DE3133218A1 - Mehrschichtiges chemisches analysen-element - Google Patents

Description

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Mehrschichtiges chemisches Analysen-Element

Die Erfindung "betrifft ,ein mehrschichtiges Analysen-Element zur Anwendung bei der quantitativen Analyse von Substanzen oder Komponenten, die in wäßrigen Flüssigkeiten, insbesondere in Flüssigkeiten lebender Körper vorhanden sind. ■-'.-"

Es wurde verschiedene Methoden empfohlen zur Analyse von Substanzen oder Bestandteilen, die in Wasser, Nahrungsmitteln oder Flüssigkeiten lebender Körper vorhanden sind. Beispielsweise ist eine Analyse bekannt, die das analytische Prinzip ausnützt, daß eine Reaktion zwischen einem Reagens und einer zu analysierenden Substanz in einer Probe (diese Substanz wird im folgenden als

"Analysat" bezeichnet) eine gefärbte Substanz im Verhältnis zur Menge des Analysats bilden kann. Die Dichte der so gebildeten Farbe wird gemessen, um die Menge des Analysats zu bestimmen. . ■ · 30

Das.vorstehende Prinzip kann nicht nur in einer Lösungs-Analysenmethode sondern auch in einer Trocken-Analysenmethode ausgenützt werden» Ein Beispiel für derartige Anwendungen in der Trocken-Analysenmethode ist eine Trocken-Analysefolie, die hergestellt wird durch Imprägnieren von Papier oder einem Absorbensglied mit einem Reagens, das eine Farbe bildet, wenn es in Kontakt mit einem Analysat kommt und das im Prinzip und in der Form

einem pH-Untersuclmngspapier ähnlich ist.

Mehrschichtige ähnliche Analysen-Elemente, die "bei Trocken-Analysenmethoden verwendet werden können, sind bekannt. Mehrschichtige chemische Analysen-Elemente wie sie beispielsweise beschrieben werden in der JA-Patentveröffentlichung Nr. 33800/74- (entsprechend der US-PS 3 630 957) und den offengelegten JA-Patentanmeldungen (im folgenden als JA-OS bezeichnet) Nr. 53888/74- (entsprechend der US-PS 3 992 158), 137194/75 (entsprechend der US-PS 3 977 568), 40191/76 (entsprechend der US-PS 4 042 335), 3488/77 (entsprechend U.S.-Reissue Patent 30267), 89796/78 (entsprechend der US-PS 4 069 01?) und 131089/78 (entsprechend der US-PS 4 144 3Ο6) sind mit einer einzigen Reagensschicht oder mehreren Reagensschichten gebaut, die auf einem Träger ausgebildet sind und aus einer nicht-faserigen porösen Yerteilungsschicht, die auf die Reagensschicht aufgeschichtet ist. Wird eine wäßrige flüssige Probe auf die Verteilungsschicht aufgebracht, so dringt sie in die Reagensschicht ein, wobei eine gleichmäßige Menge pro Flächeneinheit beibehalten wird, was zu einer farbbildenden Reaktion führt.

Durch Messung der Änderung der optischen Parbdichte nach einer bestimmten Zeit kann die Konzentration eines Analysats' in der wäßrigen flüssigen Probe bestimmt werden.

Durch die Erfindung soll ein neues Analysen-Element bereitgestellt werden, unter Verwendung eines Reaktionssystems, in dem ein Analysat Substanzen produziert, die sehr unterschiedliche Diffusionsfähigkeiten in einem hydrophilen Binder aufweisen.

Typische Beispiele für derartige Analysate sind verschiedene Hydrolasen, die in Flüssigkeiten lebender Körper, wie Blut, Urin, intestinalen Flüssigkeit, Speichel, Spinalflüssigkeit und Pankreasflüssigkeit enthalten sind.

Zwar sind viele verschiedene Hydrolasen bekannt, jedoch, ist das Analysen-Element gemäß der Erfindung besonders geeignet zur Analyse von Enzymen, die auf Verbindungen' mit hohem Molekulargewicht (Substrate) einwirken unter Bildung von diffusionsfähigen Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht, durch Hydrolyse. Die quantitative Analyse derartiger Hydrolasen stellt eine wichtige klinisehe Untersuchung dar und es besteht ein großes Bedürfnis zur Bereitstellung einer zweckmäßigen und genauen Analysenmethode.

Beispiele für diese Hydrolasen umfassen Amylase, Lipase, Protease und verschiedene Kinasen.

Die Messung der Menge an Amylase, die in Blut vorhanden ist, ist klinisch sehr wichtig'als Mittel zur Untersuchung von Pankreas-Erkrankungen (Pankreatismus). Amyla- se ist ein Enzym, das eine Auslösebindung, die in Stärke usw. vorhanden ist, hydrolysiert, unter Bildung von Polysacchariden mit niedrigem Molekulargewicht, Oligosacchariden oder Monosaccharides Im allgemeinen werden die vorhandene Amylase und die Konzentration der Amylase in einer Probenlösung als relative Werte nach einer Methode zur Messung der Enzymaktivität berechnet.

Die Enzymaktivität wurde bisher nach einer Methode gemessen, bei der eine Testlösung, die Amylase enthielt, zu einer Lösung gefügt wurde, die eine bestimmte Menge eines Substrats für Amylase, z. B. Stärke, enthielt und damit unter bestimmten Bedingungen während eines bestimmten Zeitraums umgesetzt. Auf der Basis des Verhältnisses des verbleibenden nicht umgesetzten Substrats oder des

³^ Reaktionsprodukts mit niedrigem Molekulargewicht, das durch Hydrolyse gebildet wurde, zu dem'Substrat mit hohem Molekulargewicht, das vorher zugesetzt worden war, wird die Enzymaktivität berechnet.

Bei der Messung des Verhältnisses der durch enzymatische Reaktion gebildeten Verbindung mit niedrigem MoIekulargewicht zu dem Substrat mit hohem Molekulargewicht, das vorher zugesetzt worden war, ist es nötig, die beiden Verbindungen voneinander durch eine geeignete Methode zu trennen. Zu .diesem Zweck wird eine typische Methode verwendet, bei der ein Ausfäilungsmedium mit der Fähigkeit, das Substrat mit hohem Molekulargewicht selektiv aus der Lösung auszufällen, zu der Reaktionslösung zugesetzt wird, nachdem die Reaktion unterbrochen wird, zur Entfernung des nicht umgesetzten Substrats mit hohem Molekulargewicht als Ausfällung.

Wenn eine Lösung, die. nur das nicht umgesetzte Substrat enthält, oder eine Lösung, die nur das Reaktionsprodukt enthält, abgetrennt werden könnten, so würde es relativ leicht sein, eine quantitative Analyse durchzuführen nach einer Methode unter Anwendung einer Farbbildungsreaktion. Wenn die vorstehende Methode genau durchgeführt werden könnte, so könnten Ergebnisse mit hoher Genauigkeit und Glaubwürdigkeit erzielt werden.. Jedoch sind in der Praxis die Trennung des nicht umgesetzten Substrats von dem Reaktionsprodukt und die farbbildende Reaktion nach der Trennung kompliziert und mühsam. Es bestand daher ein Bedürfnis nach der Bereitstellung einer zweckmäßigeren Analysenmethode.

Nach einer anderen Analysenmethode wird ein Farbstoff vorausgehend an ein Substrat gebunden, so daß eine optische Analyse unmittelbar nur durch Anwendung einer Trennverfahrensweise unter Anwendung eines Ausfällungsmediums nach beendeter Reaktion, durchgeführt werden kann. Diese Analysenmethode wird als sogenanntes chromogenes Verfahren bezeichnet und wurde in der letzten Zeit verbreitet angewendet, wegen seiner vereinfachten Durchführbarkeit im Vergleich mit der vorstehend

■beschriebenen grundlegenden Methode.

Außerdem ist eine Methode zur Vereinfachung der Abtrennungsverfahrensweise bekannt, bei der es sich um das sogenannte"Blau-Stärke-Verfahren handelt. Nach diesem Blau-Stärke-Verfahren wird ein Substrat, an das ein Farbstoff vorher gebunden wurde, in Form von feinen Teilchen dispergiert, um die Trennung der umgesetzten Substanz von der nicht umgesetzten Substanz nach der Reaktion zu erleichtern.

Die JA-OS 131089/78 beschreibt ein Verfahren, bei dem die vorstehenden Reaktionen mittels eines trockenen System durchgeführt werden und stellt gleichzeitig ein Material bereit, das die Messung der Amylaseaktivität nach einer stark vereinfachten Verfahrensweise ermöglicht. Dieses Verfahren verwendet ein Analysenelement laminations typ bzw. Schichttyp, das eine Reagensschicht enthält, die ein nicht-diffundierbares Substrat enthält. Dieses Substrat wird hergestellt, durch Binden eines vorher bestimmbaren Chromophors, z. B. Farbstoff, auf ein Amylasesubstrat, z. B. Stärke, und einer Registrierschicht zur Aufnahme eines Reaktionsprodukts, das durch Einwirken eines Analysats, z. B. Amylase, diffundierbar gemacht wurde. In diesem Analysenelement wird das nicht diffundierbare Substrat mit dem vorher daran gebundenen bestimmbaren Teil durch die hydrolytische Wirkung des Enzyms hydrolysiert, unter Bildung einer diffundierbaren Verbindung mit niedrigem Molekulargewicht. Die diffundierbare Verbindung mit niedrigem Molekulargewicht ist in der Schicht diffus verteilt und wird schließlich'von der Registrierschicht aufgenommen und darin fixiert. Daher kann durch optische Messung der Farbdichte, die proportional zu der aufgenommenen Menge des Farbstoffs in der Registrierschicht ist, die Menge an Reaktionsprodukt bestimmt werden.

Unter Anwendung der dem Eeaktionssystem zu eigenen Charakteristika, daß ein Substrat mit hohem Molekulargewicht von Haus aus nicht diffundierbar ist und ein diffundierbares Produkt unter Anwendung einer enzymatischem Reaktion erzeugt, führte das vorstehende Verfahren zum Erfolg, bei der Vermeidung eines komplizierten Trennvorgangs, der bei einer üblichen Lösungsreaktion angewendet werden muß. Diese Methode ermöglicht es, eine Trennung zweckmäßiger durchzuführen, als dies von den bisherigen Methoden erwartet werden konnte.

Diese Methode erfordert jedoch eine neue Technik der optischen Unterscheidung zwischen dem nicht umgesetzten Substrat und dem Reaktionsprodukt, da eine bestimmbare chemische Gruppe, z. B. ein Farbstoff, vorher an das nicht diffundierbare Substrat gebunden wurde. In den vorstehenden JA-Patentbeschreibungen sind verschiedene Methoden zur Bestimmung des nicht umgesetzten Substrats und des Reaktionsprodukts beschrieben. Eine derartige Methode besteht darin, eine lichtabschirmende Schicht oder eine Strahlungsblockierende Schicht bereitzustellen, die ein feines Titanoxidpulver zwischen der Reagemsschicht, die das nicht diffundierbare nicht umgesetzte Substrat enthält und der Aufzeichnungsschicht zur Aufnahme des Reaktionsprodukts enthält. Hierdurch wird es möglich, nur das Reaktionsprodukt zu messen unter Ausnutzung des reflektierten Lichts nach beendeter Reaktion.

Uach einer anderen Verfahrensweise werden die Reagenss.chicht und die Registrierschicht in einen Zustand oder eine Anordnung gebracht, aus der sie leicht getrennt werden können. Wach beendeter Reaktion werden sie voneinander getrennt und die optische Dichte der Registrierschicht allein wird gemessen.

Die JA-OS 40191/76 beschreibt ein mehrschichtiges Analysenelement mit Schichtkonstruktion, die ähnlich der des

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vielschictLtigen Analysenelements ist» das in der JA-OS 131089/78 "beschrieben wird. Bei diesem mehrschichtigen .Analysenelement ist es wichtig, daß eine reaktive Reagensschicht aus einer Substanz besteht, die eine diffun-• dierbare und feststellbare chemische Species in Anwesenheit eines Analysats bildet und daß eine feststellbare Schicht zur Bestimmung der so gebildeten chemischen Species bereitgestellt wird. Die Grundlage dieser Technologie besteht darin, daß die Reaktion in der reaktiven Reagens schicht eine Stufe umfaßt, bei' der eine chemische Species, die in der Bestirnmungsschicht nicht von sich aus bestimmt werden könnte, in eine diffundierbare und bestimmbare chemische Species durch Einwirkung eines Analysats umgewandelt wird. Indem in der JA-OS 1JI089/ 78 beschriebenen Analysenelement enthält andererseits die reaktive Eeagensschicht von vornherein eine bestimmbare chemische Species und die Einwirkung des Analysats führt zu einer Reaktion, die die chemische Species diffundierbar macht.

