JPS62299A - トランスアミナ−ゼ活性測定用一体型多層分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、液体試料中のトランスアミナーゼ活性を測定
するための一体型多層分析要素に関するものである。

［発明の背景］ 臨床検査において、ヒトの体液中のトランスアミナーゼ
活性を測定することは極めて重要である。すなわち急性
肝炎等の肝疾患および心筋梗塞等の心疾患の診断に体液
中のトランスアミナーゼ活性の測定がなされている。

トランスアミナーゼ（アミントランスフェラーゼ）とは
、アミノ酸のアミノ基をオキソ酸に転移して、別のオキ
ソ酸とアミノ酸を生ずる反応を触媒する酵素群（ＥＣ２
，６，１群）の総称である。臨床検査上重要なトランス
アミナーゼとしてば、アラニンアミノトランスフェラー
ゼ（ＥＣ２，６，１，２，；以下ＡＩ、Ｔと略す場合が
ある）およびアスパラギン酸アミントランスフェラーゼ
（ＥＣ２，６，１，１，；以下ＡＳＴと略す場合がある
）を挙げることができる。

トランスアミナーゼ活性の測定方法としては、従来より
様々な方法が提案されている。たとえば、トランスアミ
ナーゼ反応と補酵素ＮＡＤＨが関与する反応をカップリ
ングさせ、ＮＡＤＨ濃度の変化を紫外スペクトル領域で
速度法を用いて測定する方法がある。その例として、い
わゆるカルメン法（エイ・カルメン［Ａ、　Ｋａｒｍｅ
ｎ、］　、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスチ
ゲーション［Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ　］　３
４．１３１−１３３．１！３５５参照）があり、この方
法に様々な改良を加えたものが、Ｉ　ＦＣＣを始めとす
る各国臨床化学会の標準法として確立している・ しかしながらＮＡＤ）Ｉ濃度変化を紫外領域で測定する
には、 １）高精度の測定器を必要とし、 ２）測定装置の汚れおよび検体の濁り等による干渉を受
は易５１等、一般に紫外領域測光には精度に関する困難
性があり、そして、 ３）精度がＮＡＤＨの純度に依存する等の問題がある。

上記測定法は以上のように、日常測定法どしては精度管
理が非常に難しく、そのため近年において可視スペクト
ル領域でのトランスアミナーゼ活性測定法が見直されて
いる。

可視領域におけるトランスアミナーゼ活性測定法として
は、古くはライトマン・フランケル法が知られているが
、近年新規酵素が商業的に製造されることで、各種の検
出反応系が実用化されるようになった。

例えば美崎等による特開昭５４−１２６７９１号および
同５５−１３０６８号各公報記載のピルビン酸オキシダ
ーゼを用いるＡＬＴ活性測定法およびオキザロ酢酸脱炭
酸ｉ？Ｉ素とピルビン酸オキシダーゼとを用いるＡＳＴ
活性測定法が巾広く実用化されている。

また、松崎明記等による特開昭５７−４３６８号および
石川英彦等による同５８−１４９６７７号各公報記載の
グルタメートオキシダーゼ法を用いるＡＬＴおよびＡＳ
Ｔ活性測定法も知られている。

上記測定方法に共通しているのは反応系の中間体に過酸
化水素を生成させ公知のペルオキシダーゼを用いた過酸
化水素検出試薬系に共役させ染料を生成させて可視領域
で定量することにある。これらの過酸化水素検出試薬系
を用いた可視スペクトル測定によるトランスアミナーゼ
活性測定法は日常の精度管理が容易で、かつ通常の測定
精度を有する測光器で充分に高精度の測定値を得られる
点等から、今後さらに一般化する方法と考えられる。（
仁科他１日本臨床検査自動化学会会誌、Ｖｏｌ　７．　
Ｎｏ　４．１９８２参照）上記従来のトランスアミナー
ゼ活性の測定は、希釈水溶液中での均一反応と透過測光
を基本とする湿式分析法によって行なわれてきた。一方
、診断に関与する医師等の医療関係者からの簡便な操作
による迅速な測定を求める強い要請がある。これに答え
る方向として近年において、乾燥状態で保存された検出
反応に必要な試薬類と少量の試料溶液との反応を反射測
光により定量する乾式分析法が提案されている。特に上
記乾式分析法のうち、取り扱いの簡易な一体型多層分析
要素（以下、分析要素と略す場合もある）を用いるトラ
ンスアミナーゼ活性測定法の開発が待たれている。

トランスアミナーゼ活性測定用一体型多層分析要素とし
ては、特開昭５７−２０８９９７号および同５７−２０
８９９８号各公報に、本発明者等によるピルビン酸オキ
シダーゼを用いる一体型多層分析要素が開示されている
。上記分析要素は。

トランスアミナーゼ生成物に作用して過酸化水素を発生
させる試薬系およびトランスアミナーゼ基質を含有する
多孔性展開基質層、過酸化水素を検出する試薬系を含有
する検出試薬層および支持体層を積層してなるものであ
る。

しかしながら、これらの一体型多層分析要素を用いる分
析方法は、トランスアミナーゼ活性測定値が検体の個体
差を微妙に反映し、その精度に関し若干の問題点が生じ
ることがわかった。

本発明者が上記問題点の原因を解析したところ、これら
の原因が驚くべきことに血清または血漿中に共存するカ
タラーゼによる干渉であることが明らかとなった。上記
事実について以下において説明する。

