DE3707110A1 - Analytisches element zur bestimmung der aktivitaet von lactat-dehydrogenase - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein analytisches Element zur Bestimmung der Aktivität von Lactat-Dehydrogenase in flüssigen Proben, wie Körperflüssigkeiten (zum Beispiel Blut).

In Clinical Chemistry, Bd. 9, S. 391-399 (1963) wird ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Lactat-Dehydrogenase (LDH) beschrieben, das auf der photometrischen Messung (bei 340 nm) der Bildung von NADH (d. h. von reduziertem Nicotinamid- Adenin-Dinucleotid) aufgebaut ist, wobei Lactat als dessen Substrat verwendet wird. Somit umfaßt dieses Verfahren die photometrische Messung von Ultraviolettstrahlen. Die Messung erfordert eine relativ teure Vorrichtung und wird leicht durch die Anwesenheit einer nicht geringen Anzahl von anderen Verbindungen beeinflußt.

Eine alternative photometrische Analysenmethode unter Verwendung eines Elektronen aufnehmenden Farbstoffvorläufers und eines Elektronenüberträgers in Kombination zur Bildung eines Farbstoffs mit einem Absorptionsspektrum im Bereich des sichtbaren Lichts nach Kontakt mit dem gebildeten NADH wird beispielsweise in den JP-OS'en 49 (1974)-44 798, 50 (1985)- 80 891 und 54 (1979)-37 798 beschrieben. Diese Analysenmethode ermöglicht es vorteilhafterweise, sichtbares Licht zur photometrischen Bestimmung von NADH zu verwenden. Trotzdem hat diese Methode den Nachteil, daß der gebildete Formazanfarbstoff in Wasser schlecht löslich ist, wodurch die Zelle oder ähnliche Elemente der photometrischen Vorrichtung verschmutzt werden.

Die oben erwähnten beiden Methoden bauen sich weiterhin auf einer Bestimmung in einem wäßrigen System auf, das eine Reihe von Reaktionen in einer wäßrigen Lösung umfaßt. Es sind relativ komplizierte Maßnahmen und eine relativ lange Zeitdauer für die Maßnahmen erforderlich.

Um solche komplizierten Verfahrensmaßnahmen, wie die Herstellung der Reagenzlösungen, zu vermeiden und die Betriebszeit zu verkürzen, sind schon in Publikationen, wie der JP-PS 53 (1978)-21 677 und der JP-OS 55 (1980)-1 64 356, trockene analytische Elemente, insbesondere integrierte analytische Vielschichtelemente, vorgeschlagen worden. Man könnte annehmen, daß das oben beschriebene Reaktionssystem für die Bestimmung der LDH-Aktivität in das analytische Element eingeführt werden kann, um das nachteilige Merkmal eines Naßsystems, das die Reaktion in wäßriger Lösung umfaßt, zu vermeiden, wodurch eine Bestimmung mit verbesserter Genauigkeit gestattet würde. Von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung wurde jedoch festgestellt, daß die oben beschriebene Reaktion in analytischen Elementen eine schlechte Linearität zeigt.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein neues analytisches Element zur Bestimmung der Aktivität von Lactat-Dehydrogenase zur Verfügung zu stellen.

Dieses soll leicht handhabbar sein und eine hohe analytische Genauigkeit ergeben.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein analytisches Element zur Bestimmung der Aktivität von Lactat-Dehydrogenase mit einer Reagenzschicht gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Reagenzschicht NAD⁺, Lactat, ein Puffermittel und ein Enzym enthält, wobei das genannte Enzym dazu imstande ist, ein aus dem Lacetat durch Wirkung der Lactat- Dehydrogenase in Gegenwart von NAD⁺ erzeugtes Pyruvat in ein anderes Produkt als das Lactat umzuwandeln, wodurch der Einfluß des Pyruvats auf die Aktivität von Lactat-Dehydrogenase ausgeschaltet wird.

Die Erfindung wird anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert; es zeigen:

Fig. 1 ein Diagramm, das Eichkurven angibt, die durch Analysen erhalten worden sind, bei denen ein erfindungsgemäßes analytisches Element und ein analytisches Vergleichselement verwendet worden sind;

Fig. 2 ein Diagramm, das weitere Eichkurven angibt, die durch Analysen erhalten worden sind, bei denen ein erfindungsgemäßes analytisches Element und ein analytisches Vergleichselement verwendet worden sind; und

Fig. 3 ein Diagramm, das die Kurven der Beziehung zwischen der Menge (mM) von zugesetzter Brenztraubensäure und der gemessenen LDH-Aktivität (E/1), beobachtet unter Verwendung von Monitrol I-X und Monitrol II-X, angibt.

