JPH03262967A - 高比重リポ蛋白コレステロールの定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、生物体液、例えば全血を試料として用いて、
生物体液中の被検成分（アナライト）である高比重リポ
蛋白コレステロールの含有量を一体型多層分析要素を用
いて乾式化学分析法により定量分析する方法に関する。

［従来技術とその欠点コ 血液中に存在する脂質は、遊Ｍ脂肪酸がフルプミンと結
合している以外はリボ蛋白の構造の中に組み込まれてい
て、カイロミクロン（ＣＨＭ）、超低比重リボ蛋白（〜
’ＬＤＬ）、低比重リボ蛋白（ＬＤＬ）、高比重リポ蛋
白（ＨＤＬ）等として存在し、その内コレステロールは
特にＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬに分布している。ＨＤＬ
は動脈硬化による心疾患の予防因子とされており、従っ
てＨＤＬの代わりに高比重リボ蛋白コレステロール（Ｈ
ＤＬ−コレステロール）を測定することは臨床的により
重要な意義を有している。

現在ＨＤＬコレステロール測定方法としては、超遠心法
、電寛泳動法、沈澱法が広く知られている。

超遠心法は分離操作に長時間必要なのと機器そのものが
高価で安価な測定が望めない点など日常検査には不向き
てあり、電気泳動法は電気泳動支持媒体の違いにより分
離能か異なり使用条件や使用される検出試薬によって差
異が生しるなと定量面で問題が残っている。従って現在
日常検査としては沈澱法が広く使用されている。

沈澱法は沈澱試薬としてポリアニオンと２価金属イオン
の組合せ等を使用し・てＣＨＭ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬを沈
澱させ、上澄中に残るＨＤＬ中のコレステロール、すな
わちＨＤＬ−コレステロールを化学試薬又は酵素を使用
して測定する方法である。沈＃試薬としては、中井継彦
著ｒＨＤＬ−代謝・測定・臨床（ＨＤＬ−Ｍｅｔａｂｏ
ｌｉｓｍ、　　Ａｓ５ａｙ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ａｎ
ｄｃＩｉｎｉｃａｌ　　Ａｐｐｌ＋−ｃａｔｉｏｎ）Ｊ
（中外医学社、１９８６年）、諸種の文献・教科書によ
り１９６０年代初めより周知の硫酸多糖類−アルカリ土
類金属イオン又はアルカリ土類以外の２価金属イオンの
鞘合せ系、無機ポリアニオン地糸、ポリエチレングリコ
ール等が広く利用されている。

沈澱試薬の具体例としては、ヘパリン−カルシウム系試
薬、デキストランｉｉＪ１ｍ−マグネシウム系試薬、燐
タングステン酸−マグネシウム系試薬等がある。

これらの沈澱法では血清と沈澱試薬を混合し、一定時間
放置し、約３０００回転／分にて遠心分離させた後、上
湯部分を一定量分別し、化学反応又は酵素反応をｔテい
ＨＤＬ−コレステロールを定量する方法である。

沈澱法においては、ｖ′）Ｃ澱試薬にもとづく問題点や
遠心分離操作による問題点なとがある。そのため、沈澱
効率を高めるためにの沈澱剤の改良としては、特開昭５
５−７８２５４．特開昭５５−９３０６５．特開昭６１
−２５３４６７、特開昭６２−１９７６８、特公平１−
３９５５３等に諸種の方法が記載されている。

また、従来の沈澱法の大きな欠点は、トリグリセリドが
多い試料の場合には遠心分離後に沈澱物が一部浮遊する
ことがある。そのため遠心条件の調整などが必要で問題
点が大きい。また、燐タングステン酸塩マグネシウムイ
オンを用いる方法では、溶液のｐＨにより沈澱性がハラ
つくことがある。そのためｐＨの厳密な調整などが必要
という問題点がある。

また、遠心分離液の上澄液を分別する際、特に液量が少
ない場合は、沈澱物の境界領域が目視て判別しにくいた
め再現性、精度上問題が発生したり、個人差が発生した
りして定量分析精度が低下する二とがある。これらの遠
心操作に伴う欠点を改善することが求められている。

一方、乾式化学分析、すなわち実質的に乾燥状態の分析
要素、例えは、試験片や多層分析要素中に、分析試薬系
を保持した臨床分析法が知られている。

乾式化学分析は湿式法による化学分析（すなわち、溶液
中に試薬を用いる方法）より、例えば使用上の簡易性、
経済上の節約及び分析の迅速さなとの点て優れている。

乾式多層分析要素は、微量の液体試料で、精度の高い検
査を迅速に行うことができる分析手段として、開発され
た。乾式多層分析要素は、例えば、特公昭５３−２１６
７７、特開昭５５−１６４３５６、特開昭６０−２２２
７６９等で知られている。乾式多層分析要素の一例を挙
げれば、透明支持体、試薬層、光反射層、展開層がら構
成されている。透明支持体は、例えば下塗り処理を施し
た薄い有機ポリマーシートである。透明支持体の上に塗
布された試薬層には、液体試料中に含まれる被検成分と
反応し、その成分量に応じた光学濃度に発色する試薬が
含まれる。光反射層は、試薬層に入射した光が展開層に
達するのを防ぎ、試薬層の光学測定の際展開層に点着し
た液体試料の光学的影響を受けないようにする役割を持
つ。展開層は、点着された液体試料を−ｍ（均一）に、
！？！の量にほぼ比例する面積に広げる。このような乾
式分析要素を用いて定量分析するには、液体試料、例え
ば全血を展開層の表面に一定量点看する。展開層で展開
された血液は、光反射層を通って試薬層に達し、ここで
試薬と反応し、発色する。点着後、化学分析スライドを
適当な時間、一定温度に保って（インクベーション）発
色反応を充分に進行させた後、透明支持体側から照明光
を試薬層に照射し、特定波長域で反射光量を測定して反
射光学濃度を求め、予め求めておいた検量線に基づいて
定量分析を行う。

