JPS63283600A - クレアチンキナ−ゼ活性測定用分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、生物体液中、たとえば血液中の特定物質の定
量に用いる乾式化学分析要素およびその製造方法に関す
る９本発明は、特にクレアチンキナーゼ（以下ＣＰ　Ｋ
と記す）の活性の測定に用いる乾式化学分析要素に関す
る。

［従来技術〕 クレアチンリン酸（以下ＣＰと記す）とＡＤＰを基質と
し、生成するＡＴＰをグルコースとへキソキナーゼによ
りグルコース−６−リン酸（０６Ｐ）へ、さらにＮＡＤ
’またはＮＡＤＰ”とＧ６ＰＤＨによりＮＡＤＨまたは
ＮＡＤＰＨに変換し、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの増加
を波長３４０ｎｍで測定することによりＣＰＫ酵素活性
を測定する方法が特公昭４６−９９８８号により知られ
、５ＳＣＣ法等として広く用いられている。

ＰＫ ＣＰ　＋　Ａ　Ｄ　Ｐ　　＝　　ｃｒｅａｔｉｎｅ＋　
Ａ　Ｔ　Ｐｂｅｘｏｋｉｎａｓｅ ＡＴＰ＋ｇｌｕｃｏｓｅ−＋Ｇ６Ｐ＋ＡＤＰ６ＰＤｌｌ Ｇ８Ｐ＋ＮＡＤ’　　→ ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎｅ−６−ｐｈｏｓｐａｔｅ
＋Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈしかしこの方法は、紫外線域の測光を
必要とするので、機器が高価なものになり、また紫外線
域に吸収を有する多くの化合物の干渉を受ける欠点があ
った。

酵素反応で生成したＮＡＤＨを、電子受容性の色素前駆
体と電子伝達剤から、可視域に吸収スペクトルを有する
フォルマザン染料を形成させる比色分析法を用いれば可
視域の分光測光によりＮＡＤＨの定量ができる。このよ
うな分析法は特開昭４９−１１３９５号等で知られてい
る。

水溶液系での定量分析は一連の化学反応を水溶液中で進
行させるために、煩雑な繰作と長い時間を必要としたの
で、煩雑な調液作業を必要とせず迅速簡便な分析ができ
る乾式分析要素が考案され、特に分析精度の高い一体型
多層分析要素として特公昭５３−２１６７７号、特開昭
５５−１６４３５６の公報等に記載されたものがある。

このような一体型多層分析要素に、前記のＣＰＫ活性測
定に用いられる反応系を導入する試みがなされており、
特開昭５９−８８０９７号、特開昭６１−２５４１９９
号に開示されている。

しかし、これら公知のＣＰＫ活性測定要素においては、
夏季あるいは熱帯地方のような高温での保存安定性が不
充分で、例えば３５℃に２日以上置かれると酵素活性測
定値に実用上支障のある正誤差を生ずることがわかった
。

［発明の目的］ 本発明の目的は、可視域の分光光度計で測定でき、３０
℃以上の高温でも性能が安定に維持され、酵素活性測定
値の正誤差を生じないＣＰＫ活性定量用乾式多層分析要
素を提供することにある。

［発明の構成］ 本発明の上記目的は、多孔性担体を有し、該多孔性担体
またはこれと液体接触関係にある水浸透性層にクレアチ
ンリン酸、ＡＤＰ、ＣＰＫ活性化剤であるチオール化合
物、グルコース、ヘキソキナーゼ、ＮＡＤ”　、Ｇ６Ｐ
ＤＨ１電子伝達剤、およびフォルマザン染料形成テトラ
ゾリウム塩を含むクレアチンキナーゼ酵素活性測定用乾
式一体型分析要素において、前記多孔性担体と液体接触
関係にある水浸透性層の少なくとも１つにフォルマザン
染料形成テトラゾリウム塩と１６ｇ／ｍ２以下のゼラチ
ンを含有させることによって達成された。