血球中にトランスアミナーゼが高濃度で含有されている
事は知られている６例えば正常ヒト血清に対して、赤血
球は１５倍のＡＬＴ活性値および８０倍のＡＳＴ活性値
を示す、さらに本発明者の実験によると、ヘモグロビン
約１００ｍｇ／ｄｆＬの溶血に相当する微溶血性血清に
おいても、ＡＳＴ活性値は非溶血時より５０％〜１００
％の増加値として測定された。（参考例１参照）また、
臨床検査において重要なトランスアミナーゼ活性とは、
病的状態にある組繊細胞の変性または崩壊により体液中
に放出された酵素の活性、すなわち血清または血漿等の
体液中のトランスアミナーゼ活性である。ゆえにトラン
スアミナーゼ活性測定には、非溶血性または微溶血性の
検体を用いることが常識的に行なわれている。

一方面液等の体液中のカタラーゼ活性は、そのほとんど
が血球（特に赤血球は、多量のカタラーゼを有する細胞
であ、る）に起源を有するものであることが知られてい
る。以上の理由により、非溶血性または微溶血性の検体
を用いる上記トランスアミナーゼ活性測定においては、
カタラーゼ活性が測定精度に及ぼす影響について考慮さ
れることはほとんどなかった。しかしながら本発明者が
非溶血性の血清・血漿検体を用いても、過酸化水素を検
出する試薬系を含有するトランスアミナーゼ活性測定用
一体型多層分析要素においては測定精度に大きな変動を
ｗｉ測した。そこで本発明者が、この変動要因の解析を
多方面の要因について検討し、非溶血性の血清・血漿・
コントロール血清が〃゛ 本来持っているカタラーゼ活性に起因する事才明らかに
なった。（参考例２および３参照）カタラーゼ活性の干
渉防止効果を有する一体型多層分析要素としては、特開
昭５９−１０９１９２号公報に、本発明者等による過酸
化水素検出系を用いる血液中の基質（例、グルコース、
尿酸およびコレステロール等）検出用一体型多層分析要
素が記載されている。

しかし上記分析貿素は、全血試料を検体として用いた場
合における、赤血球（血中カタラーゼの大部分を含む）
の干渉および赤血球の破損による溶血と共に血球中より
流出したカタラーゼ活性の干渉の防止を目的とするもの
である。すなわち上記分析要素は、展開層が鼻血＃、、
ｉ：ｖ別する機能を有し、かつ上記大量の溶血により生
じたカタラーゼ活性を阻害することができる量のカタラ
ーゼ活性阻害剤を含有するものである。

［発明の要旨］ 本発明の目的は、測定精度が改みされたトランスアミナ
ーゼ活性測定用一体型多層分析要素を提供することであ
る。

本発明の他の目的は、簡便及び迅速な操作が可能で、医
師、看護婦等の臨床検査の非熟練者であっても容易に試
料液体中のトランスアミナーゼ活性を測定することので
きる一体型多層分析要素を提供することである。

本発明は、一または二以上の試薬よりなりトランス７ミ
ナーゼ生成物に作用して過酸化水素を発生させるａ　ｆ
ｌを有する試薬系およびトランスアミナーゼ基質として
機能するアミノ酸と２−オキソ酸を含有する多孔性展開
基質層、一または二以上の試薬よりなり過酸化水素を検
出する機能を有する試薬系を含有する検出試薬層および
支持体層を積層してなる一体型多層分析要素において、
上記多孔性展開基質層または上記検出試薬層が、アジ化
物を０．１ミリモル／ｒＩＴ′以上含有するこ・とを特
徴とするトランスアミナーゼ活性測定用一体型多層分析
要素を提供するものである。

［発明の効果］ 本発明のトランスアミナーゼ活性測定用一体型多層分析
要素は、多孔性展開基質層または検出試薬層が、トラン
スアミナーゼ活性の測定に一般に用いられる非溶血性ま
たは微溶血性等である検体中のカタラーゼ活性を阻害す
るのに必要かつ充分な量のアジ化物を含有するものであ
る。上記アジ化物は、カタラーゼ活性阻害剤として優れ
た性質を有している。ゆえに本発明の分析要素は、検体
中に含まれるカタラーゼ活性の個体差に影響を受けるこ
とがなく、優れた分析精度を示す。

また本発明の分析要素は、アジ化物の含有量が必要かつ
充分な量（０，１ミリモル／ハ）以上であれば、アジ化
物の含有量を可能な限り少量（具体的には０．１ミリモ
ル／ｒｒｆに近い値）に限定して取り扱いを容易にし、
簡便及び迅速な操作を可能とすることができる。

さらにトランスアミナーゼ生成物に作用して過酸化水素
を発生させる機能を有する試薬系または過酸化水素を検
出する機能を有する試薬系が酵素を含む場合（特に後者
の試薬系がペルオキシダーゼを含む場合）には、過剰量
のアジ化物がカタラーゼ活性以外の酵素活性（特にペル
オキシダーゼ活性）をも阻害する場合がある。しかし、
本発明の分析要素はアジ化物の含有量を少量に限定して
使用することができるものであるから上記試薬系に含ま
れる酵素活性の阻害および測定精度の低下を防止するこ
とができる。

