JPS62205798A - 乳酸脱水素酵素活性測定用分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、生物体液中、たとえば血液中の、特定物質の
定量に用いる乾式化学分析要素に関する。本発明は、特
に乳酸塩からピルビン酸塩への反応系を利用した乳酸脱
水素酵素（以下、ＬＤＨと略記する）の活性の測定に用
いる乾式化学分析要素に関する。

［従来技術］ 乳酸を基質として生成するＮＡＤＨの増加を波長３４０
ｎｍで測定することよりＬＤＨ酵素活性を測定する方法
が、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅ＋５ｉｓｔｒ７　Ｖｏｌ
、　９゜ｐ、３９１〜３９９（１９６３）によって知ら
れている。しかしこの方法は、紫外線域の測光を必要と
し、機器が高価なものになり、また紫外線域に吸収を有
する多くの化合物の干渉を受ける欠点があった。

生成したＮＡＤＨと電子受容性色素前駆体および電子伝
達剤とから可視域に吸収スペクトルを有する染料を形成
させる比色分析法も、特開昭４９−４４７９８号、同５
０−８０８９１号、同５４−３７７９８号の公報等で知
られている。この反応系を用いれば可視域の分光測光に
よりＮＡＤＨの定量ができる利点がある。しかしこの方
法は、生成するフォルマザン染料が水に難溶性であるこ
とが多く、分光光度計のセルなどの器具が汚染するので
、実用的でなかった。

上記いずれの方法も、水溶液系での定量分析では、一連
の化学反応を水溶液中で進行させるために、煩雑な操作
と長い時間を必要とした。

煩雑な調液作業を必要とせず迅速簡便な分析法として、
乾式分析要素が考案され、特に分析精度の高い一体型多
層分析要素として、特公昭５３−２１６７７号、特開昭
５５−１６４３５６号の公報等に記載されたものがある
。前記のＬＤＨ活°性測定法の反応系をこのような一体
型多層分析要素に導入すれば、前記のような欠点を取り
除き、かつ高い精度を得ることができるはずである。

しかし、乳酸塩を基質としＮＡＤ−の存在下にＬＤＨ酵
素反応により生成するＮＡＤＨを電子伝達剤（例えば、
ジアフォラーゼ）と色素前駆体（例えば、ＩＮＴ）に作
用させる反応系を一体型多層分析要素に導入したところ
１反応の直線性が著しく悪いことが判明した。

［発明の目的］ 本発明の目的は１分析操作の煩雑さをなくし、安価な可
視域の分光光度計で測定でき、反応の直線性も良く、か
つ分析精度の高い乳酸脱水素酵素活性定量用一体型多層
分析要素を提供することにある。

［発明の構成］ 本発明の上記目的は、多孔性担体より少なくとも成る乾
式一体型分析要素であって、該多孔性担体または／およ
びこれと液体接触関係にある水浸透性層に、ＮＡＤ・と
乳酸塩と緩衝剤とを含み、生成するピルビン酸塩をＬＤ
Ｈと共役して、乳酸塩以外の化合物へ変換することによ
りピルビン酸塩のＬＤＨ活性阻害作用を取り除くことが
できる酵素反応系を、共存させたことを特徴とするＬＤ
Ｈ活性測定用分析要素によって達成された。

特に上記目的は、水不浸透性光透過性支持体、水浸透性
層、多孔性液体展開層をこの順に積層して成る乾式一体
型分析要素であって、該多孔性液体展開層または／およ
び水浸透性層にＮＡＤ・と乳酸塩と干渉剤とを含み、生
成するピルビン酸塩をＬＤＨと共役して乳酸以外の化合
物へ変換することにより、ピルビン酸塩のＬＤＨ活性阻
害作用を取り除くことができる酵素反応系を、共存させ
たことを特徴とするＬＤＨ活性測定用分析要素によって
好ましく達成された。

ピルビン酸塩を基質としてＬＤＨ活性阻害作用を取り除
くことができる酵素としては、例えばピルビン酸キナー
ゼ　　　（ＥＣ２，７，１４０）ピルビン酸オキシダー
ゼ　（ＥＣ１，２，３，３，）グルタミン酸ピルビン酸
アミノトランスフェラーゼ　（ＧＰＴ） を用いることができる。