′本発明の前記目的はさらに、多孔性層、該多孔性層と
液体接触関係にある水浸透性層および水不浸透性・光透
過性支持体がこの順に一体に積層され、該多孔性層また
はこれと液体接触関係にある水浸透性層にクレアチンリ
ン酸、ＡＤＰ、ＣＰＫ活性化剤であるチオール化合物、
グルコース、ヘキソキナーゼ、Ｇ６ＰＤＨ，ＮＡＤ’″
および電子伝達剤を含み、前記水浸透性層（多孔性層と
液体接触関係にある）の少なくとも１つが、１６ｇ／ｍ
２以下のゼラチンから成りがつフォルマザン染料形成テ
トラゾリウム塩を含む、ＣＰＫ酵素活性測定用乾式多層
分析要素によって、好ましく達成された。

多孔性担体を有し、該多孔性担体またはこれと液体接触
関係にある水浸透性層にクレアチンリン酸、ＡＤＰ、Ｃ
ＰＫ活性化剤であるチオール化合物、グルコース、ヘキ
ソキナーゼ、Ｇ６ＰＤＨ１ＮＡＤ”および電子伝達剤を
含み、前記水浸透性層の少なくとも１つにフォルマザン
染料形成テトラゾリウム塩を含むＣＰＫ活性測定用乾式
分析要素であっても、　フォルマザン染料形成テトラゾ
リウム塩を含む水浸透性層が１６ｇ／ｍ２を越えるゼラ
チンから成るときは、高温での保存安定性が不充分で、
例えば３５℃に２．３日置かれると酵素活性測定値に実
用上支障のある正誤差を生ずる。

本発明の分析要素に含まれる試薬系は、基質としてのク
レアチンリン酸（ＣＰ）とＡＤＰ、活性化剤としてのチ
オール化合物、グルコース、ヘキソキナーゼ、Ｇ６ＰＤ
Ｈ，ＮＡＤ”　、電子伝達剤１、ホルマザン染料前駆体
であるが、これらのうちホルマザン染料前駆体以外は多
孔性担体層に含まれても、これと液体接触関係にある水
浸透性層に含まれてもよい。試薬系の一部とそれ以外が
、主として別の層に含まれてもよい。

ＣＰ　Ｋの活性化作用をもつチオール化合物としては、
システィン、還元型グルタチオン、メルカプトエタノー
ル等を用いることができるが、Ｎ−アセチルシステイン
（Ｎ　Ａ　Ｃ）が好ましい、チオール化合物の前記ＡＤ
Ｐに対するモル比は１．５より小とすることが好ましい
。

ＣＰＫ活性測定用乾式分析要素を製造する際、チオール
化合物は、フォルマザン染料前駆体を必須に含む層と異
なる層の塗布組成物に含ませることが望ましく、そのた
めにはテトラゾリウム塩を含む組成物を用いて前記水浸
透性層を塗布し、チオール化合物を含む組成物を用いて
前記多孔性担体層を塗布するか前記多孔性担体層の担体
に塗布または浸漬する方法が利用できる。

電子伝達剤としては、ヂアホラーゼ、Ｎ−ｗ＋ｅｔｂｙ
ｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ　　ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔ
ｅ　　＋　Ｎ−ｍｅｔｂｏｘｙｐｈｅｎａｚｉ−ｎｉｕ
＋ｍ　ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａＬｅ等を用いることができ
る。

フォルマザン染料前駆体としては、ＩＮＴすなわち２−
（ｐ−ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（ｐ−ｎｉｔｒｏ
ｐｈｅｎｙｌ）−５−ｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉ
ｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ＋ＢＴすなわち３゜３’　−（
３，３’　　−ｄｉｍｅＬｈｏｘｙ−４，４’　　−ｂ
ｉｐｂｅｎｙｌｅｎｅ）−ｂｉｓ［２゜５−ｄｉｐｈｅ
ｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ］、
３．３’−（４，４’−ｂｉｐｂｅｎｙｌｅｎｅ）−ｂ
ｉｓ［２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕ
＋＊ｃｈｌｏｒｉｄｅ］等を用いることもできるが、ニ
トロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢまたはＮＢＴ＞すな
わち３．３’　−（３，３−ｄｉ＋ｍｅｔｈｏｘｙ−４
，４’　−ｂｉｐｈｅｎｙｌｅｎｅ）−ｂｉｓ［２−（
ｐ−ｎｉ　ｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−ｐｈｅｎｙｌ　
ｔｅｔｒａｚｏｌ　１ｕｎｃｈｌｏｒｉｄｅコ　が好ま
しい。

