mit verschiedenen Chromogenen in der Indikatorschicht. Die Herstellung der analytischen Materialien erfolgte in der folgenden Weise.

Auf einen Polyiäthylenterephthalatjfilmschichtträger wurde eine für Ammoniak permeable, relativ Wasserundurchlässige !ndikatorschicht aus einer Beschich-

jo tungsmasse aus einem der in der folgenden Tabelle I angegebenen, verschiedenen Chromogenen 1 bis 3 Celluloseacetatbutyrat in einer Schichtstärke von 8.55 g/m^: aus einer Mischung aus Dichloräthan und Aceton aufgetragen. Auf die erzeugte Schicht wurde

j; dann eine für Ammoniak permeable, relativ Wasser-undurchlässige Schicht aus Cellulosepropionatvalerat mit einem Valerylgruppengehalt von 30 Gew.-% in einer Schichtstärke von 0.84 g/m² aus t-Butylalkohol aufgetragen. Das auf diese Weise hergestellte Material wurde

in mit einer abgepufferten Gelatineschicht (pH = TS) mit 5.4 g Gelatine/m². 4300 U Urease/m². 0.05 g Dikaliumphosphaipuffer/m². 0.06 g Bisvinylsulfonylmethyläther als Härtungsmittel/m², 0.32 g Oleyläther von Polyäthylenglykol als oberflächenaktiver Substanz/m² und 0.40 g

des Teiranatriumsalzes der Äthylendiamintetraessigsäure/m² beschichtet.

Schließlich wurde eine reflektierende Ausbreitschicht aus 6.b g Celluloseacetat/m². 46.0 g Titandioxid/m² und 2.69 g Octylphenoxypolyäthoxyäthanol/m' aufgebracht.

Das Octylphenoxypoläthoxyäthanol wurde aus einer Mischung aus 1 Teil Xylol und 6.4 Teilen eines Gemisches aus Aceton und Dichloräthan im Verhältnis 1 : I zur Anwendung gebracht.

Die in der beschriebenen Weise hergestellten analytischen Materialien wurden dann in der folgenden Weise getestet:

Zunächst wurden wäßrige Lösungen von Harnstoff von analytischer Reinheit (<10^;N NHi-Verunreini gung in einer 1 M Lösung) mit 1 bis 150 mg Harnstoff-Stickstoff/dl hergestellt. Der normale Bereich von Harnstoff Stickstoff im Serum liegt bei i_o bis 20 mg/dl Von diesen Lösungen wurden 10 μΙ-Tüpfel auf die zu testenden analytischen Materialien aufgebracht. Zur Ermittlung der erzeugten Reflexionsdichten wurde ein Spektrophotometer verwendet. Gemessen wurde nach einer lOminütigert Inkubation bei 50°C. Die erhaltenen Meßergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt.

Tabelle I

Bei- Chromogen Konzentra- Meß-Wel- Reflexionsdichte

spiel tion des lenlänge Harnstoff-Konzentration in mg/dl

Nr. Chromogens 5 mg/dl 10 mg/d! 20 mg/dl 50 mg/dl 100 mg/dl 150 mg/d!

585 nm 0,62

0,45

l-Methyl-2-(2,4- 1,08 g/m²
dinitrophenyl)-methylchinoliniumperchlorat

6-(2,4-Dinitro- 1,08 g/m² 610 nm

phenyl)-6H-pyri-

do[2,l-a]isoin-

doliumper-

chlorat

Phenolsulfon- 0,8 g/m² 565 nm 0,13 phthalein,

Natriumsalz

0,81 1,22 2,06

0,20 0,44 0,71 0,90 i),96

Aus Tabelle I ergibt sich die Verwendbarkeit der beschriebenen Materialien. Zu bemerken ist. daß es aufgrund der hohen Extinktionskoeffizienten der Chromogene der Beispiele 1 und 2 (nahe 10⁴) vorteilhaft ist, daß die Messungen unter Anwendung kinetischer Analysen durchgeführt werden (d. h. dem Verhältnis der Konzentration zur Anfangsneigung der Geschwindigkeitskurve), Anwendung einer kürzeren Reaktionsdauer oder Ablesen der Absorption des Farbstoffes an einem jo Punkt unterhalb des Punktes des maximalen Absorption bei Bestimmungen von Konzentrationen von DHST über 50 mg/dl.