前記酵素は５００〜１．０００．０ＯＯＩＵ／ゴの範囲
で含有されていることが適当であるが、特に２，０００
〜５０，０ＯＯＩＵ／ｍ’の範囲で含有されていること
が好ましい。

［発明の詳細な記述］ 本発明は公知の多種の乾式分析要素に適用することがで
きる。

特に乳酸脱水素酵素とＮＡＤ・と被検液体がいずれも浸
透し得る固体担体（以下、浸透性層という）を含む要素
に適用することができる。この要素は単一層で構成され
てもよく、また試薬層、多孔質展開層、光反射層、光遮
蔽層、濾過層、係留（ｒｅｆｉｓｔｒａｔｉｏｎ）層、
吸水層、支持体、下塗層および業界公知のその他の層を
含む多重層であってもよい、かような分析要素の例には
、米国特許第３９９２１５８号、同４０４２３３５号お
よび特開昭５５−１６４３５６号各明細書に開示のもの
がある。

支持体を用いる場合、実用的に好ましい構成は、 （１）支持体上に試薬層を兼ねる展開層を有するもの （２）支持体上に吸水層、その上に試薬層を兼ねる展開
層を有するもの （３）支持体上に試薬層と展開層を有するもの（４）支
持体上に吸水層、試薬層、展開層をこの順に有するもの （５）支持体上に試薬層、反射層（または濾過層）、展
開層をこの順に有するもの （６）支持体上に吸水層、試薬層、濾過層、展開層をこ
の順に有するもの などである。しかし、光透過性・水不透過性打体、吸水
層および検出試薬系（乳酸塩、ＮＡＤ・、緩衝剤、活性
阻害防止のための酵素、電子伝達剤、電子受容性染料形
成化合物、その他）を含有する展開層を順次積層一体化
してなる一体型多層分析要素とすることが好ましい。

本発明の乾式分析要素には、少なくとも一つの浸透性層
、好ましくは展開層に乳酸塩（たとえば乳酸リチウム）
を含む。

本発明の乾式分析要素において少なくとも一層の浸透性
層にはＮＡＤ’　　にコチンアミド・アデニンジヌクレ
オチド酸化型）を含む、ＮＡＤ・は乳酸塩と同じ層（好
ましくは展開層）に含まれることが好ましいが、別の層
（例えば試薬層）に含まれていてもよい。

本発明の乾式分析要素において、少なくとも一層の水浸
透性層には、乳酸脱水素酵素と共役してピルビン酸塩を
乳酸又はその塩以外の化合物に変換することにより、ピ
ルビン酸塩の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨと署記する）活性
阻害作用を取り除くことができる酵素又は酵素反応系を
共存させる。

上記酵素（たとえばＧＰＴ）又は酵素反応系は乳酸塩を
含む層（たとえば展開層）に含まれることが好ましいが
、それ以外の層（例えば試薬層）に含まれていてもよい
。

本発明の乾式分析要素において少なくとも一層の浸透性
層には、ＮＡＤ−にコチンアミド・アデニンジヌクレオ
チド酸化型）を含む、ＮＡＤ”は乳酸塩と同じ居（好ま
しくは展開層）に含まれることが好ましいが、別の層（
例えば試薬層）に含まれていてもよい。

本発明の乾式分析要素において少なくとも一層の浸透性
層には、電子伝達性化合物が含まれる。

本発明において電子伝達性化合物とは、被検物質の反応
により生成した還元型ニコチンアミド補酵素（電子共与
体）から電子を受は取って、後述する電子受容性染料形
成性化合物を還元する機能を有する化合物を意味する。

上記電子伝達性化合物の具体例としては、５−メチルフ
エナジニウム・メチルスルフェートあるいは１−メトキ
シ−５−メチルツェナジニウム番メチルスルフェート メトサルフェート類およびジアホラーゼ（ジヒドロリポ
アミドレダクターゼ、Ｅ　Ｃ　１．６．４．３．）等を
挙げることができる。

本発明の乾式分析要素には、さらに少なくとも一つの浸
透性層に電子受容性染料形成性化合物が含まれる．電子
受容性染料形成化合物は、上記電子伝達性化合物により
還元され、長波長債域において検出可能な化合物（染料
）を形成する物質である。電子受容性染料形成化合物は
、電子伝達性化合物と同じ層に含まれてもよく、主とし
て異なる層に含まれてもよい。本発明の乾式分析要素に
用いる電子受容性染料形成化合物としては、テトラゾリ
ウム塩が好ましい。