禾発明は公知の多種の乾式分析要素に適用することが出
来る。特に検出試薬系と被検液がともに透過し得る固体
担体を含む要素に適用することが出来る。要素は光透過
性・液不透過性の支持体上に、多孔性担体層のほか、下
塗り層、吸水層、接着層、反応試薬層、光道へい層、ろ
過層、および公知のその他の層を有する多ＮＪ構造を有
することができる。このような分析要素として、米国特
許第３，９９２．１５８号および特開昭５５−１６４３
５６号に開示されたものがある。

本発明の分析要素において、多孔性担体層のうち最も表
面に近い少なくとも一つは、液体試料を受容して適当な
面積に展開し、さらにこれと液体接触関係にある他の水
浸透性層に試料液を拡散させるｆｔ用をするいわゆる展
開層、特に液体計量作用を有する展開層であることが好
ましい、液体計量作用を有するとは、その表面に点着供
給された液体試料を、層の中で実買的に偏在させること
なく、横（面）方向に単位面積当りほぼ一定量の割合で
広げる作用を有することである。展開層以外の多孔性担
体層を有してもよい。

支持体を用いる場合、本発明の乾式分析要素の実用的に
採りうる構成は （１）支持体上に試薬層、展開層をこの順に有するもの
、支持体と試薬層の間に吸水層を有してもよい。

（２）支持体上に第二試薬層、第一試薬層、展開層をこ
の順に有するもの、支持体と第二試薬層の間に吸水層を
有してもよい。

（３）支持体上に試薬層、光道へい層、ｒｘ開層をこの
順に有するもの、支持体と試薬層の間に吸水層を有して
もよい。

（４）支持体上に第二試薬層、光道へい層、第一試薬層
、展開層をこの順に有するもの、支持体と第二試薬層の
間に吸水層を有してらよい。

上記（１）ないしく４）において試薬層と展開層の間、
第二試薬層と第一試薬層の間、または光道へい層と試薬
層もしくは展開層の間に、ろ過層を設けてもよい。

本発明のＣＰ　Ｋ活性測定用分析要素において、チオー
ル化合物だけでなく、ＮＡＤ”および電子伝達剤も、フ
ォルマザン染料形成テトラゾリウム塩を含む塗布組成物
とは別の塗布組成物に添加することが好ましい。

展開層のマｌ−リックスを構成する材料としては、１紙
、不織布、織物生地（ブロード、ボブリン等の平織等）
、編物生地（トリコット編等）、ガラス繊維濾紙、プラ
ッシュポリマーより形成されるメンブランフィルタ−５
あるいはポリマー粒子等からなる三次元格子状構造物等
を用いることができる。これらのうち、ｍ物生地および
編物生地を用いることが好ましい、詳細については特開
昭５５−１６４３５６号、同５７−６６３５９号および
同６０−２２２７６９号を参照すればよい、ｔａ物また
は編物生地は、製造時等に付着した油脂類が水洗等の脱
脂処理により実質的に除去されていることが好ましい。

本発明の分析要素の展開層として用いる織物または織物
生地には、特開昭５７−６６３５９号に開示された物理
的活性化処理（グロー放電処理、コロナ放電処理等）を
生地の少なくとも片面に施すか、特開昭５５−１６４３
５６号、特開昭５７−６６３５９号等に開示された親水
性ポリマー含浸処理、特開昭６０−２２２７７０号に開
示された方法等の親水化処理を施して、分析要素の他の
層との接着力を強化することができる。

織物または織物生地からなる展開層を前述の吸水層、検
出層、反応試薬層または接着層などに接着、積層するに
は、特開昭５５−１６４３５６号および特開昭５７−６
６３５９号等に開示の方法を用いることができる。すな
わち、吸水層または接着層の塗布後未乾燥のうちに、ま
たは乾燥後の層に水（界面活性剤を少量含んでもよい）
を実質的に均一に供給して層を膨潤させた後、織物また
は編物生地を膨潤している層の上に重ねて、なるべく均
一に軽く圧力をかけながら接着し、一体化する。

