JPH0623759B2 - 全血分析要素 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、生物体液中、たとえば血液中の特定物質の定
量に用いる乾式化学分析要素に関する。

［従来技術とその欠点］ 体液中に存在する各種代謝成分、例えばグルコース、ビ
リルビン、尿素窒素、尿酸、コレステロール、乳酸脱水
素酵素、クレアチンキナーゼ、ＧＯＴ、ＧＰＴ等の定量
分析は、臨床医学上重要で、疾患の診断、治療経過の追
跡、予後の判定などに不可欠である。血液等を試料とす
る臨床化学検査では、微量の液体試料で、精度の高い検
査を行うことができることが望ましい。従来、溶液試薬
を用いる湿式法が広く用いられているが、迅速性に欠け
る。

乾式化学分析、すなわち実質的に乾燥状態の分析要素、
例えば、試験片や多層分析要素中に、分析試薬系を導入
した臨床分析法が知られている。乾式化学分析は湿式法
による化学分析（即ち、溶液中に試薬を用いる方法）よ
り、例えば使用上の簡易性、経済上の節約及び分析の迅
速さなどの点で優れている。乾式多層分析要素は、微量
の液体試料で、精度の高い検査を迅速に行うことができ
る分析手段として、開発された。乾式多層分析要素は例
えば、特公昭 53-21677 号、特開昭 55-164356 号、特
開昭 60-222769 号等で知られている。乾式多層分析要
素の一例を挙げれば、透明支持体、試薬層、反射層、展
開層から構成されている。透明支持体は、例えば下塗り
処理を施した薄いプラスチックフィルムである。透明支
持体の上に塗布された試薬層には、液体試料中に含まれ
る被検成分と反応し、その成分量に応じた光学濃度に発
色する試薬が含まれる。反射層は、試薬層に入射した光
が展開層に達するのを防ぎ、試薬層の光学測定の際展開
層に点着した液体試料の影響を受けないようにする役割
を持つ。展開層は、点着された液体試料を均一に、液の
量にほぼ比例する面積に広げる。このような乾式分析要
素を用いて定量分析するには、液体試料、例えば全血を
展開層の表面に一定量滴下する。展開層で展開された血
液は、反射層を通って試薬層に達し、ここで試薬と反応
し、発色する。点着後、化学分析スライドを適当な時
間、一定温度に保って発色反応を充分に進行させた後、
透明支持体側から照明光を試薬層に照射し、特定波長域
で反射光量を測定して反射濃度を求め、予め求めておい
た検量線に基づいて定量分析を行う。

従来、湿式法、乾式化学分析いずれにおいても、赤血球
を除去した血清または血漿を試料として分析が行なわれ
ることが多かった。しかし血液の他の成分から赤血球を
分離する操作には多くの労力と装置のコストを伴うの
で、未希釈の全血で分析できることが望ましい。

全血を試料として乾式化学分析を行うには、血球（赤血
球及び白血球）及び全血の他の高分子量成分を、分析要
素中で何らかの手段で分離しなければならない。特公昭
53-21677 号には、血球および全血の高分子量成分を、
分析要素中で分離するために、ろ過層を設けることを開
示している。しかし、特開昭 60-111960 号に記載され
ているように、乾式分析要素に設けたろ過層により血清
または血漿から血球成分を除去する場合には非常に時間
がかかり、また血漿または血清中の分析物質の一部がろ
過層中で失われて、分析が不正確になるおそれがあっ
た。

赤血球による妨害を回避するために、全血中の赤血球を
分析要素中で血漿から分離除去し、しかも血漿中の被検
成分の試薬層への拡散が速やかに行なわれる、全血試料
中の特定成分の分析に有用な乾式分析要素が、特願昭 6
0-279860 号で提案された。この分析要素は、第１の非
繊維質多孔性層、第２の非繊維質多孔性層、繊維質多孔
性層がこの順に一体に積層されており、前記３層の多孔
性層がそれぞれ隣接する面の間で、液体の均一透過が実
質的に妨げられないような微少貫通部を形成するように
部分的に配置された接着剤により実質的に密着して接着
されて一体化されている、多層分析要素であり、発色を
生ずる試薬組成物は前記３層の多孔性層のいずれかに含
まれ、第２の非繊維多孔性層の平均有効孔径を０．８μ
ｍから３０μｍとしたものである。しかし、この多層分
析要素を用いて全血の分析を行うとき、血液のヘマトク
リット値（血液中に占める血球の容積百分率）の大小に
より、血漿中の成分含量が同じ血液でも分析結果にかな
り差が出ることが経験された。