テトラゾリウム塩の具体例としては、 ３、３’−（３．３°−ジメトキシ−４，４゛−ビフェ
ニレン）−ビス［２−（ｐ−ニトロフェニル−２Ｈ−テ
トラゾリウムクロライド］（＝ＮＥＴ）；）； ３−（ｐ−ヨードフェニル）−２−（ｐ−二トロフェニ
ル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド
（＝ＩＮＴ）。

３−（４．５−ジメチル−２−チアゾリル）−２Ｈ−テ
トラゾリウムブロマイド（＝ＭＴＴ）；３、３’−（４
．４°−ビフェニレン）−ビス（２，５−ジフェニル−
２Ｈ−テトラゾリウムクロライド； ３、３’−（３．３’−ジメトキシ−４．４。

−ビフェニレン）−ビス（２　、　５−ジフェニル−２
Ｈ−テトラゾリウムクロライド；および３、３’−（３
．３’−ジメトキシ−４．４′ービフエニレン）−ビス
［２，５−ビス（Ｐ−ニトロフェニル）−２Ｈ−テトラ
ゾリウムクロライドを挙げることができる。

なお、上記酸化型ニコチンアミド補酵素、電子伝達性化
合物および電子受容性染料形成性化合物を含む反応系の
詳細については、 Ａ．　Ｌ．　Ｂａｂｓｏｎ等によるクリ二カ・キミカ・
アクタ　　［ＣＬＩＮＩＣＡ　　ＧＨＩＭＩＧＡ　　Ａ
ＣＴＡ］　　　１　　２　　￥Ｑ　　（１９６５）　　
　２１０−２１５頁：　　； Ｒ，Ｊ、　Ｇａｙ等によるクリニカル・ケミストリー［
ＣＬＩＮＩＣＡＬ　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ］　Ｖｏｌ、１
４、Ｎｏ、　８　、１９６８．７４０−７５３頁；およ
び、 Ｒ，Ｄ、　Ｃａｐｐｓ　Ｕ等によるクリニカル・ケミス
トリー、Ｖｏｌ、１２、Ｎｏ、　７　、　１９６６、４
０６−４１３頁：等の文献に記載されている。

本発明の乾式分析要素は、カルボン酸系補酵素安定剤を
、ＮＡＤ　°と同一の層内に含有することが好ましい、
カルボン酸系補酵素安定化剤とは、少なくともＮＡＤ’
と電子伝達性化合物が接触した状態において添加するこ
とにより、酸化型ニコチンアミド補酵素の保存性を向上
させる機能を有するカルボン酸を意味する。上記カルボ
ン酸としては、乳酸脱水素酵素検出反応に実質的に影響
を与えることのないカルボン酸を用いることが好ましい
。

本発明の乾式分析要素のカルボン酸系補酵素安定化剤と
して好ましく用いられるカルボン酸の例としては、アミ
ン性窒素原子を有するカルボン酸およびヒドロキシカル
ボン酸を挙げることができる。上記アミン性窒素原子を
有するカルボン酸の具体例としては、エチレンジアミン
四酢酸、Ｎ。

Ｎ−ジヒドロキシエチルグリシン、Ｎ−ヒドロキシエチ
ルエチレンジアミン−Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’−三酢酸および
酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）を
挙げることができる。またヒドロキシカルボン酸の具体
例としては、クエン酸、リンゴ酸、トリス（ヒドロキシ
メチル）−メチルグリシン、Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロ
キシエチル）−グリシンおよびアルドン酸（例、グルコ
ン酸）を挙げることができる。これらの中では酸性アミ
ノ酸が特に好ましい。

本発明の乾式分析要素の検出試薬系を含有する居やその
他の浸透性層には、親水性ポリマー、緩衝剤あるいは光
遮蔽性微粒子等を必要に応じて含有させることができる
。

本発明の乾式分析要素の浸透性層に含有させることがで
きる親木性ポリマーの例としては、澱粉、セルロース、
アガロース、ゼラチンおよびこれらの誘導体（例、ヒド
ロキシメチル化およびヒドロキシプロピル化等）、アク
リルアミド重合体、アクリルアミドと各種ビニル性モノ
マーとの共重合体、ビニルピロリドン重合体、ビニルピ
ロリドンと各種ビニル性モノマーとの共重合体、アクリ
レート重合体およびアクリレートと各種ビニル性モノマ
ーとの共重合体等を挙げることができる。

