JPS63247657A - 乾式分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の属する分野］ 本発明は液体中の特定成分の検出定量に有用な乾式分析
要素、特に過酸化水素を生成し得るか過酸化水素を生成
する反応に関与する、液体中の特定成分の検出に適する
乾式分析要素に関する。

［従来技術］ 液体中の特定成分を、その成分が関与する反応の結果生
成する過酸化水素を検出して定量する分析方法は、種々
知られている。それらの中で、米国特許４，０８９，７
４７号や特開昭５９−１９３３５２号に記載されたイミ
ダゾール核を有するロイコ色素を利用する方法がある。

これらロイコ色素は、１モルの過酸化水素から１モルの
色素を生成し、色素の分子吸光係数が高いので、検出感
度が高い利点をもつ、しかし退色が比較的大きい欠点が
あった。

［発明の解決しようとする課題］ 液体中の特定成分を、その成分が関与する反応の結果生
成する過酸化水素を、イミダゾール核を有するロイコ色
素を利用検出して定量する乾式分析要素において、ロイ
コ色素の退色を実質的に除くことである。

［技術的課題の解決手段］ 上記の技術的課題は、下記一般式［１］で表されるロイ
コ色素を疎水性溶媒に溶解した溶液の親水性媒体中への
分散物として、水浸透性層に含む乾式分析要素によって
、解決された。

阿 一般式［Ｉ］において、Ｒ’は置換されてもよいアリー
ル基を、Ｒ２は置換されてもよいアルキル基を、Ｒ３は
置換されてもよいアリール基を表す。

Ｒ１で表されるアリール基例えばフェニル基の、有して
もよい置換基は、例えばヒドロキシ基、アルコキシ基、
アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基等で
あるが、ジアルキルアミノ基、例えばジメチルアミノ基
、ジエチルアミノ基が好ましい。

Ｒ２で表されるアルキル基、例えばメチル基、エチル基
等は、無置換でもよいが、置換されてもよく、例えばフ
ェニル基、フェノキシ基、４−ジメチルアミノフェニル
基等で置換されてもよい。

Ｒ３で表されるアリール基の有してもよい置換基は、例
えばヒドロキシ基、アルコキシ基（炭素原子数１ないし
４が好ましい〉等である。

Ｒ１で表されるアリール基の代表例は４−ジメチルアミ
ノフェニル基および４−ジエチルアミノフェニル基であ
る　ｒ（２で表されるアルキル基の代表例はベンジル基
およびフェネチル基であり、好ましいのはフェネチル基
である。Ｒ３で表されるアリール基の代表例は４−ヒド
ロキシフェニル基および３．５−ジメトキシ−４−ヒド
ロキシフェニル基である。

上記ロイコ色素の合成法は特開昭５９−１９３３５２号
に記載されている。

体液などに含有されている生化学物質を定量するに適す
る乾式分析要素はすでに知られており、例えば特開昭４
９−５３８８８号（米国特許第３，９９２，１５８号に
対応）、同５５−１６４３５６号、同５９−１０２３８
８号等に記載されている。乾式分析要素では一般に、被
検成分と分析要素内に含まれる試薬との反応の反応生成
物または未反応成分の量を、光学的に、例えば発色、変
色、蛍光、発光等の分光測光により測定し、被検成分を
定量する。乾式分析要素を用いると、簡便、迅速に、し
かも高い精度で液体中の特定成分、例えば生化学的活性
物質の分析ができる。

本発明の分析要素は、少なくとも１つの水浸透性層を有
する。好ましくは、少なくとも２層の水浸透性層を有す
る。支持体を有しなくてもよいが、支持体を有すること
が好ましい、支持体は光透過性であることが好ましく、
さらに水不浸透性であることが好ましい。

一一一色素は、試料液中の所要の特定成分と分析要素中
の組成物との相互作用によって生成してもよいし、上記
特定成分の関与、例えば触媒作用の下に、分析要素中の
成分の間の相互作用によって生成してもよい、相互作用
は単一の反応から成ってもよいし、複数の反応から成っ
てもよい、「相互作用Ｊなる用語は、化学活性、酵素−
基質複合体の形成におけるような触媒活性、抗原−抗体
反応におけるような免疫原活性、その他、染料の濃度が
直接的また間接的に特定の分析物質の存在または濃度を
示すような検出可能な染料を生成できる全ての型の化学
的または物理的相互作用を指す。