本発明のＨＤＬ−コレステロール定量分析法においては
、前記のような乾式分析要素（一体型多層分析要素）に
さらに凝集体分離機能を有する多孔性層を配置した乾式
分析要素を用いて実施される。

［発明が解決−しようとする問題点］ 本発明の目的は、沈澱剤を用いるＨＤＬ−コレステロー
ルを定量分析する方法において、乾式多層分析要素を用
いて、上澄液を沈澱物から分別するための遠心分離操作
が不要な測定方法を提供することである。

［技術的課題の解決手段］ 前記課題は、 ■液体試料；こ高比重リボ蛋白以外のリボ蛋白を沈澱さ
せる沈澱試薬含有溶液を混合し、沈澱物を生じさせ、 ■前記沈澱物を含む液体試料を、沈澱物と高比重リボ蛋
白コレステロールを含む液状成分とに分離させ、 ■前記の分離した液状成分中のコレステロールの含有量
を比色法により定量することにより、液体試料中の高比
重リボ蛋白コレステロールの含有量を定量する方法にお
いて、 沈澱物と高比重リボ蛋白コレステロールを含む液状成分
とに分離させる過程が、沈澱物を分離しろる多孔性層を
有する一体型多層分析要素内でおこなわれることを特徴
とする高比重リボ蛋白コレステロールの定量方法、によ
り解決された。

前記課題の解決方法の実施態様として、（１）前記分析
要素が、水不透過性光透過性支持体の上に、少なくとも
３層の多孔性層が一体に積層されており、前記多孔性層
がそれぞれ隣接する面の間で、液体の均一透過が実質的
に妨げられない微少貫通部が形成されるよう、部分的に
配置された接着剤により実質的に密着して接着され一体
化されている一体型多層分析要素であって、前記少なく
とも３層の多孔性層は前記支持体側から、第１の多孔性
層、非繊維質多孔性層、最上層をなすｌ＆維質多孔性層
がこの順に積層されており、前記３層の多孔性層のうち
の少なくとも１層が前記の沈澱物を分離しうる多孔性層
をなし、かつ被検成分の存在下に検出し得る光学的変化
を生ずる試薬組成物が前記３層の多孔性層の少なくとも
１つに含まれることを特徴とする一体型多層分析要素で
ある前記定量方法、及び、 （２）前記分析要素が、水不透過性光透過性支持体と、
その上に一体に積層された、少なくとも３層の多孔性層
を有し、前記多孔性層がそれぞれ隣接する面の間で、液
体の均一透過が実質的に妨げられない微少貫通部が形成
されるよう、部分的に配置された接着剤により実質的に
密着して接着され一体化されている一体型多層分析要素
であって、支持体の上に親水性ポリマーをバインダーと
する実質的に無孔性の試薬層を有し、前記３層の多孔性
層のうちの少なくとも１層が前記の沈澱物を分離しうる
多孔性層をなし、かつ前記少なくとも３層の多孔性層は
、支持体の上に前記無孔性試薬層を介して、第１の多孔
性層、非繊維質多孔性層、最上層をなす′ａ維質多孔性
層がこの順に一体に積層されており、被検成分の存在下
に検出し得る光学的変化を生ずる試薬組成物が少なくと
も前記無孔性試薬層に含まれることを特徴とする一体型
多層分析要素である前記定量方法、がある。

前記の態様において、前記試薬結成物は、第１の多孔性
層に含まれてもよいし、無孔性試薬層と第１の多孔性層
との両方に含まれてもよいし、全部又は大部分が無孔性
試薬層に含まれてもよい。

［発明の具体的構成の詳細］ 本発明のＨＤＬ−コレステロール定量分析法に用いられ
る乾式多層分析要素（一体型多層分析要素）について説
明する。非繊維多孔性層として、特公昭５３−２１６７
７、米国特許１４２１３４１等に記載のセルロースエス
テル類、例えば、セルロースアセテート、セルロースア
セテートフチレート、硝酸セルロースからなるプラッシ
ュポリマーの層が好ましい。６−ナイロン、６．６−ナ
イロン等のポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン
等の微多孔性膜、特開昭６２−２７００６に記載のポリ
スルホンからなる微多孔性膜も好ましい。特公昭５３−
２１６７７、特開昭５５−９０８５９等に記載のポリマ
ー小粒子、カラス粒子、珪藻土等が親水性又は非吸水性
ポリマーで結合された連続空隙をもつ微多孔性層も用い
ることができる。

非繊維多孔性層の有効孔径は０．８μｍから３０μｍで
あることが好ましい。本発明で非繊維多孔性層の有効孔
径は、ＡＳＴＭ　Ｆ３１６−７０に準拠した限界混圧法
（バブルポイント法）により測定した孔径て示す。

