JPS59145965A - ビリルビン定量用分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ビリルビン定量用分析要素に関するものであ
り、更に詳しくは、液体試料中のどリルビンを乾式にて
簡易、迅速かつ高精度に測定するために利用される分析
要素に関するものである。

生体液中のＪＩＩ４汁色素の主成分であるビリルビンは
、赤血球中のヘモグロビン由来のヘムの分解により血清
中で生成し、続いて肝臓に取り込まれた後グルクロン酸
包合体等となってｎＩ２社中に排泄される。血液中のビ
リルビンはヘモグロビン分解星の増加や旧臓機能の低下
により増加するため、ビリルビンの定量分析は臨床病理
学的診断に必須の検査用（１とされている。

血清中のビリルビンの定量しこは、ビリルビン固有の黄
色を吸光度測定により定量する方法およびＶａｎ　ｄｅ
ｎ　Ｂｅｒｇｈにより見い出されたエールリッヒ（Ｅｈ
ｒｌｉｃｈ）反応を応用したジアゾニウム化スルファ＝
ルｍ塩（Ｐ−スルホベンゼンジアゾニウム塩二−ルリン
ヒ試薬）とビリルビンとのカンプリング反応により形成
される赤色アゾビリルビンを比色定量する方法（一般に
「ジアゾ法」と呼ばれている）等が知られている。

なお、血清中のビリルビンの定量方法に関しては石井編
「臨床検査技術全書Ｊ第６＠、３３２〜３５０ページ、
医学占院（１９７５年発行）に詳しく記載されている。

ジアゾ法についてさらに詳しく以ドに述べる。

上述したヘムの分解により血清中に生成するビリルビン
はｔｆｔ＃ヒリルビンと呼ばれ、それ自身は疎水性であ
るが、血清アルブミン分子に吸着結′合されて血清中に
溶解している。一方、肝臓に到達した遊離ビリルビンは
、肝臓内にて酵素作用によりグルクロン酸と共有結合を
新たに形成してグルクロン酸に包合され、グルクロン酸
の親水性基の働きにより水溶性が高められたグルクロン
酸包合ビリルビンとなる。また、生成メカニズムについ
ては不明であるが、血清アルブミンと共有結合した水溶
性の高いビリルビン成分も知られている（Ｊ、　Ｊ、　
Ｌａｕｆｆ　ｅｔ　ａｌ、　：　Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ　２８（４）、　１１１２９−６３７
（＋９８２））。

このような各種ビリルビンのうち、水溶性の高い包合ビ
リルビンやアルブミン結合ビリルビンはジアゾニウム塩
と容易に反応して、直ちに比色定量されるので直接ビリ
ルビンと呼ばれる。一方、疎水性の高いＭ＃ビリルビン
は、カフェイン、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム
、タイフィリン（ｄｙｐｈｙｌｌｉｎｅ、　Ｃ，Ａ、　
Ｒｅｇｉｓｔｒｙ　Ｎｏ　［４７９−１８−５１）、尿
素、ノニオン界面活性剤、アラビヤゴム。

アルコール（例、メタノール、エタノール）、醇アミド
、スルホキシド等の反応促進剤を添加することによりカ
ップリング反応が促進され、アゾビリルビンとなる。

それ故、遊離ビリルビンの定量は通常、まず反応促進剤
を液体試料に加えて、比色定量法により総ビリルビン量
を求め、この測定値から反応促進剤を加えずに求めた直
接ビリルビン量を差し引くことにより間接的におこなわ
れる。そこで、遊離ビリルビンは間接ビリルビンとも呼
ばれる。

ジアゾ法によるビリルビン定量法は、下記の文献にも詳
しく述べられている。

Ｍ、　Ｍｉｃｈａｅｌｓｓｏｎ：　５ｃａｎ、　Ｊ、　
Ｃｌ１ｎ、　Ｌａｂ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　１３　（Ｓｕ
ｐｐｌ、）、　ｌ−８０（１９６１）；　Ｈ，Ｍａｌｌ
ｏｙ：　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｇｈｅｍ、、　１１８．４８１（１９３９
）　；　Ｚ、　Ｋ、　５ｈｉｈａｂｉｅｔ　ａｌ、　：
　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉ
ｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　４３（１０）、　１
００４〜１００７（＋９７７）　。