Die Bestimmungsschichten (oder Registrierschichten),wie sie in den JA-OSn Nr. 40191/76 und 131089/78 beschrieben werden, sind hinsichtlich !Punktion und Elementen genau die gleichen-. Die Punktion liegt darin, eine diffundierbare und bestimmbare chemische Species', die in der Reagensschicht gebildet wurde, abzufangen und aufzunehmen, wodurch deren Bestimmung durch eine optische Messung oder dergleichen leicht gemacht und gesichert wird. Das einzige Beispiel für derartige Bestimmungsschichten ist eine beizende Polymerschicht. Die Punktion derartiger beizender Polymerer ist die Auffangwirkung einer diffundierbaren und bestimmbaren chemischen Species, die in

³^ der reaktiven Reagensschicht gebildet wurde, und die so abgefangene chemische Species nicht diffundierbar zu machen.- In einigen Fällen funktioniert dies zur Vereinfachung und Bestätigung der quantitativen Analyse

durch eine optische Messung unter Anwendung einer Absorptionssteigerung oder einer Verschiebung der Absorptionswellenlänge (gewöhnlich etwa 10 nm oder weniger) durch die Beiz-Einwirkung.

In den beiden vorstehend beschriebenen !Typen von Analysenelementen soll die Bestimmungsschicht oder Registrierschicht nur eine diffundierbare chemische Species aufnehmen und keine anderen Punktionen ausüben, wie eine Farbbildungsreaktion. Um daher eine feststellbare chemische Species, die verbleibt oder in der reaktiven Reagensschicht aus einer chemischen Species gebildet wurde, die in der Bestimmungs- oder Registrierschicht abgefangen oder aufgenommen wurde, um so quantitative Meßergebnisse zu erzielen, war es wichtig, eine lichtstreuende strahlungsblockierende Schicht zwischen die Reagensschicht und die Bestimmungsschicht einzubringen, um die Farbe abzuschirmen.

Durch die Erfindung wird ein mehrschichtiges chemisches Analysenelement bereitgestellt, das einen lichtdurchlässigen wasserundurchlässigen Träger und mindestens zwei Reagensschichten, die auf diesem Träger aufgebracht sind, aufweist, wobei eine dieser Reagensschichten a) eine Substratschicht ist, die ein im wesentlichen farbloses nicht-diffundierbares Substrat enthält, das eine farbstoffbildende reaktive Gruppe enthält, die geeignet ist zur Bildung eines Farbstoffs bei Reaktion mit einer chromogenen.Verbindung und die geeignet ist zur Bildung einer im wesentlichen farblosen diffundierbaren Verbindung, die die farbstoffbildende reaktive Gruppe enthält, durch Einwirkung eines Analysats; und eine andere Reagensschicht b) eine farbbildende Reaktionsschicht ist, die die chromogene Verbindung enthält, die geeignet ist zur Bildung eines Farbstoffs bei der Reaktion mit der farbstoffbildenden reaktiven Gruppe.

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Im folgenden werden die Figuren kurz erläutert. Die FiK. 1 "bis 5 sind veranschaulichende Querschnitte von mehrschichtigen chemischen Analysenelementen gemäß der Erfindung. -

Im folgenden wird die Erfindung genauer "beschrieben. In dem erfindungsgemäßen Analysenelement ist eine diffundierbare Verbindung, die in der Substratschicht durch Einwirkung eines Analysats gebildet wird,' im wesentlichen farblos und bildet einen Farbstoff durch Einwirkung mit der chromogenen Verbindung. Daher sind vor und nach der Einwirkung des Analysats' das Substrat und das Produkt deutlich durch optische Kessung unterscheidbar. Das erf indungsgemäße Analyseneleiaent bietet daher den großen Vorteil, da es keine spezielle Schicht zur Unter-• scheidung zwischen dem Substrat und dem Produkt, die Strahlungsblockierende Schicht, oder keine VerfahrenS'-weise zur Trennung der Substratschicht von der Bestimmungsschicht vor der optischen Messung benötigt, die für die Analysenelemente nötig sind, wie sie in den JA-OSn 40191/76 und 131089/78 benötigt werden.

Darüber hinaus ist es bei diesen üblichen Analysenelementen nötig, polare organische Lösungsmittel, wie Aceton und Alkohol, als tJberzugslösungsmittel für eine gleichmäßige Beschichtung der Beizpolymeren zu verwenden. Das Beschichten mit derartigen organischen Lösungsmitteln

^3CJ erfordert spezielle Vorkehrungen für die Produktionsausrüstung, da es unterschiedlich von dem Beschichten mit wäßrigen Lösungen von Gelatine, Polyacrylamid und dergleichen ist.Auch kann ein gleichzeitiger Auftrag von mehreren Schichten, das für die Produktionswirksamkeit vorteilhaft ist, nicht für die Herstellung der üblichen Analysenelemente angewendet werden. Dagegen kann das erfindungsgemäße Analysenelement hergestellt werden durch Auftrag wäßriger Lösungen oder wäßriger .

Dispersionen. In dieser Hinsicht stellt das erfindungsgemäße Analysenelement im Vergleich mit den üblichen mehrschichtigen Analysenelementen, in denen Beizpolymere verwendet werden, einen Vorteil dar.

Im folgenden wird das mehrschichtige chemische Analysenelement gemäß der Erfindung genauer unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren erläutert.

Die 3?ig. 1 bis 5 sind Querschnitte verschiedener Ausführungsformen des mehrschichtigen chemischen Analysenelements gemäß der Erfindung, zur Veranschaulichung von dessen Bauweise.

Unter Bezugnahme auf die S¹Xg. 1 besteht ein mehrschichtiges chemisches Analysenelement aus einem lichtdurchlässigen wasserundurchlässigen Träger 10, und einer Substratschicht 50» "und einer farbbildenden Ee akt ions schicht 20, die auf dem lichtdurchlässigen wasserundurchlässigen Träger 10 ausgebildet ist. Die Substratschicht 50 besteht aus einem ersten hydrophilen Bindemittel und einem darauf enthaltenen, im wesentlichen farblosen nicht-diffundierbaren Substrat. Das nicht-diffundierbare Substrat enthält eine farbstoffbildende reaktive Gruppe, die geeignet ist zur Reaktion mit einer chromogenen Verbindung unter Bildung eines Farbstoffs und die geeignet ist durch Einwirkung eines Analysats, eine diffundierbare Verbindung zu bilden, die im wesentlichen farblos ist, die vorstehende farbstoffbildende reaktive Gruppe enthält und die in einem hydrophilen Bindemittel in der Anwesenheit von Wasser diffundierbar ist. Die farbstoffbildende ßeaktionsschicht 20 besteht aus einem zweiten hydrophilen Bindemittel und einer darin enthaltenen chromogenen Verbindung. Die chromogexie Verbindung ist geeignet zur Reaktion mit der vorstehenden farbstoffbildenden reaktiven Gruppe unter Bildung eines Farbstoffs,

Das erste, zweite und dritte hydrophile Bindemittel können gleich oder unterschiedlich sein oder können es jegliche Kombinationen sein. So können je nach der Art des Analysats, des nicht-diffundierbaren Substrats, der diffundierbaren Verbindung, der chromogenen Verbindung und des gebildeten Farbstoffs oder einer Kombination davon, geeignete hydrophile Bindemittel gewählt werden.

' '■■■·.' Für das nicht-diffundierbare Substrat und die chromogene Verbindung reicht es aus, wenn sie voneinander getrennt werden. So ist es nicht, notwendigerweise erforderlich, daß sie in die zwei Schichten, die in der Fig. 1 veranschaulicht getrennt sind, und sie können in der gleichen Schicht in einem Zustand,in dem sie voneinander isoliert sind, vorhanden sein. Diese Ausführungsform ist in der Fig. 5 dargestellt.

Die Fig. 2 zeigt ein mehrschichtiges chemisches Analysenelement der Bauweise, bei der eine die Diffusion verhindernde Schicht 30 sandwich-artig zwischen einer farbbildenden Reaktionsschicht 20 und einer Substratschicht 50 angeordnet ist. Die Funktion der die Diffusion verhindernden Schicht JO wird später genauer erläutert.

Die Fig. 5 stellt ein Konzept für die Schichtkonstruktion dar, um das Prinz'ip des erfindungsgemäßen mehrschichtigen chemischen Analysenelements zu zeigen. Das mehrschichtige chemische Analysenelement, das in der Fig. 3 dargestellt ist, besteht aus einem lichtdurchlässigen, wasserundurchlässigen Träger 10 und einer farbbildenden Reaktionsschicht 20, einer die Diffusion · verhindernden Schicht 30, einem Substrat 50 und einer Verteilungs- bzw. Ausbreiteschicht 70 , die auf dem Träger 10 in dieser Reihenfolge angeordnet sind.

Wird ein Tropfen einer wäßrigen Lösung, die ein Analysat, z. B. Amylase, enthält, auf die Verteilungsschicht aufgebracht, so wird es fast gleichmäßig darin verteilt und dringt dann in die Substratschicht 50 ein. In der Substratschicht 50 wirkt das Analysat auf das nicht diffundierbare Substrat, was zur Bildung einer diffundierbaren Verbindung führt. Die diffundierbare Verbindung, die so gebildet wurde, passiert durch die die Diffusion verhindernde Schicht 30 und diffundiert in die farbbildende Reaktionsschicht 20. Da die diffundierbare Verbindung eine farbstoffbildende reaktive Gruppe enthält, wenn sie die farbbildende Schicht 20 erreicht, reagiert die farbstoffbildende reaktive Gruppe mit einer chromogenen Verbindung, die in der farbbildenden Reaktionsschicht 20 enthalten ist, wodurch ein Farbstoff gebildet wird.

Ist das Analysat eine Hydrolase, so kann es nicht durch die die Diffusion verhindernde Schicht 30 passieren und verbleibt zusammen mit dem nicht diffundierbaren Substrat in der Substratschicht 50, da die Hydrolase ein Enzym mit hohem Molekulargewicht ist. Daher wird der Farbstoff in Proportion zu der Enzymaktivität gebildet. Dies ermöglicht die Bestimmung der Enzymaktivität durch Messung der Menge des gebildeten Farbstoffs.

Zur Messung der Menge des gebildeten Farbstoffs ist eine optische Messung unter Anwendung' d.er Transmission des Lichts in dem Absorptionswellenlängengebiet des Farbstoffs oder der Reflexion von Licht geeignet. Je nach dem Zweck und der benötigten Genauigkeit ist es jedoch möglich, die Bestimmung mit dem Auge durchzuführen.

Nachfolgend wird die Erfindung genauer erläutert unter Bezugnahme auf ein chemisches mehrschichtiges

Analysenelement der in der Fig. 1 gezeigten Bauweise, um die Erfindung besser zu verstehen und - falls notwendig - unter Bezugnahme auf die in den Fig. 2 bis 5 gezeigten Bauweisen.

Die Substratschicht 50 ist farblos und das nicht-diffundierbare Substrat ist im wesentlichen farblos.

Die farbbildende Reaktionsschicht 20 kann farblos gemacht werden durch Wahl einer farblosen Verbindung als chromogene Verbindung. Sowohl die Substratschicht 50 als auch die' farbbildende Reaktionsschicht 20 sind durchsichtig bzw. transparent, da sie höchstens etwa 50yum dick sind. Somit ist das mehrschichtige chemische Analysenelement, das in der Fig. Λ dargestellt ist, durchsichtig.