Typische Beispiele für Enzyme, die dazu imstande sind, ein aus dem Lactat durch die Einwirkung von Lactat-Dehydrogenase in Gegenwart von NAD⁺ (oxidiertem Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid) erzeugtes Pyruvat in ein anderes Produkt als Lactat umzuwandeln, wodurch der Einfluß des Pyruvats auf die Aktivität der Lactat-Dehydrogenase entfernt wird, sind Pyruvat- Kinase (EC 2.7.1.40), Pyruvat-Oxidase (EC 1.2.3.3) und Glutaminsäure- Brenztraubensäure-Transaminase (GPT). Das Enzym ist im allgemeinen in der Reagenzschicht in einer Menge von 500 bis 1 000 000 I.E./m² enthalten. Vorzugsweise ist das Enzym in der Reagenzschicht in einer Menge von 2000 bis 50 000 I.E./m² enthalten.

Das erfindungsgemäße analytische Element enthält vorzugsweise einen Elektronenüberträger und einen Elektronen aufnehmenden Farbstoffvorläufer zusätzlich zu der oben genannten Enzymzusammensetzung, nämlich eine Kombination von NAD⁺, Lactat (zum Beispiel Lithium-Lactat), einem Puffermittel und Enzym.

Der Elektronenüberträger nimmt ein Elektron von einem reduzierten Nicotinamidcoenzym (d. h. Elektronendonator) auf, das durch Umsetzung des Analyten erzeugt worden ist, und reduziert sodann den Elektronen aufnehmenden Farbstoffvorläufer. Beispiele für geeignete Elektronenüberträger sind N-Methyl- phenazinmethsulfate, wie 5-Methylphenaziniummethylsulfat und 1-Methoxy-5-methylphenaziniummethylsulfat, und Diaphorase (Dihydrolipoamid-Reductase, EC 1.6.4.3).

Der Elektronen aufnehmende Farbstoffvorläufer wird durch den Elektronenüberträger unter Bildung einer Verbindung (d. h. eines Farbstoffs) reduziert, die im Bereich des sichtbaren Lichts photometrisch erfaßbar ist. Der Elektronen aufnehmende Farbstoffvorläufer ist vorzugsweise ein Tetrazoliumsalz. Beispiele für geeignete Tetrazoliumsalze sind 3,3′-(3,3′-Dimethoxy- 4,4′-biphenylen)-bis(2-(p-nitrophenyl)-2H-tetrazoliumchlorid), (= NBT); 3-(p-Indophenyl)-2-(p-nitrophenyl)-5- phenyl-2H-tetrazoliumchlorid (= INT); 3-(4,5-Dimethyl-2- thiazolyl)-2H-tetrazoliumbromid (= MTT); 3,3′-(4,4′-Biphenylen)- bis(2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumchlorid); 3,3′-(3,3′- Dimethoxy-4,4′-biphenylen)-bis(2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumchlorid); und 3,3′-(3,3′-Bis(2,5-bis(p-nitrophenyl)-2H-tetrazoliumchlorid).

Das Reaktionssystem, an dem das oxidierte Nicotinamidcoenzym, der Elektronenüberträger und der Elektronen aufnehmende Farbstoffvorläufer (d. h. die Farbstoff bildende Verbindung) beteiligt sind, wird genauer in A. L. Babson u. a., Clinica Chimica Acta, 12 (1965), 210-215; R. J. Gay u. a., Clinical Chemistry, 14, Nr. 8 (1968), 740-753; und R. D. Gapps II. u. a., Clinical Chemistry, 12, Nr. 7 (1966), 406-413 beschrieben.

Der Elektronen aufnehmende Farbstoffvorläufer und der Elektronenüberträger können in die gleiche Schicht oder in getrennte Schichten eingearbeitet werden.