非繊維多孔性層が相分離法により作られたいわゆるプラ
ッシュ・ポリマーから成るメンブランフィルタ−である
場合、厚さ方向の液体通過経路は、膜の製造の際の自由
表面側（光沢面〉て最も狭くなっているのが普通で、液
体通過経路の断面を円に近似したときの孔径は、自由表
面の近くて最も小さくなっている。単位の通過経路にお
ける厚さ方向に関する最小孔径は、さらにメンブランフ
ィルタ−の面方向について分布を持っており、その最大
値が粒子に対する濾過性能を決定する。通常、それは限
界混圧法で測定される。

上に述へたように、相分離法により作られたプラッシュ
・ポリマーから成るメンフランフィルターては、厚さ方
向の液体通過経路は膜の製造の際の自由表面側（光沢面
〉で最も狭くなっている。本発明の分析要素の非繊維多
孔性層として二の種の膜を用いる場合には、支持体に近
い副に面する側にメンブランフィルタ−の光沢面を向け
ろことが好ましい。

繊維質多孔性層を構成する材料としては、濾紙、不織布
、織物布地（例えば平織物布地）、編物布地（例えはト
リコット編物布地）、ガラス繊維濾紙等を用いることが
できる。これらのうち織物布地、編物布地が好ましい。

布地等は特開昭５７−６６３５９に記載のようなグロー
放電処理等の物理化学的活性化処理をしてもよい。

非繊維多孔性層を繊維質多孔性層の上に又は繊維質多孔
性層を非繊維質多孔性層の上に固定する方法としては、
接着剤を用いることができるが、液体の均一（−ｔり透
過が実質的に妨げられないようにする必要がある。その
ためには、接着剤を部分的に°配置し、接着剤が存在し
ない部分に微少貫通部が形成されるようにする。その方
法として特開昭６２−１３８７５６に記載の、２つの多
孔性層を網点印刷法（例、クラビア印刷法、スクリーン
印刷法）を利用した部分接着法により接着一体化する方
法が有効である。クラビア印刷法を利用した部分接着法
の代表的な例は、高温に加熱し溶融状態のホットメルト
型接着剤を、＃Ｃ維貿多孔性層が非繊維質多孔性層のど
ちらか一方の表面に、グラビアローラーからの転写によ
りドツト状に付着させた直後に両者を重ねてラミネート
ローラーの間を通すことて接着一体化する方法である。

最上層をなす繊維質多孔性層は、液体試料の展開層とし
て機能するので、液体計量作用を有する層であることが
好ましい。液体計量作用とは、層の表面に点着供給され
た液体試料を、その中に含有する成分を実質的に偏在さ
せることなく、層の面方向に単位面積当りほぼ一定量の
割合で広げる作用である。展開層には、展開面積、展開
速度等を調節するために、特開昭６０−２２２７７０、
特開昭６３−２１９３９７、特開昭６３−１１２９９９
、特開昭６２−１８２６５２に記載のような親水性高分
子又は界面活性剤を含有することができる。

最上層をなす繊維質多孔性層を非繊維質多孔性層の上に
固定する方法としても、接着剤を用いることができるが
、液体の均一（−様）透過が実質的ロこ妨げられないよ
うにする必要がある。そのためには、接着剤を部分的に
配置し、接着剤が存在し・ない部分に微少貫通部が形成
されるようにする。

その方法として特開昭６２−１３８７５６に記載の、２
つの多孔性層を網点印刷法（例、グラビア印刷法、スク
リーン印刷法）を利用した部分接着法により接着一体化
する方法が有効である。

第１の多孔性層としては、前記の＊＄１質多質多孔上層
様な繊維質多孔性層及び前記の非繊１ｔＭ多孔性層と同
様な非繊維質多孔性層のうちから適宜選択して用いるこ
とができる。

中間の非繊維質多孔性層と最上層をなす繊維質多孔性層
の空隙体積（単位面積当たり；以下同じ）は同しても異
なってもよい。

本発明の分析法に用いられる多層分析要素は種々の構成
（層の配置）をとることができる。例えば、米国特許３
９９２１５８、特開昭５５−１６４３５６、特開昭６２
−１３８７５８、特開昭６２−１３８７５７、特開昭６
２−１３８７５８の記載を参考にてきる。実用的には例
えば、（１）支持体の上に、第１の多孔性層、非繊維多
孔性層、最上層をなす繊維質多孔性層をこの順に、（２
）支持体の上に、接着層（又は吸水層）、第１の多孔性
層、非繊維多孔性層、最上層をなすｍ維質多孔性層を、
この順に、 （３）支持体の上に、検出層、第１の多孔性層、非繊維
多孔性層、最上層をなす繊維質多孔性層を、この順に、 （４）支持体の上に、試薬層、第１の多孔性層、非繊維
多孔性層、最上層をなす繊維質多孔性層を、この順に、 （５）支持体の上に、検出層、試薬層、第１の多孔性層
、非繊維質孔性層、最上層をなすＨ維質多孔性層を、こ
の順に、 それぞれ有するものが、有用である。支持体は下塗り層
を有していてもよい。検出層は、一般に、被検成分の存
在下で生成した色素等が拡散し、光透過性支持体を通し
て光学的に検出され得る層で、親水性ポリマーにより構
成することができる。媒染剤、例えばアニオン性色索に
対してカチオン性ポリマーを、含んでもよい。吸水層は
、一般に、被検成分の存在下で生成する色素が実質的に
拡散しないような層を言い、膨潤しやすい親水性ポリマ
ーにより構成することができる。

試薬層と第１の多孔性層との間、又は検出層と第１の多
孔性層との間に、妨害物除去層、光反射層等を設けても
よい。

光透過性水不透過性支持体（透明支持体）の材料として
好ましいものはポリスチレンテしフタシート、ポリスチ
レン、セルローストリアセテート等のセルロースエステ
ル類である。親水性層の吸水層、検出層、実質的に無孔
性の試薬層等を支持体に強固に接着させるために、通常
、支持体に下塗り層を設けるか、親水化処理を施す。