その後、ジアゾ法を用いるビリルビン分析に使用される
ジアゾニウム塩については、検出虻度、生成アゾビリル
ビンの安定性の改良が行なわれ、たとえば２，４−ジク
ロロフェニルジアゾニウム１′ＡＪ、２−クロロ−４−
ニトロフェニルジアゾニウム塩等のへロベンゼンジアゾ
ニウムＳｍ　、　ＫＬＩ　１ｈａｎｅｋやＥｒｔｈｉｎ
ｇｈａｎｓｅｎ等によって開発された安定化ジアンニウ
ム塩（対イオンによる安定化）等が一般的に利用される
ようになった。この間の進歩については、時分１招５４
−１２８４０号、特開１眉５５−４４９２号、特開昭５
６−１０２５５号、特開１１７１５６−１２５５５号、
特開昭５７−１０３０５６号等の公報を参照することが
できる。

以に述べたようにアナライト（分析対象となる物質）の
濃度に比例した着色物質の生成反応を進行させ、着色物
質の濃度を測定することによりアナライトの濃度を求め
る方法は、比色分析法としてよく知られた原理である。

この原理は湿式分析法だけでなく乾式分析法にも利用さ
れている。

ここで言う乾式分析法とは、紙または吸収性担体にアナ
ライトとの接触により呈色する試薬を含侵させた、いわ
ゆるｐＨ試験紙類似の形状をした乾式の分析用シートに
おいて比色分析をおこなう方法である。

乾式分析法として高精度の多層分析要素が知られている
。たとえば、特公昭５３−２１６７７号、！１￥聞昭５
０−１３７１９２号、特開昭５１−４０１９１弓、ｑ＋
開１１１１７５２−３４８８号、特開Ｆ眉５３−８９７
９６％、特開昭５３−１３１０８９号等の公報に記載さ
れている多層分析要素は、支持体Ｉ−に中層または複層
の試薬層、さらにこの上に非繊維質からなる多孔性展開
層が積層された構成をしている。

この多層分析要素では、液体試料を展開層上に点着する
ことにより、液体試才゛ｌは中位面積あたりほぼ・定量
を維持しながら、試薬層中に浸入し呈色度＋５を起すよ
うにされている。そして、　・定時間後にその呈色濃度
を測定することにより、液体試料中のアナライトの濃度
を知ることができる。

乾式が；によるビリルビン定量用の多層分析要素も既に
公知であり、試薬層にビリルビン検出指示薬としてジア
ゾニウム化スルファニル酸ｆＪＷ　（ｐ　−スルホベン
ゼンジアゾニウム塩）を含有させて呈色反応を発生させ
る方法が利用されている。

しかしながら、」−記のジアゾニウム塩は極性。

親水性が高いために、多層分析要素を用いて分析を実施
する際にいくつかの問題点が発生する。たｋえば、液体
試料の分析要素への点着に引き続く液体試料が試薬層内
部へ拡散する過程において、」−記のジアゾニウム塩が
いわゆるクロマト現象により不均一に分配され、生成し
呈色するアゾビリルビンの一様な分布を損う結果となる
。

さらに上記ジアゾニウム塩が、多層分析要素を製造する
際および保存中に層間で拡散するため、ビリルビンの測
定精度は時間の経過とともに低−ドし、分析要素の使用
可能な期間を短１ｉｉｓせる結果となる。

さらに詳しく説明すれば、多層分析要素において測定精
度を高めるために、光プロンキング層や等方的多孔性の
展開層を付設したり、ジアゾニウム塩を分析要素中で局
在させるなどの工夫がなされている。このような多層分
析要素の製造工程あるいは保存中において、試薬層に含
有させた上記のような低分子量のジアゾニウム塩は、そ
の低分子量に起因する泳動・拡散性のために光ブロッキ
ング層や展開層へ容易に拡散する傾向がある。このよう
な状態の多層分析要素にビリルビンを含んだ液体試料を
点着すると、光ブロンキング層や展開層中においてもア
ゾビリルビンが相当量生成するため、生成した全部のア
ゾビリルビンを反射光学濃度測定により定１１）するこ
とができなくなる。

