JPH0579318B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、血液、血清などの水性液体試料中の
酵素あるいは酵素の基質などのアナライト（被検
物質）を乾式にて定量分析するために有用な酸化
型補酵素含有乾式分析要素に関する。 ［発明の技術的背景］ デヒドロゲナーゼ系酵素と補酵素とを共役反応
系に組合わせた反応は臨床化学分析において広く
用いられている。例えばグリセリンデヒドロゲナ
ーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、乳酸デ
ヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、
グルタメートデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒ
ドロゲナーゼ、α−グリセロフオスフエートデヒ
ドロゲナーゼ、グルコース−６−燐酸デヒドロゲ
ナーゼ等が関与する反応系が、トリグリセリド、
グリセリン、コレステロール、乳酸、グルタメー
ト、グリセリン−３−燐酸、グルコース−６−燐
酸等の基質や、アスパラギン酸アミノトランスフ
エラーゼ（AST）、アラニンアミノトランスフエ
ラーゼ（ALT）、乳酸デヒドロゲナーゼ
（LDH）、アミラーゼ、クレアチンキナーゼ
（CK）等の酵素の定量に用いられており、これら
の定量法は、反応系に存在させた酸化型補酵素か
ら還元型補酵素への変換の程度を、還元型補酵素
の増加または減少を直接測定する方法によつて定
量分析ができる特徴がある。しかしながら、還元
型補酵素として通常用いられるNADH（ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド）または
NADPH（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドフアスフエート）は、その吸収極大が340nｍ
付近にあるため、その光学的定量のためには、紫
外域光の測光装置が必要となり、機器が高価なも
のになる。また紫外域では多種の化合物が吸収を
有するためにそれらの干渉を受け易いとの問題も
ある。 このため、湿式分析法、すなわち、アナライト
を含む水性試料液と検出試薬とを水溶液中で反応
させて分析する方法では、生成するNADH（また
はNADPH）を紫外部吸収により直接に定量す
る代りに、生成したNADHの存在下で、電子伝
達性化合物を介して電子受容性染料形成性化合物
を還元し、可視領域において検出可能な化合物
（染料）を形成する反応系を利用することが提案
されている。 しかし、この反応系では、分析の目的物質でな
い脱水素酵素が混入した場合に正誤差が生じやす
い。特にヒト血清を測定する場合には、血清中の
乳酸脱水素酵素（LDH）と乳酸との反応によつ
て、酸化型ニコチンアミド補酵素から還元型ニコ
チンアミド補酵素が生成し、電子受容性染料形成
性化合物を発色させることがしばしばおこる。こ
の対策として反応溶液にピルビン酸塩を添加する
ことが特開昭55−104899号公報に示されている。 ［発明の要旨］ 本発明者は、検出試薬系として脱水素酵素、酸
化型ニコチンアミド補酵素、電子伝達性化合物、
および電子受容性染料形成性化合物を含有する検
出試薬層を有する乾式分析要素においても、上記
のピルビン酸塩の添加が測定誤差の低減に有効で
あろうと考え、その検出試薬層にピルビン酸塩を
添加して定量分析操作を行なつたところ、意外に
も分析要素の保存時にカブリ（着色）を生じ、充
分な分析精度が得られないことが判明した。 このため、本発明者は更に研究を行ない、その
結果、ピルビン酸塩は、酸化型ニコチンアミド補
酵素および電子受容性染料形成性化合物から分離
