DE3240463A1

DE3240463A1 - Integriertes mehrschichtiges analytisches element zur analyse von ammoniak oder ammoniak bildenden substraten und verfahren zum nachweis von ammoniak oder ammoniak bildenden substraten

Info

Publication number: DE3240463A1
Application number: DE19823240463
Authority: DE
Inventors: Harumi Katsuyama; Asaji Asaka Saitama Kondo; Nobuyoshi Sekikawa
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1981-11-02
Filing date: 1982-11-02
Publication date: 1983-06-01
Also published as: US4548906A; GB2114737A; JPS5877661A; GB2114737B

Description

X Die Erfindung betrifft ein integriertes mehrschichtiges analytisches Element zur Analyse von Ammoniak .oder Ammoniak bildenden Substraten in flüssigen Proben und ein Verfahren zum Nachweis von Ammoniak oder Ammoniak bildenden Substraten. Insbesondere betrifft die Erfindung ein analytisches Element und ein Verfahren zur Analyse von Harnstoff-Stickstoff in Körperflüssigkeiten, wie Blut und Urin.

Die Bestimmung der Konzentration von Harnstoff-Stickstoff, Ammoniak, Creatinin und dergleichen in Körperflüssigkeiten ist für die Diagnose und/oder die Verlaufsbeobachtung von bestimmten Krankheiten, wie Nierenerkrankungen, sehr wichtig. Bisher wurde die Analyse von Harnstoff-Stickstoff mit sogenannten nassen chemischen Verfahren oder Lösungsverfahren durchgeführt. Bei derartigen Lösungsverfahren wird Harnstoff direkt mit Diacetylraonoxim umgesetzt und die Absorption der erhaltenen Verbindung photometrisch gemessen. Ferner gibt es auch andere Verfahren, bei denen Harnstoff mit einer Urease unter Zersetzung zu Ammoniumcarbonat und anschliessend zu Ammoniak umgesetzt wird. Das Ammoniak wird sodann mit Nessler-Reagens unter Bildung eines gefärbten Produkts umgesetzt. Harnstoff kann auch mit Phenol/Hypochlorit unter Bildung eines gefärbten Indophenols umgesetzt werden, wobei diese gefärbten Produkte kolorimetrisch zur Bestimmung der Harnstoffmenge gemessen werden. Obgleich es sich hierbei um wertvolle Methoden handelt, haben sie den Nachteil, dass sie eine aufwendige Einrichtung, eine präzise Arbeitstechnik und eine lange Analysendauer benötigen. Angesichts dieser Nachteile von Lösungsverfahren wurden in jüngster Zeit verschiedene sogenannte trockene chemische Verfahren vorgeschlagen, die eine einfache und rasche Analyse von Harnstoff-Stickstoff ohne die Gefahr von Fehlern durch das Bedienungspersonal ermöglichen sollen; vgl. beispielsweise gg K. Okuda. "Rinsho-Kensa" (Zeitschrift für medizinische Technologie), Bd. 22, Nr. 11 (1978), S. 1203 bis 1218;

JA-OS 93^94/1975. In diesen Druckschriften wird eine Zusammensetzung zur quantitativen Analyse von Harnstoff beschrieben, wobei diese Zusammensetzung ein Enzymsystem mit Urease-Aktivität, einen pH-Indikator und einen eine Sperre bildenden Körper enthält. Bei einem typischen Trockenverfahren wird ein integriertes analytisches Element verwendet, das folgende Bestandteile enthält: Eine Reagensschicht mit einem Gehalt an Urease und einem alkalischen Puffer, eine Indikatorschicht zum Nachweis von gasförmigem Ammoniak und eine selektive Permeationsschicht, die zwischen die Reagens- und Indikatorschicht gelegt ist und nur den Durchtritt von gasförmigem Ammoniak gestattet. Beispielsweise ist in der JA-OS 3488/1977 (entsprechend US-PS Re 30 267) ein integriertes analytisches Element beschrieben, das im wesentlichen die vorstehend erläuterte Mehrschichtenstruktur aufweist. Dieses analytische Element verwendet eine selektive Permeationsschicht, die eine Polymermembran für gasförmiges Ammoniak enthält. Diese selektive Permeationsschicht weist gewisse Nachteile dahingehend auf, dass das Element aufgrund der geringen Geschwindigkeit, mit der Ammoniak durch die selektive Permeationsschicht gelassen wird, eine geringe Empfindlichkeit aufweist und dass bei abnehmenden Schichtdicken die Geschwindigkeit, mit der gasförmiges Ammoniak die Schicht passiert,zwar hoch wird und das Element infolgedessen hochempfindlich ist, es jedoch unmöglich wird, eine präzise Analyse durchzuführen, da derartige dünne Schichten einen Durchtritt von Flüssigkeit gestatten. Ausserdem ist die Dauer für die Diffusion des Ammoniaks und den Durchtritt durch die Membran je nach der Membrandicke sehr starken Veränderungen unterworfen. Daher ist es erforderlich, für eine gleichmässige Membrandicke zu sorgen, wozu äusserst aufwendige Techniken erforderlich sind. Schliesslich ist es schwierig, die Haftung einer wässrigen Matrix der Reagensschicht und der selektiven Permeationsschicht, die eine hydrophobe Polymermembran umfasst, zu bewerk-

-6-χ stelligen, so dass die Herstellung von derartigen integrierten analytischen Elementen auch dadurch erschwert wird.