上記親水性ポリマーのうちではビニルピロリドン重合体
、アクリルアミド重合体またはセルロース誘導体が好ま
しい。　。

上記親水性ポリマーを、乾式分析要素の展開層に含有さ
せる場合には、約２ｇ／ｒｒｆから約１５ｇ／ｍ′の範
囲で含有させることが好ましい、上記含有量のうち特に
好ましいのは、約２ｇ／ｍ′から約ｌｏｇ／ゴの範囲で
ある。

本発明の乾式分析要素の検出試薬系を含有する層にさら
に含有させることができる緩衝剤の例としては、炭酸塩
、ホウ酸塩、燐酸塩やグツド（Ｇｏｏｄ）の緩衝剤など
の公知の緩衝剤を挙げることができる。これらの緩衝剤
は、「蛋白質・酵素の基礎実験法」　（掘尾武−１他著
、南江堂、１９８１）等の公知文献を参考にして選択し
、使用することができる。

本発明の乾式分析要素の検出試薬系を含有する居には、
さらに後述する光遮蔽層に用いられる光遮蔽性微粒子を
含有させることもできる。

検出試薬系を含有する層に上記の検出試薬系、および必
要に応じて加えられるカルボン酸系補酵素安定化剤、親
水性ポリマー、緩衝剤、光遮蔽性微粒子等を含有させる
に際しては、上記試薬等を含有する塗布液を展開層の上
から塗布または噴霧し乾燥する方法を用いることもでき
る。

また検出試薬系を含有する層が織物、編物、濾紙、不織
布およびガラス繊！１１１１！紙等からなる展開層であ
る場合には、上記試薬等を含有する溶液に展開層を浸漬
したのち乾燥する方法を用いることができる。また、一
体型多音分析要素とするため、上記のような展開層をラ
ミネートにより積層する場合には、上記のように浸漬し
た展開層を乾燥または半乾燥状態で他の層に積層し一体
化する方法を用いることもできる。

塗布により形成される層、例えばプラッシュポリマ一層
やミクロビーズ三次元格子状粒子構造体等からなる層の
場合には、この層の塗布液と試薬等の塗布液を混合して
塗布してもよい。

なお、展開層に試薬等を含有させる場合に、いくつかの
試薬毎に異なる方法を用いることもできる。また、いく
つかの試薬毎に数回に分けて行なうこともできる。

本発明において、検出試薬系を含む層は、二つ以上の層
から成ってもよい、この場合に、乳酸塩、ＮＡＤ・、電
子伝達性化合物および電子受容性染料形成性化合物は、
全ての層に均一に含有されてもよい。しかし、ＮＡＤ−
は展開層または展開層に近い居に、電子受容性染料形成
性化合物は展開層以外または展開層から遠い層に多く分
布させることが好ましい。

本発明の乾式分析要素に用いることができる光透過性・
水不透過性支持体の例としては、ポリエチレンテレフタ
レート、ビスフェノールＡのポリカルボネート、ホリス
チレン、セルロースエステル（例、セルロースジアセテ
−１・、セルローストリアセテート、セルロースアセテ
ートプロピオネート等）等のポリマーからなる厚さ約５
０７ｚｍから約１ｍｍ、好ましくは約８０体ｍから約３
００７１ｍの範囲のフィルム、もしくはシート状の透明
支持体を挙げることができる。

本発明の乾式分析要素に用いることができる光不透過性
または光反射性支持体としては、上記ポリマー中に光反
射性色材を含有させることにより容易に作成することが
できる。また、上記ポリマー等からなる透明支持体表面
に光反射性色材を塗布する、または光反射性色材をから
なる粘着テープを貼る等によっても容易に作成すること
ができる。

これら支持体の表面には、必要により下塗層を設けて、
支持体の上に設けられる侵透性層（たとえば吸水層）と
の接着を強固なものにすることができる。また、下塗層
の代りに、支持体の表面に物理的あるいは化学的な活性
化処理を施して接着　。