' Wird eine Analysat enthaltende Lösung, das heißt eine Lösung oder Dispersion des Analysats, in Wasser auf das mehrschichtige chemische Analysenelement aufgebracht, so dringt sie in die Substratschicht 50 ein, wo das nicht-diffundierbare Substrat eine chemische Reaktion eingeht, beispielsweise durch Hydrolyse durch Einwirkung des Analysats, wodurch eine farblose diffundierbare Verbindung gebildet wird. Die farblose diffundierbare so gebildete Verbindung diffundiert durch die hydrophilen Bindemittel-Matrices der Substratschicht und der farbbildenden Reaktionsschicht 20 (in Anwesenheit von Wasser hauptsächlich durch das Wasser, das in der das Analysat enthaltenden Lösung als ein Lösungsmittel oder Dispersionsmedium enthalten ist). Die farblose diffundierbare Verbindung erreicht schließlich die chromogene Verbindung, die in der farbbildenden Reaktionsschicht 20 enthalten ist, und reagiert damit unter Bildung eines Farbstoffs. Die Reaktion kann unter vorgegebenen Bedingungen während eines vorgegebenen

Zeitraums durchgeführt werden. Anschließend kann durch Messung der Menge des gebildeten Farbstoffs in der farbbildenden Eeaktionsschicht 20 nach einer optischen Technik die Menge oder die Aktivität des Analysats bestimmt werden.

Das mehrschichtige chemische Analysenelement gemäß der Erfindung wird zur Messung der Aktivität einer Hydrolase verwendet, die in wäßrigen Flüssigkeiten vorhanden ist, insbesondere in Flüssigkeiten lebender Körper, wie. Blut, Urin, Intestinalflüssigkeit bzw. Intestinalsaft, Speichel, Spinalfluid und Pankreasflüssigkeit bzw. Pan-' kreassaft. Bei der Messung der Enzymaktivität einer Hydrolase, die im Blut vorhanden ist, z. B. von Amylase, mittels der üblichen Methoden, wurde das Plasma oder Serum, das aus einer Blutprobe durch eine Technik wie ein Zentrifugenabscheiden, gewonnen wurde, als eine Probenlösung verwendet. Der Grund hierfür lag darin, daß es unmöglich war, eine Wechselwirkung von Haemoglobin (das in großer Menge im Blut vorhanden ist) mit der optischen Messung zu vermeiden.

²^ Im Falle des erfindungsgemäßen mehrschichtigen chemischen Analysenelements jedoch ermöglicht die Einführung einer die Strahlung blockierenden Schicht als eine der funktioneilen Schichten die Messung der Enzymaktivität unter Anwendung der Blutprobe als solcher als eine Probenlösung. Dies konnte nach den üblichen Analysenmethoden nicht erzielt werden.

Da das mehrschichtige chemische Analysenelement gemäß der Erfindung von dem Typ ist, daß die farbbildende Reaktion nur nach Auftrag der Probenlösung darauf erfolgt, kann die optische Messung nach der Reaktion von der untersten Schicht des Elements durchgeführt werden oder kann auch eine- Licht-Transmissionsmessung oder

Licht-Reflexionsmessung sein*

Die Pig. 4 zeigt eine Ausführungsform des mehrschichtigen chemischen Analysenelements gemäß der Erfindung, in dem zur Vermeidung der Wechselwirkung roter Blutkörperchen und von Haemoglobin, das auf der oberen Oberfläche einer Substratschicht 50 vorhanden ist, eine die Strahlung blockierende Schicht 40 mit hohen Lichtstreueigenschaften zwischen der Substratschicht 50 und der farbbildenden Reaktionsschicht 20 ausgebildet ist. Ih der Fig. 4- zeigen die Bezugsziffern 10 und 70 einen lichtdurchlässigen wasserundurchlässigen Träger bzw. eine Verteilungsschicht auf. Die Messung der Lichtreflexion der Earbdichte der farbbildenden Reaktionsschicht 20 durch den transparenten Träger 10 ermöglicht die direkte Messung der Enzymaktivität durch Anwendung der Blutprobe als eine Probenlösung. '

Die die Strahlung blockierende Schicht wirkt als solche zur Verhinderung der Diffusion von diffundierbaren reaktiven Substanzen und/oder chromogenen Verbindungen. Es ist daher nicht nötig, eine die Diffusion verhindernde Schicht bereitzustellen.

Haemoglobin, Bilirubin und Chylomikron, die oft in Serum vorhanden sind, verhalten sich als Substanzen, die in die Analyse von Serum eingreifen. Die Diffusion dieser eingreifenden Substanzen in die niedrigere Schicht kann völlig blockiert werden durch die die Diffusion verhindernde Schicht, die in dem erfindungsgemäßen mehrschichtigen chemischen Analysenelement verwendet wird.

So ermöglicht es die Bereitstellung der die Strahlung blockierenden Schicht eine Serumprobe, die Haemolyse bzw. Haemoglobin, einen hohen Bilirubingehalt und Chylomikron enthält, genau zu bestimmen. ■

Der hier verwendete Ausdruck "nicht-diffundierbares Substrat", das in dem erfindungsgemäßen mehrschichtigen chemischen Analysenelement verwendet wird, bezeichnet eine Substanz, die beträchtliche Änderungen der Mo.lekulargröße, der Form und der physikalischen Eigenschaften, wie dem Dissoziationsgrad durch die Einwirkung eines bestimmten Analysats eingeht und daher in der Diffusionsfähigkeit in die hydrophile Bindemittelschicht des mehrschichtigen chemischen Analysenelements beträchtlich verstärkt wird.

Beispiele für derartige nicht-diffundierbare Substrate umfassen verschiedene Enzyme, die in Flüssigkeiten lebender Körper enthalten sind. Insbesondere können Hydrolasen von derartigen verschiedenen Enzymen wirksam auf das mehrschichtige chemische Analysenelement der Erfindung angewendet werden. Beispiele für derartige Hydrolasen umfassen Protease, Amylase, Lipase und Pectinase.

Wenn diese Hydrolasen als Analysate verwendet werden, werden solche Verbindungen, die hergestellt wurden durch Binden von im wesentlichen farblosen farbstoffbildenden reaktiven Gruppen an Substrate von Hydrolasen, wie Proteine, Amylose, Glyzerid und Pectin, als nicht-diffundierbare Substrate verwendet.

Die Substratschicht besteht aus einem nicht-diffundierbaren Substrat in Schichtform. Wird das erfindungsgemäße mehrschichtige chemische Analysenelement hergestellt durch Beschichten, so wird das Substrat in einer BindemittellÖsung, die aus einem oder mehreren Polymeren besteht, aufgelöst oder dispergiert, aufgeschichtet und getrocknet. In dem erfindungsgemäßen mehrschichtigen chemischen Analysenelement kann jedoch die Substratschicht hergestellt werden durch Techniken, wie Beschichtung oder Imprägnieren, ohne Verwendung eines Bindemittels,

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da das Substrat als solches eine Verbindung mit hohem Molekulargewicht ist. Beispielsweise werden Papier, Tuch, ein poröser Kunststoff-film und dergleichen einer Vorbehandlung unterzogen, z. B. mit dem Substrat imprägniert und auf einen Träger mit einer farbbildenden Schicht nach Techniken wie Schichtstoff bildung bzw. Lamination, gelegt.

Als erstes, hydrophiles Bindemittelpolymeres zur Anwendung in der Substratschicht können verschiedene hydrophile Bindemittel verwendet werden. Beispiele für hydrophile Bindemittelpolymere, die verwendet werden können, umfassen natürliche hydrophile Polymere, wie Gelatine, Agarose, Natriumalginat, Carboxymethylcellulose und Methylcellulose und hydrophile synthetische Polymere, wie Polyacrylamid, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polynatriumacrylat, Polyhydroxyäthylmethacrylat, Acrylsäure enthaltende Copolymere und Maleinsäure ent-■ haltende Copolymere.

Aus diesen Polymeren wird ein geeignetes Bindemittel gewählt, wobei die Bedingungen, unter denen das Analysenelement verwendet wird, die Charakteristika eines 'Analysats, die Beschichtungscharakteristika usw. in Betracht gezogen werden. Beispielsweise sind als Bindemittel zur Anwendung in dem Element für die Analyse von Protease, proteinhaltige Bindemittel, z. B.- Gelatine_v nicht geeignet. Ist das Molekulargewicht des Analysats groß, so führt die Diffusion des Analysats in die Substratschicht zu Problemen. Dies erfordert die Anwendung eines Bindemittels mit einem hohen Quellgrad.

Von den hydrophilen Bindemittelpolymeren sind Agarose, Polyacrylamid, Polynatriumacrylat und Acrylsäure enthaltende Copolymere besonders geeignet zur Anwendung als Bindemittel für die Substratschicht des

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Zu der Substratschicht können verschiedene organische oder anorganische Zusätze gefügt werden, z. B. oberflächenaktive Mittel, den pH-Wert einstellende Mittel, feine Pulver und Antioxidantien, um die verschiedenen Leistungsfähigkeit zu verbessern, wie die Überzugsleistungsfähigkeit, die Diffundierbarkeit, die Reaktionsfähigkeit und die LagerungsStabilität der diffundierbaren Verbindung, zusätzlich zu dem nicht-diffundierbaren Substrat und dem hydrophilen Bindemitt e1.

Die Dicke der Substratschicht ist nicht kritisch, wenn jedoch die Substratschicht durch überzugsbildung hergestellt wird, liegt die Dicke gewöhnlich im Bereich von etwa 1 yum bis etwa 50 im, wobei ein Bereich von etwa 2 um bis etwa 30 ma. besonders bevorzugt ist. Wird die Substratschicht durch Methoden hergestellt, wie beispielsweise durch Schichtstoffbildung oder Lamination, die sich von der Überzugsbildung unterscheiden, so kann die Dicke im Bereich zwischen einigen zehn Mikrometern (um) und einigen hundert· Mikrometern variieren.

Die farbbildende Reaktionsschicht, die das mehrschichtige chemische·Analysenelement gemäß der Erfindung bildet, wird aus der chromogenen Verbindung * die einen Farbstoff durch Reaktion mit der farbstoffbildenden reaktiven Gruppe bildet, die in der diffundierbaren Verbindung (d. h. dem Reaktionsprodukt) enthalten ist, und dem zweiten hydrophilen Bindemittel hergestellt. Zwar gibt es verschiedene Kombinationen für das nichtdiffundierbare Substrat in der Substratschicht und der chromogenen Verbindung in der farbbildenden Reaktionsschicht, wie später genauer beschrieben, jedoch ist es notwendig, eine spezielle Kombination zu wählen, die für

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die Leistungsfähigkeit des jeweiligen chemischen Analysenelements am geeignetsten ist.
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Wie vorstehend beschrieben, führt die Diffusion der chromogenen- Verbindung in der farbbildenden Reaktions— schicht in die Substratschicht im PaIIe der Herstellung des erfindungsgemäßen Materials zur Bildung einer Farbe, die nicht durch die Einwirkung des Analysats bewirkt wurde, d. h. zur "Schleierbildung" und verringert dessen analytische Leistungsfähigkeit. Daher sollte eine derartige Diffusion sicher vermieden werden. Zu diesem Zweck ist es nötig, verschiedene Techniken anzuwenden, um die chromogene Verbindung diffusionsbestandig zu machen.

Techniken, die hierfür angewendet werden können, umfassen Methoden Kuppler diffusionsbestandig zu machen, die bisher auf dem Gebiet der Eotochemie bekannt waren, d.h. eine Methode, bei der eine langkettige diffusionsbeständige Gruppe an den Kuppler gebunden ist, und eine ■ Methode, bei der der Kuppler in einem hydrophoben Öl gelöst wird und anschließend in ein hydrophiles Bindemittel dispergiert wird. Dies bedeutet, daß eine Schicht, hergestellt durch Dispergieren einer chromogenen Verbindung mit einer daran gebundenen langkettigen diffusionsbeständigen Gruppe, in einem hydrophilen Bindemittel, und eine Schicht, hergestellt durch Dispergieren feiner ölteilchen mit einer darin gelösten chromogenen Verbindung in einem hydrophilen Bindemittel angewendet werden können als farbbildende Reaktionsschicht des erfindungsgemäßen Materials. Außerdem kann eine Methode verwendet werden, um eine chromogene Verbindung diffusionsbeständig machen durch Fixieren an die Oberfläche eines Feststoffs, durch Techniken, wie Adsorption.

Das zweite hydrophile Bindemittel zur Anwendung in der farbbildenden Reaktionsschicht ist ein hydrophiles PoIymeres wie im Falle des Bindemittels zur Anwendung in der Substratschicht. Bindemittel mit nahezu den gleichen Charakteristika, wie die des Bindemittels zur Anwendung in der Substratschicht, sind geeignet. Die ersten und zweiten hydrophilen Bindemittel können entweder gleich oder unterschiedlich sein. Selbstverständlich können verschiedene Zusätze zu der farbbildenden Reaktionsschicht gefügt werden. Die Dicke der farbbildenden Reaktionsschicht kann innerhalb eines weiten Bereichs variiert werden und liegt gewöhnlich bei etwa 1 um bis etwa 50 yum und vorzugsweise bei etwa 2 um bis etwa 30 um.