Das analytische Element enthält vorzugsweise weiterhin einen Coenzymstabilisator vom Carbonsäuretyp. Dieser Coenzymstabilisator wird vorzugsweise in eine Schicht eingearbeitet, die NAD⁺ enthält. Der Coenzymstabilisator ist eine Carbonsäure, die die Konservierbarkeit des oxidierten Nicotinamidcoenzyms (NAD⁺) erhöht, wenn das Coenzym in Kontakt mit dem Elektronenüberträger gehalten wird. Diese Carbonsäure ist vorzugsweise im wesentlichen gegenüber der Reaktion zur Bestimmung der Lactat-Dehydrogenase inert. Geeignete Carbonsäuren können Carbonsäuren mit mindestens einem Aminstickstoff oder Hydroxycarbonsäuren sein. Beispiele für die erstgenannten Carbonsäuren sind Ethylendiamintetracarbonsäure, N,N-Dihydroxyethylglycin, N-Hydroxyethylethylendiamin-N,N′, N′-triessigsäure und sauren Aminosäuren, wie Glutaminsäure und Asparaginsäure. Beispiele für Hydroxycarbonsäuren sind Zitronensäure, Äpfelsäure, Tris(hydroxymethyl)-methylglycin, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-glycin und Aldonsäuren, wie Gluconsäure. Eine saure Aminosäure wird bevorzugt.

Beispiele für geeignete Puffermittel sind Carbonate, Borate, Phosphate und Good-Puffer und andere bekannte Puffermittel. Geeignete Puffermittel können im Einzelfall anhand von "Fundamental Experiment Methods for Protein & Enzyme", Takeichi Horio u. a. (Nankodo Tokyo, 1981) ausgewählt werden.

Bei dem erfindungsgemäßen analytischen Element ist die Reagenzschicht vorzugsweise auf einem wasserundurchlässigen transparenten Träger angeordnet. Die Reagenzschicht kann eine einzige poröse Schicht oder eine Kombination einer porösen Schicht und einer wasserdurchlässigen Schicht, die in fließfähigem Kontakt mit der porösen Schicht angeordnet ist, sein.

Analytische Element mit folgender Zusammensetzung werden bevorzugt:

• (1) eine Ausbreitungsschicht, die als Reagenzschicht dient und auf dem Träger angeordnet ist,
• (2) eine Ausbreitungsschicht, die als Reagenzschicht dient und auf einer wasserabsorbierenden Schicht angeordnet ist, welche ihrerseits auf dem Träger angeordnet ist,
• (3) eine Ausbreitungsschicht und eine Reagenzschicht, die auf dem Träger angeordnet sind,
• (4) eine Ausbreitungsschicht, eine Reagenzschicht und eine wasserabsorbierende Schicht, die der Reihe nach auf dem Träger angeordnet sind,
• (5) eine Ausbreitungsschicht, eine Reflexionsschicht (oder Filtrationsschicht) und eine Reagenzschicht, die der Reihe nach auf dem Träger angeordnet sind, und
• (6) eine Ausbreitungsschicht, eine Filtrationsschicht, eine Reagenzschicht und eine wasserabsorbierende Schicht, die der Reihe nach auf dem Träger angeordnet sind.

Funktionelle Schichten, wie eine Lichtreflexionsschicht, eine lichtabschirmende Schicht, eine Filtrationsschicht, eine Registrationsschicht, eine wasserabsorbierende Schicht, eine klebende Schicht, eine Unterschicht ("subbing layer") können in angemessenen Positionen auf dem Träger angeordnet sein.

Weitere verwendbare Bestandteile der analytischen Mehrschichtelemente werden in den US-PS'en 39 92 158 und 40 42 335 und der JP-OS 55 (1980)-1 64 356 beschrieben.

In dem erfindungsgemäßen analytischen Element wird am meisten ein Aufbau bevorzugt, der der Reihe nach einen wasserundurchlässigen Träger, eine wasserabsorbierende Schicht und eine Ausbreitungsschicht, die die an den Reaktionen teilnehmenden Reagenzien enthält, bevorzugt.

Die hierein verwendete Bezeichung "Ausbreitungsschicht" soll eine Schicht beschreiben, die dazu imstande ist, eine flüssige Probe zu dosieren bzw. abzumessen. Diese Funktion kann dahingehend beschrieben werden, daß die Schicht dazu imstande ist, eine aufgebrachte Flüssigkeit in einer solchen Weise auszubreiten, daß die ausgebreitete Fläche der Flüssigkeit ungefähr im Verhältnis zu der aufgebrachten Menge der Flüssigkeit steht.

In dem erfindungsgemäßen analytischen Element werden NAD⁺ und Lactat vorzugsweise in die gleiche Schicht, insbesondere die Ausbreitungsschicht, eingearbeitet. Sie können aber auch in getrennte Schichten eingearbeitet werden.

Das Enzym, das dazu imstande ist, ein Pyruvat, das aus dem Lactat durch Einwirkung von Lactat-Dehydrogenase in Gegenwart von NAD⁺ erzeugt worden ist, in ein anderes Produkt als Lactat (zum Beispiel GPT) umzuwandeln, und das Lactat werden vorzugsweise in die gleiche Schicht, zum Beispiel die Ausbreitungsschicht, eingearbeitet. Sie können jedoch auch in getrennte Schichten eingearbeitet werden.