させた状態にて乾式分析要素に導入した場合に、
保存時のカブリ（着色）が発生せず、かつ分析操
作時の誤差も低減することが判明した。 すなわち、本発明は、光透過性水不透過性支持
体の上に検出試薬系として脱水素酵素、酸化型ニ
コチンアミド補酵素、電子伝達性化合物、および
電子受容性染料形成性化合物を含有する層を含む
二以上の層が形成された乾式分析要素において、 背景着色防止剤（カブリ防止剤）としてのピル
ビン酸塩が、前記補酵素と前記染料形成性化合物
を含む層とは異なる層に含有されていることを特
徴とする酸化型補酵素含有乾式分析要素にある。 なお、上記のピルジン酸塩は、通常の乾式分析
要素に設けられる多孔性展開層中に導入すること
が好ましい。また、ピルビン酸塩を含む層（好ま
しくは多孔性展開層）には、該分析要素に水性液
体試料を点着した場合に該分析要素内のPH値を
7.8〜10.5の範囲の値に調整するPH緩衝剤が含ま
れていることが好ましい。 ［発明の詳細な記述］ 本発明は、公知の多種の乾式分析要素に適用す
ることができる。特にデヒドロゲナーゼ酵素系と
還元型補酵素検出系と被検液体がいずれも浸透し
得る固体担体を含む分析要素に適用することがで
きる。分析要素は単一層で構成されてもよいが、
試薬層、反射層、多孔質展開層、光遮蔽層、濾過
層、検出（registration）層、吸水層、支持体、
下塗層および業界公知その他の層を含む多重層か
らなつていてもよい。このような分析要素の例と
しては、米国特許第3992158号および同4042335号
各明細書に開示のものがある。 本発明の乾式分析要素において、実用的に好ま
しい構成を次に挙げる。 (1) 支持体上に試薬層と展開層を有するもの (2) 支持体上に吸水層、試薬層、展開層をこの順
に有するもの (3) 支持体上に試薬層、反射層または濾過層、展
開層をこの順に有するもの (4) 支持体上に吸水層、試薬層、濾過層、展開層
をこの順に有するもの。 本発明の乾式分析要素に用いることができる光
透過性・水不透過性支持体の例としては、ポリエ
チレンテレフタレート、ビスフエノールＡのポリ
カルボネート、ポリスチレン、セルロースエステ
ル（例、セルロースジアセテート、セルロースト
リアセテート、セルロースアセテートプロピオネ
ート等）等のポリマーからなる厚さ約50μｍから
約１mm、好ましくは約80μｍから約300μｍの範囲
のフイルム、もしくはシート状の透明支持体を挙
げることができる。 支持体の上には直接、あるいは親水性ポリマー
を主成分とする接着層あるいは吸水層などの公知
の補助層に介して、上記の呈色性検出試薬組成物
を含む一もしくは二以上の検出試薬層が設けられ
る。 本発明の分析要素が含むことができる接着層や
吸水層の形成に用いられる親水性ポリマーは、一
般には、水吸収時の膨潤率が30℃で約1.5〜20、
好ましくは約2.5〜15の範囲の天然または合成親
水性ポリマーである。そのような親水性ポリマー
の例としては、ゼラチン（例、アルカリ処理ゼラ
チン、酸処理ゼラチン、脱イオンゼラチン等）、
ゼラチン誘導体（例、フタル化ゼラチン等）、ア
ガロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルアル
コール、ボリビニルピロリドン等を挙げることが
できる。さらに必要に大じて、界面活性剤（カチ
オン性、両性または非イオン性の界面活性剤）を
含有させることもできる。 検出試薬層には、呈色検出試薬組成物として、
脱水素酵素、酸化型ニコチンアミド補酵素、電子
伝達性化合物、および電子受容性染料形成性化合
物が含まれる。検出試薬層は、これらの検出試薬
成分の全てを一緒に含む単一層からなつていても
よく、あるいはそれらの検出試薬成分が複数の層
に別々に含まれるような複数の層からなつていて