力の向上を図ってもよい。

本発明の乾式分析要素が一体型多層分析要素である場合
には、光透過性・水不透過性支持体の上に（場合によっ
ては下塗層等の他の層を介して）吸水層が設けられる。

本発明の乾式分析要素に備えられる吸水層は親木性結合
剤よりなる層、すなわち水を吸収して膨潤する親木性ポ
リマーを層形成成分として利用している層であることが
好ましい。

吸水層の製造に用いることができる親木性ポリマーは、
一般には水吸収時の膨潤率が３０℃で約１５０％から約
２０００％、好ましくは約２５０％から約１５００％の
範囲の天然または合成親木性ポリマーである。そのよう
な親木性ポリマーの例としては、ゼラチン（例、酸処理
ゼラチン、脱イオンゼラチン等）、ゼラチン誘導体（例
、フタル化ゼラチン、ヒドロキシアクリレートグラフト
ゼラチン等）、アガロース、プルラン、プルラン誘導体
、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビ
ニルピロリドン等をあげることができる。

吸水層の乾燥時の厚さは約１ｇｍから約１１００ｐの範
囲であることが好ましく、より好ましくは約３Ｂｍから
約３０ｕＬｍの範囲である。また吸水層は実質的に透明
であることが好ましい、さらに吸水層には、必要に応じ
て界面活性剤や緩衝剤を含有させることもできる。

上記吸水層の上には、必要に応じて光遮蔽層を設けるこ
とができる。光遮蔽層は、光遮蔽性、または光遮蔽性と
光反射性とを兼ね備えた微粒子または微粉末（以下、単
に微粒子という）が少量の皮膜形成能を有する親木性ポ
リマーバインダーに分散保持されている水透過性または
水浸透性の層である。光遮蔽層は吸水層にて発生した検
出回部な変化（色変化、発色等）を光透過性を有する支
持体側から反射測光する際に、展開層に点着供給された
水性液体の色、特に試料が全血である場合のヘモグロビ
ンの赤色等を遮蔽するとともに光反射層または背景層と
しても機能する。

光遮蔽性と光反射性とを兼ね備えた微粒子の例としては
、二酸化チタン微粒子（ルチル型、アナターゼ型または
プルカイト型の粒子径が約０゜１４ｍから約１．２ＪＬ
ｍの微結晶粒子等）、硫酸バリウム微粒子、アルミニウ
ム微粒子または微小フレーク等を挙げることができ、光
遮蔽性微粒子の例としては、カーボンブラック、ガスブ
ラック、カーボンミクロビーズ等を挙げることができ、
これらのうちでは二酸化チタン微粒子、硫酸バリウム微
粒子が好ましい、特に好ましいのは、アナターゼ型二酸
化チタン微粒子である。

皮膜形成能を有する親木性ポリマーバインダーの例とし
ては、前述の吸水層の製造に用いられる親木性ポリマー
と同様の親木性ポリマーのほかに、弱親水性の再生セル
ロース、セルロースアセテート等を挙げることができ、
これらのうちではゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリアク
リルアミド等が好ましい。なお、ゼラチン、ゼラチン誘
導体は公知の硬化剤（架橋剤）を添加することができる
。

光遮蔽層は、光遮蔽性微粒子と親木性ポリマーとの水性
分散液を公知の方法により吸水層の上に塗布し乾燥する
ことにより設けることができる。

また、光遮蔽層を設ける代りに、展開層中に光遮蔽性微
粒子を含有させてもよい。

なお、吸水層の上に、場合によっては光遮蔽層等の層を
介して、展開層を接着しａ層するために接着層を設けて
もよい。接着層は水で湿潤しているとき、または水を含
んで膨潤しているときに展開層を接着することができ、
これにより各層を一体化できるような親水性ポリマーか
らなることが好ましい、接着層の製造に用いることがで
きる親木性ポリマーの例としては、吸水層の製造に用い
られる親木性ポリマーと同様な親水性ポリマーがあげら
れる。これらのうちではゼラチン、ゼラチン誘導体、ポ
リアクリルアミド等が好ましい。接着層の乾燥膜厚は一
般に約０．５ルｍから約２０ｇｍ、好ましくは約１ｐｍ
から約１０ｐｍの範囲である。なお、接着層は吸水層上
以外にも、他の居間の接着力を向上させるため所望の層
上に設けてもよい。接着層は親水性ポリマーと、必要に
よって加えられる界面活性剤等を含む水溶液を公知の方
法で、支持体や吸水層等の上に塗布する方法などにより
設けることができる。