Andererseits ist in der JA-OS 151096/1979 ein analytisches Element beschrieben, in dem die vorerwähnten Nachteile des Stands der Technik^ insbesondere der Nachteil einer geringen Empfindlichkeit aufgrund von langen, diffusionsbedingten Durchlasszeiten, gemildert werden. Bei diesem analytischen Element wird ein Abstandsstück aus gewebtem oder gewirktem Netz oder perforierter Folie als eine selektive Permeationsschicht für gasförmiges Ammoniak verwendet, so dass der Nachteil der geringen Empfindlichkeit etwas gemildert wird. Jedoch ist dieses Element vom nicht-integrierten Typ, so dass es insbesondere in niedrigen Konzentrationsbereichen wenig empfindlich und für die Analyse von Proben, bei denen eine Analysendurchführung mit Spurenmengen erwünscht ist, beispielsweise Blutproben, ungeeignet ist. Bei Verwendung dieses Elements wird das Abstandsstück entfernt. Nach Umsetzung mit der Reagensschicht wird die Farbänderung der Indikatorschicht bestimmt. Eine derartige Arbeitsweise ist aufwendig. Gemäss den Beispielen und Zeichnungen dieser Druckschrift enthält eine analytische Vorrichtung zur Analyse von Ammoniak absorbierende Materialien, wie Papier und poröse Kunstharze, als Träger für die Indikatorschicht. Bei diesem Verfahren, bei dem die Farbänderung auf dem lichtundurchlässigen Träger photometrisch gemessen wird, ist es nicht möglich, eine genaue Messung zu erzielen, was auf eine ungleich-

₃q massige Reflektion und Maskierungseffekte auf dem lichtundurchlässigen Träger zurückzuführen ist. Infolgedessen kann eine derartige analytische Vorrichtung, nur für halbquantitative Analysen oder für quantitative Analysen von relativ geringer Genauigkeit verwendet werden.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein integriertes mehrschichtiges analytisches "Element zur Analyse von Ammoniak oder Ammoniak bildenden Substraten zur Verfügung zu stellen, das die vorbeschriebenen Nachteile des Stands der Technik . 5 vermeidet und das mit hoher Empfindlichkeit und Genauigkeit eine einfache, zweckmässige und rasche Analysendurchführung ermöglicht.

Erfindungsgemäss wird bei einem analytischen Element der vorstehend angegebenen Art zwischen einer Indikatorschicht und einer Reagensschicht eine Luftsperrschicht oder Flüssigkeitssperrschicht, die gasförmiges Ammoniak durchlässt, aber den Durchtritt von Flüssigkeiten verhindert, bereitgestellt.

Gegenstand der Erfindung ist ein integriertes mehrschichtiges analytisches Element zur Analyse von Ammoniak oder Ammoniak bildenden Substraten in flüssigen Proben, das einen durchsichtigen Träger aufweist, auf dem integriert übereinander in der angegebenen Reihenfolge (I) eine Indikatorschicht für gasförmiges Ammoniak, (II) eine Flüssigkeitssperrschicht, (III) eine Reagensschicht, der ein Reagens, das mit dem Substrat unter Bildung von Ammoniak reagieren kann, einverleibt ist, und (IV) eine Verteilungsschicht angeordnet sind, wobei die Flüssigkeitssperrschicht aus einem porösen Material mit Hohlräumen, die unter den Anwendungsbedingungen für gasförmiges Ammoniak durchlässig, aber im wesentlichen .flüssigkeitsundurchlässig sind, hergestellt ist.

Das mehrschichtige analytische Element der Erfindung eignet sich zur Analyse von Ammoniak selbst oder zur indirekten Analyse von Ammoniak bildenden Substraten, die mit einem Reagens unter Bildung von Ammoniak, der mit dem Element bestimmt werden soll, reagiert. Beispiele für derartige Korabinationen aus Ammoniak bildenden Substraten

-.·'·· 3240463 -δι und Reagentien sind Harnstoff/Urease, Creatinin/Creatinindesiminase, Aminosäure/Aminosäure-dehydrogenase, Aminosäure/ Aminosäure-oxidase, Aminosäure/Aminosäure-dehydratase, Aminosäure/Ammoniak-lyase, 'Amin/Amin-oxidase, Diamin/Amin-oxidase, Glucose und Phosphoamidat/Phosphoamidat-hexose-phospho-transferase, ADP/Carbamat-kinase und Carbamoylphosphat, Säureamid/Amid-hydratase, Nucleobase/Desaminase, Nucleotid/Desaminase, Guanin/Guaninase und dergleichen. Wie vorstehend erwähnt, betrifft der Ausdruck "Ammoniak bildendes Substrat" eine Verbindung oder eine Gruppe von Verbindungen, die direkt durch Umsetzung mit einem spezifischen Reagens oder indirekt durch ein Mehrfachreaktionssystem Ammoniak bilden.

15. Im analytischen Element der Erfindung können hydrophobe durchsichtige Träger, die im allgemeinen bei derartigen analytischen Elementen Verwendung finden, und die aus hydrophoben Materialien, wie Polyäthylenterephthalat, Polycarbonat und Polyvinylverbindungen bestehen, verwendet werden.