展開層がブラシュボリマーまたはメンブランフィルタ−
からなる場合には特公昭５３−２１６７７号等、ポリマ
ーミクロビーズからなる三次元格子状構造物である場合
には特開昭５５−９０８５９号等、１紙または不織布か
らなる場合には特開昭５７−１４８２５０号等にそれぞ
れ記載の方法に従って設けることができる。

前述した検出層、接着層などの親水性ポリマーバインダ
ーがゼラチンまたはゼラチン誘導体の場合には、層の塗
布後ゼラチン等が未屹燥のゲル状！ぶの間に上記展開層
を構成する材料を接着、積層し一体化する方法を採用す
ることができる。

展開層に反応試薬たとえば基質、グルコース、酵素、補
酵素、活性化剤等、また必要に応じて親水性ポリマー、
＃１！街剤、光遮蔽性微粒子等を含有させるためには、
これらを含有する塗布液を展開層の上から公知の方法に
より塗布することができる。展開層が織物、編物、濾紙
、不織布等からなる場合には、試薬を含有する溶液に展
開層を浸漬したのち乾燥する方法も用いることができる
。上記のような展開層をラミネートにより積層する場合
には、上記のように浸漬した展開層を乾燥または半乾燥
状態で他の層に積層し一体化する方法を用いることもで
きる。塗布により形成される層、たとえばプラッシュポ
リマー等からなる層である場合には、この層の塗布液に
試薬、例えば基質、酵素等の溶液又は分散液を混合して
塗布してもよいや 本発明のＣＰＫ活性測定用分析要素において、基質であ
るＣＰおよびＡＤＰのうち少なくとも一つは展開層に含
まれるのが好ましい。

本発明の分析要素の試薬層は、親水性ポリマーを結合剤
とする連続相から成るものが好ましいが、その少なくと
も１つが展開層について述べたような多孔質層であって
もよい、試薬層には親水性ポリマー、緩衝剤、光反射性
微粒子等を必要に応じて含有させることができる。

試薬層に含有させることができる親水性ポリマーの例と
しては、澱粉、セルロース、アガロース、ゼラチンおよ
びこれらの誘導体くヒドロキシメチル化、ヒドロキシプ
ロピル化等）、アクリルアミド重合体、アクリルアミド
と各種ビニル性モノマーとの共重合体、ポリビニルアル
コール、ビニルピロリドン重合体、ビニルピロリドンと
各種ビニル性モノマーとの共重合体、アクリル酸重合体
、アクリル酸と各種ビニル性モノマーとの共重合体等を
挙げることができる。上記親水性ポリマーのうちではゼ
ラチン、ゼラチン誘導体、ポリビニルアルコール、ビニ
ルピロリドン重合体、アクリルアミド重合体またはセル
ロース誘導体が好ましい。

本発明の酵素活性測定要素は、試薬層の少なくとも１つ
にフォルマザン染料形成テトラゾリウム塩３含む。フォ
ルマザン染料形成テトラゾリウム塩を含むこの層は、１
６ｇ／ｍ２以下のゼラチンから成る。ゼラチンは、酸処
理、アルカリ処理いずれのタイプでもよく、脱イオン処
理されていてもよい、フタル化ゼラチン等のゼラチン誘
導体を、一部または全部に用いることができる。

試薬層は、反応試薬系のすべての成分を含んでもよく、
また一部のみを含んでもよい０反応試薬系のうち、ＣＰ
、ＡＤＰ、グルコース、ヘキソキナーゼ、Ｇ６ＰＤＨ，
ＮＡＤ−、電子イ芸達剤は、試薬層に含まれてもよいが
、多孔性担体層、例えば展開層に含んでもよい、フォル
マザン染料形成テトラゾリウム塩以外の反応試薬を含む
層は、親水性ポリマーを結合剤とする実質的に均一の層
であってもよいが、例えば特開昭５８〜７０１６３号、
特開昭６１−４９５９号、特願昭６０−２５６４０８号
、特願昭６０−２７９８５９号、同６０−２７９８６０
号、同６０−２７９８６１号等に記載されたような多孔
性層も適用できる。