Im folgenden werden Kombinationen von färbstoffbildenden reaktiven Gruppen und chromogenen Verbindungen, die bei der Herstellung des erfindungsgemäßen Materials verwendet werden können, und eine Methode zur Synthese von nicht-diffundierbaren Substraten, genauer beschrieben. Der hier verwendete Ausdruck "chromogene Verbindung" bedeutet alle Verbindungen, die geeignet sind zur 3ildung eines Farbstoffs durch Reaktion mit farbstoffbildenden reaktiven Gruppen.

Techniken, die nicht-diffundierende Kuppler und ölgeschützte Kuppler betreffen, die auf dem technischen Gebiet der Fotografie bekannt sind, sind für die farbstoffbildende Reaktion geeignet, die in dem erfindungsgemäßen mehrschichtigen chemischen Analysenelement ■verwendet werden. Das grundlegende Prinzip liegt darin, daß die Diffusionsfähigkeit von Kupplern in Wasser auf ein Minimum herabgesetzt wird, wenn man an sie eine massige bzw. sperrige nicht-diffusionsfähige Gruppe bindet, oder durch Erhöhen der hydrophoben Eigenschaften, während die Reaktionsfähigkeit des Kupplers

beibehalten wird. Derartige Techniken werden beispielsweise beschrieben in T.H. James ed., The Theory of the Photographic Process, 4. Auflage, Seiten 335-372, The Macmillan Company, New York (1977)· Die Kupplungsreaktion unter Verwendung von Diazoniumverbindungen wird in J. Kosar, Light-Sensitive Systems, Seiten 194—258, John Viley & Sons Inc., New York (1965) beschrieben.

Der Ausdruck "farbstoffbildende reaktive Gruppen", der · hier verwendet wird, bezeichnet eine Atomgruppe, die aus einem einzigen Atom oder mehreren Atomen besteht, die geeignet ist an eine chromogene Verbindung durch chemische Reaktion mit dieser gebunden zu werden. Die " chemische Reaktion führt zur Bildung eines Farbstoffs. Es kann jegliche chemische Reaktion zur Bindung der farbstoffbildenden reaktiven Gruppe und der chromogenen Verbindung verwendet werden. Die Bindung kann jegliche Bindung sein, eine kovalente Bindung, eine ionische Bindung, eine Koordinationsbindung usw.. Zusammenfassend läßt sich sagen, daß so lang die chemische Reaktion der farbstoffbildenden reaktiven Gruppe und der chromogenen Verbindung zu einem Farbstoff führt, der zu einem derartigen Ausmaß stabil ist, daß seine optische Messung durchgeführt werden kann, und der vorzugsweise nach seiner Bildung für immer stabil existiert, jegliche Kombination von farbstoffbildender reaktiver Gruppe/ehromogener Verbindung und jegliche chemische Reaktion angewendet werden können. In dieser Kombination"ist zwar die farbstoffbildende reaktive Gruppe im wesentlichen farblos, d. h. sie ergibt im wesentlichen keine Absorption im Bereich des sichtbaren Lichts, jedoch kann die chromogene Verbindung farblos sein oder eine Farbe aufweisen, die in die optische Messung des Farbstoffs nicht eingreift oder kein Hindernis dafür darstellt, d. h. sie kann eine Absorption im Gebiet des sichtbaren Lichts aufweisen, die nicht in die Absorption des Farbstoffs im

Bereich des sichtbaren Lichts eingreift oder eine Hinderung dafür darstellt.

Es können verschiedene Kombinationen,· die geeignet sind für eine Kupplungsreaktion unter Bildung eines Farbstoffs, erfindungsgemäß verwendet werden. Beispiele für derartige Kombinationen umfassen eine Kombination aus einem Farbentwickler-Kuppler und einem Oxidationsmittel in üblichen fotografischen Silberhalogenidsystemen, wie in der vorstehenden Literaturstelle von T. H. James, Seiten 335-361 beschrieben, eine Kombination eines Diazoniumsalzes, wie einer Diazokomponente und eines Kupplungsreagens, wie einer Kupplerkomponente (Kuppler), wie in der Literaturstelle yon J. Kosar, Seiten 194—258 beschrieben, und eine Kombination eines Stickstoff enthaltenden heterocyclischen quaternären Ammoniumsalzes und eines Dialkylaminobenzaldehyds oder einer damit ähnlichen "Verbindung (die einen Styrylfarbstoff liefert). Diese Kombinationen werden vorzugsweise erfindungsgemäß aufgrund der hohen Farbstoff-Entwicklungsausmaße bzw. -geschwindigkeiten verwendet.

Außerdem können Kombinationen von Leucofarbstoffen und Phenolverbindungen als Farbbildungs-Beschleuniger, die in einem druckempfindlichen Kopierpapier, einem wärmeempfindlichen Aufzeichnungsmaterial und dergleichen verwendet werden, in dem erfindungsgemäßen Element verwendet werden.

Wie aus dem Prinzip ersichtlich, sind die farbstoffbildende reaktive Gruppe und die damit unter Bildung eines Farbstoffs reagierende chrc-mogene Verbindung, die erfindungsgemäß verwendet werden, nicht auf die vorstehend beschriebenen Gruppen und Verbindungen beschränkt.

Die färbstoffbildende reaktive Gruppe wird ausgewählt, wobei man die Hinderung der Enzymreaktion, die leichte .Herstellbarkeit, die Stabilität us.w. in Betracht zieht. Sie ist vorzugsweise diffundierbär, da sie zusammen mit der diffundierbaren Verbindung (Substrat, das in Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht umgewandelt wurde) diffundiert. Zur Bindung der farbstoffbildenden reaktiven Gruppe an das nicht-diffundierbare Substrat wird die "Eeaktivfarbstoff-Technik" verwendet, die auf dem Gebiet der Farbstofftechnologie weitverbreitet Anwendung findet.

In der Farbstofftechnologie wurde zusätzlich zur physikalischen Adsorption einer Färbstoffverbindung auf • ■ verschiedene natürliche Fasern, die Bildung chemischer Bindungen durchgeführt zur Erzielung einer bevorzugteren Färbung. Farbstoffe, die für diesen Zweck verwendet werden, sind sogenannte Reaktivfarbstoff und werden genauer beschrieben in K. Venkataraman, ed., The Chemistry of Synthetic Dyes, Band VI, Academic Press, New York (1972). Insbesondere werden "bindende Gruppen" zur Bindung von Farbstoffmolekülen an Cellulose natürlicher Polymerer wie Polysaccharide und Moleküle von proteinhaltigen Fasern wie Wolle und Seide genauer beschrieben. Diese Techniken können für die Herstellung von nicht-diffundierbaren Substraten zur Anwendung gemäß der Erfindung verwendet werden. Dies bedeutet, daß er-

f indungsgemäß brauchbare Verbindungen hergestellt werden können, durch Binden von farbstoffbildenden reaktiven Gruppen und nicht-diffundierbaren Substraten unter Anwendung derartiger bindender Gruppen.

Vorzugsweise enthält die färbstoffbildende reaktive Gruppe eine lösliche Gruppe oder mehrere Gruppen, z. B. eine SuIfonsäuregruppe, eine Carboxylgruppe und eine Hydroxylgruppe, da die farbstoffbildende reaktive Gruppe

in Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht durch die enzymatisch^ Reaktion umgewandelt wird und in das hydrophile Bindemittel für die Farbbildungsreaktion diffundiert und schwimmt. Diese löslichen Gruppen ergeben bevorzugte Ergebnisse, selbst wenn sie in Teile der bindenden Gruppen eingeführt werden.

Die farbstoffbildenden reaktiven Gruppen, die an die nicht-diffundierbaren Substrate durch bindende Gruppen gebunden werden, umfassen verschiedene Kuppler, die gewöhnlich in fotografischen Systemen verwendet werden, wie Pyrazolin-5-on, Naphthol, Phenol und Acylacetanilid.

Da es notwendig ist, die bindende Gruppe zu binden, muß die farbstoffbildende reaktive Gruppe eine Aminogruppe, eine Hydroxygruppe und dergleichen enthalten. 2-Äquivalent-Kuppler mit einer freisetzenden Gruppe an der Kupplungsstelle, die auf dem Gebiet der fotografischen Technologie bekannt sind, können erfindungsgemäß ebenfalls verwendet werden. Ist die chromogene Verbindung ein Diazoniumsalz, so kann Arylamin (Arymaine) und dergleichen als Kupplungskomponente zusätzlich zu den Kupplern, wie vorstehend beschrieben, verwendet werden.

.

Beispiele für chromogene Verbindungen, die mit den farbstoffbildenden reaktiven Gruppen reagieren unter Bildung eines Farbstoffs umfassen diazotisiertes Benzol, Naphthalin und Anthrachinonderivate und Ν,ΪΤ-disubstituierte p-Phenylendiaminderivate, heterocyclische quaternäre Ammoniumsalze und Arylaldehydderivate. .

Vorzugsweise werden diese Verbindungen nach einer Technik zur Verleihung der Diffusionsbeständigkeit her-³^ gestellt, die auf dem Gebiet der fotografischen Technologie bekannt ist.

Beispielsweise wird ein. langkettiges aliphatisches Säurederivat, z. B. eine Stearoylgruppe, ein langkettiger Alkohol oder eine Aminkette als langkettige diffusionsbeständige Gruppe gebunden, oder wird eine aromatische Verbindung, z. B. eine 2,4-Di-tert.-butylphenoxygruppe eingeführt, um diese diffusionsbeständig zu machen. Pigmente können durch Insolubilisieren bzw. Unlöslichmachen diffusionsbeständig gemacht werden.

Alternativ kann die-chromogene Verbindung diffusionsbeständig gemacht werden durch ihre chemische oder

poröse

physikalische Adsorption an^oberflächenaktiven Verbindungen, wie Siliziumidoxidgel und Aluminiumoxid. Alternativ kann die chromogene Verbindung diffusionsbeständig gemacht werden durch chemische oder physikalische Adsorption"an polymeren Verbindungen, oder durch Einschluß in Polymer-Matrices.

Beispiele für die farbstoffbildenden_r reaktiven Gruppen sind im folgenden angegeben:

Der Ausdruck "5-Pyrazolon" der in den folgenden Beispielen verwendet wird, bedeutet ^1I2-Pyrazolin-5-on".

4,6-Bis-C8-hydroxy-3,6-disulfo-1-naphthylamino)-striazin-2—yl-gruppe,

^—Anilino-ö-(8-hydroxy-3,6-disulfo-1-naphthylamino)-striazin-2-yl-gruppe,

^-Chlor-ö-(8-hydroxy-3,6-disulfo-1-naphthylamino)-striazin-2-yl-gruppe,
4-Chlor-6-(i-p-sulfophenyl-5-pyi'azolon-3-ylamiho)-striazin-2-yl-gruppe,

4,5-Dichlor-6-(8-hydroxy-3-sulfo-1-naphthylamino)-2-

pyridyl-gruppe, .

4-Chlor~6- C3- (1 ~m-sulf ophenyl-5-pyrazolon-3-ylamino .)-anilino]-s-triazin-2-yl-gruppe,

4-m-Sulfοanilino-6-(2-hydroxy-5-chloranilino)-s-triazin-

♦ *; η

4— (8-Hydröxy-3,6-disulf o-1-naphthylamine ) -6- (1 -phenyl-5-pyrazolon-3-ylamino)-s-triazin-2-yl-gruppe, 4— Lß-(N-Ätliyl-4-triclilormet]aylanilino)-äth.oxy]-6-(8-hydroxy-3*6-disulfo-1-naphthylamine)-s-triazin-2-y1-gruppe,

4-p-Sulfoanilino-6-(3-p-sulfophenyl-4-,4-dichlor-5-pyrazolon-3-ylamino)-s-triaz in-2-yl-gruppe.

Die gleichen. Gruppen wie vorstellend aufgeführt, wobei jedoch die Sulfogruppe durch eine SuIfonatgruppe (-SO^ ) ersetzt ist, an die ein Alkalimetallkation (z. B. Li^, Na® und Ε^φ) als Gegenion gebunden ist.

Gruppen, die aus der Bindung von Chloranionen als Gegenionen'an eine (1,3»3-^i'i^methyl-6-p-formylphenyl-6-azoniaoctyl)-oxy-gruppe, resultieren.