Beispiel 4

Ein analytisches Material wurde wie folgt hergestellt:

Auf e:nen Polyäthylenterephthalatfilmschichtträger wurde eine Indikatorschicht aus 3.78 g des Chromogens l-Äthyl-4(2.6dinitrophenyl)methylchinoliniumäthylsulfonat/m^? und 6.43 g Celluloseacetat/m² aus einer Mi- .ίο schung aus Methanol und Aceton im Volumenverhältnis 1 :2 aufgetragen. Auf die Indikatorschicht wurde dann eine für Ammoniak permeable Trennschicht aus Celluloseacetaibutyrat mit einem Butyrylgruppengehalt von 27% und einem Acetylgruppengehalt von 21% in einer Schichmärke von 0.8 g/m^J aus Dichloräthan aufgetragen. Auf diese Trennschicht wurde eine Haftschicht aus einem Copolymeren aus Methylmetharcrylat; Methacryloyloxytrimethylammoniummethylsulfat: 2 Hydroxypropyiacrylat und 2-Acetoacetoxyäthyl- >n methacrylat im Verhältnis von *0 : 20 . 20 : 20 in einer Schii-htstärkf von 0.14 g/m' aus Aceton aufgetragen.

Schließlich wurde noch eine Cielattncschicht aufge bracht, die auf einen pH Wert von 8.0 abgepuffert worden war. Diese Schicht bestand aus 21.6 g η dciontsierter Gela'ine/m^;. O.b5 g des Oleyläthers eines Polyäthvlenglykols/m'. 0.4 g des TLiraiialruimsal/e«; der Athvlendiamintefacisipsiiure'iif. ^r>·⁴ P N.N Bis(2 hy dn>vyälhvl)-gl\un m-, 0.28 g Diiiatnumurthopho· sphat'nv 0.9 mg Dithothreitol'm·'. 27 000 I! lireast/rn² μί und 0,13 g Bisvifiylsulfonylmethylalher/m², Auf diese Schicht wurde eine Haftschicht aus 0,32 g Poly(N'isopropylacrylamid)/m² aus Aceton aufgebracht. Auf diese Schicht wurde dann schließlich eine reflektierende Äusbreitsehicht, wie in Beispiel 1 beschrieben, aufgetragen.

Das hergestellte analytische Material wurde dann in der folgenden Weise getestet.

Zunächst wurden wäßrige Lösungen mit 7% Albumin und Harnstoff von analytischem Reinheitsgrad in Konzentrationen von 0 bis 150 mg Harnstoff-Stickstoff/dl hergestellt

Von diesen Lösungen wurden Mengen von 10 u.1 auf das analytische Material aufgebracht. Als Meßgerät dient ein Spektrophotometer mit einem Interferenz-Filter, das eine Bande von 30 nm bedeckte, zentriert bei 463 nm, einem Wratten 2B-Filter und einem Filter einer neutralen Dichte von 0,4. Die Messungen der Reflexionsdichten erfolgte nach einer 5 Minuten langen Inkubation bei 40⁰C. Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten

mg Harnstoff-Stickstofr/dl in	Refkxionsdichte
7% Albuminlösung	(5 Minuten bei 40 (Ί
0	0,04
10	0.26
25	0,57
50	0,97
100	1.69
150	2,33

Beispiel 5

F.in analytisches Material mit einer für Ammoniak permeablen, für Wasser relativ impermeablen Schicht mit einem Diazo-Kupplungssystem als Indikator wurde in folgender Weise hergestellt:

\uf einem 0.18 mm starken Polyäthylenterephthalat filmschichtträger mit einer Gelatinehafuchicht wurde eine Schicht aus folgenden Bestandteilen aufgetragen:

1. 3.19 g Celluloseacetatbutyrat mit einem Butvrvl gfiippengehalt von 27 Gew.-% und einem Acetylgruppengehalt von 21 Gew.-%/m²,

2. 0,63 g 2'NitrO'4'pipefidinöberlzoldiazöniufflhexa· fluorphosphat/m²,

3. 0,84 g 3-(2-Methoxyphenylcarbamoyl)*2'naphtho!/m^}und

4. 0,097 g des Oleyläthers' des Polyäthylenglykols 1540/m².