［発明の詳細な記述］ 本発明のトランスアミナーゼ活性測定用一体型多層分析
要素の支持体層を構成するものとしては、光透過性でか
つ水不透過性である支持体が好ましい。光透過性・水不
透過性支持体の例としては、ポリエチレンテレフタレー
ト、ビスフェノールＡのポリカルボネート、ポリスチレ
ン、セルロースエステル（例、セルロースジアセテート
、セルローストリアセテート、セルロースアセテートプ
ロピオネ−１：）等のポリマーからなる厚さ約５０１Ｌ
ｍから約１ｍｍ、好ましくは約８０１Ｌｍから約３００
ルｍの範囲のフィルム、もしくはシート状の透明支持体
を挙げることができる。

支持体の表面には必要により下塗層を設けて。

支持体の上に設けられる検出試薬層あるいはその他必要
に応じて設けられる層（例、吸水層）と支持体との接着
を強固なものにすることができる。

また、下塗層の代りに、支持体の表面を物理的あるいは
化学的な活性化処理を施して接着力の向上を図ってもよ
い。

支持体の上には（場合によっては上記下塗層等の他の層
を介して）検出試薬層が設けられる。本発明のトランス
アミナーゼ活性測定用分析要素に備えられる検出試薬層
は親木性結合剤よりなる層、すなわち水を吸収して膨潤
する親木性ポリマーを層形成成分として利用している層
であることが好ましい。

検出試薬層の製造に用いることができる親水性ポリマー
は、一般には水吸収時の膨潤率が３０℃で約１５０％か
ら約２０００％、好ましくは約２５０％から約１５００
％の範囲の天然または合成親木性ポリマーである。その
ような親木性ポリマーの例としては、特開昭５８−１７
１８６４号公報および特願昭５８−２１７４２８号明細
書等に開示されているゼラチン（例、酸処理ゼラチン、
脱イオンゼラチン等）、ゼラチン話導体（例、フタル化
ゼラチン、ヒドロキシアクリレートグラフトゼラチン等
）、アガロース、プルラン、プルラン誘導体、ポリアク
リルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリ
ドン等を挙げることができる。

本発明のトランスアミナーゼ活性測定用分析要素の検出
試薬層は、一または二以上の試薬よりなり過酸化水素を
検出する機崗を有する試薬系゛（以下、過酸化水素検出
試薬系と記す）を含有する。

過酸化水素検出試薬系としては、ペルオキシダーゼおよ
び過酸化水素の存在下でペルオキシダーゼの作用により
顕色性を示す化合物からなる試薬系を挙げることができ
る。具体的には、ペルオキシダーゼ、４−７ミノアンチ
ピリンおよびヒドロキシナフタレン類（例、１．７−シ
ヒドロキシナフタレン；１−ヒドロキシナフタレン−２
−スルホン酸（塩）等）または置換ア・ニリン化合物（
例、８−アニリノナフタレン−１−スルホン１％ｉ；Ｎ
−メチル−Ｎ−（スルホプロピル）アニリン等）の組合
せからなるトラインダー試薬（米国特許第３９９２１５
８号明細書、特開昭５０−１３７１９２号、Ｌ司５９−
５４９６２号、同６０−１１１９６０報答公報等に記載
）、ベンジジン系化合物（＃！ｊ公昭５０−１６６７８
号、同５１−３７５５５号、同５３−４４８３４号、同
５４−３３９４時各公報等に記載）、トリアリールイミ
ダゾールロイコ染料（ｃｉ開昭５３−２６１８８号公報
に記載）、ジアリールイミダゾールロイコ染料（特開昭
５９−１９３３５２号公報等に記ａ）、芳香族アミン化
合物と４−７ミノアンチビリン、４−アミノ−２−メチ
ル−３−フェニル−１−（２゜４．６−ドリクロロフエ
ニル）−３−ピラゾリン−５オン等の電子供与体との組
合せ（特開昭５０−１１５８９２号、同５４−２５８９
２号、同５５−２０４７１号、特公昭５５−２９６０号
各公報答に記載）を挙げることができる。

また上記試薬系については、アナルス争オブ・クリニカ
ル・バイオケミストリー（Ａｎｎ、　Ｇ１１ｎ。

Ｂｉｏｃｈａｍ、）第６巻、第２４頁から第２７頁（１
９６９年）の記載、特公昭５６−４５５９９号、特開昭
５５−１６”４３５６号、同５６−１２５３７３報答公
報の記載も参照することができる。

本発明のトランスアミナーゼ活性測定用分析要素はＬ記
検出試薬層または後述する多孔性展開基質層が、アジ化
物を０．１ミリモル／ｒｎ′以上含有する。アジ化物の
詳細については後述する。

検出試薬層には必要に応じて緩衝剤を含有させることが
できる０本発明のトランスアミナーゼ活性測定用分析要
素の検出試薬層に含有させることができる緩衝剤の例と
しては、炭酸塩、ホウ酸塩、燐酸塩やＧｏｏｄの緩衝剤
などの公知の緩衝剤を挙げることができる。これらの緩
衝剤はｒ蛋白質・酵素の基礎実験法１　（掘尾武−他、
南江堂。

１９８１）等の公知文献を参考にして選択し、使用する
ことができる。

検出試薬層の乾燥時の厚さは約ｌＩＬｍから約１００ｇ
ｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは約３Ｂ
ｍから約３０ＪＬｍの範囲である。