Auf dem Träger ist eine Indikatorschicht vorgesehen. Der Indikatorschicht sind eine oder mehrere Verbindungen einverleibt, die aufgrund einer Umsetzung mit gasförmigem Ammoniak eine Veränderung in der Absorptionswellenlänge erfahren. Diese Verbindungen werden nachstehend als Färb-Stoffvorläufer beezeichnet. Als Farbstoffvorläufer können im analytischen Element der Erfindung Leukofarbstoffe, wie Leukocyanin-, nitrosubstituierte Leuko- und Leukophthaleinfarbstoffe (vgl. JA-OS 3^88/1977 entsprechend US-PS Re 30 267), pH-Indikatoren, wie Bromphenolblau, Bromcresolgrün, Bromthymolblau, Chinolinblau und Rosolsäure (vgl. Kagaku Dai-Jiten (chemisches Lexikon) Kyoritsu, Bd. 10, S. 63 bis 65), Triarylmethan-Farbstoffvorlaufer, Leukobenziliden-Pigmente (vgl. japanische Patentanmeldung (OPI) 145273/1982), Diazoniumsalze und Azofarbstoffkuppler und basische bleichbare Farbstoffe, verwendet werden.

Einer oder mehrere der vorstehenden Färb stoffvorlaufer werden mit einem in einem organischen Lösungsmittel.oder in Wasser, löslichen Bindemittel vermischt und sodann auf den durchsichtigen Träger unter .Bildung einer Indikatorsehicht aufgebracht. Beispiele für Bindemittel für diesen Zweck sind Celluloseester, wie Celluloseacetate (mono-, di- und tri), Celluloseacetobutyrat und Celluloseacetopropionat, Alkylcellulose, wie Methylcellulose, Äthylcellulose und Propylcellulose, synthetische Vinylpolymerisate, wie Polyraethylmethacrylate Polyacrylat, Polystyrol, Polyacrylnitril, Polyvinylacetat, Polyvinylbutyral, chloriertes Polyvinylacetat, Polyacrylamid, Polyvinylpyrrolidon und Polyvinylalkohol, Polymaleinsäureanhydrid, Polyolefine und Copolymerisate davon.

Die einzelnen Bindemittel können je nach ihrer Löslichkeit oder Beschaffenheit in Form von homogenen Lösungen in organischen oder wässrigen Lösungsmitteln oder als Latexdispersionen in wässrigen oder organischen Lösungsmitteln verwendet werden.

Die Menge des Farbstoffvorläufers kann 10 bis 70 Prozent, bezogen auf das· Gewicht des Bindemittels, betragen. Um eine Verfärbung des Farbstoffvorläufers während der Herstellung des Elements zu vermeiden, können organische oder anorganische Säuren, wie Äthansulfonsäure, 3,3-Dimethylglutarsäure, Citronensäure, p-Toluolsulfonsäure, Perchlorsäure oder Salzsäure, verwendet werden, um einen pH-Bereich einzustellen, in dem keine Farbentwicklung durch den Vorläufer erfolgt. Diese Flüssigkeiten, die den Farbstoffvorläufer enthalten, werden zu Wasser oder organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Methylcellosolve, Methyläthylketon, Dichlormethan, Dichloräthan, Methanol oder Äthanol ,gegeben, um eine Beschichtungsflüssigkeit mit einem Gehalt an Feststoffen von 1 bis 20 und vorzugsweise von 3 bis 10 Gewichtsprozent zu erhalten. Mit der Beschichtungsflüssigkeit

' ' · 3240463 -ιοί wird sodann auf dem durchsichtigen Träger ein Überzug mit einer Dicke in trockenem Zustand von 1 bis 20 ^m aufgebrächt und getrocknet. Auf diese Weise erhält man eine Indikatorschicht.
5

Auf der so gebildeten Indikatorschicht wird eine Flüssigkeitssperrschicht angeordnet. Die Flüssigkeitssperrschicht des erfindungsgemässen Elements enthält eine poröse Substanz mit Hohlräumen, die unter den Anwendungsbedingungen für gasförmiges Ammoniak durchlässig aber für Flüssigkeiten im wesentlichen undurchlässig sind. Vorzugsweise wird die · poröse Substanz aus hydrophoben oder hydrophob (wasserabstossend ) behandelten Materialien, in denen keine wesentliche Kapillarwirkung für Flüssigkeiten, insbesondere für Wasser, eintritt, hergestellt. Beispielsweise können Membranfilter aus Celluloseacetat, Cellulosenitrat, regenerierter Cellulose, Polyamid, Polycarbonat von Bisphenol A oder Polyäthylen, sowie derartigen Materialien, die gegebenenfalls einer wasserabstossend ausrüstenden Behandlung unterzogen worden sind, verwendet werden. Die Dicke der Membranfilter beträgt im allgemeinen 30 bis 300 pm und vorzugsweise 70 bis 200 pm. Die Porosität liegt im allgemeinen über 25 Prozent und vorzugsweise über 76 Prozent. Der durchschnittliche Porendurchmesser beträgt im allgemeinen 0,01 bis 20 um und vorzugsweise 0,1 bis 10 _yum. Derartige Membranfilter können beispielsweise gemäss dem Verfahren der japanischen Patentveröffentlichung 21 677/1978 oder gemäss US-PS 3 992 158 hergestellt werden. Solche Membranfilter sind auch im Handel erhältlich. Beispiele dafür sind FM- oder FR-Mikrofilter, wie FM 22, FM 30, FM 45, FM 55, FM 80, FM 120, FM 300 und FM 500 (Fuji Photofilm Co., Ltd.), SM 11301, SM 11103, SM 11907 und SM 13604 (Sartorius), FA, FH, LC oder LS, wie FALP 14200 und LSWP 14200 (Millipore), Membranfilter TM, TM-P, TM-A, Ultrafilter UH, UK und UP (Toyokagaku Sangyo), mikroporöse Membranen Cellpore NW-O1 und W-O1 (Sekisui Chemical

- 11 Industry Co.) und poröse Metallmembranen.