もよい。 本発明の検出試薬組成物に用いられる脱水素酵
素（すなわち、酸化還元酵素）としては、分析目
的のアナライトに対応して、前述のように各種の
酵素が選ばれる。すなわち、本発明の乾式分析要
素は、所定の酸化還元反応により、酸化型ニコチ
ンアミド補酵素が電子受容体となる全ての物質の
測定が可能である。例えばグリセリンを測定する
場合には、グリセリンデヒドロゲナーゼ、乳酸を
測定する場合はラクテートデヒドロゲナーゼを添
加することでそれぞれの測定が可能となる。 本発明の乾式分析要素に用いられる検出試薬系
は、液体試料中における様々な種類の酸化還元酵
素活性の測定に使用することもできる。すなわ
ち、本発明の乾式分析要素では、酸化型ニコチン
アミド補酵素が電子受容体となる全ての酸化還元
酵素（脱水素酵素）の測定が可能である。上記の
ように、本発明の乾式分析要素を酸化還元酵素の
活性の測定に使用する場合には、上記検出試薬系
には、さらに、酸化還元酵素が触媒する酸化反応
（脱水素反応）の基質が加えられる。例えば、本
発明の分析要素を乳酸デヒドロゲナーゼ活性測定
用として用いる場合には、上記検出試薬系には、
さらに乳酸が含まれる。グルコース−６−燐酸デ
ヒドロゲナーゼの場合には、基質としてグルコー
ス−６−燐酸が添加される。 酸化型ニコチンアミド補酵素は、具体的には、
NAD⁺（ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチ
ド酸化型：単にNADとも書く）、またはNADP⁺
（ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド・ホ
スフエート酸化型：単にNADPとも書く）を意
味する。NAD⁺およびNADP⁺のうちでどちらを
使用するかは、分析対象として、あるいは検出試
薬として検出反応に関与する酸化還元酵素の種類
に応じて決定される。 電子伝達性化合物とは、被検物質の反応により
生成した還元型ニコチンアミド補酵素（電子供与
体）から電子を受け取つて、後述する電子受容性
染料形成性化合物を還元する機能を有する化合物
を意味する。電子伝達性化合物の具体例として
は、５−メチルフエナジニウム・メチルスルフエ
ートあるいは１−メトキシ−５−メチルフエナジ
ニウム・メチルスルフエート等のＮ−メチルフエ
ナジン・メトサルフエート類およびジアホラーゼ
〔ジヒドロリポアミドレダクターゼ、EC1.6.4.3.）
等を挙げることができる。 電子受容性染料形成性化合物は、上記電子伝達
性化合物により還元され、長波長領域において検
出可能な化合物（染料）を形成する物質である。
本発明の乾式分析要素において、電子受容性染料
形成性化合物としては、テトラゾリウム塩を用い
ることが好ましい。 テトラゾリウム塩の具体例としては、 ３，3′−（３，3′−ジメトキシ−４，4′−ビフエ
ニレン）−ビス［２−（ｐ−ニトロフエニル）−2H
−テトラゾリウムクロリド］（NBT）； ３−（ｐ−ヨードフエニル）−２−（ｐ−ニトロ
フエニル）−５−フエニル−2H−テトラゾリウム
クロリド］（INT）； ３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−
2H−テトラゾリウムブロミド（MTT）； ３，3′−（４，4′−ビフエニレン）−ビス（２，
５−ジフエニル）−2H−テトラゾリウムクロリ
ド； ３，3′−（３，3′−ジメトキシ−４，4′−ビフエ
ニレン）−ビス（２，５−ジフエニル）−2H−テ
トラゾリウムクロリド；および ３，3′−（３，3′−ジメトキシ−４，4′−ビフエ
ニレン）−ビス［２，５−ビス（ｐ−ニトロフエ
ニル）−2H−テトラゾリウムクロリド］を挙げる
ことができる。 なお、上記酸化型ニコチンアミド補酵素、電子