また検出試薬層は実質的に透明であることが好ましい。

上記検出試薬層の上に必要に応じて光直蔽層を設けるこ
とができる。光遮蔽層は、光遮蔽性、または光遮蔽性と
光反射性とを兼ね備えた微粒子または微粉末（以下、単
に微粒子という）が少量の被膜形成能を有する親木性ポ
リマーバインダーに分散保持されている水透過性または
水浸透性の層である。光遮蔽層は検出試薬層にて発生し
た検出可能な変化（色変化、発色等）を光透過性を有す
る支持体側から反射測光する際に、後述する多孔性展開
基質層に点着供給された水性液体の色、特に試料が全血
である場合のヘモグロビンの赤色等を遮蔽するとともに
光反射層または背景層としても機俺する。

光遮蔽性と光反射性とを兼ね備えた微粒子の例としては
、二酸化チタン微粒子（ルチル型、アナターゼ型または
プルカイト型の粒子径が約０．１ｐｍから約１．２ルｍ
の微結晶粒子等）、硫酸バリウム微粒子、アルミニウム
微粒子または微小フレーク等を挙げることができ、光遮
蔽性微粒子の例としては、カーボンブラック、ガスブラ
ック。

カーボンミクロビーズ等を挙げることができ、これらの
うちでは二酸化チタン微粒子、硫酸バリウム微粒子が好
ましい、特に好ましいのは、ルチル型二酸化チタン微粒
子である。

被膜形成能を有する親木性ポリマーバインダーの例とし
ては、前述の検出試薬層の製造に用いられる親木性ポリ
マーと同様の親木性ポリマーのほかに、弱親水性の再生
セルロース、セルロースアセテート等を挙げることがで
き、これらのうちではゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリ
アクリルアミド笠が好ましい。なお、ゼラチン、ゼラチ
ン誘導体は公知の硬化剤（架橋剤）を混合して用いるこ
とができる。

光遮蔽層は、光遮蔽性微粒子と親水性ポリマーとの水性
分散液を公知の方法により検出試薬層のＬに塗４１シ乾
燥することにより設けることができる。また光ｉｌ！蔽
層を設ける代りに、後述する多孔性展開基質層中に光遮
蔽性微粒子を含有させてもよい。

なお、検出試薬層の丘に、場合によっては光遮蔽層等の
層を介して、後述する多孔性展開基質層を接着し積層す
るために接着層を設けてもよい。

接着層は木で湿潤しているとき、または水を含んでＷ潤
しているときに多孔性展開基質層を接着することができ
、これにより各層を一体化できるような親木性ポリマー
からなることが好ましい。

接着層の製造に用いることができる親木性ポリマーの例
としては、検出試薬層の製造に用いられる親木性ポリマ
ーと同様な親木性ボ゛リマーがあげられる。これらのう
ちではゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド
等が好ましい。接着層の乾繰膜厚は一般に約０．５１Ｌ
ｍから約２０ｇｍ。

好ましくは約ＩＩＬｍから約１０ｐｍの範囲である。

なお、接着層は検出試薬層上以外にも、他の居間の接着
力を向上させるため所望の層上に設けてもよい、接着層
は親木性ポリマーと、必要によって加えられる界面活性
剤等を含む水溶液を公知の方法で、支持体や検出試薬層
等の上に塗布する方法などにより設けることができる。

これらの層の上には、多孔性展開基質層が設けられる。

本発明の多孔性展開基質層は液体試料計量作用を有して
いることが好２ましい、液体試料計量作用を有する多孔
性展開基質層とは、モの上側の表面（支持体から遠い側
の表面）に点着供給された水性液体試料を、その中に含
有している成分を実質的に偏在させることなしに、横（
水平）方向に広げ、単位面積当りほぼ一定容量の割合で
検出試薬層に供給する作用を有する層である。また本発
明の多孔性展開基質層は、アナライトであるトランスア
ミナーゼが容易に通過・拡張しうる空間を有する多孔性
展開基質層であることが好ましい。

以上の点から本発明のトランスアミナーゼ活性測定用一
体型多層分析要素に備えられる多孔性展開基質層のマト
リックスを構成する材料としては、ｉｌ！紙、不織布、
織物生地１編物生地、ガラス繊維、濾紙またはプラッシ
ュポリマーより形成されるメンブランフィルタ−１ある
いはポリマーミクロビーズ等からなる三次元格子状構造
物等を用いることが好ましい、多孔性展開２１ｉ賀層の
マトリックスは、Ｌ記各材料のうちから分析条件等に応
じて選択することができる。

上記多孔性展開基質層に用いることができる織物生地（
織布）としては特開昭５５−１６４３５６号および特開
昭５７−６６３５９号の各公報に開示の広範囲の種類の
織物生地があげられる。織物生地のうちでは、たて（経
）糸とよこ（緯）糸とで織った平織物が好ましく、平織
物のうちでは細布生地、金山生地、ブロード生地、ボブ
リン生地等が好ましい、織物生地を構成する糸としては
後述する編物生地を構成する糸と同様の素材からなる糸
があげられ、糸ρ形態としてはフィラメント糸、紡績糸
（加捻糸）のいずれをも用いることができ、これらのう
ちでは紡績糸が好ましい、織物生地の糸の太さは綿紡績
糸番手で表して約２Ｏ５から約１５Ｏ５、好ましくは約
４０５から約１２０５相当の範囲または組糸デニールで
表して約３５０から約３００Ｄ、好ましくは約４５０か
ら約１３０Ｄ相当の範囲、織物生地の厚さは約１１００
ｐから約５００ＪＬｍ、好ましくは約１２０ＪＬｍから
約３５０ｇｍの範囲、織物生地の有する空隙率は約４０
％から約９０％、好ましくは約５０％から約８５％の範
囲である。