Diese Membranfilter können direkt als solche eingesetzt werden. Sollen jedoch hydrophile Membranfilter zur Anwendung gelangen, ist es wünschenswert, die Filter, wie vorstehend erläutert, mit einem wasserabstossenden Mittel zu behandeln, so dass die Kapillarwirkung für Flüssigkeiten, insbesondere Wasser, gehemmt und dadurch die Undurchlässigkeit für Flüssigkeiten verbessert wird ο Die Behandlung mit wasserabstossender Wirkung kann leicht durchgeführt werden, indem man herkömmliche wasserabstossende Mittel, wie Siliconöle, Siliconharze, fluorhaltige öle, fluorhaltige Kunststoffe und dergleichen, die im allgemeinen mit Wasser verdünnt sind, durch Tauchen, Streichen, Spritzen oder dergleichen, auf die Membranfilter aufbringt.

Die Membranfilter können mit für die Praxis zweckmässiger Haftfestigkeit auf verschiedene Materialien, beispielsweise auf wasserlösliche oder in organischen Lösungsmitteln lösliche Bindemittel, die in der Matrix der Indikatorschicht enthalten sind, haftend befestigt werden. Diese Befestigung oder Verklebung wird durchgeführt, indem man die Membranfilter auf die Indikatcrschicht, die gegebenenfalls befeuchtet ist, aufbringt und trocknet. Unter dem Ausdruck "befeuchtet" ist zu verstehen, dass noch Lösungsmittel, in dem das Bindemittel gelöst ist, vorhanden ist oder dass die getrocknete Membran wieder mit dem Lösungsmittel (organisches Lösungsmittel oder Wasser) befeuchtet wird und somit das Bindemittel in einen gequollenen, dispergierten oder gelösten Zustand übergeführt wird. Sofern ein klebendes Bindemittel, wie Polyvinylacetat, in der Indikatorschicht verwendet wird, kann der Membranfilter auf der Schicht befestigt werden, indem man ihn einfach auf die Schicht bringt und aufpresst, ohne dass eine Befeuchtung der Schicht erforderlich ist.

Auf der Flüssigkeitssperrschicht ist eine Reagensschicht vorgesehen. Die Reagensschicht enthält eines oder mehrere Reagentien, wie Urease, Creatin-desiminase und dergleichen, die mit Ammoniak bildenden Substraten, wie Harnstoff oder Creatinin, unter Bildung von Ammoniak reagieren. Vorzugsweise enthält die Reagensschicht einen alkalischen Puffer, der das gebildete Ammoniak in gasförmiges Ammoniak überführt. Derartige alkalische Puffer haben zweckmässigerweise einen pH-Wert von 7 bis 9,5· Beispiele hierfür sind Äthylendiamintetraacetat (EDTA), Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan und Phosphatpuffer. Die Reagensschicht enthält vorzugsweise Hilfsstoffe, wie Netzmittel, Vernetzungsmittel für das. Bindemittel (Härter), Stabilisatoren und Mittel zum Abfangen von Schwermetallionen. Die genannten Abfangmittel werden zur Maskierung von Schwermetallionen, die eine Aktivitätshemmung von Enzymen bewirken können, verwendet. Beispiele hierfür sind komplexbildende Mittel, wie EDTA . 2Na, EDTA . 4Na, Nitrilotriessigsäure (NTA) und Diäthylentriaminpentaessigsäure. Diese Reagentien werden mit wasserlöslichen Bindemitteln, wie Gelatine, vermischt, wodurch man eine Überzugsflüssigkeit erhält, mit der die Flüssigkeitssperrschicht unter Bildung einer Reagensschicht direkt beschichtet wird. Obgleich die Flüssigkeitssperrschicht eine Anzahl von Hohlräumen enthält, tritt während dieses Verfahrens fast nie Wasser, das in der Überzugslösung enthalten ist, durch die Flüssigkeitssperrschicht, so dass keine Beeinträchtigung der darunterliegenden Indikatorschicht eintritt. Ferner haften die beiden Schichten so fest aneinander, dass während der weiteren Herstellung und Weiterverarbeitung des integrierten analytischen Elements praktisch keine Trennung dieser Schichten auftritt. Die Menge der Reagentien, wie Urease·, die in der Reagensschicht zum Einsatz kommt, beträgt 0,1 bis 50 Prozent und vorzugsweise 2 bis 20 Prozent, bezogen auf das Gewicht des Bindemittels. Die Menge an alkalischem Puffer beträgt 0,1 bis 10 Prozent, bezogen auf das Gewicht

des Bindemittels. Die Menge an Mittel zum Abfangen von Schwermetallionen beträgt 0,5 bis 20 Prozent, bezogen auf das Gewicht des Bindemittels. Die Dicke der Reagensschicht beträgt im allgemeinen 1 bis 20 μ^α und vorzugsweise 3 bis 10 pm.