伝達性化合物および電子受容性染料形成性化合物
を含む反応系の詳細については、 A.J.Babson等による「CLINICA CHIMICA
ACTA」Vol.12、210−215頁（1965）； R.J.Gay等による「CLINICAL
CHEMISTRY」Vol.14(8)、740−753頁
（1968）；および、 R.D.Capps等による「CLINICAL
CHEMISTRY」Vol.12(7)、406−413頁
（1966）；等の文献に記載されている。 検出試薬層の上には直接、あるいは接着層、吸
水層、光反射層、光遮蔽層、濾過層などの補助層
を介してピルビン酸塩を含む多孔性展開層が設け
られる。 吸水層は、前述のように親水性ポリマーから形
成することができる。 光遮蔽層あるいは光反射層は、皮膜形成能を有
する親水性ポリマーをバインダーとして、これに
光反射性微粒子が分散されている水浸透性の層で
あることが好ましい。光反射性微粒子は、試薬層
（または吸水層）に生じた検出可能な変化（色変
化、発色等）を光透過性を有する支持体側から反
射測光する際に、展開層に点着供給された水性液
体の色、特に試料が全血である場合のヘモグロビ
ンの赤色等を遮蔽するとともに、光反射層または
背景層としても機能する。光反射性を有する微粒
子の例としては、二酸化チタン微粒子、硫酸バリ
ウム微粒子が好ましい。本発明において、必要に
応じ展開層中にも上記のごとき光遮蔽性微粒子を
含有させてもよい。 吸水層、光遮蔽層、濾過層、試薬層等の層の上
には、展開層を接着し積層するための接着層を設
けてもよい。接着層は水で湿潤しているとき、ま
たは水を含んで膨潤したときに展開層を接着する
ことができるような親水性ポリマーからなること
が好ましい。接着層に用いることができる親水性
ポリマーの例としては、吸水層に用いられると同
様な親水性ポリマーが挙げられる。これらのうち
ではゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルア
ミド等が好ましい。接着層の乾燥膜厚は一般に約
0.5μｍ〜約20μｍ、好ましくは約1μｍ〜約10μｍの
範囲である。なお、接着層は検出層の上外にも、
他の層間の接着力を向上させるため所望の層の上
に設けてもよい。接着層は親水性ポリマーと必要
によつて加えられる界面活性剤等を含む水溶液を
公知の方法で、試薬層等の上に塗布する方法など
により設けることができる。 多孔性展開層にはピルビン酸塩が含まれる。 多孔性展開層には液体計量作用（メータリン
グ）作用を有する展開層であることが特に好まし
い。液体計量作用を有する展開層とは、その表面
に点着供給された液体試料を、その中に含有して
いる成分を実質的に偏在させることなく、横（水
平）方向に単位面積当りほぼ一定量の割合で広げ
る作用を有するものである。 展開層のマトリツクスを構成する材料として
は、瀘紙、不織布、織物生地（例、ブロード、ポ
プリン等の平織等）、織物生地（例、トリコツト
編、ダブルトリコツト編、ミラニーズ編等）、ガ
ラス繊維濾紙、ブラツシユポリマーより形成され
るメンブランフイルター、あるいはポリマーミク
ロビーズ等からなる三次元格子状構造物等を用い
ることが好ましい。これらのうちでは、試薬類の
保持性の点で、織物生地および編物生地に代表さ
れる繊維質層を用いることが特に好ましい。 本発明の乾式分析要素に用いることができる織
物生地または編物生地は水洗等の脱脂処理によつ
て、少なくとも糸製造時、織物製造時あるいは編
物編成時に供給され、または付着した油脂類を実
質的に除去した織物または編物生地が好ましい。 上記織物または編物生地を一体型多層分析要素
の展開層として用いる場合には、さらにその織物
または編物生地に特開昭57−66359号公報に開示