上記の相互作用組成物は、選択される分析反応系によっ
て決まる。試料液中の酵素活性を測定する場合には、相
互作用組成物に当該酵素に対する基質を含むことを必要
とする。試料液中の被検成分が酵素の基質である場きに
は、相互作用組成物に当該基質に対する酵素活性物質を
含むことによリ、分析を実行することができる。

本発明で有用な相互作用組成物は、例えば酸化酵素活性
を有する物質を含むものである。酵素、例えばグルコー
スオキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、コレステ
ロールオキシダーゼ等のようなオキシダーゼ活性物質を
、このような酵素に対する基質である成分の分析のため
に分析要素の試薬層や液体展開層（後述）に含ませるこ
とができる。またこれらの基質を別の酵素反応や免疫反
応（抗原抗体反応）の結果生ずる酵素、基質、抗原、抗
体等の分析にも適用できる。

疎水性溶媒、親水性媒体、および分散方法は、後に述べ
るように、公知のものを用いることができる。

本発明に用いる有用なロイコ色素の具体例を以下に示す
。

（ＪＩＶｉｌ！ （発明の具体的実施態様コ 前記一般式のロイコ色素は、軸式分析要素の少なくとも
１つの水浸透性層に含まれる。水浸透性層は多孔性層で
あってもよいが、親水性ポリマーを結合剤とする無孔層
が好ましい、親水性ポリマーとして例えば、ゼラチンお
よびこれらの誘導体（ＩＮえばフタル化ゼラチン）、セ
ルロース誘導体（例えばヒドロキシメチルセルロース）
、アガロース、アクリルアミド重合体、メタアクリルア
ミド重合体、アクリルアミドまたはメタアクリルアミド
と各種ビニル性モノマーとの共重合体等が利用できる。

前記ロイコ色素は、これらの親水性ポリマーの連続相の
中に、疎水性溶媒に溶解した溶液の分散物として含まれ
る。疎水性溶媒としては、重層ゼラチン／ハロゲン化銀
カラー写真感光材料で普通に用いられる疎水性溶媒を利
用できる。ＰＡえば、米国特許２，３２２，０２７号に
記載された溶媒を用いることができる１例えば、フタル
酸ジエステル類、例えばジブチルフタレート、ジシクロ
へキシルフタレート、ジー２−エチルへキシルフタレー
ト、デシルフタレート等；リン酸エステル類、例えばト
リフェニルホスフェート、トリクレジルホスフェート、
２−エチルヘキシルジフェニルホスフェート、トリシク
ロへキシルホスフェート、トリー２−エチルへキシルホ
スフェート；安７ｇ、香酸エステル類、例えば２−エチ
ルへキシルベンゾエート；アミド類、例えばＮ、Ｎ−ジ
エチルラウリルアミド、Ｎ−デトラデシルビロリドン；
フェノール類、例えば２．４−ジ−ｔ−アミルフェノー
ル、脂肪酸エステル類、例えばくえん酸トリオクチル：
炭化水素類、例えばパラフィン；ハロゲン化炭化水素、
例えば塩素化パラフィン等を挙げることができる。これ
らは一般に高沸点溶媒である。

ロイコ色素をこれらの高沸点溶媒中に溶解する際、高沸
点溶媒のみを用いてもよいが、低沸点溶媒を同時に用い
てもよいし、またまず低沸点溶媒に溶解した後、高沸点
溶媒と混合してもよい、低沸点溶媒としては、沸点が５
０℃以上、１６０℃以下の有機溶媒、例えば脂肪酸エス
テル類、例えば酢酸エチル、酢酸ブチル、酢酸−２−二
トキシエチル；ケトン類、例えばメチルエチルケトン；
アミド類、例えばジメチルホルムアミド等が利用できる
。