Auf der auf diese Weise gebildeten Reagensschicht ist eine Verteilungsschicht vorgesehen. Gegebenenfalls kann auch eine Lichtreflektionsschicht vorgesehen sein. Die Lichtreflektionsschicht kann hergestellt werden, indem man beispielsweise eine Beschichtung mit einer wässrigen Flüssigkeit, die Titandioxid, Gelatine, grenzflächenaktive Mittel und dergleichen enthält, in einer Dicke in trockenem Zustand von 0,5 bis 20 pm auf die Reagensschicht aufbringt und dann trocknet. Die Verteilungsschicht dient dazu, die als Tropfen aufgesetzte Flüssigkeitsprobe rasch radial zu verteilen. Danach tritt die Probe durch diese Schicht hindurch und verteilt sich gleichmässig in der Reagensschicht. Beispielsweise kann als Verteilungsschicht ein hydrophilisiertes Gewebe gemäss US-PS 4 292 272 (Spalten 5 bis 6) oder ein nicht-fasriges poröses Medium gemäss japanischer Patentveröffentlichung 21677/1978 oder US-PS

3 992 158 verwendet werden. Bei Verwendung des hydrophilisierten Gewebes gemäss US-PS 4 292 272 wird vorzugsweise vorher eine Haftschicht mit einem Gehalt an einem Bindemittel, wie Gelatin.e, und an einem grenzflächenaktiven Mittel, auf der Reagensschicht oder der Lichtreflektionsschicht angeordnet.

3Q Statt, wie vorstehend erläutert, die Reagens-, Lichtreflektions-, Haft- und Verteilungsschichten direkt auf die Flüssigkeitssperrschicht aufzubringen, kann aus den

4 Schichten ein mehrschichtiger Schichtstoff hergestellt werden. Anschliessend wird die Reagensschicht dieses Schichtstoffs unter Verwendung eines Haftmittels auf die Flüssigkeitssperrschicht aufgebracht, wodurch man ebenfalls

BAD ORIGINAL

ein erfindungsgemässes analytisches Element erhält.

Das Haftmittel kann aufgebracht werden, indem man eine wässrige Flüssigkeit mit einem Gehalt an einem grenzflächenaktiven Mittel und einem Latex eines Copolymerisate eines Acrylsäureester, Methacrylsäureesters oder Acrylamidderivats in einer Dicke in trockenem Zustand von 0,1 bis 5 um und vorzugsweise von 0,5 bis 2 um in Form eines Überzugs aufbringt und sodann trocknet.

Zur Analyse von Ammoniak oder Ammoniak bildenden Substraten unter Verwendung des integrierten mehrschichtigen analytischen Elements der Erfindung wird eine Flüssigkeitsprobe von 5 bis 30 ul auf die Verteilungsschicht aufge-

^g setzt. Sodann wird gegebenenfalls 1 bis 20 Minuten und vorzugsweise 3 bis 10 Minuten bei 30 bis 40 C und vorzugsweise bei.35 bis 39 C inkubiert. Hierauf wird die Farbänderung (Entwicklung oder Verschwinden einer Farbe) der Indikatorschicht durch Lichtreflektion oder durch visuellen Ver-

2Q gleich mit einem Standard durch den durchsichtigen Träger bestimmt. Das integrierte mehrschichtige analytische Element der Erfindung besitzt eine hohe Diffusionsgeschwindigkeit für gasförmiges Ammoniak; dies ist auf die Flüssigkeitssperrschicht, die eine Luftschicht darstellt, zurückzuführen. Daher ermöglicht das Element eine beträchtliche Verkürzung der Analysenzeit bei hoher Analysengenauigkeit. Da es sich ferner um ein Element vom integrierten Typ handelt, ist es leicht handzuhaben. Als Flüssigkeitssperrschicht können, wie bereits erwähnt, handelsübliche Mem-OQ branfilter, die gegebenenfalls einer wasserabstossend ausrüstenden Behandlung unterzogen worden sind, verwendet werden,so dass die grosstechnische Herstellung des Elements- durch relativ einfache Beschichtungs- und Laminierungsschritte möglich ist.

- 15 Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Nachstehend ist die"Herstellung eines integrierten mehrschichtigen analytischen Elements für die quantitative ■ Analyse von Blutharnstoff-Stickstoff beschrieben.

1) Indikatorschicht

Auf einem durchsichtigen Film aus Polyäthylenterephthalat wird pro 1 m ein Überzug mit einer Lösung folgender Zusammensetzung aufgebracht:

Farbstoff vorlauf er: 4-/"Bis- (2,4-dinitrophenyl) -

methyJLT-N-hexadecylpyridiniumperchlorat 1,00 g

Celluloseacetat 8g

Aceton 65 ml

Methylcellosolve 35 ml

Äthansulfonsäure 25 jxl

2) Flüssigkeitssperrschicht

Ein Membranfilter (Fuji Mikrofilter, FM 500, Dicke 14O ^m Porosität 75 Prozent, durchschnittlicher Porendurchmesser um) wird in eine Lösung von Siliconharz in Hexan getaucht

„,_ und getrocknet. Der so behandelte Filter wird auf die in 2b

Stufe 1) hergestellte Indikatorschicht gelegt. Dabei ist in der Indikatorschicht noch Lösungsmittel vorhanden (d.h.sie befindet sich in "befeuchtetem" Zustand). Nach Trocknung erhält man eine Flüssigkeitssperrschicht.

.

3) Reagensschicht

Der Membranfilter wird mit einer Lösung der nachstehend angegebenen Zusammensetzung, die mit Dinatriumorthophosphat und Natriumhydroxid auf den pH-Wert 8 eingestellt ist, beschichtet und getrocknet.