の物理的活性化処理（好ましくはグロー放電処理
またはコロナ放電処理等）を生地の少なくとも片
面に施すか、あるいは特開昭55−164356号、特開
昭57−66359号公報等に開示の親水性ポリマー含
浸処理等の親水化処理またはこれらの処理工程を
逐次実施することにより、織物または編物を親水
化し、下側（支持体に近い側）の層との接着力を
強化することができる。 織物または編物生地からなる一体型多層分析要
素の展開層を吸水層または接着層に接着、積層す
るには、特開昭55−164356号および特開昭57−
66359号公報等に開示の方法に従つて作成するこ
とができる。すなわち、吸水層または接着層の塗
布後未乾燥のうちに、または乾燥後の層に水（ま
たは界面活性剤を少量含む水）を実質的に均一に
供給して層を膨潤させ、ついで織物または編物生
地を湿潤または膨潤している層の上に実質的に均
一に軽く圧力をかけながら接着、積層し一体化す
る。 また展開層がブラツシユポリマーまたはメンブ
ランフイルターからなる場合には特公昭53−
21677号公報等、ポリマーミクロビーズからなる
三次元格子状構造物である場合には特開昭55−
90859号公報等、濾紙または不織布からなる場合
には特開昭57−148250号公報等にそれぞれ記載の
方法に従つて設けることができる。 本発明の分析要素に含有されるピルビン酸塩は
乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の影響を低減す
ることができるか、あるいはLDH活性を阻害で
きるのであれば、いかなる塩でも用いることがで
きる。すなわち、一般的には、ピルビン酸カリウ
ム、ピルビン酸リチウム、ピルビン酸ナトリウム
などのピルビ酸アルカリ金属塩を用いることがで
き、それらのうちではピルビン酸カリウムが好ま
しい。液体試料添加時の分析要素内のPH値を高値
側に維持するのが必要な場合にはピルビン酸リチ
ウムが好ましい。 本発明の分析要素におけるピルビン酸塩の含有
量は、通常は約50mg／m²〜約1000mg／m²の範囲に
あり、好ましくは約100mg／m²〜約500mg／m²の範
囲にある。 多孔性展開層には、本発明の乾式分析要素に水
性液体試料を点着した場合に該分析要素内のPH値
を7.8〜10.5の範囲の値に調整するPH緩衝剤が含
まれていることが好ましい。そのようなPH緩衝剤
の例としては、２−アミノ−２メチル−１，３−
プロパンジオール、２−アミノ−２−エチル−
１，３−プロパンジオール、ジエタノールアミ
ン、エタノールアミン、２−アミノ−２−メチル
−１−プロパンジオール、トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン、トリメチルアミン等が挙げ
られる。このほかに用いうるPH緩衝剤としては、
日本化学会編「化学便覧 基礎偏」（東京、丸善
(株)、1966年発行）1312−1320頁R.M.C.Dawson
et al編「Data for Biochemical Research」第
２版（Oxford at the Clarendon Press、1969年
発行）476−508頁、「Biochemistry」５、467頁
以降（1966年）、「Analytical Biochemistry」
104 300−310頁（1980）等に記載のPH緩衝剤系
がある。 展開層は展開を制御するために、親水性ポリマ
ー、界面活性剤を含有させることができる。 親水性ポリマーとしては、セルロース誘導体、
ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、
ポリアクリルアミド等を挙げることができる。 界面活性剤としては、非イオン、両性、カチオ
ン、アニオンなどの各種界面活性剤からの分析項