また、上記多孔性展開Ｕ質層に用いることができる編物
生地（編布、すなわち編んだ布状物）としては、広範囲
の種類の編物生地があげられ、それらのうちではたて（
経）メリヤスとよこ（緯）メリヤスが好ましい、たてメ
リヤスとしては、−重アトラス編生地、トリコツ）Ｍ生
地、ダブルトリコット編生地、ミラニーズ編生地、ラッ
シェル編生地等を用いることができ、よこメリヤスとし
ては、平編生地、パール編生地、ゴム編生地および両面
編生地等を用いることができる。ＩｊＡ物生地を編成す
る糸としては、綿、絹、羊毛等の天然繊維の糸、ビスコ
ースレーヨン、キュプラ等の再生セルロース、セルロー
スジアセレート、セルローストリアセテート等の半合成
有機ポリマー、ポリアミド（各種のナイロン類）、アセ
タール化ポリビニルアルコール（ビニロン等）、ポリア
クリロニトリル、ポリエチレンテレフタレート、ポリエ
チレン、ポリプロピレン、ポリウレタン等の合成有機ポ
リマーの細繊維からなる糸または単繊維からなる糸、天
然繊維と再生セルロース、半合成または合成有機ポリマ
ー繊維との混合繊維からなる糸があげられる。糸の形態
としては、フィラメント糸、紡績糸（加捻糸）のいずれ
をも用いることができ、これらのうちでは紡績糸が好ま
しい０編物生地の糸の太さは、綿紡績糸番手で表わして
約４０５から約１ｓｏｓ、好ましくは約６Ｏ３から約１
２０５相当の範囲または絹糸デニールで表わして約３５
０から約１３．ＯＤ、好ましくは約４５Ｄから約９００
相当の範囲である６編物生地の編成工程時のゲージ数と
しては約２０から約５０の範囲、編物生地の厚さは約１
１００ＪＬから約６００ｐｍ、好ましくは約１５０μｍ
から約４００川ｍの範囲、編物生地の有する空隙率は約
４０％から約９０％、好ましくは約５０％から約８５％
の範囲である。たてメリヤスのうちでは縦方向の伸縮が
少なく、また編物多孔性展開基質層のラミネーション工
程にお°ける操作のしやすさ、裁断時の編目はどけのな
さ等の観点でトリコット纒生地。

ラッセル編生地、ミラニーズ編生地、ダブルトリコット
編生地が好ましい。

多孔性展開基質層に用いられる織物または編物生地は水
洗等の脱脂処理により少なくとも糸製造時、織物製造時
あるいは編物編成時に供給または付着した油脂類を実質
的に除去した織物ま・たは編物生地であるが、さらにそ
の織物または編物生地は特開昭５７−６６３５９号公報
に開示の物理的活性化処理（好ましくはグロー放電処理
またはコロナ放電処理′：ｇ）を生地の少なくとも片面
に施すか、あるいは特開昭５５−１６４３５６号、特開
昭５７−６６３５９号公報等に開示の親木性ポリマー含
浸処理等の親木化処理、またはこれらの処理工程を逐次
実施することにより織物または編物を親水化し、下側（
支持体に近い側）の層との接着力を強化することができ
る。

織物または編物生地からなる多孔性展開基質層を検出試
薬層または接着層に接着、積層するには、特開昭５５−
１６４３５６号および特開昭５７−６６３５９号各公報
報答開示の方法に従って作成することができる。すなわ
ち、検出試薬層または接着層の塗布後未乾燥のうちに、
または乾燥後の層に水（または界面活性剤を少量含む水
）を実質的に均一に供給して層を膨潤させ、ついで織物
または編物生地を湿潤または膨潤している層の上に実質
的に均一に軽く圧力をかけながら接着、積層し一体化す
る。

また多孔性展開基質層がプラッシュポリマーまたはメン
ブランフィルタ−からなる場合には特公昭５３−２１６
７７号公報等、ポリマーミクロビーズからなる三次元格
子状構造物層である場合には特開昭５５−９０８５９号
公報等、＋１！紙または不織布からなる場合には特開昭
５７−１４８２５０号公報等にそれぞれ記載の方法に従
って設けることができる。

検出試薬層または接着層の親木性ポリマーバインダーが
ゼラチンまたはゼラチン誘導体の場合には１層の塗布後
ゼラチン（Ｕ導体）が未乾鰻のゲル状態の間に上記多孔
性展開基質層を構成する材料（織物または編物生地′：
Ｊ）を接着、積層し一体化する方法を採用することがで
きる。

本発明のトランスアミナーゼ活性測定用一体型多層分析
要素の多孔性展開基質層は、トランスアミナーゼ基質を
含有する０本発明において上記トランスアミナーゼ基質
とは、トランスアミナーゼが触媒するアミノ基転移反応
の基質となるオキソ酸およびアミノ酸のことである。上
記トランスアミナーゼ反応のほとんどが可逆反応である
ため、トランスアミナーゼ基質と後述するトランスアミ
ナーゼ生成物の間には互換性がある。たとえば、下記の
反応を触媒するアラニンアミノトランスフェラーゼの活
性測定においては、 アラニン＋２−オキソグルタル酸 ピルビン酸＋グルタミン酸 アラニンおよび２−オキソグルタル酸の組み合わせ、あ
るいはピルビン酸およびグルタミン酸の組み合わせのい
ずれか一方を基質として用いることができる。