［解決しようとする技術的課題］ 本発明は、分析要素中で全血中の赤血球を血漿から分離
除去して赤血球による妨害を回避し、しかも血漿中の被
検成分の試薬層への拡散が速やかに行なわれ、全血試料
中の特定成分を血液のヘマトクリット値に拘わらず高い
精度で分析することができる乾式分析要素を提供を、技
術的課題とする。

［技術的課題の解決手段］ 水不透過性、光透過性支持体の上に、第１の非繊維質多
孔性層、第２の非繊維質多孔性層、繊維質多孔性層がこ
の順に一体に積層されており、前記３層の多孔性層がそ
れぞれ隣接する面の間で、液体の均一透過が実質的に妨
げられない程度に微少貫通部が形成されるよう部分的に
配置された接着剤により、実質的に密着して接着され一
体化されている多層分析要素であり、被検成分の存在下
に発色、変色、発光、蛍光等の検出し得る光学的変化を
生ずる試薬組成物が前記３層の多孔性層の少なくとも１
つに含まれ、第１の非繊維質多孔性層の空隙体積（単位
面積当たり）は第２の非繊維質多孔性層の空隙体積（同
上）の２分の１以下であることを特徴とする一体型多層
分析要素により、解決された。

本発明の上記課題はさらに、前記分析要素において、前
記試薬組成物が第１の非繊維質多孔性層に含まれると
き、また第２の非繊維多孔性層の有効孔径が０．８μｍ
から３０μｍであるとき、好ましく達成された。

［発明の具体的構成の詳細］ 非繊維多孔性層として、特公昭 53-21677 号、米国特許
1,421,341 号等に記載されたセルロースエステル類、
例えば、セルロースアセテート、セルロースアセテート
／ブチレート、硫酸セルロースからなるブラッシュ・ポ
リマーの層が好ましい。6−ナイロン、6,6−ナイロン等
のポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン等の微多
孔性膜でもよい。特開昭６２−２７００６号に記載され
たポリスルホンから成る微孔性膜でもよい。その他、特
公昭 53-21677 号、特開昭 55-90859 号等に記載され
た、ポリマー小粒子、ガラス粒子、けい藻土等が親水性
または非吸水性ポリマーで結合された連続空隙をもつ多
孔性層も利用できる。

本発明で非繊維多孔性層の有効孔径は、ＡＳＴＭ Ｆ３
１６−７０に準拠した限界泡圧法（バブルポイント法）
により測定した孔径で示す。非繊維多孔性層が相分離法
により作られたいわゆるブラッシュ・ポリマーから成る
メンブランクフィルターである場合、厚さ方向の液体通
過経路は、膜の製造の際の自由表面側(即ち光沢面)で最
も狭くなっているのが普通で、液体通過経路の断面を円
に近似したときの孔径は、自由表面の近くで最も小さく
なっている。単位の通過経路における厚さ方向に関する
最小孔径は、さらにフィルターの面方向について分布を
持っており、その最大値が粒子に対するろ（瀘）過性能
を決定する。通常、それは限界泡圧法で測定される。

第１の非繊維多孔性層の空隙体積（単位面積当たり。以
下同じ）を第２の非繊維多孔性層の２分の１以下とする
には、両者の空隙率を同じにして、前者の厚さを後者の
２分の１以下としてもよいし、両者の厚さを同じとし
て、前者の空隙率を２分の１以下としてもよい。厚さと
空隙率の組み合わせで、両者の空隙体積の関係を規制し
てもよい。第２の非繊維質多孔性層に用いるものと同じ
膜を、適当な溶剤処理することによって、空隙率を必要
なだけ小さくすることができる。