ロイコ色素の溶液を前記親水性ポリマーの水溶液中に分
散するためには、公知の種々の分散方法、特に水中油滴
型分散物の調製に適する分散方法を用いることができる
０分散に当たってドデシルベンゼンスルホン酸すトリウ
ム等の、界面活性剤を用いることが好ましい。

本発明は公知の多種の乾式分析要素に適用することが出
来る。要素は多孔性層、試薬層のほか、支持体、展開層
、検出層、光遮蔽層、接＠層、ろ過層、吸水層、下塗り
層その他の層を含む多重層の構成を有してもよい、かよ
うな分析要素として、米国特許第３，９９２，１５８号
、同４，０４２，３３５号および特開昭５５−１６４３
５６号各明細書に開示されたものがある。

光透過性水不透過性支持体を用いる場合、本発明の乾式
分析要素の実用的に採りうる構成は（１）支持体上に試
薬層、その上に展開層を有するもの。

（２）支持体上に検出層、試薬層、展開層をこの順に有
するもの。

（３）支持体上に試薬層、光反射層、展開層をこの順に
有するもの。

（４）支持体上に検出層、試薬層、光反射層、展開層を
この順に有するもの。

（５）支持体上に検出層、光反射層、試薬層、展開層を
この順に有するもの。

（６）支持体上に第二試薬層、光反射層、第一試薬層、
展開層をこの順に有するもの。

（７）支持体上に検出層、第二試薬層、光反射層、第一
試薬層、展開層をこの順に有するもの。

上記（１）ないしく５）において試薬層は異なる複数の
層から成ってもよい、支持体と試薬層または検出層との
間には吸水層を設けてもよい、上記（１）ないしく３）
と（６）において試薬層と検出層または展開層の間にろ
過層を設けてもよい。

上記（３）ないしく７）において光反射層と検出層、試
薬層または展開層との間、試薬層と検ｉＪｊ層との間ま
たは試薬層と展開層の間に、さらにろ過層を設けてもよ
い。試薬層が複数層から成る場合に、試薬層と試薬層の
間にさらにろ過層を設けてもよい。

本発明は全血、血漿または血清中の種々の分析物質の定
量に有用である０本発明は、例えばグルコース、コレス
テロール、尿酸、グリセロール、トリグリセリド、尿酸
、ビリルビンなどの代ツ（物質の定量に有用であるのみ
ならず、クレアチンキナーゼ、トランスアミナーゼ（例
えばアラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン
アミノトランスフェラーゼ）、加水分解酵素（例えばア
ミラーゼ、酸性ホスファターゼ、アルカリホスファター
ゼ等）等の酵素活性の測定にも有用である。

本発明は又、特定の抗体または抗原を用いた免疫分析に
も使用できる。

本発明の乾式分析要素の試薬層としては、親水性ポリマ
ーを結合剤とする実質的に均一の層のほか、例えば特開
昭５８−７０１．６３号、特開昭６１−４９５９号、特
願昭６０−２５６４０８号、同６０−２７９８５９号、
同６０−２７９８６０号、同６０−２７９８６１号等に
記載されたような多孔性層も用いることができる。

試薬層は、相互作用組成物の総てを含んでもよく、また
一部のみを含んでもよい、ただし試薬層は前記ロイコ色
素を含むものとする。試薬層にはロイコ色素のほか、酵
素、補酵素、酵素に対する基質、酸化剤、緩衝剤等を含
有させることができる。

本発明の分析要素の試薬層に含有させることができる緩
衝剤の例としては、炭酸塩、ホウ酸塩、燐酸塩やＢｉｏ
ｃｈｅ鴫１ｓｔｒｙ誌　第５巻　第２号、４６７ページ
より４７７ページ（１９６６年）に記載されているグツ
ド（Ｇｏｏｄ　）のＩＨＦｆ剤などを挙げることができ
る。これらの緩衝剤は「蛋白質・酵素の基礎実験法１（
堀尾武−ほか著、南江堂、１９８１年）、前記［１ｉｏ
ｃｂｅｍｉｓＬｒｙ誌第５巻等の文献を参考にして選択
することができる。