目により適宜選択できる。また塗布層を通過しに
くいアナライト（親油性高分子量物質）の分析た
めには、展開層に反応試薬の一部、酵素などを含
ませることもできる。 本発明の乾式分析要素においては、ピルビン酸
塩は酸化型補酵素と電子受容性染料形成性化合物
の二者と接触して混在することなく、実質的に隔
離されて存在する必要がある。実質的に隔離され
て存在する好ましい具体的態様としては、上記の
ように、別に設けた多孔性展開層にピルビン酸塩
を含有させる方法がある。あるいは、酸化型補酵
素と電子受容性染料形成性化合物を含む親水性の
層（これら二物質は一層に含有されていても、あ
るいは別々に二層に含有されていてもよい）の上
方にピルピン酸塩を含む層を前記親水性ポリマー
バインダーを実質的に膨潤させない有機溶媒分散
液または溶液を用いて塗布し乾燥して設ける方
法、および前記同様の有機溶媒分散液または溶液
を塗布またはスプレーし、乾燥させて含有させる
方法等がある。ただし、以下の製造例では、展開
層にピルビン酸塩を含有させる態様を例にして説
明する。 本発明の分析要素は、上記のような材料を用い
て、前述の諸特許公報に記載の公知の方法により
調製することができる。 本発明の分析要素の好ましい製造方法において
は、ピルビン酸塩、PH緩衝剤と、必要により併用
される親水性ポリマーを、前記試薬組成物を実質
的に溶解しない有機溶媒に溶解または分散して多
孔性展開層に加える。有機溶媒は、このような条
件を満たすものであればよいが、一般的には沸点
が100℃以下の極性溶媒がよく、例えば脂肪族ア
ルコール（例、メタノール、エタノール、プロパ
ノール、ブタノール、イソプロピルアルコール）、
ジアルキルケトン（例、アセトン）、ジアルキル
エーテル（例、ジメチルエーテル）、脂肪族状エ
ーテル（例、テトラヒドロフラン、ジオキサン）
等が適当である。これらのなかでは脂肪族アルコ
ールが好ましく、作業環境等も考慮するとエタノ
ール、プロパノール、ブタノール、イソプロピル
アルコール等の人体の毒性の小さいアルコールが
特に望ましい。溶液または分散液の濃度は、含有
を容易に行なうことができ、かつ多孔性展開層に
均一に浸透させうる範囲でなるべく高濃度にする
のがよく、これはピルビン酸塩、PH緩衝剤と、必
要により併用される親水性ポリマーの種類等にも
よるが、例えば、約0.2％〜約10％、好ましくは
約0.3％〜約７％の範囲が適当である。溶液の調
製は常法によればよい。呈色試薬組成物の展開層
へのマイグレーシヨンが実質的に生じない範囲で
有機溶媒に水を混合して用いることができる。 展開層に界面活性剤を含有せしめる場合には、
ピルビン酸、PH緩衝剤（必要により親水性ポリマ
ーも併用する）と界面活性剤の混合溶液にしても
よく、別々の溶液にして別個に含有させてもよ
い。 ピルビン酸塩（そして好ましくはPH緩衝剤も一
緒に）の多孔性展開層への含有は、該展開層を積
層した後に行なうのがよい。展開層がミクロフイ
ルター、編物あるいは織物などの構造体の場合に
は先に含有させてから積層することもできるがそ
の場合には含有量のコントロールが難しいという
問題点がある。従つて、展開層を試薬層の上に
（直接、または接着層等を介して）設けた後にピ
ルビン酸塩とPH緩衝剤と展開層中に含有させるの
が、分析精度および製造コストの点で有利であ
る。これらを含有させるためには、例えば多孔性
展開層の上から公知の方法により均一に塗布ある
いは噴霧すればよい。乾燥は風乾あるいは減圧乾
燥等によつて行なえばよい。 本発明の乾式分析要素は、一体型多層分析要素
とした場合には、一辺約15mmから約30mmの正方形
またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特