Die Ausbreitungsschicht, die als Reagenzschicht dienen kann, kann aus einem Filterpapier, einem gewebten Flächengebilde, einem nichtgewebten Flächengebilde, einem gestrickten oder gewirkten Flächengebilde, einem Glasfaserfilter, einem Membranfilter oder einer dreidimensionalen Gitterstruktur, bestehend aus Polymermikroperlen, als Material, das eine Matrix bildet, hergestellt werden.

Beispiele für gewebte Flächengebilde (gewebtes Tuch), die für die Ausbreitungsschicht verwendet werden können, sind solche, wie sie zum Beispiel in den JP-OS'en 55 (1980)1 64 356 und 57 (1982)-66 359 beschrieben werden. Unter den gewebten Flächengebilden werden glatte gewebte Flächengebilde, hergestellt aus Kette und Schuß, bevorzugt. Unter glatten gewebten Flächengebilden werden dünnes Tuch, Musselin, feiner Wollstoff und Popeline bevorzugt.

Das gewebte Flächengewebe oder das gewirkte bzw. gestrickte Flächengebilde ist vorzugsweise ein Flächengebilde, aus dem das Fett im wesentlichen entfernt worden ist, wenn das Garn oder das Flächengebilde hergestellt wird. Die Flächengebilde werden mehr bevorzugt so bearbeitet, daß sie hydrophil sind, um die Haftung an der darunterliegenden Schicht zu erhöhen, wenn das Flächengebilde als Ausbreitungsschicht verwendet wird. Beispiele für ein Verfahren, um das Flächengebilde hydrophil zu machen, sind ein physikalischer Aktivierungsprozeß (vorzugsweise ein Glimmentladungsprozeß oder ein Koronaentladungsprozeß), beschrieben in der JP-OS 57 (1982)-66 359, und ein Permeatisierungsprozeß für das hydrophile Polymere, der in den JP-OS'en 55 (1980)-1 64 356 und 57 (1982)-66 359 beschrieben wird.

Die Ausbreitungsschicht, die aus einem gewebten Flächengebilde oder einem gewirkten Flächengewebe besteht, kann auf eine wasserabsorbierende Schicht oder eine klebende Schicht nach dem Verfahren auflaminiert werden, wie es beispielsweise in den JP-OS'en 55 (1980)-1 64 356 und 57 (1982)-66 359 beschrieben wird. Bei diesem Verfahren geht man so vor, daß man das gewebte oder gewirkte Flächengebilde unter einem im wesentlichen gleichförmigen geringen Druck auf die nasse oder aufgequollene Pufferschicht oder die klebende Schicht, die nach dem Aufschichten noch im nassen Zustand ist oder der Wasser (oder Wasser, das eine kleine Menge eines Netzmittels enthält) nach dem Trocknen zugeführt worden ist, auflaminiert.

Die Ausbreitungsschicht, die aus einem aufgerauhten Polymeren oder einem Membranfilter besteht, kann nach dem Verfahren erhalten werden, wie es in der JP-PS 53 (1979)-21 677 beschrieben wird. Eine Ausbreitungsschicht mit einer dreidimensionalen Gitterstruktur, bestehend aus polymeren Mikroperlen, kann nach dem Verfahren hergestellt werden, das in der JP-OS 55 (1980)-90 859 beschrieben wird. Das Reagenzblatt oder die Ausbreitungsschicht, bestehend aus einem Filterpapier oder nichtgewebten Flächengebilde, kann nach einem Verfahren hergestellt werden, wie es in der JP-OS 57 (1982)- 1 48 250 beschrieben wird.

Wenn eine wasserabsorbierende Schicht oder eine klebende Schicht, hergestellt aus Gelatine oder Gelatinederivaten, verwendet wird, dann wird die Ausbreitungsschicht, die aus einem gewebten Flächengebilde oder einem gewirkten Flächengebilde hergestellt ist, vorzugsweise auf die nasse oder aufgequollene Gelatine (oder ihre Derivate) der wasserabsorbierenden Schicht oder auf die klebende Schicht, die nach dem Beschichten noch in nassem Zustand ist, auflaminiert.

Die Ausbreitungsschicht kann ein hydrophiles Polymeres enthalten.