本発明の定量方法に用いられる多層分析要素に配合され
るコレステロール測定用試薬組成物と光学的変化を生し
る試薬組成物について説明する。

■コレステロール測定用試薬組成物 コレステロール測定用試薬組成物はコレステロールエス
テラーゼ活性を有する少なくとも１層の酵素く以下ＣＨ
Ｅと略記する）とコレステロールオキシダーゼを含む試
薬組成物である。

コレステロールエステルから遊離コレステロールを得る
ために用いるコレステロールエステラーゼ活性を有する
酵素としては、例えば、米国特許３．９２５．１６４、
同４，２７５．１５１等に製法が記載されたコレステロ
ールエステラーゼをはじめ、市販のコレステロールエス
テラーゼを選択して用いることができる。コレステロー
ルエステラーゼは動物臓器起源のものでも、微生物起源
のものでもよい。特公昭５６−１９２４０に記載のよう
に、コレステロールエステラーゼとともにリボプロテイ
ンリバーセを併用してもよい。

遊離したコレステロールの定量には、コレステロールオ
キシダーゼを用いて酸化し、生成する過酸化水素を定量
する方法を用いることができる。

コレステロールオキシダーゼとして、例えば、特開昭４
９−４７５８２、特公昭５７−２８５５２、特公昭５７
−４４３１８等に製法が記載されたｉ１紫を用いること
ができる。

■光学的変化を生じる試薬組成物 試薬組成物には、生成した過酸化水素を、光学的に検出
し得る物質、例えば色素（又は染料）を生成し得る！ｔ
ｌｉ成物である。好ましくはペルオキシダーゼ、及び過
酸化水素の存在下に発色、変色、蛍光発生又は化学発光
等の検出し得る光学的変化を生ずる試薬組成物である。

過酸化水素を光学的に検出し定量する試薬組成物は種々
のものが良く知られており、当業者はそれらの中から選
択して採用することができる。例えば、 ペルオキシダーゼと特開昭５０−１３７１９２　（米国
特許３９８３００５）に記載の４−７ミノアンチビリン
（色原体化合物又は水素供与体化合物）とフェノール類
又はナフトール類（カプラー）との組み合わせ、特開昭
５７−１４２５６２に記載のペルオキシダーゼ、色原体
化合物（水素供与体化合物）、Ｎ、Ｎ−ジ置換アニリン
との絹み合わせ、 ロイコ色素の酸化により染料を生成する試薬組成物、例
えば、ペルオキシダーゼと特公昭５７−５５１９（米国
特許４０８９７４７）に記載のトリアリールイミダゾー
ルロイコ色素との延み合わせ、ペルオキシダーゼと特開
昭５９−１９３３５２号等に記載のジアリールイミダゾ
ールロイコ色素との組み合わせ、 還元型補酵素（ＮＡＤ又はＮＡＤＰ）と電子伝達剤の存
在下で染料を生成することのできる染料前駆体化合物と
の朝み合わせ、 等が有用である。

コレステノンを検出するには、ヒドラジン類、例えばヒ
ドラジン、２．４−ジニトロヒドラジン等を試薬として
用いることができる。

遊離したコレステロールの定量にはまた、ＮＡＤ（又は
ＮＡＤＰ）依存コレステａ−ルデヒトロゲナーセを試薬
として用いて、生成するコレステノン又はＮＡＤＨ（又
はＮＡＤＰＨ）を定量する方法を用いることもてきる。

光学的変化を生しる試薬組成物は試薬層、第１の多孔性
層、又は中間に配置される非ａ維多孔性層に含むことが
できる。

これら全てを多孔性試薬層に含んでもよいし、その一部
を多孔性試薬層以外の水浸透性層に含んでもよい。例え
ば、ＣＨＥとコレステロールオキシダーゼを多孔性試薬
層に含み、ペルオキシダーゼと過酸化水素検出試薬組成
物を親水性ポリマーから成る層に含んでもよい。上記鎖
成分の一部、例えばＣＨＥを、沈澱物を分離しうる多孔
性層に含んでもよい。

被検成分の存在下に光学的変化を生じる試薬組成物を前
記３層の多孔性層の少なくとも１層に含有させるには、
試薬組成物の適当な溶液又は分散液を予め含浸又は塗布
し・た多孔性層を、他の水浸透性層、例えば試薬層の上
に接着一体化する方法で接着させる方法が有用である。

適用しうる接着方法の例として、特開昭５５−１６４３
５６に記載のように、親水性ポリマーバインダーを含む
層（接着層又は試！！層）の表面全面を水又は界面、古
性剤含有水てほぼ一様に湿潤させておき、その表面に多
孔性層を重ねあわせ軽く一様に圧力をかけて接着一体化
する方法かある。また、多孔性層を他の水浸透性層（例
、下塗り層、接着層、吸水層）の上に特開昭５５−１６
４３５６に記載のような方法で接着させた後、試薬組成
物の溶液又は分散液を多孔性層に塗布してもよい。

多孔性層に試薬組成物を含浸又は塗布するには公知の方
法を利用できる。塗布には、例えば、デイツプ塗布、押
し出し塗布、ドクター塗布、ホッパー塗布、カーテン塗
布等を適宜選択して用いることができる。