すなわち測定値に負の誤差を生じる結果となる。

本発明者は、Ａ（η定精度の高いビリルビン分析用分析
要素の開発において、ビリルビン検出指示薬であるジア
ゾニウム塩を試薬層中に固定化することを検討し、本発
明に到達した。

本発明の第一・の目的は、液体試料中のビリルビンを簡
易、迅速、高精度に宏量できる分析要素を提供すること
にある。

本発明の第二の「］的は、分析要素の製造あるいは保存
中におけるジアゾニウム塩の拡散を防ぎ。

Ａ１１ｌ定値の誤差を著しく減少させることを可能にし
た難拡散性のジアゾニウム塩を含むビリルビン定量用分
析要素を提供することにある。

（記の目的は、液体試料中のビリルビンをジアゾ法によ
り定損する系を利用する分析要素において、アルコキシ
カルボニル基、アルキルアミノスルホニル基およびアル
キルアミノカルボニル基からなる群より選ばれる少なく
とも−・個の置換基がアリール基に付いている難拡散性
アリールシアツニウム塩がビリルビン検出指示薬として
含まれていることを特徴とするビリルビン定量用分析要
素からなる本発明により達成される。

次に本発明の詳細な説明する。

本発明における分析要素は、通常は、液体試料ｊ■（間
層、一層もしくは二層以」二の試薬層、および液体不透
過性・光透過性の支持体を含む多層構成からなる多層分
析要素の形態にあるものである。

］−記の構成において、液体試料展開層および支持体の
材料および構成は既に公知である。本発明において利用
する液体試料展開層および支持体の材料および構成につ
いては、公知技術に従って任意に選択することができる
。また所望により、光プロンキング層、遮蔽層、拡散防
止層、接着外付ケ１層などのような従来の多層分析要素
において知られている各種の層を設けることができる。

なお、本発明においては試薬層および液体試料展開層を
含む積層物が自己支持性の一体積層物である場合には、
試薬層および／または液体試料展開層に１−記の支持体
の機能を持たせることもＨｆ能である。また、液体試料
展開層は本発明の分析要素の構成にとって必須なもので
はない。

本発明の分析要素は、その内部にビリルビン検出指示薬
としてアリール基に特定の置換基を有する外拡散性（耐
拡散性）アリールジアゾニウム塩を含むものである。

本発明において利用されるアリールジアゾニウム塩は、
アルコキシカルボニル基、アルキルアミノスルホニル基
およびアルキルアミノカルボニル基からなる群より選ば
れる少なくとも−・個の置換ノルがアリール基に付いて
いるアリールジアゾニウム用であり、このアリールジア
ゾニウム塩には、更にアルキル基およびアルコキシ基か
らなる群より選ばれる少なくとも一個以上の置換基が含
まれていることが好ましい。