多孔性層を展開層として利用する場合、液体計量作用を
有する層であることが好ましい、液体計量作用とは、そ
の表面に点着供給された液体試↑゛１を、その中に含有
している成分を実質的に漏布させることなく、面の方向
に単位面積当りほぼ一定呈の割合で広げる作用である。

展開層その他の多孔性層を構成する材料としては、２紙
、不織布、ＡＩ物生地（例えば下織生地）、編物生地（
例えば、トリコット編）、ガラス繊維ｒ紙等を用いるこ
とができる。展開層としては、これらのうち織物、編物
等が好ましい、織物等は特開昭５７−８６３５９号に記
載されたようなグロー放電処理をしてもよい、展ｊｍ層
には、展開面積、展開速度等を調節するため、特開昭６
０−２２２７７０号、特願昭６１−１２２８７５号、６
１−１２２８７６号、６１−１４３７５４号に記載した
ような親水性高分子あるいは界面活性剤を含有してもよ
い。

多孔性層を接着し積層するための接着層を、試薬層、光
反射層、濾過層、吸水層、検出層等の層の上に設けても
よい、接着層は水で膨潤したときに多孔性層を接着する
ことができるような親水性ポリマー、例えばゼラチン、
ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド、澱粉等からなる
。

本発明の分析要素は光反射層を有してもよい。

例えば、試薬層と検出層との間、または試薬層と液体展
開層との間に、光反射層を設けることができる。光反射
層は、検出層、試薬層等に生じた検出可能な変化（色変
化、発色等）を光透過性を有する支持体側から反射測光
する際に、展開層に点着供給された被検液の色、特に試
料が全血である場合のヘモグロビンの赤色、ビリルビン
の黄色等を遮蔽するとともに光反射層または背景層とし
て機能する。光反射層は、親水性ポリマーをバインダー
として、酸化チタン、硫酸バリウム等の光反射性微粒子
が分散された水浸透性の層であることが好ましい、バイ
ンダーとしてはゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリ
ルアミド等が好ましい。

ゼラチンのような硬化可能なポリマーには硬膜剤を加え
てもよい０分析要素には、必要に応じ展開層、試薬層、
検出層等に酸化チタン等の粒子を含有させてもよい。

本発明の分析要素は、液体展開層とは別に全血球を実質
的にろ過して除去する層を有してもよい。

例えば特開昭５８−７０１６３号、特開昭８１−４９５
９号、特願昭６０−２５６４０８号、同６０−２７９８
５９号、同６〇−２７９８６０号、同６０−２７９８６
１号等に記載されたような多孔性層は好適である。

試料全血を適用後、試験結果を早く又は正確に得るため
に、インキュベーション（加熱）を要素に対して行なう
ことができる。

分析成分が存在するならば、サンプル中の分析成分の濃
度に基づく速度で分析物質が相互作用組成物と相互作用
する。染料を検出するための適当な装置に分析要素を通
すことによって、染料の形成速度を測定するか、分析成
分濃度に対応して形成された染料の量を測定する。染料
は当業者に公知の適当な分光光度測定装置、例えば本田
特許４゜５８４　、２７５号や、特願昭６１−２５５８
３号に記載された装置を用いて検出できる。

本発明をさらに具体的に説明するため以下に実施例を記
載する。

［実施ｒＩＡ１］ 下記組成Ａのロイコ色素溶液を調製した。

Ａ　： ２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）
−４−ｆ：４−（ジメチルアミノ）フェニルシー５−フ
ェネチルイミダゾール （ロイコ色素＞　　１１ｉｔ酸塩　　　　４．４ｇ２−
（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）−４
−（４−（ジメチルアミノ）フェニルシー５−フェネチ
ルイミダゾール 塩酸塩　　　　　　　　　　　０．［３ｇＮ、Ｎ−ジェ
チルブウリルアミド　　　９０　ｍｌｙうＪシ合冶良 下記組成りのゼラチン溶液を作成した。