試薬組成物は総てを一つの多孔性層、例えは第１の多孔
性層に含んでもよく、複数の多孔性層に分けて含有させ
てもよい。試薬組成物の一部又は全部を、多孔性層より
支持体に近く設けられた親水性ポリマーを結合剤とする
実質的に一様な無孔性の層（無孔性試薬層）に含ませて
もよい。親水性ポリマーとして、例えば、セラチン及び
これらの誘導体（例、フタル化ゼラチン）、セルロース
誘導体く例、ヒトミキシプロピルセルロース〉、アガロ
ース、アクリルアミド重合体、メタアクリルアミド重合
体、アクリルアミド又はメタアクリルアミドと各種ヒニ
ル性モノマーとの共重合体等が利用できる。

親水性ポリマーを結合剤とし試薬組成物を含む均一な無
孔性の層を塗布した後、試薬組成物を含まない多孔性層
を特開昭５５−１６４３５６に記載のように、親水性ポ
リマーを含む試薬層の表面を水で一様に湿潤させておき
、その上に多孔性層を重ねて軽くほぼ一様に圧力をかけ
て接着させる方法で接着させることによっても、試薬組
成物を第１の多孔性層に実質的に含有させることかでき
る。

試薬組成物には、必要に応し、活性化剤、ｐＨ緩衝剤、
架橋剤（硬膜剤又は硬化剤）、界面活性剤等を含有させ
ることができる。本発明の分析法に用いられる分析要素
の試薬層又は試薬層と液体接触しうる層に含有させるこ
とができるｐ）Ｉ緩衝剤の例としては、炭酸塩、硼酸塩
、燐酸塩や「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｊ　５巻（２号
）、４６７−４７７頁（１９６６年）に記載の６００ｄ
のｐＨ緩衝剤などがある。これらのｐ）Ｉ緩衝剤は「蛋
白質・酵素の基礎実験法Ｊ（堀尾武−ほか著、南江堂、
１９８１年）、ＦＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ５巻等の
文献の記載を参考りこして選択することができる。

第１の多孔性層を接着し積層するための接着層を、支持
体、下塗り層、吸水層、検出層等の層の上に設けてもよ
い。接着層は水で＃潤したときに多孔性層を接着するこ
とができるような親水性ポリマー、例えば、ゼラチン、
セラチン誘導体、ポリアクリルアミド、澱粉等からなる
ことが好ましい。

第１の多孔性層は、検出層、試薬層等に生した検出可能
な変化（色変化、発色等）を透明支持体側から反射測光
する際に、全血中の赤血球のヘモグロビンの赤色を遮蔽
するとともに、光反射層又は背景層として機能する。第
１の多孔性層に親水性ポリマーをバインダーとして分散
された二酸化チタン、ｉｉ［バリウム等の光反射性微粒
子を含有させてもよい。バインダーとしてはゼラチン、
ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド等が好ましい。

本発明の定量分析方法に用いられる沈澱試薬の主成分と
しては、中井継彦著ｆｆＨＤＬ−代謝・測定・臨床−（
ＨＤ　Ｌ　−Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、　Ａｓ５ａｙ　Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎ）４　（中外医学社、１９８６年）、諸種の
文献・教科書により　１９６０年代初めより周知の硫酸
多ｌｌｌ−アルカリ土類金属イオン又はアルカリ土類以
外の２１ｉ１！ｉ金属イオンの組合せ系、無機ポリアニ
オン地糸、ポリエチしングリコール等を用いることがで
きる。

これらの沈澱試薬のうちで、硫酸多糖類−金属イオンの
朝合せ系としては、 ＦＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙａｎｄ
　Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅｊ８２巻４７３
頁以降（１９７３年）に記載のデキストラン硫酸−カル
シウム（２＋）イオンの絹合せ、ｒＪ、　Ｌｉｐｉｄ　
Ｒｅｓ、Ｊ］　１１巻５８３−５９５頁（１９７０年）
、ｆｆｃｌ　ｉｎ。

Ｃｈｅｍ、Ｊ　２４巻９３１−９３３頁（１９７８年）
等に記載のデキストラン硫酸−マグネシウム（＋２）イ
オン複合体、ｒｊ、　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ、Ｊ１１巻５
８３−５９５頁（１９７０年）、ｒＭａｎｕａｌ　　ｏ
ｆ　　ＬｉｐｉｄＯｐｅｒａｔｉｏｎｓ、　　Ｌｉｐｉ
ｄ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＣ１ｉｎｉｃｓ　Ｐｒｏｇｒａ
ｍ、νｏｌｕｍｅＩ　Ｊ　Ｐｕｂ、ＮｆＬ（ＮＩＨ）７
５−６２８（１９７８年）等に記載のヘパリン単独、ヘ
パリンナトリウム−マンカンイオンの絹合せ、 特開昭５５−５１３５９に記載のヘパリン−カルシウム
イオン−ニッケル（＋２）イオンの絡合せ等の沈澱試薬
が好ましい。

無機ポリアニオン塩基沈澱試薬としては、ｆｒ、１．　
Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ、ｕ　１１巻５８３−５９５頁（１
９７０年）、ｆｃｌｉｎ。

Ｃｈｅｍ、　Ｊ２３巻８８２−８８４頁（１９７７年）
、ｆｃｌ　ｉｎ、Ｃｈｅｍ、Ａ２５巻９３９−９４２頁
（１９７９年）、米国特許４２２６７１３、特公昭６３
−２７６５９（米国特許４２１５９９３）、特開平０ｌ
−３９５５３（米国特許４２５１５１９）等に記載の燐
タングステン酸（塩）−マグネシウム（２＋）イオンの
組合せが好ましい。