本発明で使用され得るアリールジアゾニウム塩の具体例
を次に示す。ただし、これらは本発明を限定するもので
はない。

１）　２−メトキシ−５−（テトラデシルオキシカルボ
ニル）ベンゼンジアゾニウム・テトラフルオロポレート ２）２−メトキシ−５−（テトラデシルオキシカルボニ
ル）ペンセンジアゾニウム俸へキサフルオロポレート ３）２−二トキシ−５−（ヘキサデシルオキシカルボニ
ル）ベンゼンジアゾニウム・テトラフルオロボレート ４）２−ドデシルオキシ−５−（エトキシカルボニル）
ベンゼンジアゾニウム・テトラフルオロボレート ５）２−メＩ・キシ−５−［β−（２′、４゛−ジ−ｔ
−アミルフェノキシ）エトギシ力ルボニル］ヘンセンジ
アソ゛ニウム拳テトラフルオロボレーｉ・ ６）２−メトキシ−５−（Ｎ−ヘキサデシルスルファモ
イル）ベンゼンジアゾニウム・テトラフルオロボレー！
・ ７）２−プロポキシ−５−（Ｎ−テＩ・ラブシルスルフ
ァモイル）ベンゼンジアゾニウム・ペルクロレート ８）２−才クチルオキシ−５−（Ｎ−デシルスルファモ
イル）ベンゼンジアゾニウム・ヘキサフルオロフォスフ
ェート ９）　３　、５−ビス（ドデシルオキシカルボニル）ベ
ンゼンジアゾニウム・テトラフルオロボレート１０）　
３　、　５−ビス（テトラデシルオキシカルボニルレー
ト ＩＩ）　２−メトキシ−５−（Ｎ−テトラデシルカルバ
モイル）ベンゼンジアゾニウム−　１−シレート１２）
２−メトキシ−５　−　［Ｎ−　（４．−　ｔ−アミル
フェノキシエチル）カルバモイル］ベンゼンジアゾニウ
ム・ｌ−ナフタレンスルフォネート１３）　４−ヘキサ
デシルオキシカルボニルベンゼンジアゾニウム １４）４−（Ｎ−ヘキサデシルスルファモイル）ベンゼ
ンジアゾニウム・テトラフルオロボレー１・＋５）　３
−ヘキサデシルオギシ力ルポニルベンセンジアツニウム
・テトラフルオロボレートＩｆ（）３−（Ｎ−テトラデ
シルカルバモイル）ベンゼンジアゾニウム−テトラフル
オロボレート１７）２−メチル−５−テトラデシルオキ
シカルボニルベンゼンジアゾニウム命テトラフルオロボ
レート ＋８）２−１’チル−５−デシルオキシ力ルボニルベン
ゼンジアツニウム・テＩ・ラフルオロボレーＩ・＋９）
ｌ−　（Ｎ−［γ−（２′，４゛−ジ−ｔ−アミルフェ
ノキシ）プロピル］カルバモイル）ベンゼンジアゾニウ
ム・テｉ・ラフルオロボレ−１・２０）４−［β−（２
′，４°−ジ−ｔ−アミルフェノキシ）エトキシ］カル
ポニルヘンセ゛ンジアツニウ１、・テトラフルオロボ１
／−１・Ｊｌ記のようなアリールジアゾニウム塩は通常
は分析要素の試薬層に含有される。

本発明の分析要素において用いられる試薬層の材才゛ｌ
および構成に特に制限はなく、公知技術に従って、アリ
ールジアゾニウム塩を含有する試薬層を形成することが
できる。

ただし、本発明における試薬層は、アナライトのビリル
ビンの拡散を容易にするために、多孔性試薬層であるこ
とが好ましく、この多孔性試薬層は、基本的に固体微粒
子と／ヘイングーから構成される多孔性構造体からなる
ものであることが特に好ましい。

］−記の固体微粒子とパインターから構成される多孔性
構造体とは、微結晶性セルロース、セルロース微粉末、
シリカ、ケイソウ−Ｌ等の二酸化ケイ素化合物の微粒子
、あるいは沸石等のケイ酸塩の微粒子、ポリマービーズ
等の多孔性微粒子または非孔性微粒子と、これらの微粒
子間を接着して多孔性連続空隙構造を保持するバインダ
ーからなるものである。

多孔性試薬層の構成に使用するバインダーとして、親水
性高分子化合物や親木性繰り返し単位を少なくとも２％
含有する高分子ラテックス粒子などを使用することがで
きる。

親水性高分子化合物の例として、スチレン−ｐ−スルホ
ン醇、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸誘導体、
アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−（スルホアル
キル）アクリルアミド、Ｎ−（スルホアルキル）メタク
リルアミド、Ｎ−アルキルアクリルアミド、Ｎ−アルキ
ルメタクリルアミド、Ｎ−（ヒドロキシアルキル）アク
リルアミ！・、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ヒニルイミ
タシール、ビニルアルコール、ヒドロキシエチルメタク
リレート　ヒドロキシエチルアクリルアミド等に由来チ
ーｃ′、り返し単位を有するホモポリマー、または−］
−記繰り返し単位と他のモノマーに由来する繰り返し中
位一種以−にとからなるコポリマーを挙げることができ
る。

また、１−記のバインターは、酸性ポリマーである−と
がＤｆまし、。

１種のビリルビンとジアツニウ１、塩との反逆、性は、
ビリルビー・の溶解性に著しく影響される。非包合性の
遊離ビリルビン（間接ビリルビン）は疎水性が高く水溶
性に劣るため、ジアゾニウム塩との反応速度が遅いのに
対し、包合性やアルブミン結合性ヒリルビンは水溶性が
高く、ジアゾニウム塩との反応速度は速い。従って、従
来のジアゾ法に基づくビリルビンの定量においては、各
種のビリルビンにおける］１記の反応速度の差を利用し
て、直接ビリルビン（包含およびタンパク結合性ビリル
ビン）と間接ビリルビン（′Ｍ＃ビリルビン）とをそれ
ぞれ定量することが行なわれている。