第１と第２の非繊維多孔性層の孔径は同じでも、異なっ
てもよい。しかし第１の非繊維多孔性層の有効孔径は、
大きくても第２の非繊維多孔性層の有効孔径の３倍を越
えないことが好ましい。また第２の非繊維多孔性層の有
効孔径は０．８μｍから３０μｍであることが好まし
い。

前に述べたように、相分離法により作られたいわゆるブ
ラッシュ・ポリマーから成るメンブランフィルターで
は、厚さ方向の液体通過経路は膜の製造の際の自由表面
側（即ち光沢面）で最も狭くなっており、本発明の分析
要素においてこの種の膜を用いる場合には、第１の非繊
維多孔性層の支持体に近い側にメンブランフィルターの
光沢面を向けることが好ましい。第２の非繊維多孔性層
も、支持体に近い側にメンブランフィルターの光沢面を
向けることが好ましい。

第２の非繊維質多孔性層を第１の非繊維質多孔性層の上
に固定するには、接着剤を用いることができるが、液体
の均一透過が実質的に妨げられないようにする必要があ
る。そのためには、接着剤を部分的に配置し、接着剤が
存在しない部分には微少貫通部が形成されるようにす
る。その方法として特願昭 60-279859 号に記載された
方法が有用である。

本発明の分析要素は種々の構成を有することができる。
例えば、米国特許 3,992,158 号、特開昭 55-164356
号、特願昭 60-279859 号、同 60-279860号，同 60-279
861 号の記載を参考にできる。実用的には例えば、 (１)支持体の上に、第１非繊維多孔性層、第２非繊維多
孔性層、繊維質多孔性層をこの順に、 (２)支持体の上に、接着層（または吸水層）、第１非繊
維多孔性層、第２非繊維多孔性層、繊維質多孔性層を、
この順に、 (３)支持体の上に、検出層、第１非繊維多孔性層、第２
非繊維多孔性層、繊維質多孔性層を、この順に、 (３)支持体の上に、試薬層、第１非繊維多孔性層、第２
非繊維多孔性層、繊維質多孔性層を、この順に、 それぞれ有するものが、有用である（支持体は下塗り層
を含んでいてもよい）。検出層は一般に、被検成分の存
在下で生成した色素等が拡散し、光透過性支持体を通し
て光学的に検出され得る層で、親水性ポリマーにより構
成することができる。媒染劑、例えばアニオン性色素に
対してカチオン性ポリマーを、含んでもよい。吸水層は
一般に、被検成分の存在下で生成する色素が実質的に拡
散しないような層を言い、膨潤しやすい親水性ポリマー
により構成することができる。

第１非繊維多孔性層と第２非繊維多孔性層の間には、さ
らに他の非繊維または繊維質多孔性層を設けることがで
きる。

試薬層と第１非繊維多孔性層との間に、妨害物除去層、
気体透過層、光反射層等を設けてもよい。また検出層と
第１非繊維多孔性層との間に、妨害物除去層、光反射層
等を設けてもよい。

光透過性水不透過性支持体の材料として好ましいものは
ポリエチレンテレフタレートである。セルローストリア
セテート等のセルロースエステル類でもよい。親水性層
を強固に接着させるため通常、下塗り層を設けるか、親
水化処理を施す。

試薬組成物には、被検成分の存在下に、光学的に検出し
得る物質、例えば染料を生成し得る組成物を含む。ロイ
コ色素の酸化によって染料を生成する組成物（例とし
て、米国特許 4,089,747号、特開昭59-193352号等に記
載されたようなアリールイミダゾールロイコ色素）、ジ
アゾニウム塩、酸化されたときに他の化合物とカップリ
ングにより染料を生成する化合物を含む組成物（例えば
４-アミノアンチピリン類と、フェノール類またはナフ
トール類）、還元型補酵素と電子伝達剤の存在下で染料
を生成することのできる化合物から成るもの等を、用い
ることができる。また、酵素活性を測定する分析要素の
場合には、例えばｐ−ニトロフェノールのような有色物
質を遊離しうる自己顕色性基質を、試薬層や展開層に含
むことができる。