沈澱試薬は前記の主成分を含む適当な溶媒の溶液として
用いる。本発明の方法に好ましい沈澱試薬である燐タン
グステンＭ（塩〉−マグネシウムイオンの組合せを例と
して説明するが、本発明の方法においては沈澱試薬は燐
タングステン酸（塩）−マグネシウムイオンの組合せに
限定されるわけてはない。

燐タングステン酸（塩）は適当な溶媒、通常は水に約２
００ｍｇ／Ｌ　〜約３．０ｇ／Ｌ、好ましくは約２５０
１１Ｉｇ／Ｌ〜約２．０ｇ／Ｌの範囲、マグネシウム（
２リイオンは約２ミリ七ｌｌ／Ｌ以上、好まし・くは約
４ミリモＩｌ／Ｌ〜約２５ミリモルへの範囲を含む溶液
として用いられる。燐タングステン酸はナトリウム塩、
カリウム塩、アンモニウム塩のいずれかが好ましい。マ
グネシウム（２＋）イオンは塩化マグネシウムφ６Ｈ２
０、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウムのいずれかが
好ましい。燐タングステン酸−マグネシウムイオン水溶
液はｐＨ約２゜Ｏ〜約８．０、好ましくはｐＨ約６．１
〜約７．６の範囲である。

沈澱試薬水溶液は、燐タングステン酸（塩）とマグネシ
ウムイオンを含むｌｉとして用いてもよいし、燐タング
ステン酸（塩）水溶液とマグネシウムイオン水溶液の２
液として用いてもよい。燐タングステン酸（塩）−マグ
ネシウムイオン沈澱試薬水溶液及び他の沈澱試薬水溶液
は、いずれも前記の文献や特許明ｍｓに記載の方法ＩＺ
従って用いることができる。

燐タングステン酸−マグネシウムイオン系沈澱試薬を例
として使い方を説明する。

２液型沈澱試薬の場合： 検体（全血、血漿、又は血清）液に下記の割合が一般的
である。

全血試料　　　　　　　　　　　　１０００μＬ燐タン
グステン酸ナトリウム塩水溶潅 （４０ｇ／Ｌ　、Ｎａ０）１水溶液を加えてｐＨ６，ｌ
〜？、６Ｌこ調整）１００μＬ 塩化マグネシウム・６Ｈ２０水溶液 （２モルル）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　２５μＬ検体液に燐タングステン酸ナ
トリウム塩水溶液と塩化マグネシウム・６Ｈ２０水溶液
を二〇噸又は逆の順に添加する。

ｌ渣型沈澱試薬の場合： 検体（全血、血漿、又は血清）液に下記の割合が一般的
である。

全血試料　　　　　　　　　　　　　１０００μＬ沈澱
試薬水溶液　　　　　　　　　１００μＬ燐タングステ
ン酸ナトリウム塩　２．０〜１０．０％塩化マクネシウ
ム・６Ｈ２１）　　　　　２５０〜７５０ミリモル（Ｎ
ａＯＨ水溶液を加えてｐ）１６．１〜？、６、好ましく
はｐＨ６，８〜７．２に調整） 検体液に沈澱試薬溶液を添加する。

本発明の高比重リボ蛋白コレステロールの定量方法の特
徴は、前記の操作で生成した比重リボ蛋白以外のリボ蛋
白の凝集物（沈澱物）が生成した検体液を充分に撹拌し
、沈澱した成分を懸濁させ、次いで凝集物を分離する機
能を有する前記の多層分析要素の最上層をなす！！維質
多孔性層にそのまま点着供給することにある。点着され
た検体液は凝集物を分離する機能を有する多孔性層によ
り捕捉され多孔性層内部にととまり、高比重リボ蛋白コ
レステロールを含む液体が下側のコレステロール分析試
薬組成物を含む層に到達する。コレステロール分析試薬
組成物を含む層において、高比重リボ蛋白コレステロー
ルからコレステロールが分離され、分離されたコレステ
ロールは試薬成分と反応し、分解生成物（多くの場合過
酸化水素）はついて呈色試薬成分と反応して、含有され
ていたコレステロール濃度に対応した発色又は色変化が
生じる。

生した発色又は色変化を測光し、周知の比色反応の原理
により、コレステロール濃度が求められる。

求められたコレステロール濃度は高比重リボ蛋白コレス
テロール濃度である。

［発明の効果コ 本発明の分析法は、従来の）ＩＤＬ−コレステロール測
定に用いられる沈澱剤を用いて、凝集物を形成させたの
ち、凝集物を分離する機能を有する乾式分析要素を用い
て、沈澱試薬水溶液を添加した血液試料（全血、血漿、
血清）を多層分析要素に点着し、従来の沈澱法の大きな
欠点である、遠心条件の調整と繁雑な遠心分離と上澄液
の沈澱物からの分取の操作なしに、ＨＤＬ−コレステロ
ール含有量について、高い精度で分析することができろ
。

口９口 ［実施例１コ 総コレステロール定置用一体型多層分析要素１−１０イ
コ色業分散液の調製 ■ロイコ色素溶液 下記組成のロイコ色素溶液を調製した。

２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）
−４−［４−（ジメチルアミノ）フェニルツー５−フェ
ネチルイミダゾール酢酸塩　５．７８２−（４−ヒドロ
キシ−３，５−ジメトキシフェニル）−４（４−（ジメ
チルアミノ）フェニルコー５−フェネチルイミダゾール
塩酸塩　０．８８Ｎ、Ｎ−ジエチルラウリルアミド　　
　　１０４ｇ■セラチン水溶液 下記組成のゼラチン水Ｊｆｉを作成した。