Beispiele für hydrophile Polymere, die in die Ausbreitungsschicht des erfindungsgemäßen analytischen Elements eingearbeitet werden können, sind Stärke, Cellulose, Agarose, Gelatine und ihre Derivate (zum Beispiel hydroxymethylierte und hydroxypropylierte Derivate), Acrylamidpolymere, Copolymere von Acrylamid mit anderen Vinylmonomeren, Vinylpyrrolidonpolymere, Copolymere von Vinylpyrrolidon mit anderen Vinylmonomeren, Acrylatpolymere und Copolymere von Acrylat mit einem anderen Vinylmonomeren. Bevorzugt werden Acrylamidpolymere und Cellulosederivate.

Das hydrophile Polymere kann in einer Menge im Bereich von etwa 0,5 bis 15 g/m², vorzugsweise etwa 2 bis 10 g/m², in die Ausbreitungsschicht des analytischen Elements eingearbeitet werden.

Das hydrophile Polymere konserviert eine kleine Menge von Wasser in der fleckförmig aufgebrachten Probe, um die katalytische Reaktion des Analyten zu beschleunigen.

Die Reagenzschicht kann in Form einer porösen Schicht, bestehend aus feinen Teilchen, die in einem hydrophilen Polymeren dispergiert sind, vorliegen. Die feinen Teilchen können lichtblockierende oder lichtreflektierende Teilchen sein.

Beispiele für hydrophile Polymere sind Gelatine (zum Beispiel säurebehandelte Gelatine, entionisierte Gelatine etc.), Gelatinederivate (zum Beispiel phthalatierte Gelatine, mit Hydroxyacrylat gepfropfte Gelatine etc.), Agarose, Pullulan, Pullulanderivate, Dextran, Polyacrylamid, Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon sein. Das hydrophile Polymere kann in die Ausbreitungsschicht eingearbeitet werden. Bei dieser Ausführungsform wird das hydrophile Polymere in die Ausbreitungsschicht in einer Menge von ungefähr 2 g/m² bis ungefähr 15 g/m², mehr bevorzugt ungefähr 2 g/m² bis ungefähr 10 g/m², eingearbeitet.

Beispiele für lichtblockierende und lichtreflektierende Teilchen, die in die Ausbreitungsschicht des analytischen Elements eingearbeitet werden können, sind feine Titandioxidteilchen (Rutil-Typ, Anatas-Typ oder Brookit-Typ; durchschnittliche Größe im Bereich von ungefähr 0,1 µm bis ungefähr 1,2 µm), feine Bariumsulfatteilchen, feine Aluminiumteilchen und feine Flocken davon. Beispiele für lichtblockierende Teilchen sind Ruß-, Gasruß-, und Kohlemikroperlen. Feine Titandioxidteilchen und feine Bariumsulfatteilchen werden bevorzugt. Am meisten werden feine Titandioxidteilchen vom Anatas-Typ bevorzugt.

Das Trägermaterial für das erfindungsgemäße analytische Element ist vorzugsweise ein lichtdurchlässiger und flüssigkeitsundurchlässiger Träger.

Beispiele für flüssigkeitsundurchlässige, lichtdurchlässige Träger sind im wesentlichen wasserundurchlässige transparente Träger in Form von Filmen oder Blättern, hergestellt aus einem Polymeren, wie Polyethylenterephthalat, Polycarbonat von Bisphenol A, Polystyrol und Celluloseestern (zum Beispiel Cellulosediacetat, Cellulosetriacetat, Celluloseacetatpropionat etc.). Die Dicke des Trägers liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 50 µm bis etwa 1 mm, vorzugsweise etwa 80 µm bis etwa 300 µm.

Auf dem Träger kann eine Unterschicht vorgesehen werden, um die Haftung zwischen dem Träger und der wasserabsorbierenden Schicht (wasserdurchlässigen Schicht) zu steigern. Anstelle der Verwendung einer Unterschicht kann die Oberfläche des Trägers auch durch eine physikalische oder chemische Behandlung zur Erhöhung der Haftung aktiviert werden.

Die wasserabsorbierende Schicht ist eine Schicht, die ein hydrophiles Bindemittel enthält, das vorzugsweise ein hydrophiles Polymeres ist, das unter Quellen Wasser absorbiert.

Das hydrophile Polymere zeigt vorzugsweise ein Quellverhältnis im Bereich von ungefähr 150% bis ungefähr 2.000%, mehr bevorzugt ungefähr 250% bis ungefähr 1.500% bei 30°C. Beispiele für hydrophile Polymere, die den oben beschriebenen Bedingungen genügen, sind Gelatine (zum Beispiel säurebehandelte Gelatine, entionisierte Gelatine etc.), Gelatinederivate (zum Beispiel phthalatierte Gelatine, mit Hydroxyacrylat gepfropfte Gelatine etc.), Agarose, Pullulan, Pullulanderivate, Dextran, Polyacrylamid, Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon.