開昭57−63452号、特開昭54−156079号、実開昭
56−142454号、実開昭58−32350号および特表昭
58−501144号各公報等に開示のスライド枠等に納
めて分析スライドとして用いるのが、製造、包
装、輸送、保存および測定操作等の全ての観点で
好ましい。 本発明の乾式分析要素は、約5μから約30μ
、好ましくは約8μから約15μの水性液体試
料を展開層に点着供給し、必要に応じて約20℃か
ら約45℃の範囲の実質的に一定の温度にてインク
ベーシヨンするような方法で使用される。そして
その後、一方の側から（一体型多層分析要素にお
いては光透過性支持体側から）、乾式分析要素内
の色変化、発色等の検出可能な変化を反射測光し
比色法の原理により液体試料中の測定対象成分を
分析する。 ［発明の効果］ 本発明の乾式分析要素において、酸化型ニコチ
ンアミド補酵素、電子伝達性化合物および電子受
容性染料形成性化合物、脱水素酵素を用いる系に
おいて、測定検体中の乳酸脱水素酵素の影響を、
ピルビン酸塩を添加することによつて大幅に低減
させ、さらに酸化型ニコチンアミド補酵素、電子
受容性染料形成性化合物を含む層とピルビン酸塩
を別の層に配置することによつて、保存時の着色
（カブリ）を著しく防ぐことができる。このよう
な構成の乾式分析要素としたことにより、本発明
の分析要素の使用により分析結果の再現性、検出
精度が顕著に向上する。 実施例 １ ゼラチン下塗りが施されている無色透明の厚さ
180μｍのPET（ポリエチレンテレフタレート）上
に下記処方で乾燥膜厚が12μｍになるように塗布
し、乾燥して、検出試薬層を形成した。 アルカリ処理ゼラチン 10ｇ ノニルフエノキシ・ポリエトキシエタノール（オ
キシエチレン単位平均15含有） 0.05ｇ ATP 0.9ｇ 硫酸マグネシウム 0.7ｇ クエン酸ナトリウム 2.0ｇ NAD 0.5ｇ ニトロテトラゾリウムブルー 0.2ｇ ジアホラーゼ 2830U グリセロールキナーゼ 880U グリセロール−３−燐酸デヒドロゲナーゼ 5410U 水 80ｇ 注：ニトロテトラゾリウムブルーの化学名は、
３，3′−（３，3′−ジメトキシ−４，4′−ビフエニ
リレン）ビス（２，５−ジブエニル−2H−テト
ラゾリウム）ジクロリドである。 なお、上記検出試薬層の塗布量は、アルカリ処
理ゼラチンが16ｇ／m²（支持体表面積）となるよ
うな量である。 検出試薬層の上層に、下記処方で乾燥膜厚が
7μｍになるように塗布し、乾燥して、光遮蔽層
を設けた。 ルチル型二酸化チタン 30ｇ アルカリ処理ゼラチン ５ｇ ノニルフエノキシ・ポリエトキシエタノール（オ
キシエチレン単位平均15含有） 0.2ｇ 水 60ｇ なお、上記光遮蔽層の塗布量は、アルカリ処理
ゼラチンが2.7ｇ／１m²（支持体表面積）となる
ような量である。 光遮蔽層の上層に、展開層を接着するために下
記処方で、乾燥塗布厚が7μｍになるように塗布
し、乾燥して接着層を形成した。 アルカリ処理ゼラチン ４ｇ ノニルフエノキシ・ポリエトキシエタノール（オ
キシエチレン単位平均15含有） 0.1ｇ 水 90ｇ なお、上記光遮蔽層の塗布量は、アルカリ処理
ゼラチンが9.3ｇ／１m²（支持体表面積）となる
ような量である。 次に、塗布層上に30ｇ／m²の割合で、水を湿し
水として供給湿潤させたのち、グロー放電で親水
化処理したポリエチレンテレフタレート紡績糸
（50デニール）からなるトリコツト編物生地（平
均厚さ250μｍ）を圧着ラミネートして多孔性展
開層を設けた。この上に下記処方液を１m²当り
100mlの割合で塗布し、乾燥して、中性脂肪検出
用の乾式多層分析要素を得た。 エチルアルコール 500ml ノニルフエノキシ・ポリエトキシエタノール（オ