アルカリ処理セラチン　　　　　　３００ｇ水　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１９００ｇヒス
［（ヒニルスルホニルメチル力ルボニル）−アミノコメ
タン　　　　　　　　　　　３．０８■ロイコ色素乳化
液の調製 ゼラチン水溶液をＴＫオートホモミキサー（特殊機械工
業社製乳化器）で約５７００回転／分で撹拌しながらロ
イコ色素溶液を添加し、約３０分間分散して、ロイコ色
素乳化液を調製した。

１−２発色試薬層の塗布 上記の工程■で得られた乳化液を、セラチン下塗りされ
ている厚さ１８０μｍで平滑な表面の無色透明ポリエチ
レンテレフタレート（ＰＥＴ）シート（支持体）の上に
ｌｆｆ１２当たり１５０ｇの割合で塗布し、乾燥させて
、無孔性の発色試薬層（乾燥厚さ約２０μｍ、被覆量的
２６．ｇ／ｍ”）を形成した。

１−３第１の多孔性層の積層と処理 上記発色試薬層の表面を約２５℃の水で一様に湿らせ（
約３０ｇ／＋ｎ２の割合）、５０デニール相当のＰＥＴ
紡績糸を３６ゲージ編みしたトリコット編物布地（厚さ
約２５０μｍ）を重ね合わせ、乾燥させて発色試薬層に
布地を接着させた。

次にこのトリコット編物布地の上から、下記の試薬組成
物水溶液を、布地１ｍ２当り下記の成分被覆量になるよ
うに塗布し、乾燥させて、第１の多孔性層（１ａ維質多
孔性層）とした。

試薬組成物の成分被覆量（１ｍ２当り）メチルセルロー
ス　　　　　　　　　３．０ｇ二二酸化チタン粒子（平
均粒子径０．３μｍ）４ｇ リボプロティンリバー七 コレステロールエステラーセ コレステロールオキシターセ ベルオキシダーセ 燐酸二水素カリウム フェロシアン化カリウム （ＩＬＩは酵素国際単位） １−４最上層をなす繊維質多孔性層の含浸処理５０デニ
ール相当のＰＥＴ紡績糸を３６ケージ編みしたトリコッ
ト編物布地（厚さ約２５０μｍ）を下記組成の水溶液に
浸漬し、空隙に液を満たした後、取り出して乾燥させた
。

ポリエチレングリコール （分子量約５万）　　　　　　　　　　２．０　ｇ四硼
酸ナトリウム　　　　　　　　　２．０ｇ精製水　　　
　　　　　　　　　　　９６８１−５最上層をなす繊維
質多孔性層と非繊維質多孔性層の積層（部分接着による
一体化） 次に含浸処理済みのトリコット編物布地を温度８０℃に
予熱した表面に、温度１３０°Ｃに加熱して溶解したホ
ットメルト型接着剤を、グラビア印刷法を利用してグラ
ヒアローラーからの転写により、点２０００１Ｌ１ ５００１Ｕ ５００１Ｕ ５００１Ｕ ７．３ｇ ００ｍｇ 状に付着させた。グラヒアローラーは円形のドツトの直
径０．３　ｇｅｍ、ドツト中心間距離０．６ｍｍ、ドツ
ト面積率約２０％のものを用いた。付着した固形成分の
量は約、３ｇ／ｍ”であった。

接着剤が転写された直後の高温の布地の表面に、有効孔
径３μｍ、厚さ１４０μｍ、空隙率約８０％のセルロー
スアセテートメンブランフィルタ−（富士写真フィルム
（株）製ミクロフィルターＦＭ３００）の非光沢面とを
向かい合わせてラミネートローラーの間を通し、両者を
ラミネート（接着一体化）した。トリコット編物布地が
最上層をなす繊維質多孔性層、メンブランフィルタ−が
中間に配置される非ｌｌ′維質多孔性層（展開層として
も機能する）である。

１−６一体型多層分析要素の完成 この積層物（非繊維質多孔性層（展開層）と最上層をな
す多孔質層）を前記と同し点状接着法により第１多孔性
層の面の上に接着し、一体化させた。

すなわち前記の積層物のメンブランフィルタ−面に、加
熱したホットメルト型接着剤を、グラビア印刷法を利用
してグラヒアローラーからの転写により、点状に付着さ
せた後、直ちに第１の多孔性層（支持体及び発色試薬層
の上にある）の面と向かい合わせ、両者をラミネートロ
ーラーの間を通し、ラミネート（接着一体化）した。

こうして完成した総コレステロール定量用多層分析要素
は、支持体、実質的に無孔性の発色試薬層、第１の多孔
性Ｎ（繊維質多孔性層）、非！１１１ｉ維質多孔性層、
最上層をなす繊維質多孔性層の順に一体に積層されてい
る。最上層をなすｍ＄ＩＩ質多孔質多孔中層に配置され
た非繊維質多孔性層とは協同して沈澱物の濾過分別層と
して作用し、第１の多孔性層に）ＩＤＬ−コレステロー
ルを供給する。第１の多孔性層は、ＨＤＬ・コレステロ
ールの存在下に第２鉄イオンを生成する反応層として作
用する。発色試薬層は、ＨＤＬ−コレステロールの存在
下に第１の多孔性層で生成した第２鉄イオンにより色素
を形成し、色素は透明支持体を通して光学的に検出され
る。