Die Trockendicke der wasserabsorbierenden Schicht liegt im Bereich von etwa 1 bis 100 µm, vorzugsweise etwa 3 bis 30 µm. Vorzugsweise sollte die wasserabsorbierende Schicht im wesentlichen transparent sein.

Auf der wasserabsorbierenden Schicht kann eine lichtblockierende Schicht vorgesehen sein. Die lichtblockierende Schicht ist eine wasserdurchlässige Schicht, in der lichtblockierende (oder lichtreflektierende) feine Teilchen in einer geringen Menge eines filmbildenden hydrophilen Polymerbindemittels dispergiert sind. Die lichtblockierende Schicht kann als lichtreflektierende Schicht oder als Hintergrundschicht sowie als Blockierungsmittel für die Farbe einer auf die Ausbreitungsschicht fleckförmig aufgebrachten wäßrigen Flüssigkeit, wie das Rot von Hämoglobin in einer Ganzblutprobe, wirken, wenn eine erfaßbare Veränderung (Farbveränderung oder Farbentwicklung etc.) in der wasserabsorbierenden Schicht von der Seite des transparenten Trägers durch Reflexionsphotometrie gemessen wird.

Beispiele für lichtblockierende und lichtreflektierende Teilchen sind feine Titandioxidteilchen (Rutil-Typ, Anatas-Typ oder Brookit-Typ; durchschnittliche Größe im Bereich von etwa 0,1 µm bis etwa 1,2 µm), feine Bariumsulfatteilchen, feine Aluminiumteilchen und ihre Flocken. Beispiele für lichtblockierende Teilchen sind Ruß-, Gasruß- und Kohlemikroperlen. Feine Titandioxidteilchen und feine Bariumsulfatteilchen werden bevorzugt. Am meisten werden Titandioxidteilchen vom Anatas-Typ bevorzugt.

Beispiele für das filmbildende hydrophile Polymerbindemittel sind schwach hydrophile Polymere, wie regenerierte Cellulose und Celluloseacetat, sowie die hydrophilen Polymeren, die für die Reagenzschicht verwendbar sind. Am meisten bevorzugt werden Gelatine, Geltainederivate und Polyacrylamid. Gelatine und Gelatinederivate können als Gemisch mit einem bekannten Härtungsmittel (Vernetzungsmittel) verwendet werden.

Die lichtblockierende Schicht kann in einer solchen Weise vorgesehen sein, daß eine wäßrige Dispersion, die die lichtblockierenden Teilchen und das hydrophile Polymere enthält, auf die Reaktionsschicht aufgeschichtet wird und sodann durch herkömmliche Methoden getrocknet wird. Anstelle der lichtblockierenden Schicht können die lichtblockierenden Teilchen auch in die Ausbreitungsschicht eingearbeitet werden.

Eine Klebstoffschicht kann auf der wasserabsorbierenden Schicht vorgesehen sein oder gegebenenfalls zu einer anderen Schicht (zum Beispiel Lichtblockierungsschicht) gegeben werden, um die Haftung der Ausbreitungsschicht zu erhöhen.

Die klebende Schicht besteht vorzugsweise aus einem hydrophilen Polymeren, das die Ausbreitungsschicht mit einer anderen Schicht klebend verbinden kann, um alle Schichten integriert zu machen, während das Polymere mit Wasser befeuchtet oder gequollen wird. Beispiele für hydrophile Polymere sind Polymere, wie sie in der wasserabsorbierenden Schicht verwendbar sind. Am meisten bevorzugt sind Gelatine, Gelatinederivate und Polyacrylamid. Die Trockendicke der klebenden Schicht liegt im allgemeinen im Bereich von ungefähr 0,5 µm bis ungefähr 20 µm, vorzugsweise ungefähr 1 µm bis ungefähr 10 µm.

Die klebende Schicht kann auf anderen Schichten sowie auch auf der wasserabsorbierenden Schicht vorgesehen sein. Die klebende Schicht kann in einer solchen Weise hergestellt werden, daß eine Lösung eines hydrophilen Polymeren und eines gegebenenfalls zugesetzten weiteren Mittels, zum Beispiel eines Netzmittels, auf die wasserabsorbierende Schicht oder eine andere Schicht aufgeschichtet wird.