本発明の分析要素においても同様に、同じ原理に基づい
て直接ビリルビンと間接ビリルビンとをそれぞれ定量す
ることが可能である。

しかしながら、総ビリルビン量を定量したり。

また間接ビリルビンを短時間に測定するためには、−・
股に反応促進剤の添加が必要である。このような目的に
用いられる反応促進剤は各種の成書に記載されており公
知であり、その例としては、アルコール（例、メタノー
ル、エタノール等）、カフェイン、安息香酸ナトリウム
、酢酸ナトリウム、グイフィリン（７−（２，３−ジヒ
ドロキシプロピルテオフィリン［４７９−１８−５］　
）、原木、アラビアゴム、非イオン性界面活性剤、酸ア
ミド、スルホキシド等である。これらの促進剤を、必要
に応じて本発明の分析要素に添加することができる。

次に本発明の実施例と比較例を記載する。

［実施例１］ 本発明において規定されたアリールジアゾニウト塩のビ
リルビン検出試薬としての性能評価を溶液実験でおこな
った。

アリールジアゾニウム１１ゞ　の組 ２−メトキシ−５−（テトラデシルオ キシカルボニル）ベンゼンジアゾニ ウム・テトラフルオロボレー１・５００　ｍ　ｇアセト
ン　　　　　　　　　　　　　１’５ｍ文エタノール　
　　　　　　　　　　　４０ｍ交］二記のアリールジア
ゾニウム塩溶液２００　ｇｌを、１０％酢酸溶液２ｍ文
に溶解した各種コントロール血清１００ｇ文に加え、２
５°Ｃで１分間反応させ、光路長１０　ｍ　ｍのキュベ
ツト中にて波長５４０ｎｍの光学濃度を計測して、生成
したアゾヒリルビン量を測定した。

また、別に総ビリルビン濃度をアボット・ラボラドリー
ス看のＡＢＡ−２００で測定した。

結果を第１表に示す。

第１表 総ビリルビン濃度　　光学濃度 （ｍｇ／ｄｌ）　　　　　（５’４０ｒ＋＋ｎ　）ヒト
アルブミン溶液　　０　　　　　０．０６５モニトロー
ル　Ｉ　　　　１．８　　　　０．１１７（Ｄａｄｅ社
製） モニトロール］ｌ［４，３０，２０４ （Ｄａｄｅ社製） ヘパテスｌ−１０、６０、３９５ （第一製薬■製） パーサトールＰ　　　　、　ＩＢ、Ｂ　　　　　Ｏ，Ｈ
３（Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｄｉａ　ｎｏｓｔｉｃ社製第１表
のビリルビン濃度と光学濃度との関係をグラフとしたと
ころ、第１図に示すグラフが得られた。

５４０ｎｍの光学濃度とビリルビン濃度とが直線関係に
あることがわかる。

［比較例１］ 市販のビリルビン測定キントのジアンニウム塩（ジアソ
ニウム化スルファニル醇塩）溶液および実施例１のアリ
ールジアゾニウム塩溶液を各々２００川文取り、それぞ
れにｌＯ％酢酸溶液２ｍ文に溶解した各種コントロール
血清１００＃９．に加え、２５°Ｃで１分間反応させ、
光路長１０　ｍ　ｍのキュペア）中にて吸収スペクトル
を測定した。

得られた吸収スペクトルを第２図に示す。

７ｆｔ、２図に示した吸収スペクトルによれば、実施例
１のアリールジアゾニウム塩はジアノ法によるヒリルビ
ン測定の基準化合物であるジアンニウム化スルファニル
酸塩とほぼ同等の光学濃度を示し、そのビリルビン検出
能力は充分であることが判明した二また。基準化合物に
より生成するアラビリルビンの吸収極大が５２０ｎｍで
あるの番こ対して、実施例１のアリールジアゾニウム塩
により生成するアラビリルビンは、より長波長側の５２
０〜５５０ｎｍに１１】広い吸収極大を有しており、測
定Ｉ−有利であることもわかる。