Beispiele für chromogene Verbindungen, die verwendet werden können sind im folgenden aufgeführt: 2-Tetradecyloxy-5-sulfonatbenzoldiazonium, 5-(N-0ctadecylsulfamoyl)-2-metho3fybenzoldiazoniumtetrafluorborat,

5-(li-0ctylsulfamoyl)-2-methoxybenzoldiazonium-1-naphthalinsulf onat,

2-Dod ecylO2cy-4--nitr ob enz ο ldiaz oniumt e tr af luorborat, 5-Tetradecyloxycarbonyl-2-methoxybenzoldiazoniumteträfluorborat,

9 »10-Anthrachinon~1-diazonium-2-naphthalinsulfonat, 2-Methyl-3~"bstradecylbenzothiazoliumperchlorat, 5-Dodecyloxycarbonyl-2,3 -> 3-trimethyl-1- (Γ-sulf onatpropyl)-indolenium,
1-(2,4—Di-tert.-amylphenoxy)-2-οχο-δ-(4-amino-2-methylphenyl)-3»6-diazaoctan.

Lichtdurchlässige wasserundurchlässige Träger, die "bei der Herstellung der mentschichtigen chemischen Analysenelemente gemäß der Erfindung verwendet werden können, umfassen Kunststoff-Filme, wie Polyethylenterephthalat, Celluloseester (z. B. Cellulosediacetat, Cellulosetriacetat und Celluloseacetatpropionat), Polycarbonat und Polymethylmethacrylat und eine Glasplatte. Der lichtdurchlässige wasserundurchlässige Träger ist durchsichtig und weist eine Dicke von etwa 50yum "bis etwa 2 mm auf. Wenn der Träger hydrophil ist und seine Adhäsion an das hydrophile Bindemittel der Reagensschicht unzureichend ist, können bekannte Hilfsbehandlungen hieran ausgeführt werden. Derartige Hilfsbehandlungen umfassen eine Behandlung die Oberfläche des Trägers hydrophil zu machen (z. B. Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen, Bestrahlung mit Elektronenstrahlen, Plammenbehandlung und Hydrolyse durch Alkalis), eine Behandlung um eine Unterüberzugsschicht aufzutragen, hergestellt aus einer Substanz mit einer geeigneten Adhäsion sowohl an dem Träger als auch an dem hydrophilen Bindemittel der Reagensschicht an der Oberfläche des Trägers, und eine Behandlung zur Bildung feiner Unregelmäßigkeiten an der Oberfläche, des Trägers bis zu einem derartigen Ausmaß, daß die Lichtdurchlässigkeit nicht wesentlich verringert wird (z. B. Bürsten und elektrolytisches Ätzen).

Das erfindungsgemäße mehrschichtige chemische Analysenelement kann gegebenenfalls zusätzlich zu dem Träger und der Reagensschicht andere funktionelle Gruppen enthalten, die darauf aufgeschichtet sind., beispielsweise zur Verhinderung der Diffusion, zur gleichmäßigen Verteilung einer Probe, zur Blockierung von Strahlung, zur Adhäsion und dergleichen.

Die Funktion der die Diffusion verhindernden Schicht liegt darin, die Diffusion des nicht-diffundierbaren

Substrats in eine andere Schicht vor der Einwirkung des Analysats völlig zu verhindern, jedoch die Diffusion des nunmehr diffundierbar gemachten Reaktionsprodukts (d. h. der diffundierbaren Verbindung) nicht zu verhindern. Es versteht sich, daß sie zur Verhinderung der Diffusion der chromogenen Verbindung in der farbbildenden Reaktionsschicht in die Substratschicht dient. Die die Diffusion verhindernde Schicht besteht aus einem hydrophilen Bindemittel, wie im Falle der Substratschicht. Das heißt, daß hydrophile Bindemittelpolymere, wie sie vorstehend im Zusammenhang mit der Substratschicht beschrieben wurden, verwendet werden können. Von derartigen hydrophilen Bindemittelpolymeren sind.Gelatine und Polyvinylalkohol besonders geeignet. Sie haben Charakteristika, die geeignet sind, den Unterschied der Diffusionsfähigkeit zwischen dem nicht-diffundierbaren Substrat und. dem Reaktionsprodukt (d. h. der diffundierbaren Verbindung) unterscheidbar zu machen.

Die die Diffusion verhindernde Schicht kann verschiedene Zusätze enthalten, wie vorstehend in Verbindung mit der Substratschicht beschrieben.

Als eine die wäßrige flüssige Probe verteilende Schicht (im folgenden als "Verteilungsschicht" bezeichnet) zur Anwendung in dem erfindungsgemäßen mehrschichtigen chemischen Anälysenelement können hydrophil gemachte Stoffe bzw. Gewebe sowie nicht-faserige isotrop-poröse Materialien verwendet werden, wie sie in der vorstehend genannten Patentliteratur und Literatur beschrieben werden.

Nicht-faserförmige isotrop-poröse Materialien umfassen ³^ Bürsten-Polymere bzw. "Brush-Polymere" (im allgemeinen als "Membranfilter" bezeichnet), Materialien, die hergestellt wurden durch gleichmäßiges Dispergieren von feinen, porösen Substanzen, wie Diatomeenerde und

feinen kristallinen Materialien (z. B. feiner kristalliner Cellulose) in einem Bindemittel, poröse Materialien, hergestellt durch Halten von feinen sphärischen Perlen aus Glas oder einer synthetischen polymeren Substanz in punktförmigem Kontakt miteinander unter Anwendung eines Bindemittels, und Bürsten-bzw. "Brush-Polymere", in denen feine Pulver von TiO- oder BaSO^ oder derglei— chen gleichmäßig dispergiert sind. Stoffe "bzw. Gewebe, die hydrophil gemacht wurden, umfassen einen Stoff, der durch Waschen mit Wasser und Trocknen völlig entfettet wurde und einen Stoff,_:.der durch Waschen mit Wasser völlig entfettet wurde und anschließend mit einer geringen Menge eines oberflächenaktiven Mittels, eines Benetzungsmittels, eines hydrophilen Polymeren oder eines hydrophilen Polymeren mit feinem Pulver von TiOg oder BaSO. darin dispergiert, imprägniert wurde. Einzelheiten bezüglich der Technik zur Anwendung derartiger Stoffe, die hydrophil gemacht wurden, als eine Verteilerschicht und die Stoffe sind in der JA-Pat ent a ητη eldung Ur. 7204-7/79 (entsprechend der GB-PS 2 052 057 A). beschrie-· ben. Derartige Techniken und Stoffe können bei der Durchführung der Erfindung verwendet werden.

Besteht die Verteilungsschicht aus einem nicht-faserförmigen isotrop-porösen Material, so liegt seine Dicke im Bereich zwischen etwa 50 um und 500 tun, vorzugsweise zwischen etwa 90 um und 500 um. Falls die Stoffe hydrophil gemacht wurden, weist der Stoff, der hydrophil gemacht wurde, und trocknengelassen wurde, eine Dicke von etwa 80yum bis 1 mm, vorzugsweise von etwa 100 Aim bis etwa 400 um auf.

Eine Verteilungsschicht, die aus einem nicht-faserförmigen isotrop-porösen Material bereitet wurde, kann nach einer Methode hergestellt werden, bei der eine Lösung

oder eine Dispersion, die geeignet ist zur Bildung einer nicht-faserigen isotrop-porösen Schicht, auf die Reagensschicht aufgeschichtet und getrocknet werden. Nach einer anderen Methode wird ein nicht-faserförmiges isotropporöses Material in einer dünnen Schicht auf die Reagensschicht geklebt. Diese Methoden sind in den JA-OSn Nr. 53888/74 und 137192/75 beschrieben. Eine Verteilungsschicht aus einem hydrophil gemachten Stoff kann durch Kleben des Stoffs auf die Reagensschicht hergestellt werden.

Beim Kleben des nicht-faserförmigen isotrop-porösen Materials oder hydrophil gemachten Stoffs auf die Reagensschicht während die Reagensschicht noch naß ist oder nachdem die Oberfläche des trockenen Reagens mit Wasser oder Wasser, das ein oberflächenaktives Mittel enthält, naß gemacht wurde, werden das nicht-faserförmige isotrop-poröse Material oder der hydrophil gemachte Stoff in engen Kontakt mit der Reagens schicht gebracht und 'falls notwendig unter Anwendung eines geeigneten Drucks gebunden. Andere Methoden, die zum Kleben des nichtfaserförmigen isotrop-porösen Materials oder des hydrophil gemachten Stoffs auf die Reagensschicht verwendet werden können, umfassen ein Verfahren, bei dem ein Klebstoff, der dazu geeignet ist, eine wäßrige flüssige Probe durchzulassen, verwendet wird, und ein Verfahren, bei dem eine Klebstoffschicht, die geeignet ist, eine wäßrige flüssige Probe durchzulassen, wie nachstehend beschrieben, auf der Reagensschicht ausgebildet wird.

In dem erfindungsgemäßen mehrschichtigen chemischen Analysenelement kann, falls nötig, die Diffusion verhindernde Schicht ausgebildet werden. Außerdem kann eine Strahlungsblockierende oder lichtreflektierende Schicht zwischen der Substratschicht und der farbbildenden Reaktionsschicht vorgesehen sein. Um die Verteilungsschicht

fest zu kleben, kann eine Klebstoffschicht, die geeignet ist, eine wäßrige flüssige Probe durchzulassen* zwischen der Verteilungsschicht und der Reagensschicht vorgesehen sein oder zwischen der Verteilungsschicht und der die Strahlung blockierenden oder Licht reflektierenden Schicht. Diese die Strahlung blockierende Schicht, die Licht reflektierende Schicht und die Klebstoffschicht werden in der vorstehenden Patentliteratur beschrieben und sie können bei der·Durchführung der Erfindung verwendet werden. .

Eine geeignete die Strahlung blockierende Schicht oder Licht reflektierende Schicht kann bestehen aus: (i) · einer Schicht aus einem, hydrophilen Bindemittel mit weißem, feinem Pulver von"Ii-(^» BaSO^ oder gleichen darin dispergiert, mit einer Dicke von etwa 1 ;um bis etwa 50yUm und vorzugsweise von etwa 2 yum bis etwa 20yum,

(2) einer Schicht aus einem hydrophilen Bindemittelpolymeren mit feinem Pulver eines Metalls mit weißem oder blaßmetallischem Glanz, wie Aluminium, darin dispergiert, und mit einer Dicke von etwa 2 um bis etwa ^Q xm und vorzugsweise von etwa 2 um bis etwa 20/im, oder (3) einer porösen, metallischen, dünnen Schicht, die geeignet ist eine wäßrige flüssige .Probe durchzulassen, die aus einem weißen oder blaßen bzw. matten Metall wie Alu-. minium besteht und die eine Dicke von etwa 5 nm bis etwa 100 nm und vorzugsweise von etwa 5m bis etwa 50 nm aufweist.

Die Klebstoffschicht kann hergestellt werden durch Bereiten einer Schicht aus einem Polymeren des gleichen Typs wie das hydrophile Polymere, das geeignet ist, eine wäßrige flüssige Probe durchzulassen, das als ein Bindemittel in der Eeagensschicht, in der die Strahlung blockierenden Schicht oder der Licht reflektierenden Schicht verwendet wird und weist eine Dicke im Bereich zwischen

1 4»·»

etwa 0,5/um und etwa 10 um und vorzugsweise zwischen etwa 0,7 /UD- und etwa 5 /u& auf.

Beim Kleben der Klebstoffschicht aus dem hydrophilen Polymeren auf die Verteilungsschicht, wird eine wäßrige hydrophile Polymerlösung auf die Reagensschicht, die die Strahlung blockierende Schicht oder die Licht reflektierende Schicht aufgeschichtet und während die so gebildete hydrophile Polymerschicht noch naß ist oder nachdem die hydrophile Polymerschicht getrocknet wurde und mit Wasser oder Wasser, das ein oberflächenaktives Mittel enthält, an der Oberfläche naß gemacht wurde, wird das nicht-faserige isotrop-poröse Material oder der Stoff, der hydrophil gemacht wurde, in Kontakt gebracht mit der Oberfläche der hydrophilen Polymerschicht und daran gleichmäßig durch Anwendung eines geeigneten Drucks gebunden. Alternativ kann eine Lösung oder Dispersion, die geeignet ist zur Bildung einer nicht-faserigen isotrop-porösen Schicht auf die Klebstoffschicht aufgetragen werden zur Bildung eines mehrschichtigen chemischen Analysenelements, in dem eine Verteilungsschicht fest gebunden ist.