試薬層に含有させることができる緩衝剤は、例えば炭酸
塩、ホウ酸塩、燐酸塩やＢｉｏｃｈｅ…１ｓｔｒ）’誌
第５巻（第２号）４６７ページより４７７ページ（１９
６６年）に記載されているＧｏｏｄのＷｉ衝剤などで、
これらの＆！衝剤は「蛋白質・酵素の基礎実験法１（堀
尾武−ほか著、南江堂、１９８１）等の公知文献を参考
にして選択しすることができる。試薬層にはさらに、後
述する光反射性粒子を含有させることもできる。

光透過性・水不透過性支持体は例えば、ポリエチレンテ
レフタレート、ポリカーボネート、ポリスチレン、セル
ロースエステル（セルローストリアセテート、セルロー
スアセテートプロピオネート等）等の合成または半合成
ポリマーからなる、厚さが通常５０μ履から５００μｌ
の透明フィルムである。支持体の表面には下塗層を設け
て、支持体に接して設け−られる試薬層その他の層と支
持体との接着を強化することができる。下塗層の代りに
、または同時に支持体の表面に物理的（たとえばグロー
放電、コロナ放電）あるいは化学的な活性化処理を施し
て接着力の向上を図ってもよい。

本発明の分析要素には、支持体の上に（下塗層等の層を
介してもよい）吸水層を設けることができる。吸水層は
一般に、被検成分の存在下で生成する色素が実質的に拡
散しない層で、水を吸収して膨潤する親水性ポリマーか
ら成る層が好ましい。

吸水層に用いることができる親水性ポリマーは、一般に
は膨潤率が３０℃で約１．５から１０の範囲の天然また
は合成親水性ポリマーである。そのような親水性ポリマ
ーの例として、アガロース、ポリアクリルアミド、ポリ
ビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等がある。吸
水層の乾燥時の厚さは１μｌから１００μ夏、好ましく
は約３μ履から約３０μｌの範囲である。さらに吸水層
には、必要に応じて界面活性剤（カチオン性、両性、非
イオン性、アニオン性）や緩衝剤を含有させることもで
きる。

光道へい層、濾過層、試薬層等の層の上には、展開層を
接着しｆａ層するための接着層を設けてもよい、接着層
は通常、水を含んで膨潤したときに展開層を接着するこ
とができる親水性ポリマーから成る。親水性ポリマーの
例としては、吸水層に用いられると同様なポリマーがあ
げられるが、ゼラチン、ポリアクリルアミド等が好まし
い。接着層の乾燥膜厚は一般に０．５μ屑から２０μ履
の範囲である。

本発明の分析要素には、光遮蔽層を設けることができる
。光遮蔽層は、親水性ポリマーをバインダーとして、光
反射性微粒子が分散されている水浸透性の層であること
が好ましい、光反射性微粒子は、試薬層等に生じた検出
可能な変化（色変化、発色等）を光透過性の支持体側か
ら反射測光する際に、展開層に点着供給された水性液体
の色、特に試料が全血である場合のヘモグロビンの赤色
等を遮蔽するとともに光反射層または背景層としても機
能する。

光反射性を有する微粒子の例としては、二酸化チタン微
粒子、硫酸バリウム微粒子が好ましい。

必要に応じ、液体展開層中に光反射性微粒子を含有させ
てもよい。

検出層にも光反射性微粒子を必要に応じて含有させるこ
とができる。

［実施例１］ 透明ポリエチレンテレフタレートフィルム（厚さ１８０
μｍ）の表面を親水化処理し、その上に下記組成の塗布
液を塗布、乾燥して乾燥膜厚１０μｍ（被覆量的１３．
３　ｇ／ｍ２）の発色層を形成した。

１色１１１籐： ゼラチン　　　　　　　　　　１００ｇ水　　　　　　
　　　　　　　　　　　９００ｇＮＴＢ＊　　　　　　
　　　　　　　６ｇ＊Ｎ１ｔｒｏｔｅｔｒａｚｏｌｉｕ
ｓ＋　ｂｌｕｅ　＝３．３’−（３，３−ジメトキシ−
４，４゛−ビフェニレン）−ビス［２−（ｐ−ニドミツ
８ニル）−５−フェニルテトテゾリウムクロティド］上
記発色層を約３０ｇ／ｍ”の水で湿らせた後、ポリエチ
レンテレフタレート紡績糸（３６ゲージ、５０Ｄ）から
なるトリコット編物を圧着し乾燥させて展ｒＭ層とした
。