Ｂ　： アルカリ処理ゼラチン　　　　２３０　。

水　　　　　　　　　　　　　　　　　１４００１１ジ
ー２−エチルへキシルスルホ コハク酸ナトリウム　　　　　　５ｇ ビス〔（ビニルスルホニルメチル カルボニル）アミンコメタン　　２ｏ３２アＬ］ヒＡ勿
ヂリ≦Ｕ〜Ｌ Ｂ液をＴＫオートホモミキサー（特殊機械工業社製乳化
器）で約６０００回転／分でかくはんしながらＡ液を添
加し、約３０分間分散して、乳化物を調製した。

１−２．九−色試１Ｊθ！侃 上記乳化物を、ゼラチン下塗りされている厚さ１８０μ
ｍの透明ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィル
ム（支持体）の上に１ｍ２当たり１５０ｇの割合で塗布
し、０２燥した。

１−３１尺閾賢 ついで、この表面に水を３０９／１２の割６てほぼ一様
に供給して湿潤させ、その上に５０デニール相当のＰＥ
Ｔ紡績糸を３６ゲージに編んだ厚さ約２５０μ贋のトリ
コット編物布地を軽く圧力をかけてラミネート（圧着）
して接着した。多孔性展開層となる。

１−４．１糺入２土五 上記多層分析フィルムを、−辺１５ｉ＋ａの正方形チッ
プに裁断し、特開昭５８−３２３５０号に記載のスライ
ド枠に収めて、分析スライドを完成させた。

［比較例１，１〕 Ａ液の組成を下記に変更した以外はすべて実施例１と同
じ方法で作成し、ロイコ色素が直接ゼラチン中に分散さ
れた型の分析スライドを完成した。

ＡＩ　。

２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）
−４−（４−（ジメチルアミノ）フェニルシー５−フェ
ネチルイミダゾール　酢酸塩　４．４ｇ２−（４−ヒド
ロキシ−３，５−ジ刈・キシフェニル）−４（４−（ジ
メチルアミノ）フェニルシー５−フェネチルイミダゾー
ル　塩酸塩　０．６　ｇメタノール　　　　　　　　　
　　　９０　ｘｌ［比較例１−１２コ 実施例１のＡ液の２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメ
トキシフェニル）−４−Ｃ４−（ジメチルアミノ）フェ
ニルクー５−フェネチルイミダゾール塩の代わりに２−
（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）−４
，５−ビス（ｐ−ジメチルアミノフェニル）イミダゾー
ル３．５ｇを用いた以外は、実施例１と同じ方法で分析
スライドを作製した。

［比較例１．３］ 比較ＩＭＩのロイコ色素を ２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）
−４，５−ビス（ｐ−ジメチルアミノフェニル）イミダ
ゾール３．５ｇに変えた以外は比較例１と同様の方法で
作成した。

［測定例１］ 下記のようにして退色速度を評価した。

実施例１および比較例で作成した分析スライドに、３０
０ｘｙ／Ｊ１のフェリシアン化カリ溶液を各１０μｒ点
着し３７℃でインクベーションしながら、中心波長が５
４０ｎｍの可視光でＰＥＴ支持体側から反射測光して発
色濃度変化を調べた。

結果を第１表に示す。

第１表 第１表から明らかなように、本発明による分析要素は酸
化剤による発色が速く、かつ生成した色素の退色が少な
い。比１２Ｍ１暑は退色が大きい。

ロイコ色素として２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメ
トキシフェニル）−４，５−ビス（ｐ−ジメチルアミノ
フェニル）イミダゾールを用いた場合（比較例１．２゜
１．３）は、本発明と同様な疎水性溶液の分散物として
も、メタノール溶液から直接分散しても、退色の速さは
変わらなかった。

［実施例２］ ２−１．旦（コニ」録Ｎ「１０訓ｌ− 実施例１のＢ液に グルコースオキシダーゼ　４００００　Ｕペルオキシダ
ーゼ　　　　７００００　Ｕ（Ｕは国際単位を表す） を添加した他、実施例１と同様にした。