Im folgenden wird das mehrschichtige chemische Analysenelement gemäß der Erfindung genauer unter Bezugnahme auf die Messung der Amylaseaktivität beschrieben.

Ein mehrschichtiges chemisches Analysenelement zur Anwendung bei der Analyse von Amylase, das eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Elements darstellt, weist eine Substratschicht auf, die aus einem nicht-diffundierbaren Substrat besteht. Das Substrat wird hergestellt durch Binden einer farbstoffbildenden reaktiven Gruppe an eine Verbindung, die eine Amylosebindung enthält, d. h. ein Substrat von Amylase, wie Stärke. Das Element enthält auch ein hydrophiles Bindemittel, eine die Diffusion

verhindernde Schicht und eine farbbildende Reaktionsschicht, hergestellt aus einer chromogenen Verbindung, die geeignet ist durch Reaktion mit der farbstoffbildenden reaktiven Gruppe, die an das Substrat gebunden ist einen Farbstoff zu bilden, und ein hydrophiles Bindemittel wird auf einen transparenten Kunststoff-Film aufgeschichtet.

Die Diffusion von Stärkemolekülen in die farbbildende Reaktionsschicht vor der Reaktion erfolgt nicht, da das Stärkemolekül sehr groß' ist und nicht diffusionsfähig ist. Daher werden die farbstoffbildende reaktionsfähige Gruppe und die chromogene Verbindung in einem Zustand gehalten, in dem sie voneinander isoliert sind und das . mehrschichtige chemische Analysenelement ist im wesentlichen farblos.

Wird eine Probe, d. h. eine wäßrige Lösung, die ein Amylase-Analysat enthält, auf die Verteilungsschicht aufgebracht, so diffundiert die Amylase und dringt in die Substratschicht zusammen mit dem wäßrigen Medium ein. In der Substratschicht wird das Stärkemolekül in zwei Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht durch die hydrolytische Wirkung der Amylase aufgespalten, wodurch deren Diffusionsfähigkeit in die Schicht vergrößert wird. Auf diese Weise diffundiert das Oligosaccharid mit der daran gebundenen farbstoffbildenden reaktiven Gruppe

(d. h. die diffundierbare Verbindung)_t das so gebildet wurde, in die farbbildende Reaktionsschicht, wo es eine Kupplungsreaktion mit der chromogenen Verbindung unter Bildung eines Farbstoffs eingeht.

Die Aktivität der Amylase ist proportional zu dem Hydrolyseausmaß bzw. der Hydrolysegeschwindigkeit der Stärke und das Ausmaß bzw. die Geschwindigkeit der Farbstoffbildung ist proportional zur Menge des Oligosaccharids

α Ρ

mit der daran gebundenen farbstoffbildenden reaktiven Gruppe, das in die farbbildende Reaktionsschicht diffundiert. Daher kann durch, optische Messung der in einem . vorbestimmten Zeitraum gebildeten Menge des Farbstoffs die .Aktivität der Amylase bestimmt werden.

Bei der Verwendung des erfindungsgemäßen mehrschichtigen chemischen Analysenelements wird, wie aus der vorstehenden Erläuterung ersichtlich, das Ausmaß bzw. die Geschwindigkeit der farbstoffbildenden Reaktion gemessen und unter Bezugnahme auf ein Eichdiagramm, das unter Verwendung einer bekannten Amylasemenge' hergestellt wurde, wird die Aktivität der Amylase bestimmt.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren ist das mehrschichtige chemische Analysenelement vor dem Auftrag des Analysats fast farblos und der Vert der optischen Dichte, der durch Messung nach der Reaktion erzielt wird, ist proportional zur Menge des durch die enzymatisch^ Reaktion gebildeten Farbstoffs. Diese Methode erfordert daher keine völlige Trennung des nicht umgesetzten Substrats von einem umgesetzten Substrat bei einer optischen Messung, wie dies bei der bekannten Blau-Stärke-Methode und der Trocken-Analysen-Methode, wie in der JA-OS Nr. 131089/78 beschrieben, notwendig war, wo ein Farbstoffsubstrat, das durch Binden eines Farbstoffs an Stärke hergestellt wurde, was ähnlich blauer Stärke ist, verwendet wird.

Beispielsweise sind bei der Lehre der JA-OS Nr. 131089/. 78 die optischen Charakteristika vor und nach der Reaktion völlig oder fast gleich. Es ist daher nicht nur notwendig, die Schichten durch Ausnutzung der Diffusions-Xähigkeit zu trennen, sondern es ist auch wesentlich, eine die Strahlung blockierende Schicht zwischen eine Substratschicht, die ein nicht-diffundierbares

S.S I \* \S

Farbstoffsubstrat enthält und eine Bestimmungsschicht, die ein polymeres Beizmittel enthält, zur optischen Bestimmung, die beiden Schichten völlig zu trennen. Darüber hinaus ist es für diese Hethode wesentlich, eine Messung des ReflexionsIichts von der Bestimmungsschicht-Seite her durchzuführen. Dagegen kann mit dem erfindungsgemäßen mehrschichtigen chemischen Analysen-■ ίο element die Messung durchgeführt werden unter Verwendung des transmittierten Lichts, ohne Anwendung der strahlungsblockierenden Schicht. Es ist so ersichtlich, daß das erfindungsgemäße chemis-che Analysenelemtn für quantitative Analysen besser geeignet ist.

Da das erfindungsgemäße mehrschichtige chemische Analysenelement eine farbstoffbildende Reaktion ausnützt,'ist es nötig, daß vor der Reaktion durch Einwirken des Analysats das nicht-diffundierbare Substrat, das die farbstoffbildende reaktive Gruppe enthält und die chromogene Verbindung in einem Zustand gehalten werden, in dem sie völlig voneinander isoliert sind. So lange dieses Erfordernis erfüllt wird, müssen das nicht-diffundierbare Substrat und die chromogene Verbindung nicht in verschiedenen Schichten enthalten sein und sie können in derselben Überzugsschicht.vorliegen. Wichtig ist, daß das nicht-diffundierbare Substrat und die chromogene Verbindung in einem völlig isolierten Zustand gehalten werden. Um einen derartigen Zustand einzuhalten, ist es erforderlich, daß nicht nur Substrat per se nichtdiffundierbar ist, sondern daß auch die chromogene Verbindung per se nicht-diffundierbar ist. Es können verschiedene bekannte Methoden und Prinzipien verwendet werden, um die chromogene Verbindung nicht-diffundierbar

zu halten. ·

Eine Technik, die sehr wirksam ist, eine chromogene Verbindung diffusionsbeständig zu machen, besteht darin,. zuerst die chromogene Verbindung in einem hydrophoben öl zu lösen. Es ist auch möglich, lokal Teilchen einzuführen und sie anschließend in einem hydrophilen Bindemittel in diesem Zustand zu dispergieren. Ein Verfahren zur Herstellung derartiger Teilchen und Einzelheiten, die zu dessen Durchführung benötigt werden, sind in der JA-Patentanmeldung Nr. 83608/79 (entsprechend der US-Patentanmeldung S.W. 165 444 vom 2. 7. 1980) beschrieben. Selbstverständlich können verschiedene Techniken, die auf dem Gebiet der fotografischen Wissenschaft bzw. Technik bekannt sind, verwendet werden. Die Hauptcharakteristika, die für hydrophobe Lösungsmittel erforderlich sind, die als Lösungsmittel für das Chromogen verwendet werden, sind im folgenden aufgeführt: (1) ein hoher Siedepunkt; (2) sie können in einem hydrophilen Bindemittel in einem stabilen Dispersionszustand vorhanden sein; (J) sie sind hydrophob; und (4) sie haben die Fähigkeit, nicht nur die chromogene Verbindung aufzulösen, sondern auch den gebildeten Farbstoff, oder haben sie eine hohe Affinität dafür.

Beispiele für derartige Öle umfassen flüssige Weichmacher bzw. Plastifiziermittel wie Phthalsäureester (z. B. Dibutylphthalat, Dicyclohexylphthalat, Didodecylphthalat und Dioctylphthalat), Phosphorsäureester (z.B.

Triäthylphosphat, Tributylphosphat und Triphenylphosphat), Adipinsäureester (z. B. Diisodecyladipat und Dioctyladipat) und langkettige aliphatisch^ Säureamide (z. B. Ν,Ν-Diäthyldodecanamid, Ν,Ν-Diiaethyloctanamid und Ν,ΙΤ-Diäthylo.ctanamid). Außerdem können zur Verbesserung der · Löslichkeit oder Stabilität organische Lösungsmittel mit niedrigem oder hohem Siedepunkt (z. B. Toluol, Benzylalkohol, Äthylacetat, Butylacetat, Aceton, Methyläthylketon, Alky!naphthalin, Acetonitril und

Methylenchlorid), tierische öle, pflanzliche Öle, Mineralöle und dergleichen allein oder in vermischtem Zustand verwendet werden.

Der Durchmesser der feinen Teilchen des hydrophoben Öls, das die chromogene Verbindung enthält oder der feinen Teilchen, die die chromogene Verbindung enthalten, liegt im Bereich von etwa 0,1 urn bis etwa 30 yum und vorzugsweise von etwa 0,1 jam bis etwa 10 /um. Diese Teilchen können gleichmäßig emulgiert oder dispergiert in dem hydrophilen Bindemittel der Reagensschicht 60, wie in der i"ig. 5 dargestellt, sein. Wenn die Reagensschicht in die Substratschicht und die farbbildende Reaktionsschicht aufgeteilt ist, sind selbstverständlich feine Teilchen des hydrophoben Öls, das die chromogene Verbindung enthält oder feine Teilchen, die die chromogene Verbindung enthalten, in der farbbildenden Reaktionsschicht dispergiert.

Die farbbildende Reaktionsschicht, in der feine Teilchen des hydrophoben Öls, das die hydrophile chromogene Verbindung enthält, in dem hydrophilen Bindemittel dispergiert sind, ist"eine bevorzugte Ausführungsform der farbbildenden Reaktionsschicht zur Anwendung in dem erf indungsgemäßen mehrschichtigen chemischen Analysenelement. Insbesondere ist im Palle von Amylase als Analysat und falls das nicht-diffundierbare Substrat eine Stärke ist, die die farbstoffbildende reaktive Gruppe trägt, die in der Substratschicht durch Einwirkung der Amylase gebildete diffundierbare Verbindung ein Oligosaccharid, das eine farbstoffbildende reaktive Gruppe enthält. Das Oligosaccharid diffundiert leicht in das hydrophile Bindemittel aufgrund seiner hydrophilen Eigenschaften und erreicht die farbbildende Reaktionsschicht. Wenn das Oligosaccharid die farbbildende Reaktionsschicht erreicht, so gehen die farbstoffbildende

reaktive Gruppe, die darin enthalten ist, und die chromogene Verbindung in den feinen hydrophoben ölteilchen eine Kupplungsreaktion ein unter Bildung eines Farbstoffs. Daher nimmt die Konzentration des Oligosaccharide, das die farbstoffbildende reaktive Gruppe enthält, in der farbbildenden Reaktionsschicht plötzlich um das.feine hydrophobe Ölteilchen herum, das die chromogene Verbindung enthält, ab. Dies führt zu einer Verringerung der Konzentration des Oligosaccharide, das die farbstoff- . bildende reaktive Gruppe enthält in der farbbildenden Reaktionsschicht. Im Hinblick auf die Konzentration des Oligosaccharids, das die farbstoffbildende reaktive Gruppe enthält, besteht ein Konzentrationsgradient von der Substratschicht zu der farbbildenden Reaktionsschicht, Dieser Konzentrationsgradient beschleunigt immer die Diffusion des Oligosaccharids, das die farbstoffbildende reaktive Gruppe enthält von der Substratschicht zu der farbbildenden Reaktionsschicht. Die Geschwindigkeit bzw. das Ausmaß der farbstoffbildenden Reaktion ist daher groß, falls die Geschwindigkeit bzw. das Ausmaß der farbstoffbildenden Reaktion in der farbbildenden Reaktionsschicht nicht äußerst niedrig ist. Dies führt zu einem beträchtlichen Vorteil, da die zur Messung der Amylaseaktivität unter Verwendung des erfindungsgemäßen mehrschichtigen chemischen Analysenelements benötigte Zeit abgekürzt wird.