［実施例２］ 実施例１に記載した本発明のアリールジアゾニウム塩溶
液５＋ｎＪＪをメチルビニルエーテル／無水マレイン酸
（モル比１：１）共重合体（１％メチルエチルケＩ・ン
溶液２５°Ｃにおける固有粘度［η］　１．０〜１．４
、商品名：　ＧＡＮＴＲＥＴＺＡＮ　　１３９、ＧＡＦ
社製）水溶液（５％）１０ｇに添加分散し、これに水１
００　ｍ　ｌを添加して含浸液とした。

次いで、木台浸液を、 工：セルロースアセテート製メンブランフィルタ−（１
ｔ−均ボアサイズ０．３ｇｍ；厚み１４０川ｍ）、およ
び ■゛癌紙厚み１０１００ｐＬ のそれぞれに約ｌｏｎｇ／ｒｎ’含浸させ、親水化処理
したプラスチック支持体上に放置して乾燥させ、ビリル
ビン定量用多層分析要素を得た。

各々の多層分析要素に室温で、市販の高ビリルヒン含有
コントロール血清（パーサト−ルＰ、およびオメカ高ヒ
リルビン）を１０川交点着し、３分後に発色した分析要
素の光学濃度を反射測光によりグリーンフィルターを通
して測定した。その結果を第２表に示す。

第２表 メンツランフィルター　　成紙 パーサト−ルＰ　　　Ｏ，５１０，４９オメカ　　　　
　　０．５２　　　　　０．５０（高ヒリルヒン） ［実施例３］ 実施例１に記載したアリールジアゾニウム塩溶液５　ｍ
　ｌをメチルビニルエーテル／無水マレイン醇（モル比
１：ｌ）共重合体（１％メチルエチルケトン溶液２５°
Ｃにおける固有粘度［η］１．０〜】、４）水溶液（５
％）１０ｇに添加分散し、次いで水をｌｏｍす、更に微
結晶セルロース（商品名：Ａｖｉ　ｃｅ　Ｉ）５ｇを添
加分散して調製し塗布液をポリエチレンテレフタレート
透明支持体１：、に塗１＋ｊ乾燥膜厚が２０ｇｍになる
ように塗布した。次いでメチルビニルエーテル／無木マ
レイン酩（モル比１：１）共重合体水溶液（１％）を更
に塗布し、この直後に、０．２％ｐ−ノニルフェノキシ
グリシドールで活性化処理をして乾燥したフジミクロフ
ィルターＦＭ、１２０（商品名、セルロースアセテート
系ブラシュポリマーよりなるメンブランフィルタ−１１
１均孔径１．２ｇｍ、厚さ１８０　ｐＬｍ）を圧着して
一体化分析要素を得た。

純粋の遊離ビリルビンを炭酸ナトリウムおよびヒトアル
ブミン水溶液（５％）に溶解して、濃度の児なる三種の
間接ビリルヒン溶液を調製した。各ヒリルヒン水溶液１
０μ文を」−述の分析要素に点着し、４分後に発色した
分析要素の光学濃度を反射測光によりグリーンフィルタ
ーを通してΔ＋１１定した。その結果を第３表に示す。

第３表 間接ビリルビン濃度　　　　　ΔＯＤ （ｍｇ／ｃ１文） ５　　　　　　　　　　０．２３ １０　　　　　　　　　　０．３２ ２０　　　　　　　　　　０．５０ ｔｔｌ：　）ΔＯＤとは、各測定値より、５％ヒトアル
ソミン水溶液について上と同様の操作を行って得られた
Ｊｌｌｌ定値を減じた値を意味している。

［実施例４］ ポリエチレンテレフタレート透明支持体−にに脱イオン
ゼラチン水溶液（１０％）を乾燥時の膜厚が１０μｍと
なるように塗布し、吸水性層を形成した。

Ｌ五五ジアソニウムｊ’　−、’−ＩＪ”アリールジア
ゾニウム塩　　　　　　４０　ｍ　ｇケイソウ上　　　
　　　　　　　　　　１０ｇ３．３−ジメチルグルタル
酸　　　　　３ｇポリアクリルアミド水溶液（５％）　
２０ｇグイフィリン　　　　　　　　　　　　　５ｇ水
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　１０ｇ各種のアリールジアゾニラ１、塩について
、」−記の塗布液を調製し、これを吸水性層の−にに塗
布し多孔性ジアンニウム塩層を形成した。３０秒後にそ
のＪ−にプラッシュポリマー（フジミクロフィルターＦ
Ｍ３００、平均孔径３．ＯｐＬｍ、厚さ１８０１Ｊ、　
ＩＩＩ　）を圧着し、これを乾燥することにより多孔性
展開層を形成し、以１−により多層分析要素を製造した
。