BAD ORIGJSSIAL

" ' * *	Gelatine	10	g	3240463	g
- 16 -	Wasser	100	ml		g
p-Nonylphenoxypolyglycidol	0	,3
Urease	0	,8		g
Äthylendiamintetraessigsäure-
tetranatriumsalz (EDTA.4Na)	0
4) Lichtreflektionsschicht

Die Reagensschicht wird mit einer Lösung der nachstehend angegebenen Zusammensetzung beschichtet und getrocknet.

TiOp, feines Pulver 4g

Gelatine 4 g

p-Nonylphenoxypolyglycidol 0,15 g

Wasser 40 ml

5) Haftschicht

Die Lichtreflektionsschicht wird mit einer Lösung der nachstehend angegebenen Zusammensetzung beschichtet und getrock^net·

Gelatine 2,5 g

Wasser 50 ml p-Nonylphenoxypolyglycidol 0,15 g

Durch die Haftschicht wird eine Verbindung der Verteilungsschicht mit der Lichtreflektionsschicht ermöglicht.

6) Verteilungsschicht

Nach Trocknen der Oberfläche wird die Haftschicht mit

Wasser gequollen. Sodann wird 1 Stück Baumwollgewebe (cotton broad Nr. 100) als Verteilungsschicht aufgebracht. Man erhält ein analytisches Element.

Die auf diese Weise hergestellten analytischen Elemente 35

werden gemäss folgendem Verfahren bewertet. Wässrige Lösungen mit einem Gehalt an 0 bis 100 mg Harnstoff-Stickstoff

- 17 -

(UN) pro 1 dl einer 7-prozentigen Albuminlösung werden hergestellt. Die Lösungen werden jeweils in Mengen von 10 ul auf die Verteilungsschicht der analytischen Elemente aufgesetzt. Nach 6-minütiger Inkubation bei 37°C wird die gebildete Farbdichte bei 600 nm durch den PET-FiIm an einem Re= flektionsspektrophotometer gemessen. Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle zusammengestellt.

Harnstoff-Stickstoff (mg/dl)	Reflektionsdichte
0	0,16
4	0,25
12	0,50
25	0,95
50	1,74
75	2,26
100	2,40

Die Ergebnisse zeigen, dass es sich um ein analytisches Element von hoher Empfindlichkeit handelt.

Beispiel. 2

Das nachstehende Beispiel dient zum Vergleich des erfindungsgemässen integrierten mehrschichtigen analytischen

Elements zum Nachweis von Blutharnstoff-Stickstoff, bei dem ein Membranfilter als Flüssigkeitssperrschicht verwendet wird, mit dem integrierten mehrschichtigen analytischen Element der JA-OS 3488/1977 (entsprechend US-PS Re 30 267), bei dem eine Polymermembran (oder Trennschicht) aus Cellu-

loseacetobutyrat als selektive Permeationsschicht verwendet wird.

1) Indikatorschicht

Ein durchsichtiger PET-Filmträger wird pro ra mit folgender Lösung beschichtet:

Farbstoff vorlauf er: 4-/~Bis-(2 , 4-dinitrophenyl)-

methyJLT-N-hexadecylpyridinium-"perchlorat 1,00 g

Celluloseacetobutyrat ' 6 g

Methyläthylketon 80 ml

Dichlormethan 20 ml

Äthansulfonsäure 50

2) Ein mit einem wasserabstossenden Mittel auf Siliconbasis ¹^ gemäss Beispiel 1 behandelter Membranfilter (Dicke 140 μαι, Porosität 75 Prozent, durchschnittlicher Porendurchmesser 5 um, Fuji Photo Film Co., Ltd.) wird auf eine auf die vorstehende Weise hergestellte, in feuchtem Zustand befindliche Probe geklebt. Auf die Vergleichsprobe wird eine 6-prozentige Lösung von Celluloseacetobutyrat (CAB) in Methyläthylketon (MEK)/Dichlormethan aufgebracht, wodurch eine 1 bis 2 um dicke Trennschicht (oder selektive Permeationsschicht) gebildet wird.

Auf beide Überzüge werden gemäss Beispiel 1, 3) eine Reagensschicht, 4) eine Lichtreflektionsschicht und 5) eine Haftschicht aufgebracht und getrocknet. Sodann wird zur Fertigstellung der analytischen Elemente eine Verteilungsschicht aufgebracht.

Gemäss dem Verfahren von Beispiel 1 werden die Eigenschaften der beiden Elemente miteinander verglichen.

Reflektionsdichte

Harnstoff-Stickstoff (mg/dl)	Flüssigkeitssperr schicht (Membranfilter)	Trennschicht (CAB-Membran)
0	0,15·	0,20
4	0,30	0,25
12	0,63	0,40
25	.1,15	0,64
50	1,88	1,05
75	. 2,23 ·	1,47
100	2,39	1,80

Aus den vorstehenden Ergebnissen geht hervor, dass .das analytische Element mit dem Membranfilter im Vergleich zu dem Element mit der Trennschicht (CAB-Membran) empfindlicher ist.

Beispiel -3

Gemäss Beispiel 1 wird ein integriertes mehrschichtiges analytisches Element zur quantitativen Analyse von Blutharnstoff-Stickstoff hergestellt, wobei 1,00 g Bromphenolblau als Farbstoffvorläufer verwendet werden.

²^ Das auf diese Weise hergestellte Element wird gemäss Beispiel 1 bewertet. Man erhält folgende Ergebnisse.