展開層は、液体計量作用を有する展開層であることが特
に好ましい、液体試料計量作用を有する展開層とは、そ
の表面に点着供給された液体試料を、その中に含有して
いる成分を実質的に偏在させることなく、横（水平）方
向に単位面積当りほぼ一定量の割合で広げる作用を有す
るものである。

展開層のマトリックスを構成する材料としては、濾紙、
不織布、織物生地（例、ブロード、ボブリン等の平織等
）、編物生地（例、トリコット編、ダブルトリコット編
、ミラニーズ編等）、ガラス繊ｍ濾紙、プラッシュポリ
マーより形成されるメンブランフィルタ−１あるいはポ
リマーミクロビーズ等からなる三次元格子状構造物等を
用いることが好ましい。これらのうちでは、試薬類の保
持性の点で、織物生地および編物生地に代表される繊維
質層を用いることが特に好ましい。

本発明の乾式分析要素に用いることができる織物生地ま
たは編物生地は水洗等の脱脂処理により少なくとも糸製
造時、織物製造時あるいは編物編成時に供給または付着
した油脂類を実質的に除去した織物または編物生地が好
ましい。

上記織物または編物生地を一体型多層分析要素の展開層
として用いる場合には、さらにその織物または編物生地
に特開昭５７−６６３５９号公報に開示の物理的活性化
処理（好ましくはグロー放電処理またはコロナ放電処理
等）を生地の少なくとも片面に施すか、あるいは特開昭
５５−１６４３５６号、特開昭５７−６６３５９号公報
等に開示の親水性ポリマー含浸処理等の親水化処理また
はこれらの処理工程を逐次実施することにより織物また
は編物を親水化し、下側（支持体に近い側）の層との接
着力を強化することができる。

織物または編物生地からなる一体型多層分析要素の展開
層を前述した吸水層または接着層に接着、積層するには
、特開昭５５−１６４３５６号および特開昭５７−６６
３５９号各公報等に開示の方法に従って作成することが
できる。すなわち、吸水層または接着層の塗布後、未乾
燥のうちに、または乾燥後の層に水（または界面活性剤
を少量含む水）を実質的に均一に供給して層を膨潤させ
、ついで織物または編物生地を湿潤または膨潤している
層の上に実質的に均一に軽く圧力をかけながら接着、積
層し一体化する。

また展開層がプラッシュポリマーまたはメンブランフィ
ルタ−からなる場合には特公昭５３−２１６７７号、特
開昭６１−４９５９号公報等、ポリマーミクロビーズか
らなる三次元格子状構造物である場合には特開昭５５−
９０８５９号公報等、濾紙または不織布からなる場合に
は＃開開５７−１４８２５０号公報等にそれぞれ記載の
方法に従って設けることができる。

前述した吸水層または接着層の親木性ポリマーバインダ
ーがゼラチンまたはゼラチン誘導体の場合には、層の塗
布後ゼラチン（または誘導体）が未乾燥のゲル状態の間
に上記展開層を構成する材料（織物または編物生地等）
を接着、積層し一体化する方法を採用することができる
。

本発明の乾式分析要素は、一体型多層分析要素とした場
合には、−辺約１５ｍｍから約３０ｍｍの正方形または
ほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特開昭５７−６
３４５２号、特開昭５４−１５６０７９号、実開昭５６
−１４２４５４号、実開昭５８−３２３５０号および特
開昭５８−５０１１４４号各公報等に開示のスライド枠
等に納めて分析スライドとして用いるのが製造、包装。

輸送、保存および測定操作等の全ての観点で好ましい。

本発明の乾式分析要素は、約５牌文から約３０ル文、好
ましくは約８終見から約１５ル見の水性液体試料を展１
３１１層に点着供給し、必要に応じて約２０℃から約４
５℃の範囲の実質的に一定の温度でインクベーションす
る。その後、一方の側から（一体型多層分析要素におい
ては光透過性支持体側から）乾式分析要素内の色変化、
発色等の検出回部な変化を反射測光し比色法の原理によ
り液体試料中の測定対象成分を分析する。