１−６分析スライドの製作 得られた総コレステロール定量分析用多層分析要素を一
辺１５ｍｍの正方形チップに裁断し、特開昭５７−６３
４５２に記載のスライド枠に収めてＨＤＬ−コレステロ
ール定量用生化学分析スライドを完成した。

被検液の調製とＨＤＬ−コレステロールの測定総コレス
テロール値がほぼ等しく、■ロＬ−コレステロール値が
異なるヒト血清を５サンプル選び、試験管に、選んだヒ
ト血清それぞれ１００μＬと、燐タングステン酸と塩化
マグネシウムを含む沈澱試液（和光純薬（株）製）！０
０μＬをとり、試験管ミキサーでよく混和し、室温で約
１０分間放置して凝集状態で白濁した検液試料を得た。

調製した検液を分析スライドの最上層に２０μＬずつ点
着し、３７℃で６分インクヘーションした後、中心波長
６４０ｎｍの可視光てＰＥＴ透明支持体側から反射測光
により、分析スライドの発色光学濃度を測定した。

一方、ＨＤＬ−コレステロールの含有量は従来の標準分
析法（沈澱の遠心分離後の湿式分析法）により求めた。

前記の凝集状態で白濁した検液試料の一部を遠心分離管
に分は取り、常温で遠心分離機にかけ、３０００ｒｐ…
てＩＱ分遠心分離した。分離した上澄液を取り出し、日
立７０５自動分析機を用いてＨＤＬ−コレステロール含
有量を測定し１、標準値とする含有量を求めた。

日立７０５自動分析機を用いて測定したＨＤＬ−コレス
テロール含有量を横軸に、本発明の方法により測定して
得られた発色光学濃度を縦軸にとり、プロットして第１
図のグラフ（検量線）を得た。

第１図の検量線から本発明の分析法により沈澱物の遠心
分離を行わずに白濁した状態の検液試料を乾式多層分析
要素に点着することにより、ＨＤＬ−コレステロールを
精度良く定量できることが明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒト血清に含まれるＨＤＬ−コレステロール含
有量と本発明実施例１の多層分析要素の発色の反射光学
濃度との関係を示すグラフ（検量線）である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）［１］液体試料に高比重リボ蛋白以外のリボ蛋白
   を沈澱させる沈澱試薬含有溶液を混合し、沈澱物を生じ
   させ、 ［２］前記沈澱物を含む液体試料を、沈澱物と高比重リ
   ボ蛋白コレステロールを含む液状成分とに分離させ、 ［３］前記の分離した液状成分中のコレステロールの含
   有量を比色法により定量することにより、液体試料中の
   高比重リボ蛋白コレステロールの含有量を定量する方法
   において、 沈澱物と高比重リボ蛋白コレステロールを含む液状成分
   とに分離させる過程が、沈澱物を分離しうる多孔性層を
   有する一体型多層分析要素内でおこなわれることを特徴
   とする高比重リボ蛋白コレステロールの定量方法。
2. （２）前記分析要素が、水不透過性光透過性支持体の上
   に、少なくとも３層の多孔性層が一体に積層されており
   、前記多孔性層がそれぞれ隣接する面の間で、液体の均
   一透過が実質的に妨げられない微少貫通部が形成される
   よう、部分的に配置された接着剤により実質的に密着し
   て接着され一体化されている一体型多層分析要素であっ
   て、前記少なくとも３層の多孔性層は前記支持体側から
   、第１の多孔性層、非繊維質多孔性層、最上層をなす繊
   維質多孔性層がこの順に積層されており、前記３層の多
   孔性層のうちの少なくとも１層が前記の沈澱物を分離し
   うる多孔性層をなし、かつ被検成分の存在下に検出し得
   る光学的変化を生ずる試薬組成物が前記３層の多孔性層
   の少なくとも１層に含まれることを特徴とする一体型多
   層分析要素である請求項１に記載の定量方法。
3. （３）前記分析要素において試薬組成物が第１の多孔性
   層に含まれるものである請求項２に記載の定量方法。
4. （４）前記分析要素が、水不透過性光透過性支持体と、
   その上に一体に積層された、少なくとも３層の多孔性層
   を有し、前記多孔性層がそれぞれ隣接する面の間で、液
   体の均一透過が実質的に妨げられない微少貫通部が形成
   されるよう、部分的に配置された接着剤により実質的に
   密着して接着され一体化されている一体型多層分析要素
   であって、かつ支持体の上に親水性ポリマーをバインダ
   ーとする実質的に無孔性の試薬層を有し、前記３層の多
   孔性層のうちの少なくとも１層が前記の沈澱物を分離し
   うる多孔性層をなし、かつ前記少なくとも３層の多孔性
   層は、支持体の上に前記無孔性試薬層を介して、第１の
   多孔性層、非繊維質多孔性層、最上層をなす繊維質多孔
   性層がこの順に一体に積層されており、被検成分の存在
   下に検出し得る光学的変化を生ずる試薬組成物が少なく
   とも前記無孔性試薬層に含まれることを特徴とする一体
   型多層分析要素である請求項１に記載の定量方法。
5. （５）前記分析要素において前記試薬組成物が前記無孔
   性試薬層及び第１の多孔性層に含まれるものである請求
   項４に記載の定量方法。
6. （６）前記分析要素において前記試薬組成物が前記無孔
   性試薬層に含まれるものである請求項３に記載の定量方
   法。