１０ｇｆＬのパーサ−・−ルＰ（直接ビリルビン含右帛
：３．８ｍｇ／ｄ文、総ビリルビン含有量＋　１８．６
ｍｇ／ｄ９．）およびオメガ高ヒリルビン標準液（直接
ビリルビン含有量：１０．９ｍｇ７８文、総ビリルビン
含有量：１９．９ｍｇ／ｄｕ）を各々の分析要素に点着
し、これを３０°Ｃで６分間インクペーションした後、
５５０ｎｍで反射測光により発色の光学濃度を測定した
。その結果を第４表に記載する。

第４表 ジアン　　パーサトールＰ　　　オメカニウム塩　　　
　　　　　　　　（高ビリルヒン）２　　　　　　０　
、４６　　　　　　０　、４７３　　　　　　０．４９
　　　　　　０．５０５　　　　　　０　、４８　　　
　　　０　、４９６　　　　　　０．５１　　　　　　
０．５２１３　　　　　　０．４５　　　　　　０．４
６１６　　　　　　０　、４７　　　　　　０　、４７
１７　　　　　　０　、４５　　　　　　０　、４６１
８　　　　　　０．５０　　　　　　０．５１Ａ１：）
第４表においてジアゾニウムＩｎの表示番号は前記の本
発明のアリールジアゾニウム塩の表示番号に　・致する
ものであり、各々は次の化合物を表わす。

２：２−メトキシ−５−（テトラデシルオキシカルボニ
ル）ベンゼンジアゾニウム拳ヘキサフルオロボレート ３：２−エトキシ−５−（ヘキサデシルオキシカルボニ
ル）ペンセンジアゾニウム・テトラフルオロポレート ５：２−メトキシ−５−［β−（２′、４゛−ジ−ｔ−
アミルフェノキシ）エトキシカルボニル］ベンセンシア
ソニウム・テトラフルオロボレー１・ ６：２−メトキシ−５−（Ｎ−ヘキサデシルスルファモ
イル）ペンセンジアゾニウム・テトラフルオロボレー１
・ １３・４−ヘキサデシルオキシ力ルポニルベンセンジア
ツニウム中テトラフルオロポレート１６：３−（Ｎ−テ
トラデシル力ルバモイ］し）ベンゼンジアゾニウム・テ
トラフルオロボレート１７：２−メチル−５−テトラデ
シルオキシカルボニルベンゼンジアゾニウム・テトラフ
ルオロボレー１・ １８：２−ブチル−５−デシルオキシカルボニルベンゼ
ンジアゾニウム・テトラフルオロボレー１・［実施例５
］ 孔ヤシアゾニウム　　°・イ液の１ ２−メトキシ−５−（テトラデシルオキシカルボニル）
ペンセンジアゾニウム・テトラフルオロボレーｌ−３７
、５ｍ　ｇをエタノール５　ｍ　ｆＬおよびアセトン２
ｍ、Ｑの混合液に溶解し、これをメチルヒニルエーテル
／無水マレイン酸（モル比１：１）共重合体（１％メチ
ルエチルケトン溶液２５°Ｃにおける固有粘度［η］２
．６〜３．５）水溶液（５％）１０ｇに添加し均一に混
合分散した。

次いで水３０ｒｎｌを添加し、微結晶セルロース（ｆ均
粒径６ｐｍ）７．５ｇ、更にダイフィリン８ｇを添加し
、超音波分散装置で均一分散した。

ＰＨ：　　、　　Ｊ　　−の１ 脱イオンゼラチン水溶液（１０％）３０ｇにジビニルベ
ンゼン／２−（ジメチルアミノ）エチルアクリレ−トノ を２　、５ｍＭ添加し、均一・に混合分散した。