以下に本発明の実施例と比較例を示す。

［実施例１−比較例１］ 透明ポリエチレンテレフタレート支持体（厚さ：　１８
０　ＪＬ、ｍ）の表面を親木化処理し、その処理表面上
に下記の組成の塗布液を１２０　ｍ　ｌ　／　ｒｎ’と
なるように塗布、乾燥して乾燥膜厚１０ルｍの吸水層を
形成した。

吸水層／成用塗布液 ゼラチン　　　　　　　　　　３００ｇ水　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　２７００ｇオクチルフェノ
キシ・ ポリエトキシエタノール　　　６ｇ 次に、上記吸水層の上に、ポリエステル撚糸トリコット
編み展開層（層厚：２５０ＪＬｍ）を湿式ラミネート法
により接着した。

上記展開層に下記の組成の試薬塗布液を塗布乾燥した。

試薬塗布液 トリス（ヒドロキシメチル） アミノメタン　　　　　５．８４ｇ ２０％ポリアクリルアミド 水溶液　　　　　　　　　１２８ｇ 乳酸リチウム　　　　　　　３．０８ｇＮＡＤ−０，６
０ｇ 水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
２ｇジアホラーゼ　　　　　　１３５００Ｕ水　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２ｇグルタミ
ン酸ナトリウム　　２．２２ｇＧＰＴ　　　　　　　　
　　　　６０００Ｕ最終塗布液ｐＨｐＨ８、５ 次に、ＩＮＴ　［３−（ｐ−インドフェノール）−２−
（ｐ−二トロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラ
ゾリウム・クロライド］２４ｍＭの９９．５％エタノー
ル溶液を塗布した後、乾燥して、本発明のＬＤＨ活性活
性定量体型分析要素を得た。

別に上記のＬＤＨ活性活性定量体型分析要素からグルタ
ミン酸０．１ＭＧＰＴ５００００Ｕ／Ｌを取り除いた以
外は同一の分析要素（比較例１）を作成した。

前記の本発明のＬＤＨ分析要素および比較例の分析要素
に、特願昭６０−２３４２３６号明細書に記載の方法で
ＬＤＨｌ　０００Ｕ／Ｌを添加した管理血清１ＯＪＬｆ
Ｌを点着し、ＬＤＨＤＨ酵素反応り生成される色素量を
、３７℃、５４０ｎｍで１分から６分まで測定した。

得られた結果を第１表に示す。

第１表 測定時間　　　　ル」Ｌ例」エ　　　実施例１（分）　
　　　　ＯＤＲＯＤＲ （５１０ｎｍ）　　　　　　　　（５１０ｎｍ）１　　
　　　　　　　　　　０、Ｇ２ｆ；　　　　　　　　０
．６２［ｉ２　　　　　　　　　　　　０．７８２　　
　　　　　０．８０７３　　　　　　　　　　　　０．
８８４　　　　　　　０．９３５４　　　　　　　　　
　　　０．９６１　　　　　　　１．０２６５　　　　
　　　　　　　　１．０２Ｂ　　　　　　　　１．１０
５６　　　　　　　　　　　　１．０９１　　　　　　
　１．１７７本結果をグラフに図示したのが第１図であ
る。

すなわち、ＬＤＨ高濃度域の検量線の傾きは著しく改善
される。

［実施例２］ グルタミン酸を２．０ｇ、ＧＰＴを１００００Ｕ／Ｌを
添加したこと以外は実施例１と同様にしてＬＤＨ活性活
性定量体型分析要素を作成した。

この分析要素に、ＬＤＨを添加した管理血清を１０ｐ文
点着し、Ｉ、ＤＨ酵素反応による３７°ＣＣ１５４０ｎ
におけるスペクトルの変化量を測定した。スペクトル変
化量は次の式により算出した。

ΔＯＤＲ／分　−［ＯＤＲ（５分）　−ＯＵＲ（２分］
　）／３（分）なお、ΔＯＤＲ／分は１分間あたりのス
ペクトル変化量を意味する。

得られた結果を第２表に示す。

以下余白 第２表 管理血清　ＬＤＨ活性　　ΔＯＤａ／ｗｉｎ　　ΔＯＤ
＊／ｗｉｎ１　　　　　　　　８０　　Ｕ／Ｌ　　　　
　　Ｏ，０２４０，０２５２１６０Ｕ／Ｌ　　　　　　
Ｏ，０３１０，０３４３３６０Ｕ／Ｌ　　　　　　Ｏ，
０４６０，０５２４７２０Ｕ／Ｌ　　　　　　Ｏ，０５
４０，０６８５１０００Ｕ／Ｌ　　　　　　Ｏ，０５８
０，０７４６１３００υ／Ｌ　　　　　　Ｏ，０６００
，０７Ｂ本結果をグラフに図示したのが第２図である。