Im Hinblick auf Herstellung, Abpackung, Transport, Konservierung und Meßvorgang wird es bevorzugt, daß das erfindungsgemäße integrale analytische Mehrschichtelement zu Stücken mit einer Kantenlänge von etwa 15 bis 30 mm oder zu Kreisen mit einem Durchmesser von etwa 15 bis 30 mm zugeschnitten wird und in einen Gleitrahmen eingegeben wird, um ein analytisches Diapositiv zu ergeben, wie in den JP- OS'en 57 (1982)-63 452 und 54 (1979)-1 56 079, den veröffentlichten japanischen Gebrauchsmusterunterlagen 56 (19181)-1 42 454 und 58 (1983)-32 350 und der JP-OS 58(1983)-5 01 144 beschrieben wird.

Etwa 5 bis etwa 30 µl, vorzugsweise etwa 8 bis etwa 15 µl, einer wäßrigen flüssigen Probe werden auf die poröse Ausbreitungsschicht des analytischen Elements abgeschieden (fleckförmig aufgebracht). Erforderlichenfalls wird das analytische Element bei im wesentlichen konstanter Temperatur von etwa 20 bis 45°C inkubiert. Eine erfaßbare Veränderung, wie eine Farbveränderung oder eine Farbbildung, des Elements wird (von der Seite des lichtdurchlässigen Trägers) durch Reflexionsphotometrie gemessen, um den Analyten in der Flüssigkeitsprobe kolorimetrisch zu analysieren.

Die Erfindung wird in den Beispielen und Vergleichsbeispielen erläutert.

Beispiel 1 Vergleichsbeispiel 1

Eine Oberfläche eines transparenten Polyethylenterephthalatträgers (Dicke: 180 µm) wurde behandelt, um sie hydrophil zu machen. Die hydrophile Oberfläche des Trägers wurde mit einer Beschichtungslösung (120 ml/m²) mit folgender Zusammensetzung beschichtet und getrocknet, um eine wasserabsorbierende Schicht mit einer Trockenfilmdicke von 10 µm zu bilden.

Beschichtungslösung für die wasserabsorbierende Schicht

Gelatine 300 g Octylphenoxypolyethoxyethanol   6 g Wasser2.700 g

Auf die Oberfläche der wasserabsorbierenden Schicht wurde eine Ausbreitungsschicht (Dicke: 250 µm) aus trikotgewirktem verzwirnten Polyestergarn durch ein Naßlaminierungsverfahren aufgebracht. Auf die Ausbreitungsschicht wurde eine Reagenz enthaltende Lösung mit folgender Zusammensetzung aufgeschichtet.

Reagenz enthaltende Lösung

Tris(hydroxymethyl)aminomethan  5,84 g Polyacrylamid (20gew.%ige wäßrige Lösung128 g Lithiumlactat  3,08 g NAD⁺  0,60 g Wasser  2 g Diaphorase13.500 E/l Natriumglutamat  2,22 g GPT6.000 E/l (pH der formulierten Lösung: 8,5)

Auf die so gebildete hydrophile Schicht wurde eine 99,5%ige Ethanollösung, enthaltend 24 mM INT (d. h. 3-(p-Indophenol)- 2-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazoliumchlorid), aufgebracht, und die aufgeschichtete Schicht wurde getrocknet.

Auf diese Weise wurde ein integrales analytisches Mehrschichtelement gemäß der Erfindung zur quantitativen Bestimmung von LDH hergestellt.

Zum Vergleich wurde das gleiche analytische Element mit der Ausnahme, daß in die Reagenzlösung kein Natriumglutamat und keine GPT eingearbeitet wurden, hergestellt.

Auf jedes analytische Element wurden 10 µl eines Kontrollserums, enthaltend 1.000 E/l LDH, fleckförmig aufgebracht, und die Menge des durch die LDH-Enzymreaktion bei 37°C gebildeten Farbstoffs wurde bei 540 nm 1 bis 6 Minuten lang gemessen.

Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.

Tabelle I

Die Ergebnisse der Tabelle I sind in Fig. 1 graphisch dargestellt. Es wird ersichtlich, daß die durch das analytische Element gemäß der Erfindung erhaltene Eichkurve steiler ist als die Kurve, die durch das analytische Vergleichselement erhalten wird.

Beispiel 2

Die Verfahrensweisen des Beispiels 1 wurden mit der Ausnahme wiederholt, daß 2,0 g Natriumglutamat und 10.000 E/l GPT verwendet wurden, um ein erfindungsgemäßes integrales analytisches Mehrschichtelement zur quantitativen Bestimmung von LDH herzustellen.