Harnstoff-Stickstoff	Reflektionsdichte
(mg/öl)
0	0,15
4	0,35
12	0,65
25	1,20
50	1,64
75	1,90
100	2 ,02

SAD

- 20 Beispiel4

20 mg Bromthymolblau werden als Indikator mit 4 g 5-prozentiger wässriger Methylcelluloselösung vermischt. Der pH-Wert des Gemisches wird mit wässriger Natriumhydroxidlösung auf 4,9 eingestellt. Man erhält eine Beschichtungsflüssigkeit. Die auf diese Weise hergestellte Beschichtungsflüssigkeit wird auf einen durchsichtigen PET-Träger aufgebracht, wodurch ein überzug mit einer Dicke in trockenem Zustand von 5 pm gebildet wird. Der beschichtete Träger wird sodann in eine 0,2-prozentige wässrige p-Nonylphenoxypolyglycidollösung von 5°C getaucht und zur Entfernung von überschüssiger Flüssigkeit zwischen auf 5°C eingestellte Siliconkautschuk-Walzen auf die ein haftend aufzubringender Membranfilter entsprechend Beispiel 1 gedrückt ist, gepresst. Gemäss Beispiel 1 werden eine Reagens-, Haft- und Verteilungsschicht schichtweise unter Bildung eines integrierten mehrschichtigen analytischen Elements zur Harnstoffanalyse aufgebracht.

Gemäss dem Verfahren von Beispiel 1 wird die Farbdichte entsprechend der Menge an Harnstoff-Stickstoff festgestellt.

Harnstoff-Stickstoff	■ Reflektionsdichte
(mg/dl)	0,22
0	0,34
5	0,55
10	1,06
25	1,64
45	2,05
75	2,14
100

Beispiel 5

Eine Beschichtungsflüssigkeit der nachstehend angegebenen Zusammensetzung wird als Indikatorschicht auf einen trans-

parenten PET-FiIm unter Bildung eines Überzugs von 10 um Stärke in trockenem Zustand aufgebracht.

Bromcresolgrün " 60 mg Latex eines Copolymerisats
aus Vinylacetat und Acrylsäureester (etwa 50 Prozent Feststoffe, pH-Wert 4,4) 5g 3,3-DimethyIglutarsäure 20 mg Wasser 2 ml 10

Auf die auf diese Weise hergestellte getrocknete, haftende Indikatorschicht wird mittels einer Laminiermaschine ein Membranfilter gemäss Beispiel 1 gepresst= Sodann werden gemäss Beispiel 1 eine Reagens-, Haft- und Verteilungsschicht schichtweise aufgebracht, wodurch man ein integriertes mehrschichtiges analytisches Element zur Harn- ' stoffanalyse erhält.

Gemäss .Beispiel 1 wird die Reflektionsdichte entsprechend der Menge an Harnstoff-Stickstoff in handelsüblichen Kontrollseren und in mit Harnstoff versetzten Proben ermittelt.

Harnstoff-Stickstoff*	Reflektionsdichte
(mg/dl)	0,13
0	0 ,60
15	0,81
23	1,29
40	1,55
52	2,02
95	2,17
115

* Es wird eine physiologische Kochsalzlösung mit einem Gehalt an 7 Prozent Albumin verwendet»

- 22 Beispiel6

Ein Gemisch der nachstehend angegebenen Zusammensetzung wird als Indikatorschicht auf einen durchsichtigen photographischen PET-Filni, der mit Agarose vorbeschichtet ist, unter Bildung eines Überzugs von 3.um Dicke in trockenem Zustand aufgebracht.

Glyoxal - 2,5 rag

Bromcresolicrün 20 mg

!0 5-Drozentige wässrige

Methylcelluloselösung ■ 5 g

Auf die Indikatorschicht wird ein Membranfilter (Fuji Mikro Filter FM 80, Porendurchmesser 0,8 pm), der gemäss

Beispiel ¹J mit einer Siliconharzlösung behandelt ist, aufgebracht. Auf den erhaltenen mehrschichtigen Film wird eine Überzugsflüssigkeit der nachstehend angegebenen Zusammensetzung unter Bildung einer Reagensschicht aufgebracht.

entionisierte Gelatine	10 g	Einheiten	g
Creatinin-desiminase	3000		g
N-Tris-(hydroxyraethyl)-		-	g
methyl-2-aminoäthansulfon-
säure-phosphorsäure	0,07	g
KH₂ PO₄	0,08
Borsäure	2,5
Alkylally1-polyäthersulfon
säur e-natriumsalζ	0 ,06
Wasser	150 g

Anschliessend werden eine Haftschicht und eine Verteilungsschicht aus Baummwollgewebe (cotton broad) aufgebracht, wodurch man einen analytischen Film zur Analyse von Creatinin erhält.

BAD ORIGINAL

Auf die Verteilungsschicht werden Proben von Jeweils 10 ul aufgesetzt und 3 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Farbdichte wird bei 600 Nanometer mittels eines Reflektionsspektrophotometers gemessen;

Creatinin

(mg/dl) Reflektionsdichte

0,05 0,17

1 ,0 0 ,20

2,0 0,24

5,0 0,40

10,0 0,90

16,0 1,63

Beispiel'7

Das Verfahren von Beispiel 6 wird zur Herstellung eines analytischen Films zum Nachweis von Creatinin wiederholt, wobei Bromphenolblau als Indikator verwendet wird.