被検成分の存在下に発色を生ずる試薬組成物を前記３層
の多孔性層の少なくとも１つに含有させるには、試薬組
成物の適当な溶液または分散液を予め含浸または塗布し
た多孔性展開層を、他の水浸透性層、例えば試薬層の上
に特開昭 55-164356号のような方法で接着させる方法も
有用である。

多孔性層を、他の水浸透性層（例えば下塗り層、接着
層、吸水層）の上に前記特開昭 55-164356号のような方
法で接着させた後、試薬組成物の溶液または分散液を多
孔性層に塗布してもよい。

多孔性層への含浸または塗布には公知の方法を利用でき
る。塗布には例えばディップ塗布、ドクター塗布、ホッ
パー塗布、カーテン塗布等を適宜選択して用いる。

試薬組成物は、総て一つの多孔性層、例えば第１の非繊
維多孔性層に含んでもよく、別の多孔性層に分けて含有
させてもよい。

試薬組成物は、その一部を親水性ポリマーを結合剤とす
る実質的に均一な層に含ませてもよい。親水性ポリマー
として例えば、ゼラチンおよびこれらの誘導体（例えば
フタル化ゼラチン）、セルロース誘導体（例えばヒドロ
キシメチルセルロース）、アガロース、アクリルアミド
重合体、メタアクリルアミド重合体、アクリルアミドま
たはメタアクリルアミドと各種ビニル性モノマーとの共
重合体等が利用できる。

親水性ポリマーを結合剤とし試薬組成物を含む均一層を
塗布した後、試薬組成物を含まない非繊維多孔性層を特
開昭 55-164356 号のような方法で接着させることによ
って、試薬組成物を第１の非繊維多孔性層に実質的に含
有させることができる。

試薬組成物には必要に応じ、活性化剤、緩衝剤、硬膜
剤、界面活性剤等を含有させることができる。本発明の
分析要素の試薬層に含有させることができる緩衝剤の例
としては、炭酸塩、ホウ酸塩、燐酸塩やBiochemistry誌
第５巻 第２号、467ページより477ページ（1966年）
に記載されているグッド（Good）の緩衝剤などを挙げる
ことができる。これらの緩衝剤は『蛋白質・酵素の基礎
実験法』(堀原武一ほか著、南江堂、１９８１年)、前記
Biochemistry 誌第５巻等の文献を参考にして選択する
ことができる。

試薬組成物は酵素を含むものでもよく、特願昭60-27985
9 号明細書第１８ページから第２０ページに記載された
ものを用いることができる。

繊維質多孔性層は、液体試料の展開層として利用される
ので、液体計量作用を有する層であることが好ましい。
液体計量作用とは、その表面に点着供給された液体試料
を、その中に含有している成分を実質的に偏在させるこ
となく、面の方向に単位面積当りほぼ一定量の割合で広
げる作用である。繊維質多孔性層を構成する材料として
は、紙、不織布、織物生地(例えば平織生地)、編物生
地（例えば、トリコット編）、ガラス繊維紙等を用い
ることができる。これらのうち織物、編物等が好まし
い。織物等は特開昭 57-66359 号に記載されたようなグ
ロー放電処理をしてもよい。展開層には、展開面積、展
開速度等を調節するため、特開昭 60-222770 号、特願
昭 61-122875 号、 61-122876 号、 61-143754 号に記
載したような親水性高分子あるいは界面活性剤を含有し
てもよい。繊維質多孔性層を非繊維質多孔性層の上に固
定するには、接着剤を用いることができるが、液体の均
一透過が実質的に妨げられないようにする必要がある。
そのためには、接着剤を部分的に配置し、接着剤が存在
しない部分に微少貫通部が形成されるようにする。その
方法として特願昭 60-279859号に記載された方法が有用
である。