すなわち、ＬＤＨ高濃度域の検量線の傾きは著しく改善
される。

［参考例］ ピルビン酸による比活　阻宙の実例 モニトロールエ・ＸとモニトロールＨのそれぞれにピル
ビン酸リチウムを添加した検体を実施例１で調製したＬ
ＤＨ分析スライドに点着し、ＬＤＨ活性を測定した。結
果を第３表に示す。なお、ＬＤＨ活性値は、点着量１０
ｇ１．５４０ｎｍにおける２分〜５分のタイムコースか
ら算出した。

第３表 ビルビシ酸量　　　　　　　モニトａ−ル　　相対　　
　　　モニトａ−ル　　相対（ｍＭ）　　ｐＨＩ−Ｘ　
　　活性値　　１１−Ｘ　　活性値０　　　　　７．０
　　１６００／Ｌ　　　　１００％　　　　　４１１ｉ
０Ｕ／Ｌ　　　　１００＄０．２５　　７．０　　１１
８Ｕ／Ｌ　　　　　７４２　　　　３９６０／Ｉ、　　
　　　８６２１　　　　７．０　　　８３Ｕ／Ｌ　　　
　　５２％　　　　　３１３Ｕ／Ｌ　　　　　６８＄２
　　　　　７．０　　　４６０／Ｌ　　　　　２９％　
　　　　１８４０／Ｌ　　　　　４０＄３　　　　　７
．０　　　３０Ｕ／Ｌ　　　　　１９％　　　　　　９
２０／Ｌ　　　　　２０％上記の参考例でａ察された添
加ピルビン酸量（ｍ　Ｍ　）とＬＤＨ活性測定値（Ｕ／
Ｌ）との関係を第３１ｆｆｌに、モニトールエ・Ｘとモ
ニトールＩＩ・Ｘとについてグラフとして表わす。

［実施例３］ 実施例１で調製したＬＤＨ分析スライドに、グルタミン
酸ナトリウム１２ｍＭ／ｒｎ’およびＧ　Ｐ　Ｔ７２０
０Ｕ／ゴを添加して、添加しない場合とＣ，Ｖ、を比較
した。各々のスライドは実施例２の方法に従って各々検
量線を作成した。試料はモニトロールエ・Ｘとモニトロ
ールエ・Ｘ＋ＬＤＨである。結果を第４表に示す。

第４表 正常域　高活性　　　正常域　高活性 ｘ　　　　１６１　　　［５１６０６０４ＳＯ４，７３
４，３２，８２１，８ Ｃ，Ｖ、　　　２．９＄　　　５．７＄　　　　１．８
＄　　　３．６＄

【図面の簡単な説明】 第１図は、実施例１と比較例１とにて得られたＬＤＨ活
性定量用一体型分析要素の検量線を示すグラフである。 第２図は、実施例２と比較例１とにて得られたＬＤＨ活
性定量用一体型分析要素の検量線を示すグラフであるΦ 第３図は、参考例で観察された添加ピルビン酸量（ｍ　
Ｍ　）とＩ、ＤＨ活性測定値（Ｕ／Ｌ）との関係ヲモニ
トロール■・ＸとモニトロールＩＩ−Ｘとについて表わ
すグラフである。 特許出願人　富士写真フィルム株式会社代　理　人　弁
理士　　柳　川　泰　力測定時間（分） 第２図 ＬＤＨ活セ℃イ直　（Ｕ／Ｌ）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 多孔性担体を含む乾式一体型分析要素であって、該多孔
   性担体または／およびこれと液体接触関係にある水浸透
   性層に、ＮＡＤ＾＋と乳酸塩と緩衝剤とを含み、乳酸脱
   水素酵素と共役して、生成するピルビン酸塩を乳酸塩以
   外の化合物へ変換することにより、ピルビン酸塩の乳酸
   脱水素酵素活性阻害作用を取り除くことができる酵素反
   応系を共存させたことを特徴とする乳酸脱水素酵素活性
   測定用分析要素。