２−２１発込ＥｉＪｉｌ− 上記のロイコ色素分散液を実施例１と同様にしてＰＥＴ
支持体上に塗布した。

２−３．刷Ωυ１ 発色試薬層の上に、各成分について下記の被覆量から成
る光反射層（乾燥層厚７μｓ）を、水分散液の塗布・乾
燥により設けた。

アルカリ処理ゼラチン　　　　　　　２．９　ｇ７ｚ２
ルチル型二酸型子酸化微粒子　　　１３　ｇ／ｘ”ノニ
ルフェノキシポリグリシド （平均１０グリシド一ル単位含有）　４００　ｘｇ／ｘ
２２−４．及肌尋 光反射層の上に下記の被覆量でく乾燥厚５μ履）接着層
を、水分散液の塗布・乾燥により設けた。

アルカリ処理ゼラチン　　　　　　　６．７　ｇ７１ノ
ニルフェノキシポリグリシド （平均１０グリシド一ル単位含有）　Ｂｏｏ　ｘｇ７ｍ
２ついで、接着層の表面に水を３０ｇ／ｚ２の割合でほ
ぼ一様に供給して湿潤させ、その−トに　５０デニール
相当のＰＥＴ紡績糸を３６ゲージ編みした厚さ約２５０
μｌのトリコット編物布地を軽く圧着しくラミネート）
接着させて、多孔性展開層とした。

次に下記の被覆量になるように、ポリマー含有エタノー
ル分散液を展開層の上から塗布し、乾燥して、尿酸定量
分析用多層分析フィルムを作製した。

ヒドロキシプロピルセルロース （メトキシ基２８〜３０％。

ヒドロキシプロポキシ基７〜１２％含有。

２％水溶液の２０°Ｃでの粘度５０ｃｐｓ）　　５　ｇ
／ｘ２ノニルフエノキシボリエトキシ エタノール （平均４０オキシ工チレン単位）５００１ｇ／ｊ１２２
−５．坐４ん１光五 得られたグルコース定員分析用分析フィルムを一辺１５
＋ｎｗの正方形チップに裁断し、特１ｍ昭５８−３２３
５０号に記載のスライド枠に収めてグルコース定型用生
化学分析スライドを完成した。

［比較ｒＩＡ２］ Ａ液の組成を下記に変更した以外はすべて実施１Ｍ２と
同じ方法で作成し、ロイコ色素が直接ゼラチン中に分散
された型の分析スライドを完成した。

Ａｌ； ４−（４−（ジメチルアミノ）フェニルツー５〜フエネ
チルイミダゾール　酢酸塩　４．４　ｇ４（４−（ジメ
チルアミノ）フェニル〕−５−フェネチルイミダゾール
　塩酸塩　０．６ｇメタノール　　　　　　　　　　　
　９０　ｍｌ［測定例２］ 正常人の血漿にグルコースを５ｏｚｇ、１００ａｙ、２
００３１１？それぞれ添加した血漿を用意し、グルコー
ス電極法を用いて正確なグルコース量を定量した。

上で作製した２種類のグルコース定量用生化学分析スラ
イドの展開層、Ｅに４種の血漿を各１０μ１点着し、３
７℃で６分インクベーション後、中心波長５４０ｎｍの
可視光でＰＥＴ支持体側がら反射測光により、分析スラ
イドの発色光学濃度を測定した。結果を第２表に示す。

第２表 本発明の実施例２は、比較例と異なり退色が見られない
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）光透過性支持体の上に少なくとも一つの水浸透性層
   を有し、該水浸透性層のうち少なくとも一つに液体中の
   特定成分に対し相互作用する組成物を含む、前記液体中
   の前記特定成分を検出するための乾式分析要素であって
   、前記組成物が下記一般式［ I ］で表されるロイコ色
   素を含み、該ロイコ色素が疎水性溶媒に溶解された溶液
   の親水性媒体中への分散物として、水浸透性層に含まれ
   ることを特徴とする乾式分析要素。 ▲数式、化学式、表等があります▼［ I ］ （一般式［ I ］において、Ｒ＾１は置換されてもよい
   アリール基を、Ｒ＾２は置換されてもよいアルキル基を
   、Ｒ＾３は置換されてもよいアリール基を表す）２）光
   透過性支持体の上に少なくとも２つの水浸透性層を有し
   、該水浸透性層のうち少なくとも一つに前記ロイコ色素
   を含む特許請求の範囲１）の乾式分析要素。