上記展開層に、下記の組成の塗布液を１２０ｍ１／ｘ２
の割合で塗布、乾燥した。

６夷囮： 水　　　　　　　　　　　　　　　　　１８０ｇイミダ
ゾール　　　　　　　　　４ｇ クレアチンホスフェート・ ２ナトリウム　　　　　　　　６ｇ ＡＤＰ　　　　　　　　　　　　　２．４ｇＡＭＰ　　
　　　　　　　　　　　４ｇＥＤＴＡ−２ナトリウム　
　　　１．６ｇＭｇ（Ｊ、・６　Ｈ２０４ｇ グルコース　　　　　　　　　　　２ｇＮＡＤ“　　　
　　　　　　　　　２ｇＮ−アセチルシステイン　　　
　０．６ｇジアデノシンベンタホスフェート　　８０ｍ
ｇＧ６ＰＤＨ３万Ｕ ヘキソキナーゼ　　　　　　　４万Ｕ ジアフオラーゼ　　　　　　　３万Ｕ アスコルビン酸オキシダーゼ　３万Ｕ ポリアクリルアミド（平均分子量３，７万）（２０％水
溶液）　　　　　２００ｇ ＜２Ｎ−１−ＩＣＩによりｐＨ６，５に調整）以上の方
法により、本発明のＣＰＫ活性測定用分析要素を作成し
た。ＣＰＫを含まない７％ヒト血清およびＣＰＫ活性が
１４３，４９０，９８０および１８９４単位／１（３７
℃）と検定された管理血清１ｏａｎを、各々分析要素の
展開層に点着し、水分の蒸発が防止された状態で３７℃
恒温加熱板上に静置し、波長５４０ｎｍで２分後および
３分後に反射光学濃度を測定しな、測定結果を第１表に
示す。

第１表 ［比較ＩＭＩ］ 発色層塗布液中のゼラチンの量を　１５０ｇとした他は
、実施例１と同様にしてＣＰＫ活性測定用分析要素を作
製した。ゼラチンの被覆量約２０ｇ／ｍ２に相当する。

［試験例コ 第２表に示す条件で保存された実施例１および比較例１
の分析要素を用いて、１ｆｌ当たり約８０ユニツトのＣ
ＰＫを含む市販管理血清の酵素活性を測定した。結果を
第２表および第３表に示す。

第２表　保存前後のＣＰＫ活性測定値 第３表　保存前後の活性測定値く相対値）実施例１の４
℃、０日を１００とする。

実施例１のＣＰＫ分析要素は比較例１の分析要素に比し
、高温保存した後も酵素活性値の正誤差が小さいことが
判る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）多孔性担体を有し、該多孔性担体またはこれと液体
   接触関係にある水浸透性層にクレアチンリン酸、ＡＤＰ
   、クレアチンキナーゼに対し活性化作用をもつチオール
   化合物、グルコース、ヘキソキナーゼ、Ｇ６ＰＤＨ、Ｎ
   ＡＤ＾＋、電子伝達剤、およびフォルマザン染料形成テ
   トラゾリウム塩を含むクレアチンキナーゼ酵素活性測定
   用乾式分析要素であって、前記多孔性担体と液体接触関
   係にある水浸透性層の少なくとも１つにフォルマザン染
   料形成テトラゾリウム塩と１６ｇ／ｍ＾２以下のゼラチ
   ンを含有することを特徴とする分析要素。 ２）多孔性層、該多孔性層と液体接触関係にある水浸透
   性層および水不浸透性・光透過性支持体がこの順に一体
   に積層されている、特許請求の範囲１）記載の分析要素
   。 ３）前記水浸透性層（多孔性層と液体接触関係にある）
   の１つが１６ｇ／ｍ＾２以下のゼラチンから成りかつフ
   ォルマザン染料形成テトラゾリウム塩を含む、特許請求
   の範囲１）記載の分析要素。 ４）前記チオール化合物がＮ−アセチルシステインであ
   る特許請求の範囲１）記載の分析要素。 ５）フォルマザン染料形成テトラゾリウム塩がニトロテ
   トラゾリウムブルーである特許請求の範囲１）記載の分
   析要素。