Darüber hinaus fällt durch Wahl der Kombination färbst off bildende reaktive Gruppe/chromogene Verbindung, derart, daß der in der farbbildenden Reaktionsschicht gebildete Farbstoff in Wasser, hydrophilem Bindemittel und hydrophobem Öl wenig löslich ist, der Farbstoff, der in der Nähe der Oberfläche der feinen hydrophoben Ölteilchen gebildet wurde, um die feinen hydrophoben Ölteilchen herum aus. Dies beschleunigt die chemische Reaktion, die den Farbstoff bildet in der Nähe der .

Oberfläche der feinen hydrophoben öltellchen» ohne eine Zunahme der Konzentration des Farbstoffs in den feinen hydrophoben ölteilchen zu bewirken. Somit wird hierdurch ein Vorteil erzielt, da die Geschwindigkeit bzw. das Ausmaß der Farbbildung groß ist. .

Außerdem wird durch Wahl der Kombination farbstoffbildende reaktive Gruppe/chromogene Verbindung» derart, daß der in der farbbildenden Reaktionsschicht'- gebildete !!farbstoff in dem hydrophoben Öl leicht löslich ist, der gebildete Farbstoff iin.Inneren der feinen Teilchen des hydrophoben Öls konzentriert. Diese Konzentration führt zu einer Zunahme der optischen Dichte des Farbstoffs in der farbbildenden Reaktionsschicht, wodurch die Änderung der optischen Dichte pro Aktivitätswert-Einheit vergrößert wird. So führt dies zu dem Vorteil, daß die Genauigkeit der quantitativen Analyse verbessert werden kann. 20

Die folgenden Herstellungsbeispiele und Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung.,

Herstellungsb e ispie1
25

(1) Synthese der farbstoffbildenden reaktiven Gruppe (reaktiver Kuppler): Herstellung des reaktiven Kupplers 2-[8-Hydroxy-3 ₅ 6-bis-(natriumsulfonato)-1-naphthylamine3-4-,6-dichlor-s-triazin aus Cyanursäurechlorid und I-Amino-8-hydroxynaphthalin-3,6-disulfonsäure (H-Säure)-mononatriumsalz (im folgenden als Η-Säure Ha-SaIz bezeichnet) nach der Methode von J. T. Thurtston et al., J. Amer. ehem. Soc, 73 (7), Seiten P.981-2983 (1951).

In 150 ml heißem Aceton wurden 36,9 g Cyanursäurechlorid gelöst und die resultierende Lösung wurde anschließend in 500 ml Eiswasser gegossen und darin unter Bildung einer Suspension suspendiert. Eine Lösung von 14-0 g

H-Säure Ha-SaIz und 16 g Natriumhydroxid in 500 ml Wasser wurde tropfenweise zu der vorstehend hergestellten Cyanursäurechloridsuspension, die "bei 0 bis 4· ⁰C gehalten wurde, gefügt. Anschließend wurden 250 ml 2n wäßrige Natriumhydroxidlösung zugetropft. Die resultierende Reaktionslösung wurde allmählich auf Raumtemperatur angehoben und wurde 1 Stunde bei dieser Temperatur gerührt.

Die Reaktionslösung wurde in 4 1 Aceton gegossen und die so gebildete Ausfällung wurde abfiltriert. Die so hergestellte Verbindung zeigte ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum, das sich von dem der Η-Säure unterscheidet. Hochgeschwindigkeits-iTüssigkeits-chromatografische Analyse zeigte, daß der reaktive Kupplergehalt 90 % oder mehr betrug.

(2) Synthese eines nicht-diffundierbaren Substrats, das eine farbstoffbildende reaktive Gruppe enthält (Kupplergebundene Stärke);

In 2 1 Wasser wurden 20 g Natriumhydroxid gelöst und 4-6 g Maisstärke wurden zugesetzt. Nach dem Rühren der resultierenden Lösung erhielt man eine durchsichtige Paste. Zu der durchsichtigen Paste wurden 12 g des in (1)

²^ hergestellten reaktiven Kupplers gefügt und das resultierende Gemisch wurde 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach, dem Neutralisieren der resultierenden Reaktionslösung mit verdünnter·Chlorwasserstoffsaure wurden 1,5 1 Aceton zu der Reaktionslösung gefügt, um die Stärke auszufällen. Die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert und anschließend wurde in 2 1 destilliertem Wasser gelöst. Nach dem Auflösen wurde 5 g Natriumchlorid zugesetzt und es wurde unter Verwendung von 1,5 1 Aceton eine erneute Ausfällung gebildet. Diese Verfahrensweise wurde dreimal wiederholt, um Ausgangsmaterialien und Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen.

Die so hergestellte Ausfällung war eine Kuppler-gebundene Stärke und die Ausfällung wurde gefriergetrocknet. Wurde die Kuppler-gebundene Stärke mit Wasser gequollen und anschließend unter Anwendung eines Dispersionsmischers fein suspendiert, so wurde sie leicht in Wasser gelöst. Darüber hinaus war die kupplergebundene Stärke gleichmäßig löslich in einer 1 % wäßrigen Lösung von Uatriumhydroxid und ihr Absorptionsspektrum stimmte mit dem des vorstehenden reaktiven Kupplers überein.

Unter Wiederholung der gleichen Arbeitsweise wie vorstehend beschrieben, wobei jedoch die Menge des zugeführten reaktiven Kupplers geändert wurde, konnte Kuppler— gebundene Stärke hergestellt werden, in die der reaktive Kuppler in verschiedenen Anteilen eingeführt war, d. h. das Verhältnis der Anzahl der reaktiven Kupplermoleküle zur Anzahl der Glucoseeinheiten wurde im Bereich von 1:18 und 1:50 variiert.

Zur Bestimmung der Enzymaktivität der so hergestellten kupplergebundenen Stärke wurde die Farbdichte nach einer Methode gemessen, die ähnlich der unter Anwendung der Farbstoff-gebundenen Stärke war: Dyamyl-L (Handelsbezeichnung), handelsüblich für die Analyse von Amylase.

Ein Gemisch von 460 mg Kuppler-gebundene Stärke, 140 mg Kaliumphosphat und 176 mg Kaliumdihydrogenphosphat wurde in 25 ml destilliertem Wasser gelöst unter Bereitstellung einer Lösung von Kuppler-gebundene Stärke*

Eine farbbildende Lösung wurde hergestellt durch Auflösen von 3500 mg i'ast lied JB-üalz 01-37125 (Diazonium-" Salzgehalt etwa 20 %) in 5 g destilliertem Wasser.

Eine Amylaselösung wurde hergestellt durch Verdünnen von Speichel mit einer wäßrigen Lösung enthaltend 0,9 %

Natriumchlorid und 7 % Albumin, die als 200 Somogyi-Einheiten/dl bestimmt wurde.

(3) Verfahrensweise

1 ml der Kuppler-gebundene Stärke wurde gewogen und jeweils in Teströhrchen A und B eingefüllt. In die Teströhrchen G und D wurden jeweils 1 ml Farbstoff-gebundene Stärkelösung von Dyamyl-L eingefüllt. Jedes Teströhrchen wurde einer Präinkubation während 3 Minuten bei 37 ⁰C unterzogen. Bei jeder Untersuchung wurden in die Röhrchen A und C 100 ul Amylaselösung eingeführt und in jedes Teströhrchen B und D 100 ixl einer wäßrigen Lösung, die 0,9 °/° Natriumchlorid und 7 % Albumin enthielt.

Anschließend wurde jedes Teströhrchen einer 10-minütigen Inkubation bei 37 ⁰C unterzogen und 4- ml Dyamyl-L (Handelsprodukt)-Ausfällungsmittel wurden zugesetzt, um die enzymatisch^ Reaktion zu beenden.

Anschließend wurden zu jedem Teströhrchen A und B 100 ul einer farbbildenden Lösung des vorstehenden Diazoniumsalzes zur Bewirkung einer Farbbildung gefügt.

Alle Teströhrchen wurden einer Zentrifugenabscheidung bei 3000 Upm während 10 Minuten unterzogen. Die überstehenden Flüssigkeiten in den Teströhrchen A und B wurden auf ihre optische Dichte gemessen unter Anwendung von Licht mit einer Wellenlänge von 530 nm und die überstehenden Flüssigkeiten der Teströhrchen C und D unter Anwendung von Licht mit einer Wellenlänge von 54-0 nm.

Die Ergebnisse sind nachstehend aufgeführt. 35

\J I \J \J L·. I KJ

Unterschied der optischen Dichte

Kuppler-gebundene

Stärke 0,550

0,076

0,454

Unterschied der optischen Dichte

Dyamyl-L

0,507

0,067

0,440

Unter Verwendung der kupplergebundenen Stärke, in der das Verhältnis der reaktiven Kupplergruppe zu der GIu-■ coseeinheit variiert wurde, wurde die gleiche Untersuchung wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Die optische Dichte der überstehenden Flüssigkeit entsprechend der des Teströhrchens A variierte über einen weiten Bereich von 0,23 bis 1,9.

So ist ersichtlich, daß die Amylase normal auf den Stärkekuppler einwirkt.

Beispiel 1

Auf eine farblose transparente Polyäthylenterephthalat (PET)-Polie (Dicke 180 um), die mit Gelatine unterbeschichtet worden war, wurden eine farbbildende Reaktionsschicht, eine die Diffusion verhinderne Schicht, eine Substratschicht und eine Verteilungsschicht in der genannten Reihenfolge aufgetragen, um ein mehrschichtiges chemisches Analysenelement herzustellen.

Diese»farbbildende Reaktionsschicht, die diffusionsverhindernde Schicht, die Substratschicht und die

Verteilungsschichit wurden wie folgt hergestellt.
ffarbbildende Reaktionsschicht

Lösung_A

2-Methoxy--5-tetradecylo2cycarbonyrbenzol-

diazoniumtetrafluoroborat 4,0 g

ΪΤ,Ν-Dimethylcaprylamid 5>0 g

Ν,Ν-Diäthyllaurylamid 1,0 g

Acetonitril 8,0 g

Dichlormethan 8,0 g

£ösung_B

Polyacrylamid (durchschnittlicher Polymerisationsgrad 18000; 5 % wäßrige
Losung) 140 g

Gelatine (10 % wäßrige Lösung) 50 g

p-Nonylphenoxyglyzerin (25 % wäßrige

Lösung) 2 g

Bis~(vinylsulfonylmethyl)-äther (1 %
Acetonitrillösung) 2 g

Die Lösung A, in der die Bestandteile gleichmäßig gelöst worden waren, wurde zur Lösung B gefügt, sorgfältig darin unter Anwendung eines Homogenisators dispergiert, mit einer kleinen BeSchichtungsvorrichtung aufgeschichtet und getrocknet unter Herstellung der farbbildenden Reaktionsschicht. Die Trockendicke der farbbildenden Ee akt ions schicht betrug 8 /um.

Wasser 50 ml

feines TiO₂-Pulver 80 g p-lTonylphenoxyglyzerin (25 % wäßrige

Lösung) 0,5 g

Die vorstellenden Bestandteile wurden sorgfältig unter Anwendung einer Pulverisiervorrichtung vom Kugelmühlentyp pulverisiert. Anschließend wurden 300 g einer 10 % wäßrigen Lösung von Gelatine zugefügt und es wurde leicht vermischt. Das resultierende Gemisch wurde anschließend auf die farbbildende Reaktionsschicht wie vorstehend beschrieben hergestellt, aufgeschichtet und getrocknet unter Herstellung der diffusionsverhindernden Schicht. Die Trockendicke der die Diffusion verhindernden Schicht betrüg 8 adb..

Kuppler-gebundene Stärke, hergestellt

im Herstellungsbeispiel 1 10 ^- g

Kaliumdihydrogenphosphat 2,6g

Kaliumphosphat 2,1 g

Wasser 105 g

Polyacrylamid (5 % wäßrige Lösung) 80 g p-Nonylphenoxyglyzerin (25 % wäßrige

Lösung) 2g

Die vorstehenden Bestandteile wurden voll dispergiert und gelöst unter Anwendung eines Homogenisators. Die resultierende Lösung wurde durch ein Uylon-ITetz geführt, um nicht-dispergierte Teilchen abzufiltrieren und sie wurde anschließend auf die die Diffusion verhindernde Schicht wie vorstehend hergestellt aufgeschichtet und zur Herstellung der Substratschicht getrocknet. Die Trockendicke der Substratschicht betrug 10 um.