また、下記の反応を触媒するアスパラギン酸アミノトラ
ンスフェラーゼの活性測定においては、アスパラギン酸
＋２−オキソグルタル酸しオキサロ酢酸＋グルタミン酸 アスパラギン酸および２−オキソグルタル酸の組み合わ
せ、あるいはオキサロ酢酸およびグルタミン酸の組み合
わせのいずれか一方を基質として用いることができる。

なお上記のように一方の組み合わせを基質として用いた
場合、他方の組み合わせを構成する化合物は後述するト
ランスアミナーゼ生成物となる。

上記二種類の組み合わせのうち、どちらをトランスアミ
ナーゼ基質として用いるかは、反応の平衡定数および下
記トランスアミナーゼ生成物に作用して過酸化水素を発
生させる機能を有する試薬系を設定する場合の容易さ等
の条件を考慮して決定する。

さらに本発明のトランスアミナーゼ活性測定用一体型多
層分析要素の多孔性展開基質層は、一または二以上の試
薬よりなりトランスアミナーゼ生成物に作用して過酸化
水素を発生させる機能を有する試薬系を含有する０本発
明においてトランスアミナーゼ生成物とは、トランスア
ミナーゼが触媒するアミン基転移反応により生成したオ
キソ酸および／またはアミノ酸のことである。一般的に
はトランスアミナーゼ生成物のうち、オキソ酸またはア
ミノ酸の一方（好ましくはオキソ酸）に対して、下記過
酸化水素を発生させる機能を有する試薬系を作用させる
。

トランスアミナーゼ生成物に作用して過酸化水素を発生
させる機能を有する試薬系としては２様々なものを用い
ることができる。一般に上記試薬系は、酸素を過酸化水
素に還元する機能を有するオキシダーゼ系の酵素を含む
ものである。上記トランスアミナーゼ生成物をそのまま
上記オキシダーゼ系の酵素の基質として用いる場合には
、上記試薬系は上記オキシダーゼ系の酵素および同酵素
反応に必要な物質（例、補ｆ／Ｉ素等）のみからなる、
また、上記トランスアミナーゼ生成物をそのまま下記オ
キシダーゼ系の酵素の基質として用いるない場合には、
上記試薬系は上記オキシダーゼ系の酵素および同酵素反
応に必要な物質に加えて、トランスアミナーゼ生成物に
作用してオキシダーゼ系の酵素の基質を生成させる一ま
たは二以上の反応に必要な試薬類を含む。

具体的にはアラニンアミノトランスフェラーゼ活性測定
のように、ピルビン酸を上記トランスアミナーゼ生成物
とすることができる場合には、トランス７ミナーゼ生成
物に作用して過酸化水素を発生させる機能を有する試薬
系として、ピルビン酸オキシダーゼおよびピルビン酸オ
キシダーゼの反応に必要な物質であるチアミンピロリン
酸、リン酸およびフラビンアデニンジヌクレオチドから
なる試薬系を用いることができる。

また、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの活性
測定においては、トランスアミナーゼ生成物をオキサロ
酢酸に対してトランスアミナーゼ生成物に作用して過酸
化水素を発生させる機能を有する試薬系として、上記ピ
ルビン酸オキシダーゼおよびピルビン酸オキシダーゼの
反応に必要な物質に加えて、オキサロ酢醜に作用してピ
ルビン酸を生成させるオキサロ酢酸デカルボキシラーゼ
およびオキサロ酢酸デカルボキシラーゼの反応に必要な
物質を含む試薬系を用いることができる。

本発明のトランスアミナーゼ活性測定用分析要素は多孔
性展開基質層または前述した検出試薬層が、アジ化物を
０．１ミリモル以上含有する。アジ化物の好ましい含有
量は、０．１ミリモルから１０ミリモルの範囲であり、
特に好ましくは０．２ミリモルから２ミリモルの範囲で
ある。

本発明のトランスアミナーゼ活性測定用分析要素に用い
ることができるアジ化物としてはアジ化塩を挙げること
ができる。アジ化塩のうちでは特にアジ化ナトリウム、
アジ化カリウム、アジ化リチウム、アジ化アンモニウム
等が有効であるが。

これらに限定するわけではない。

多孔性展開基質層に上記のトランスアミナーゼ生成物に
作用して過酸化水素を発生させる機能を有する試薬系、
トランスアミナーゼ基質、アジ化物および光遮蔽性微粒
子や酵素賦活剤、緩衝剤等の試薬を含有させるに際して
は、下記のような様々な方法を用いることができる。

たとえば、上記試薬等を含有する塗布液を多孔性展開基
質層の上から塗布または噴霧し乾燥する方法を用いるこ
とができる。

また多孔性ａ１３１ｘ質層がラミネートにより積層する
多孔性展開基質層材料、例えば、織物１編物、濾紙、不
織布およびガラス繊維濾紙等からなる場合には、上記試
薬等を含有する溶液に多孔性展開基質層を浸漬したのち
乾燥または半乾燥状態で他の層に積層し一体化する方法
を用いることができる。