Das hergestellte Material hatte ein hell cremefarbiges Aussehen. Es wurde dadurch getestet, daß Spots von verschiedenen Ammoniumhydroxidlösungen mit Ammoniakkonzentrationen entsprechend 10 und 40 mg °/o Harnstoff aufgebracht wurden, wodurch eine hellgrüne und eine dunkelgrüne Verfärbung erzeugt wurde, woraus sich die Verwendbarkeit des Diazoniumsalzes als Farbstoffvorläuferverbindung ergibt

Beispiel 6

Ein analytisches Material mit einer für Ammoniak permeablen, für Wasser relativ impermeablen Schicht mit einem durch Ammoniak bleichbaren Feststoff als Indikator wurde in der folgenden Weise hergestellt:

Ein 0,18 mm starker Polyäthylenterephthalatschichtträger mit einer Haftschicht, wie in Beispiel 4 beschrieben, wurde mit einer Schicht aus folgenden Bestandteilen beschichtet:

1. 3,22 g Celluloseacetatbutyrat mit einem Butyrylgruppengetralt von 27 Gew.-% und einem Acetylgruppengehali von 21 Gew.-%/m-und

2. 0,322 g 2[j3-(2-Hydroxy-l-naphthyl)-«-methylvinyl]-l-benzopyryliumperchlorat/m².

Das hergestellte dunkelblaue Material wurde dann dadurch getestet, daß Spots von Ammoniumhydroxidlösungen von Konzentrationen entsprechend 10 und 20 mg % Harnstoff aufgebracht wurden. Die dunkelblaue Farbe des Materials wurde in den Bezirken, in denen die Ammoniumhydroxidlösungen aufgebracht wurden, gebleicht und zwar teilweise in den Bereichen, in denen die Ammonhimhydroxidlösung geringer Konzentration aufgebracht wurde und vollständig in den Bereichen, in denen die konzertiertere Ammoniumhydroxidlösung aufgebracht wurde.

Da die angewandten Ammoniakkonzentrationen den normalen Blut-Harnstoff-Stickstoffbereich abdecken, Eeigt Beispiel 6, daß sich das beschriebene analytische Material zur Analyse des Blut-Harnstoff-Stickstoffgehaltes eignet

Beispiel 7bis 16

Es wurde ein weiteres analytisches Material, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt mit der Ausnahme jedoch, daß die Indikatorschicht hergestellt wurde durch Auftragen von 2,26 g4(2,6-Dinitro-4-chIorbenzyl)l-propylchinoliniumäthansulfonat/m³ in Celluloseacetat mit einem Acetylierungsgrad von 40%, so daß die Indikatorschicht selbst eine Sperre enthielt, zusätzlich zu einer besonderen Sperrschicht aus Celluloseacetatbutyrat mit einem Butyrylgruppengehalt von 27% und einem Acetylgruppengehalt von 21% zwischen der Indikatorschicht und der Enzymschicht. Die Enzymschicht war auf einen pH-Wert von etwa 8,0 abgepuffert

Das auf diese Weise hergestellte analytische Material wurde wie folgt getestet:

Zunächst wurden wäßrige Lösungen mit Albumin und Harnstoff von analytischer Feinheit in vier Konzentrationen von etwa 15 bis etwa 115 mg Harnstoff-Stick-Si-off/dl hergestellt Die hergestellten Lösungen wurden dann auf das analytische Material in Mengen von 10 μΐ aufgebracht

Ermittelt wurden die Reflexionsdichten bei 670 nm nach 5 Minuten. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II zusammengestellt

Tabelle II	von BHST	(mg/dl)	74,3	114,5
Konzentration	15,2	30,0	1,3280
Beispiel Nr.	0,4251	0,6567	1,3433	1,8942
7	0,4156	0,6475	1,3090	1,8859
8	0,4117	0,6403	1,3152	1,9255
9	0,4151	0,6627	1.3566	1,9097
10	0,4234	0,6536	1,3171	1,8790
11	0,4113	0,6546	1,3106	1,8739
12	0,4099	0,6559	1,3230	1,9024
13	0,4121	0,6428	-	1,8650
14	0,4157	0,6586	1,3335	1,8800
15	0,4094	0,6549	i,3268	1,8906
16	0,4149	0,6528	0,0163	0,0192
Mittelwert	0,0054	0,0071	1,23	1,01
SD	1,30	1,08
% COV

*) = Standardabweichung.

**) = % Koeffizient der Abweichung, d. h. die Standardabweichung geteilt durch den Mittelwert und multipliziert mit 100.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Analytisches Material für die analytische Bestimmung eines Stoffes A in einer Flüssigkeitsprobe, das enthält:

1, ein erstes Reagenz B, das in Gegenwart des Stoffes Λ unter Bildung eines Zerfallsproduktes C zu reagieren vermag und

2. ein zweites Reagenz D, das mit dem Zerfallsprodukt C oder einem Reaktionsprodukt hiervon unter Herbeiführung einer meßbaren Änderung zu reagieren vermag,