キシエチレン単位平均40含有） ５ｇ ２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオ
ール ９ｇ リポプロテインリパーゼ 11400U ピルビン酸ナトリウム １ｇ 水 ２ｇ なお、上記液は、ピルビン酸ナトリウムと水以
外の成分を含むエタノール溶液を調製し、これに
ピルビン酸ナトリウム水溶液を少しずつ滴下攪拌
して、ピルビン酸ナトリウムを分散させて調製し
た。なお、上記のPH緩衝剤（２−アミノ−２−メ
チル−１，３−プロパンジオール）は、上記分析
要素にヒト血漿などの液体試料を添加した場合
に、分析要素内のPHを約8.4〜8.7に調整する。 完成した分析要素を1.5cm×1.5cmの正方形のチ
ツプに裁断し、特開昭57−63452号公報に開示の
プラスチツクマウントに収めて中性脂肪定量用化
学分析スライドを完成した。 各スライドにヘパリン採血した中性脂肪濃度値
62、167、238、383、527、659mg／dl（グリセロ
ール三燐酸法を用いた溶液分析法で求めた）のヒ
ト血漿を10μ点着し、37℃、６分間インキユベ
ーシヨンした後、中心波長640nｍの測定光で支
持体側から発色の反射光学濃度を測定し検量線を
作成した。次に、ヒト血漿にブタ心臓由来乳酸脱
水素酵素（LDH）（凍結乾燥由来品）を添加して
活性の異なるLDH液を作成し、検量線と同様の
方法で発色、反射光学濃度を測定し作成検量線か
ら中性脂肪濃度に換算し、試料中のLDHの影響
を測定した。 比較例 １ 比較例１として検出試薬層に、展開層を塗布し
た量と単位面積当り同量になるようにピルビン酸
塩を添加した以外は、実施例１と同様にして、比
較用の分析要素を作成して、同様な方法により、
乳酸脱水素酵素の影響、そして保存時の着色カブ
リへの影響を調べた。 比較例 ２ 比較例２としてピルビン酸塩の添加を行なわな
かつた以外は、実施例１と同様にして、比較用の
分析要素を作成して、同様な方法により、乳酸脱
水素酵素の影響、そして保存時の着色カブリへの
影響を調べた。 ［測定結果］ 実施例１の乾式多層分析要素と比較例１、２の
乾式多層分析要素をそれぞれ用いて得られた測定
結果を、第１表乃至第３表に示す。 【表】 【表】 【表】 これらの測定結果から、本発明に従う実施例１
の酸化型補酵素含有乾式分析要素が、乳酸脱水素
酵素の影響が少ない上に、保存時のカブリ（着
色）が少なく、優れていることが明らかである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 光透過性水不透過性支持体の上に検出試薬系
   として脱水素酵素、酸化型ニコチンアミド補酵
   素、電子伝達性化合物、および電子受容性染料形
   成性化合物を含有する層を含む二以上の層が形成
   された乾式分析要素において、 背景着色防止剤としてのピルビン酸塩が、前記
   補酵素と前記染料形成性化合物を含む層とは異な
   る層に含有されていることを特徴とする酸化型補
   酵素含有乾式分析要素。 ２ ピルビン酸塩を含む層に、該分析要素に水性
   液体試料を点着した場合に該分析要素内のPH値を
   7.8〜10.5の範囲の値に調整するPH緩衝剤が含ま
   れている特許請求の範囲第１項記載の酸化型補酵
   素含有乾式分析要素。 ３ ピルビン酸塩が、ピルビン酸ナトリウム、ピ
   ルビン酸カリウム、およびピルビン酸リチウムか
   らなる群より選ばれるものである特許請求の範囲
   第１項記載の酸化型補酵素含有乾式分析要素。 ４ 電子受容性染料形成性化合物がテトラゾリウ
   ム塩である特許請求の範囲第１項記載の酸化型補
   酵素含有乾式分析要素。 ５ 該分析要素が多孔性展開層を含み、かつピル
   ビン酸塩が該多孔性展開層に含有される特許請求
   の範囲第１項記載の酸化型補酵素含有乾式分析要
   素。