塗布により形成される多孔性展開基質層１例えばプラッ
シュポリマ一層やミクロビーズ三次元格子状粒子構造体
等からなる多孔性展開基質層の場合には、多孔性展開基
質層と試薬等の塗布液を混　　　。

合して塗布してもよい。

なお、どれらの多孔性展開基質層に試薬等を含有させる
方法を用いる場合には、いくつかの試薬毎に異なる方法
を用いることができる。また、いくつかの試薬毎に数回
に分けて行なうこともできる。

本発明のトランスアミナーゼ活性測定用一体型多層分析
要素は以上のように、支持体、検出試薬層および多孔性
展開基質層を積層してなるものであり、これらの支持体
、検出試薬層および多孔性展開基質層はこの順で積層さ
れていることが好ましい、なお本発明のトランスアミナ
ーゼ活性測定用一体型多層分析要素は、前述のように上
記の必須の層以外にも他の機能層を含んでいてもよいこ
とは勿論である。

本発明の−・体型多層分析要素は、−辺約１５ｍｍから
約３０　ｍ　ｍの正方形またはほぼ同サイズの円形等の
小片に裁断し特開昭５７−６３４５２号、特開昭５４−
１５６０７９号、実開昭５６−１４２４５４号、実開昭
５８−３２３５０号および特開昭５８−５０１１４４号
各公報等１開示のスライド枠等に納めて分析スライドと
して用いるのが製造、包装輸送、保存および測定操作等
の全ての観点で好ましい。

本発明の一体型多層分析要素は、前述の諸公報に開示の
方法に従い約５鉢文から約３０ｔｔ、ｌ、好ましくは約
８ル文から約１５μ文の水性液体試料を多孔性展開基質
層に点着供給し、必要に応じて約２０℃から約４５℃の
範囲の実質的に一定の温度でインクベーションの後に、
光透過性支持体側から一体型多層分析要素内の色変化１
発色等の検出可能な変化を反射測光し比色法の原理によ
り液体試料中の測定対象成分を分析する。

［参考例１］ 血清の溶血度とＡＬＴ活性およびＡＳＴ活性の関係： ヒト血清に溶血血液を添加して、溶血度（溶血血液／（
血清＋溶血血液））が異なる各種コントロール血清を作
成した。この各種血清について、ＡＬＴ活性値およびＡ
ＳＴ活性値を測定し、溶血度とＡＬＴ活性値およびＡＳ
Ｔ活性値の相関関係を調べた。測定結果を第１図に示す
、第１図より明らかなように、非溶血性血清に対し、ヘ
モグロビン約１００　ｍ　ｇ　／　ｄ　ｌの溶血に相当
する溶血度（１／１２８希釈の溶血全血に相当）では、
ＡｓＴ活性値が約１００％増加した。

［参考例２］ 各血を中のカタラーゼ活性の測定： １ｍＪ１のヒト新鮮血清および下記第１表に示す各種コ
ントロール血清に含まれるカタラーゼ活性により、ｌｏ
ｍＭのＨ２Ｏ２から３７℃で生成する酸素を酸素電極法
により測定し、この酸素の生成速度からカタラーゼ活性
値を求めた。測定結果を第２図に示す。

第２図から明らかなように、通常これらの生化学検体に
含有されるカタラーゼ活性は１０　Ｕ　／　ｍ見程度で
あり、特別な例としである種のコントロール血清（モニ
トロールＩ）で３２９　Ｕ　／　ｍ　！Ｌを測定した。

以下余白 第１表 コントａ−ル　　　　　　商品名　　　　　　　　　　
　　　　備考血清 ａ　　　モニトロールＩ　　　　　正常値域生化学コン
トロール血清 ｂ　　　　　　モニトａ−ルＩＸ　　　　　　　　　　
　　同上ｃ　　　　モｕｂａ−ル■　　　　異常値域生
化学コントロール血清 ｄ　　　　　　モニトａ−ル■　Ｘ　　　　　　　　　
　　　同上ｅ　　　ベルサトールＥＮプラス　酵素正常
値域生化学コントロール血清 ｆ　　　ベルサトールＥプラス　　酵素異常値域生化学
コントロール血清 ｇ　　　７％Ｈ５Ａ　　　　　　　− ｈ　　　７％Ｈ５Ａ　　　　　　　− 註：ａ−ｄはデート（Ｄａｄｅ）社製；ｅおよびｆはワ
ーナーｅランベルト（ＷａｒｎｅｒＬａｍｂｅｒｔ）社
製 また患者血清についてカタラーゼ活性を測定したところ
大部分がＢ　ＯＵ　／　ｍ　ｌ以下であり多くても１２
０Ｕ／ｍ！Ｌであった。これらの活性が全て赤血球の溶
血に基づくものと仮定すると、これはヘモグロビン約１
００　ｍ　ｇ　／　ｄ　ｌ以下の溶血に相当する。

［参考例３］ 血　の血　とカタラーゼ活　の関係： ヒト血清に溶血血液を添加して、溶血度（溶血血液／（
血清＋溶血血液））が異なる各種コントロール血清を作
成した。この各種血清について、参考例２と同様にカタ
ラーゼ活性値を測定し、溶血度とカタラーゼ活性値の相
関関係を調べた。ｎ定結果を第３図に示す、第３図より
明らかなように溶血度が増加するとともにカタラーゼ活
性は箸しく増加する。