Creatinin

(mg/dl) Reflektionsdichte

0 ,05 0 ,22

1,0 0,26

2,0 0,37

5,0 0,64

10,0 1,13

15,0 1,62

Beispiele

Eine Indikatorschicht gemäss Beispiel 5 wird auf einen PET-FiIm aufgebracht. Nach dem Trocknen wird auf die haftende Indikatorschicht ein Membranfilter, der nicht mit einem wasserabstossenden Mittel behandelt ist, mittels einer La-

miniermaschine aufgepresst.
35

- 24 -

Sodann werden gemäss Beispiel 1 eine Lichtreflektionsschicht, eine Haftschicht und eine Verteilungsschicht auf gebracht oder auf einen anderen PET-FiIm von guter Ablösbarkeit aufgeschichtet, wodurch man einen mehrschichtigen Verbundstoff erhält. Nach Entfernen des PET-Films wird der mehrschichtige Verbundstoff mittels eines Klebstoffs (Latex eines Copolymerisate aus 85 Molprozent Butylacrylat, auf 5 Molprozent 2-Acetoacetoxyäthylmethacrylat und 10 Molprozent N-(2-Sulfo-tert.-butyl)-acrylamid) mit dem Membranfilter laminiert. Man erhält ein analytisches Element.

Dieses Element wird gemäss Beispiel 1 bewertet. Man erhält folgende Ergebnisse. 15

Harnstoff-Stickstoff	Reflektionsdichte
(mg/dl)	0,2 1
0	0,51
15	0,90
34	1,03
42	1,37
58	1,64
76	1,96
98

Claims

Γ ·Α ; " 'V- -VV "Ί ''■-

SIEBERT Sl U. ·«. C(IIiI MCiNt-HSN TEL- ΙϋΒΘ) 47 40 75

! u.Z.: S 155

Case: OP 82072-03

FUJI SHASHIN'FILM KABüSHIKI· KAISHA

Asaka-shi, Saitama-ken, Japan

2. November 1982

"Integriertes mehrschichtiges analytisches Element zur Ana-

lyse von Ammoniak oder Ammoniak bildenden Substraten und Verfahren zum Nachweis von Ammoniak oder Ammoniak bildenden Substraten"

Patentansprüche

1.^Integriertes mehrschichtiges analytisches Element zur Analyse von Ammoniak oder Ammoniak bildenden Substraten

in flüssigen Proben, enthaltend einen durchsichtigen Träger, auf dem (I) eine Indikatorschicht für gasförmiges Ammoniak, (II) eine Flüssigkeitssperrschicht, (III) eine Reagensschicht, der ein Reagens, das mit dem Substrat unter Bildung von Ammoniak reagieren kann, einverleibt ist_s und (IV) eine Verteilungsschicht

in der angegebenen Reihenfolge integriert übereinander angeordnet sind, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeitssperrschicht aus einem porösen Material mit Hohlräumen, die unter den Anwendungsbedin-

gungen für gasförmiges Ammoniak durchlässig, aber im wesentlichen flüssigkeitsundurchlässig sind, hergestellt ist.

2. Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem porösen Material um ein Membranfilter mit einer Dicke von 50 bis 300 um und einer Porosität von mehr als 25 Prozent handelt.

3· Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Ammoniak bildenden Substrat um Harnstoff und bei dem mit dem Substrat unter Bildung von Ammoniak reagierenden Reagens um Urease handelt.

4. Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Ammoniak bildenden Substrat um Creatinin und bei dem mit dem Substrat unter Bildung von Ammoniak reagierenden Reagens um Creatinindesiminase handelt.

5. Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Reagensschicht zusätzlich einen Stabilisator und ein grenzflächenaktives Mittel umfasst.

6. Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Indikatorschicht eine Farbstoffvorlauferverbindung enthält, die in Gegenwart von Ammoniak einen Farbstoff bildet.

7. Analytisches Element nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Membranfilter einen durchschnittliehen Porendurchmesser von 0,01 bis 20 pm aufweist.

8. Verfahren zum Nachweis von Ammoniak oder Ammoniak bildenden Substraten in flüssigen Proben, bei dem

ein integriertes ' mehrschichtiges analytisches Element zur Analyse von Ammoniak oder von Ammoniak bildenden Substraten bereitgestellt wird, wobei das Element einen durchsichtigen Träger aufweist^auf dem (I) eine Indikatorschicht für gasförmiges Ammoniak, (II) eine Flüssigkeitssperrschicht, (III) eine Reagensschicht, der ein Reagens, das mit dem Substrat zur Bildung von Ammoniak

* reagieren kann,einverleibt ist, und (IV) eine Verteilungsschicht integriert in der angegebenen Reihenfolge

dadurch gekennzeichnet,

übereinander angeordnet sind,/ daß die Flüssigkeitssperrschicht aus"einem porösen Material mit Hohlräumen

5 oder Luftlöchern, die unter den Anwendungsbedingungen für gasförmiges Ammoniak durchlässig, aber im wesentlichen f lüssigkeitsundurchlässig sind, hergestellt ist,

. und daß
/die Probe auf die Verteilungsschicht des Elements aufgesetzt wird und man

visuell oder photometrisch durch den transparenten Träger die Entwicklung oder das Verschwinden von Farbe in der Indikatorschicht aufgrund einer Umsetzung zwisehen dem Indikator und Ammoniak, der in der Reagensschicht gebildet worden ist und die Flüssigkeitssperrschicht passiert hat, iftißt.