Auf das obige analytische Element und ein analytisches Vergleichselement (hergestellt wie in Vergleichsbeispiel 1) wurden 10 µl eines Kontrollserums fleckförmig aufgetragen, das unterschiedliche Mengen von LDH enthielt. Danach wurde die Menge des durch die LDH-Enzymreaktion bei 37°C gebildeten Farbstoffs bei 540 nm nach 2 Minuten und nach 5 Minuten gemessen. Die erhaltenen Werte wurden dazu verwendet, um eine Spektralveränderung, ausgedrückt als Δ OD _R /min, nach folgender Gleichung zu ergeben:

Δ OD _R /min = (OD _R (nach 5 min) - OD _R (nach 2 min))/3

Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.

Tabelle II

Die Ergebnisse der Tabelle II sind in Fig. 2 graphisch dargestellt. Es wird ersichtlich, daß die durch das erfindungsgemäße analytische Elemente erhaltene Eichkurve steiler ist als die Kurve, die durch das analytische Vergleichselement erhalten wird, und zwar insbesondere im Bereich einer hohen LDH-Konzentration.

Referenzbeispiel der Störung der Aktivität durch Brenztraubensäure

Auf die gemäß Beispiel 1 hergestellten analytischen Elemente wurden Monitol I-X und Monitol II-X fleckförmig aufgebracht, welche beide Lithiumpyruvat enthielten, um die LDH- Aktivität zu messen. Die LDH-Aktivität wurde wie in Beispiel 2 gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt.

Tabelle III

Die Ergebnisse der Tabelle III sind in Fig. 3 graphisch dargestellt. Die Figur zeigt die Kurven der Beziehung zwischen der Menge (mM) von zugesetzter Brenztraubensäure und der gemessenen LDH-Aktivität (E/l), welche unter Verwendung von Monitrol I-X und Monitrol II-X beobachtet worden war.

Beispiel 3

Die Verfahrensweisen des Beispiels 1 wurden mit der Ausnahme wiederholt, daß 12 mM/m² Natriumglutamat und 7.200 E/l GPT dazu verwendet wurden, um ein erfindungsgemäßes integrales analytisches Mehrschichtelement zur quantitativen Bestimmung von LDH herzustellen.

Zum Vergleich wurde das gleiche analytische Element mit der Ausnahme hergestellt, daß kein Natriumglutamat und kein GPT in die Reagenz enthaltende Lösung eingearbeitet wurden.

Beide analytischen Elemente wurden bezüglich CV verglichen, wobei eine Eichkurve verwendet wurde, die in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 erstellt worden war. Die Proben waren Monitrol I-X und Monitrol I-X + LDH.

Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle IV

Claims (10)

1. Analytisches Element zur Bestimmung der Aktivität von Lactat-Dehydrogenase mit einer Reagenzschicht, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzschicht NAD⁺, Lactat, ein Puffermittel und ein Enzym enthält, wobei das genannte Enzym dazu imstande ist, ein aus dem Lactat durch Wirkung der Lactat-Dehydrogenase in Gegenwart von NAD⁺ erzeugtes Pyruvat in eine anderes Produkt als das Lactat umzuwandeln, wodurch der Einfluß des Pyruvats auf die Aktivität von Lactat-Dehydrogenase ausgeschaltet wird.

2. Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Enzym aus der Gruppe Pyruvat-Kinase, Pyruvat-Oxidase und Glutaminsäurebrenztraubensäure- Transaminase ausgewählt ist.

3. Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Enzym in der Reagenzschicht in einer Menge von 500 bis 1.000.000 I. E./m² enthalten ist.

4. Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Enzym in der Reagenzschicht in einer Menge von 2.000 bis 50.000 I. E./m² enthalten ist.

5. Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Reagenzschicht weiterhin einen Elektronen aufnehmenden Farbstoffvorläufer und einen Elektronenüberträger enthält.

6. Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzschicht weiterhin einen Coenzymstabilisator enthält.

7. Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzschicht eine poröse Schicht enthält und daß die poröse Schicht NAD⁺, Lactat, ein Puffermittel und das Enzym enthält.

8. Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzschicht eine poröse Schicht und eine wasserdurchlässige Schicht, die in fließfähigem Kontakt mit der porösen Schicht angeordnet ist, enthält und daß die wasserdurchlässige Schicht NAD⁺, Lactat, ein Puffermittel und das Enzym enthält.

9. Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzschicht auf einem wasserundurchlässigen transparenten Träger angeordnet ist.

10. Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzschicht auf einem wasserundurchlässigen transparenten Träger angeordnet ist und eine poröse Schicht und eine wasserdurchlässige Schicht enthält, wobei die wasserdurchlässige Schicht auf dem Träger angeordnet ist.