非繊維多孔性層を接着し積層するための接着層を、支持
体、下塗り層、吸水層、検出層等の層の上に設けてもよ
い。接着層は水で膨潤したときに多孔性層を接着するこ
とができるような親水性ポリマー例えば、ゼラチン、ゼ
ラチン誘導体、ポリアクリルアミド、澱粉等からなるこ
とが好ましい。第２の非繊維多孔性層は、検出層、試薬
層等に生じた検出可能な変化（色変化、発色等）を光透
過性の支持体側から反射測光する際に、全血中の赤血球
のヘモグロビンの赤色を遮蔽するとともに、光反射層ま
たは背景層として機能する。第２の非繊維多孔性層に親
水性ポリマーをバインダーとして分散された酸化チタ
ン、硫酸バリウム等の光反射性粒子を含有させてもよ
い。バインダーとしてはゼラチン、ゼラチン誘導体、ポ
リアクリルアミド等が好ましい。さらに、第１の非繊維
多孔性層、繊維質多孔性層のいずれかまたは両方にも、
光反射性粒子を含ませてもよい。

本発明は、全血中のグルコース、尿素、尿酸、クレアチ
ニン等の低分子成分の定量は勿論、総蛋白、アルブミ
ン、各種酵素等の高分子成分、ビリルビン等の蛋白質と
結合した成分、コレステロール、グリセリド等の疎水性
成分の定量に特に有用である。

多孔性層に抗原、抗体の少なくとも一方を含有させて、
免疫学的方法による抗原または抗体の定量に用いること
もできる。

第１の非繊維多孔性層の空隙体積は１００ cm²当たり１
cm³以下であるのが好ましい。

［発明の効果］ 本発明の分析要素は、全血を試料として、血液のヘマト
クリット値が２５％から５５％の広い範囲にわたり、種
々の被検成分についてヘマトクリット値に左右されない
分析値を得ることができる。

本発明をさらに具体的に説明するため、以下に実施例を
記載する。

［実施例１］ ゼラチン下塗された１８０μｍの無色透明ポリエチレン
テレフタレート(ＰＥＴ)フィルム（支持体）の上に、乾
燥後の膜厚が７μｍになるようにゼラチン水溶液を塗布
し、乾燥して吸水層を形成した。

次に吸水層表面を約２５℃の水でほぼ一様にぬらした
後、最小孔径３．０μｍ、厚さ７０μｍ、空隙率約８０
％のセルロースアセテートメンブレンフィルタをラミネ
ートし、乾燥させて、吸水層にメンブレンフィルタを一
体化させた。

次にこのメンブレンフィルタの上から下記組成物１およ
び組成物２を表示の割合で順次塗布し、乾燥して第１非
繊維多孔質層とした。

組成物１： ゼラチン 0.64 g/m² ポリオキシエチレン ノニルフェニルエーテル(n＝40) 2.5 g/m² トリスヒドロキシ メチルアミノメタン 0.64 g/m² リン酸２水素１カリウム 0.64 g/m² Ｌ−アスパラギン酸 2.5 g/m² 塩化マグネシウム（無水） 0.3 g/m² ペルオキシダーゼ 6,400 U/m² フラビンアデニンジヌクレオチド 28 mg/m² チアミンピロリン酸 118 mg/m² α-ケトグルタル酸 500 mg/m² オキザロ酢酸 デカルボキシラーゼ 12,600 U/m² ピルビン酸オキシダーゼ 35,000 U/m² （ｐＨ＝７．５の水溶液） 組成物２： ロイコ色素（下記構造） 1.8 g/m² ポリオキシエチレンノニル フェニルエーテル(n=40) 0.6 g/m² （エタノール溶液） 色素： 2-(3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenyl)-4-phenethyl-5-(4
-dimethylaminophenyl)imidazole 次に富士写真フイルム（株）製ミクロフィルタＦＭ３０
０（最小孔径３．０μｍ、厚さ１４０μｍ、空隙率約８
０％のセルロースアセテートメンブレンフィルタ）の表
面に、100 メッシュの網点（面積率約２０％）を通して
スクリーン印刷法で澱粉糊を固形成分３g/m²の割合で付
着させたものをラミネートし、乾燥して第２非繊維多孔
質層とした。第１非繊維多孔質層と第２非繊維多孔質層
の空隙体積の比は約１：２である。