Ein gemischtes Gewebe bzw. ein gemischter Stoff aus Polyester und Baumwolle (Mischverhältnis: Polyester/ Baumwolle = 75/25) wurde hydrophil gemacht durch Einweichen in eine wäßrige Lösung der folgenden lOrmulierung.

Polyacrylamid (mittlerer Polymerisationsgrad 18000; 0,8 % wäßrige Lösung) 150 g

p-Nonylphenoxyglyzerin (25 % wäßrige

Lösung) 1 g

Die Uberzugsoberflache der PET-Folie, auf der die farbbildende Reaktionsschicht, die die Diffusion verhindernde Schicht' und die Substratschicht aufgeschichtet waren, wurde mit einer 0,2 % wäßrigen Lösung von p-Honylphenoxyglyzerin naß gemacht. Anschließend wurde das gemischte Gewebe, das hydrophil gemacht worden war, auf die nasse tiberzugsoberflache aufgelegt, darauf gepreßt und getrocknet zur Herstellung der Yerteilungsschicht. Auf diese Weise erhielt man eine mehrschichtige chemische Analysenfolie zur Messung der Amylaseaktivität.

Das mehrschichtige chemische Analysenelement, das so hergestellt wurde, zeigte eine optische Farbdichte, die proportional der Amylaseaktivität von 30 bis 2000 Somogyi-Einheiten/dl in menschlichem Serum und menschlichem Blut war. So ist ersichtlich, daß das mehrschichtige chemische Analysenelement zur quantitativen Analyse der Amylaseaktivität verwendet werden kann.

Beispiel 2

In gleicher Weise wie in Beispiel 1 wurde eine farbbildende Reaktionsschicht auf einem PET-FiIm ausgebildet. Die Trockendicke der farbbildenden Reaktionsschicht betrug 15/um·

Gelatine (10 % wäßrige Lösung) 30 g

Polyacrylamid (5 % wäßrige Lösung) 70 g

Hbnylphenoxyglyzerin (25 % wäßrige Lösung) 500 mg

Das Gemisch wurde auf die farbbildende ßeaktionsschicht aufgeschichtet, so daß seine Dicke nach dem Trocknen 4- um betrug. ' " .

In gleicher Weise wie bei dem Herstellungsbeispiel 1 wurde eine Kuppler-gebundene Stärke hergestellt aus einer Stärke (Handelsprodukt TlPON), die aus 100 % Aminopectin bestand. Die so hergestellte Kupplergebundene Stärke wurde ,auf die die Diffusion verhindernde Schicht aufgetragen, so daß die Dicke nach dem Trocknen 10 im betrug. Auf diese Weise erhielt man eine mehrschichtige chemische Analysenfolie.

Eine überstehende flüssigkeit, erhalten durch Unterziehen von Speichel einer Zentrifugenabtrennung, wurde mit einer wäßrigen Lösung verdünnt, die 7 °/° Rinderserumalbumin und 0,9% Natriumchlorid enthielt, zur Bereitstellung von Amylaseproben-Iiösungen mit unterschiedlichen Amylasekonzentrationen; d. h. enthaltend 56, 120, 550, 1100 und 3500 Somogyi-Einheiten/dl Amylase.

Die mehrschichtige chemische Analysenfolie wurde auf eine warme Platte aufgesetzt, die bei einer Temperatur von 37 °C gehalten wurde und es wurden Jeweils 10-ul-Anteile der Amylaseprobelösung vorsichtig auf die Substr at schicht getropft. Nach 5 Minuten wurde ein mit 0,1 % Zinkchlorid imprägniertes Filterpapier in Kontakt mit der Substratschicht gebracht, um die Eeaktion zu beenden. Anschließend wurde die Farbdichte optisch gemessen. Die optischen Parbdichten (OD), proportional zu den Amylaseaktivitäten wurden wie folgt erzielt:

Somogyi-Einheiten/dl 56 120 550 1100 3500 OD 0,35 0,45 0,53 1,04 1,27

Die Beziehung zwischen dem .Amy-lasegehalt und den OD wurde unter Aufstellung einer Grafik aufgetragen. Diese grafische Darstellung zeigt, daß der Amylasegehalt unter Verwendung des mehrschichtigen chemischen Analysenelements gemessen werden kann.

Beispiel 3

In gleicher Weise wie in Beispiel 1 wurden eine farbbil- !5 dende Eeaktionsschicht, eine die Diffusion verhindernde Schicht und eine Substratschicht auf eine PET-Folie in der angegebenen Reihenfolge aufgetragen. Anschließend wurde ein Membranfilter: J¹UJi Microfilter FM-500 (Handelsbezeichnung) auf die Substratschicht als eine Verteilungsschicht in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, gepreßt, zur Herstellung einer mehrschichtigen chemischen Analysenfolie zur Analyse von Amylase.

Probelösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen an ²^ Amylase wurden hergestellt durch Verdünnen von Speichel mit einem Enzym-Standardserum, das handelsüblich ist, in gleicher Weise wie in Beispiel 2. Die Amylaseaktivität jeder Probe wurde mit einem handelsüblichen Meßreagens für die Amylaseaktivität, d. h. nach der Blau-Stärke-Methode der Pharmacia Diagnostics Corp., gemessen. Die Ainylaseaktivitäten der Probelösungen betrugen 36, 61, 136, 236, 530, 856, 1533 und 2964 Somogyi-Einheiten/dl.

Jede Probelösung wurde auf die Verteilungsschicht in einer Menge von 10 ul aufgebracht und wurde einer 10-

minütigem Inkubation bei 37 C unterzogen. Anschließe: wurde die optische Parbdichte gemessen. Es wurde

gefunden, daß die optischen ITarbdichten fast proportional zu den Amylaseaktivitäten waren. Die Ergebnisse sind nachstellend aufgeführt: .

Somogyi-Einheit/dl OD ..

36 0,30

61 0,35

136 0,4-3 ■

236 0,53

530- ■ 0,68

856 . ' 0,87

1533 ' 1,06

' 2964- 1,25

Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß die Amylaseaktivität unter Anwendung der mehrschichtigen chemischen Analysenfolie gemessen werden kann. "20

. Beispiel 4

Eine mehrschichtige chemische Analysenfolie wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, wobei jedoch eine Zusammensetzung mit der nachstehenden Formulierung durch Spinndüsenbeschichtung (Spinner-Beschichtung.) unter Bildung der farbbildenden Reaktionsschicht aufgeschichtet wurde.

2-Methoxy-5-tetradecyloxycarbonylbenzol-

diazoniumtetrafluoroborat 100 mg

Diacetylcellulose 100 mg

Methylenchlorid 5g

Eine Lösung, hergestellt durch Verdünnen von Speichel auf das 50-fache seines ursprünglichen Volumens wurde auf die mehrschichtige chemische Analysenfolie aufgebracht und einer "Inkubation während 30 Minuten bei

40 ⁰C unterzogen. Die optische Messung zeigte, daß wie im Falle des Beispiels 1, die optische Dichte proportional der Amylaseaktivität war.

Beispiel 5

Unter Verwendung von Kuppler-gebundener Stärke aus Maisstärke mit einer daran gebundenen 4—Cp-(ITatriumsulfonato)-anilino] -6-[ 3-p-(natriumsulf onato)-phenyl-4-,4-dibrom-2-pyrazolin-5-on-3-ylaminol-s-triazin-2-yl-gruppe bei der Herstellung einer Substratschicht und einer chromogenen Verbindung von 1-(2,4-Di-tert.-amylphenoxy)-2-oxo-6-(4-amino-2-methylphenyl)-3,6-diazaoctan bei der Herstellung einer farbbildenden Beaktionsschicht, wurde eine mehrschichtige chemische Analysenfolie zur quantitativen Analyse der Amylaseaktivität in gleicher Weise wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt. Die her— gestellte mehrschichtige Analysenfolie bildete eine Purpurfarbe fast proportional zur Amylaseaktivität. Dies zeigt deutlich, daß die mehrschichtige chemische Analysenfolie zur quantitativen Analyse der Amylaseaktivität verwendet werden kann.

Vorstehend wurden spezielle Ausführungsformen der Erfindung beschrieben, die jedoch keine Einschränkung darstellen sollen.

Leerseite

Claims (11)

1. GRÜNECKER, KINKELDEY, STOCKMAIR & PARTNER . ; : ."". , .PATENTANWÄLTE

   t «N BMENT ATTOKNEVS

   A. GRUNECKER. opl-imo DR. H. KINKELDEY. opling

   DR. W. STOCKMAIR, 0IPL-In(I-AEE-(CALTECH)

   DR. K. SCHUMANN. dipl.pmys

   P. H. JAKOB, DlPL-ING

   DR. G. BE2OLD. oipl-chem

   W. MEISTER, dipl-inö.

   H. HILGERS, opl-ing.

   DR. H. MEYER-PLATH. dipl-ins

   FUJI PHOTO FILM CO LTD eooo München ₂₂

   No. 210, Nakanuma, ·

   Minami Ashigara-shi, P 16 579

   Kanägawa,

   Japan 21. August 1981

   Mehrschichtiges chemisches Analysen-Element

   Pat ent ansprüche

   " 1.^Mehrschichtiges chemisches Analysen-Element enthaltend: einen lichtdurchlässigen, wasserundurchlässigen Träger; eine erste Reagensschicht, die auf dem Träger ausgebildet ist und eine farbbildende Eeaktionsschicht enthält, die eine chromogene Verbindung enthält, die geeignet ist zur Bildung'eines Farbstoffs durch Reaktion mit einer farbstoffbildenden reaktiven Gruppe; und eine zweite Reagensschicht, enthaltend eine Substratschicht, die ein nicht-diffundierbares Substrat enthält, das die farbstoffbildende reaktive Gruppe enthält, die im wesentlichen farblos ist und geeignet ist zur BiI-dung eines Farbstoffs durch Reaktion mit der chromoge- ^ nen Verbindung, und geeignet ist zur Bildung einer im V wesentlichen farblosen diffundierbaren Verbindung, die "-die farbstoffbildende reaktive Gruppe enthält, durch Einwirken eines Analysats bzw. eines zu analysierenden

   TELEX 03-28 300 TELEGRAMME MONAPAT* TELEFAX

   IJdY. IU
2. 2. Mehrschichtiges chemisches Analysenelement nach Anspruch 1, in dem die farbstoffbildende reaktive Gruppe in einem hydrophilen Bindemittel in Anwesen-" heit von Wasser diffundierbar ist.
3. 3· Kehrschichtiges chemisches Analysenelement nach Anspruch 1 oder 2, enthaltend darüber hinaus eine die Diffusion verhindernde Schicht, die zwischen der ersten Reagensschicht und der zweiten Reagensschicht angeordnet ist.
4. 4-, Mehrschichtiges chemisches Analysenelement nach Anspruch 1, 2 oder 3» enthaltend darüber hinaus eine Verteilungsschicht, die auf der zweiten Reagensschicht angeordnet ist. " ■
5. 5. Mehrschichtiges chemisches Analysenelement nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4-, enthaltend darüber hinaus eine die Strahlung blockierende Schicht, die zwischen der ersten Reagensschicht und der zweiten Reagensschicht angeordnet ist; und

   eine Verteilungsschicht, die auf der zweiten Reagens-.25 schicht angeordnet ist.
6. 6. Mehrschichtiges chemisches Analysenelement nach einem der Ansprüche 1-, 2, 3» 4- oder 5» in dem die zweite

   Reagens schicht eine Dicke von etwa 1 ^um bis etwa 30 /um aufweist.
7. 7· Mehrschichtiges chemisches Analysenelement nach Anspruch 6, in dem die Dicke im Bereich von etwa 2

   bis etwa 3OyUBi liegt.
   35
8. 8. Mehrschichtiges chemisches Analysenelement nach einem der Ansprüche 1, 2, 3₅ 4» 5» 6- oder 7» in dem die erste Reagens schicht ein.e Dicke von etwa 1 um bis etwa 50 um aufweist.
9. 9. Mehrschichtiges chemisches Analysenelement nach Anspruch 8, in dem die Dicke etwa 2yam bis etwa 30 um beträgt.
10. '10. Mehrschichtiges chemisches Analysenelement nach Anspruch 1 oder einem der Ansprüche 2 bis 9» in dem die erste Reagensschicht die farbbildende Reaktionsschicht ist.
11. 11. Mehrschichtiges chemisches Analysenelement nach

    Anspruch- .1 oder Anspruch 2 bis 10 > in dem die zweite Reagensschicht die Substratschicht ist. 20