ヒリルヒンー“：′（ＬｌｆＬａＪ　　　の皇　譬ポリ
エチレンテレフタレート透明支持体（厚さ１８０ｐｍ）
にｐＨ調節層塗布液を乾燥膜厚１５１１、ｍとなるよう
に塗布，乾燥した。次し）で多イＬ性ジアツニウム塩塗
布液をこのｐＨ調節層上（こ乾燥膜厚が３０ＪＬｍにな
るように塗布し、塗布後約１分経過して塗布層の表面が
若干硬化した状態で、この上に綿布をラミネートローラ
ーを通して圧着して乾燥した。

ζ四重」墨乞悲欠逝 得られたビリルビン定量用分析要素番こ各種ｉｎ　ｌ仮
コントロールを１０１ｐ文点着し、３０°Ｃで６分１１
１１インクベーシヨンした後、５５０ｎｍで反身＋　ｆ
ｉｌｌｌ　光により発色の光学濃度をｌ’ｌｌｌｌ定し
た。その結果を第５表に記載する。

第５表 総ビリルビン濃度　　光学濃度 （ｍｇ／ｄｌ）　　　　　（　５５０ｎｍ　）ヒトアル
ブミン溶液　　０　　　　　　０．１６９パーサトール
　　　　　１．　１０　　　　　０．２０７キユーパン
クＩ　　　　　１．２Ｂ　　　　　０．２１５カリプレ
ートＩ　　　　　１．８＋　　　、　　　０．２１１モ
ニトロールＩ　　　　　１．８１　　　　　０．２２４
カリプレーＩ・ｎ　　　　　３．３１３　　　　　０．
３０，４モニトロールｎ　　　　　４．２４　　　　　
０．３２１キユーバツクｎ　　　　　４．７７　　　　
　０．３４１カリプレートＩＩＩ　　　　　５．０７　
　　　　０．３５０パーサＩ・−ルＰ　　　　１８．ｆ
（　　　　　０．６４４才メカ　　　　　　　１９．８
　　　　　０．１（７５（高ビリルビン） 註）各種コントロールの総ビリルビン濃度は、アボット
・ラボラトリーズ社のＡＢＡ−２００で実施例１に記載
の方法により定量した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１の分析要素を用いてビリルビンの分
析を行なった際の分析要素の発色の光学濃度と総ビリル
ビン濃度との対応関係を示すグラフである。 第２図は、本発明において規定されたアリールジアゾニ
ウム塩の−・例とジアゾニウム化スルファニル醇塩（ｐ
−スルホベンゼンジアゾニウム塩）の各々より生成した
アゾビリルビンの吸収スペクトルを示している。 ”　　　　特許出願人　富士写真フィルム株式会社代理
人　　　　弁理士　　　柳川泰男 黍蝕ビリルビ゛ン濃＆（ｍｇ７ｄｌ） 第１図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 Ｉ６液体試料中のビリルビンをジアノ法により定量する
   系を利用する分析要素において、アルコキシカルボニル
   基、アルキルアミノスルホニル基およびアルキルアミ７
   カルボニル基からなる群より選ばれる少なくとも−・個
   の置換基がアリール基に付いている難拡散性アリールシ
   アツニウム塩がビリルビン検出指示薬として含まれてい
   ることを特徴とするビリルビン定量用分析要素。 ２゜ビリルビン検出指示薬のアリールジアンニウム塩の
   アリール基に、更にアルキル基およびアルコキシ基から
   なる群より選ばれる少なくとも一個以）−の置換基が含
   まれていることを特徴とする特許請求の範囲第１項の分
   析要素。 ３゜少なくとも液体試料展開層、試薬層および液体不透
   過性・光透過性の支持体を含む多層構成からなることを
   特徴とする特許請求の範囲第１項もしくは第２項記載の
   分析要素。 ４゜試薬層が多孔性試薬層であることを特徴とする特許
   請求の範囲第３項記載の分析要素。 ５゜多孔性め該試薬層が、基本的に固体微粒子と／ヘイ
   ダーから構成される多孔性構造体からなるものであるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第４項記載の分析要素。 ６゜多孔性の該試薬層が、酸性ポリマーを含むことを特
   徴とする特許請求の範囲第４項もしくはｈ’ｓ　５８４
   記戦のビリルビン定量用多層分析要素。