次に１００Ｓ相当のＰＥＴ紡績糸からなる厚さ約２５０
μｍのトリコット編物生地を、第２非繊維多孔質層上に
上記と同じ網点接着法により接着し、一体化させ、ＧＯ
Ｔ活性測定用分析要素とした。

［比較例］ 実施例１で第１非繊維多孔質層を形成させるのに用いた
厚さ７０μｍのセルロースアセテートメンブレンフィル
タの代わりに、同じ最小孔径と空隙率をもつ厚さ１４０
μｍのセルロースアセテートメンブレンフィルタ（富士
写真フイルム株製ミクロフィルタＦＭ３００）を用いた
他は、実施例１と同様にしてＧＯＴ活性測定用分析要素
を作製した。第１非繊維多孔質層と第２非繊維多孔質層
の空隙体積の比は約１：１である。

［実施例２］ 実施例１で第１非繊維多孔質層を形成させる際に下記の
ような変更をした以外、実施例１と同様にしてＧＯＴ活
性測定用分析要素を作製した。

１）厚さ７０μｍのセルロースアセテートメンブレンフ
ィルタの代わりに、同じ最小孔径と空隙率をもつ厚さ１
４０μｍのセルロースアセテートメンブレンフィルタを
用いた。

２）組成物１および組成物２を塗布する前に、下記処理
液を塗布（塗布速度３ｍ／分）し、乾燥した。

メタノール １００ｇ 塩化メチレン １００ｇ 上記の処理によりメンブレンフィルタの空隙率は約３６
％に減少した。第１非繊維多孔質層と第２非繊維多孔質
層の空隙体積の比は約０．９：２である。

［測定例］ ヘマトクリット値がそれぞれ 25，40，55 ％の３種の新
鮮全血（ヘパリン採血）に、ブタ由来のＧＯＴ（米国シ
グマ社）をＧＯＴ活性が 280 および 850単位/になる
ように加え、合計６種類の血液を作成した。

前記分析要素を１．５×１．５ｃｍ角に切断し、プラス
チックマウントに挿入し、これに上記４種類の血液を点
着した。点着後３７℃にて反応させ６４０ｎｍの吸収を
ＰＥＴ支持体側より２．５分後と４分後に反射測光し、
ＯＤt（透過光学濃度）に換算した値（Clinical Chemis
try，Vol.24，1335（1978）の原理による）を用いてＧ
ＯＴ活性値を算出した。結果を第１表に示す。

第１表より、第１非繊維多孔質層と第２非繊維多孔質層
の空隙体積の比が約１：２および０．９：２である実施
例１および実施例２の分析要素は、第１非繊維多孔質層
と第２非繊維多孔質層の空隙体積の比が約１：１である
比較例の分析要素に比して、ＧＯＴ活性測定値に対し試
料血液のヘマトクリット値の影響を受けにくいことが明
らかである。

第２表から、血球の有無により背景の光学濃度に有意の
差はなく、また実施例の分析要素は背景に対し充分高い
光学濃度を示すことがわかる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】水不透過性、光透過性支持体の上に、第１
   の非繊維質多孔性層、第２の非繊維質多孔性層、繊維質
   多孔性層がこの順に一体に積層されており、前記３層の
   多孔性層がそれぞれ隣接する面の間で、液体の均一透過
   が実質的に妨げられない程度に微少貫通部が形成される
   よう、部分的に配置された接着剤により実質的に密着し
   て接着され一体化されている多層分析要素であり、被検
   成分の存在下に検出し得る光学的変化を生ずる試薬組成
   物が前記３層の多孔性層の少なくとも１つに含まれ、第
   １の非繊維質多孔性層の空隙体積は第２の非繊維質多孔
   性層の空隙体積の２分の１以下であることを特徴とする
   一体型多層分析要素。
2. 【請求項２】前記試薬組成物が第１の非繊維質多孔性層
   に含まれる特許請求の範囲(１)の分析要素。
3. 【請求項３】第２の非繊維多孔性層の有効孔径が０．８
   μｍから３０μｍである特許請求の範囲(１)の分析要
   素。