またカタラーゼ活性（Ｙ）と溶血度（Ｘ、Ｘ＝溶血血液
／（血清＋溶血血液））との相関は、Ｙ＝２．２４Ｘ１
０４　　Ｘ＋１．８３であった。ただし相関係数γは、
０．９９９７である。

［実施例１］ ａｌＪ］ポリエチレンテレフタレート支持体（厚さ１８
０１Ｌｍ）の−表面を親木化処理し、その表面上に下記
の組成の塗布液を塗布、乾燥して、乾燥膜厚１５ＩＬｍ
の試薬層を形成した。

試薬層塗布液： ゼラチン　　　　　　　　　　　２４ｇペルオキシダー
ゼ　　　　１００ＯＯＵ（上記Ｕは、２０℃における １００００プルプロガリン 単位である） オクチルフェノキシ ポリエトキシエタノール （平均９〜１０ オキシエチレン単位含有）４ｇ ２−（３，５−ジメトキシ− ４−ヒドロキシフェニル）− ４−［４−（ジメチルアミノ） フェニル］−５−フェネチル イミダゾール　　　　　　０．９６ｇ １．２−ビス（ビニルスルホニル ア　セ　ト　ア　ミ　　ド　　　　　　　　　　　　　
　　　　０　　　、　　２４ｇ水　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　１８０ｇアセトン　　　　　　
　　　　　　３ｇメタノール　　　　　　　　　　３２
ｇＬ記試薬層上に多孔性展開基質層を密着させるために
、下記の組成からなる塗布液を乾燥膜厚２４ｍになるよ
うに塗布、乾燥して接着層を形成した。

以下余白 接着層形成用塗布液： ゼラチン　　　　　　　　　　　２５ｇノニオン界面活
性剤 （ｐ−ノニルフェノキシ ポリグリシドール； モ均１０グリシドール単位含有； 登録商標１０Ｇ、下記の 構造式よりなる化合物）　　　　Ｉｇ 上記接着層を０．２重量％のノニオン性界面活性剤（上
記接着層形成用塗布液に使用した、上記の構造式よりな
る化合物の５０重量％水溶液）を含む水溶液でほぼ均一
に湿潤させ、直ちにポリエチレンテレフタレート紡績糸
（５０デニール）よりなるモ均厚さ２４０　ＩＬｍのト
リコット編物生地（３６ゲージ）を多孔性展開基質層と
して密着ラミネートし、乾燥した。

以上のように作成された多孔性展開基質層を下記の組成
の塗布液を２００ｍＪＬ／ゴになるようにほぼ均一に塗
布し、湿潤させた。（上記の結果、多孔性展開基質層に
対しアジ化ナトリウムが６０ｍ　ｇ　／　ｒｎ’　（＝
　０　、９２ミリモル／ｒｒｙ’）となるように被覆さ
れた） Ｌ匙盗血羞： Ｌ−アラニン　　　　　　　１．１８ｇα−ケトグルタ
ルＩ％ｔ　　　　　　６０　ｍ　ｇリン醜カリウを （０，２Ｍ溶液）　　　　　　　２．２ｇフラビンアデ
ニン ジヌクレオチド　　　　　３．５ｍｇ チアミンピロリン酸　　　　　　１６ｍｇ塩化マグネシ
ウム　　　　　　３５ｍｇポリビニルピロリドン （乎均分子量３６万）　　　　　１．６ｇ水　　　　　
　　　　　　　　　　　　　２７．３ｇピルビン酸オキ
シダーゼ　　３６００Ｕアジ化ナトリウム　　　　　　
１０　ｍ　ｇ以１のように作成された本発明に従うアラ
ニンアミノトランスフェラーゼ活性測定用一体型多層分
析要素を１５ｍｍＸ　１５ｍｍの正方形に裁断し、中央
部に直径１０ｍｍの円形の開口を有する２　４　ｍ　ｍ
　Ｘ　２８　ｍ　ｍのプラスチックスライド枠に収容固
定して、アラニンアミノトランスフェラーゼ活性測定用
分析スライドを作成した。

［比較例］ 上記基質塗布液から、アジ化ナトリウムを取り除いた以
外は、実施例１と同様にして、分析スライドを作成した
。

以上のように作成された実施例１および比較例の分析ス
ライドに下記第２表に示すコントロール血清をそれぞれ
ｉｏ、ｘ滴下した。各々のスライドを３７℃でインキュ
ベートし、３分後から４分後の間の６４０ｎｍにおける
反射測光の変化（ΔＯＤ／分）を測定した。測定結果を
第３表に示す。　　　　　　　　　　以下余白 第２表 コントロール　　ＡＬＴ活性　カタラーゼ活性血清　　
　　（Ｕ　／　Ｌ　）　　　　（Ｕ　／　ｍ文）ただし
、第２表におけるコントロール血清は。

ヒト血清に下記の酵素を添加して作成した。

ｌおよび３ ＡＬＴ（シグマ社製、豚の心臓［ＰａｒｃｉｎｅＨｅａ
ｒｔ　］より抽出） ２および４ ＡＬ−Ｔ（シグマ社製、豚の心臓［ＰｏｒｃｉｎｅＨｅ
ａｒｔ　］より抽出）およびカタラーゼ（シグマ社製、
牛の肝１ｉ１　［Ｂｏｖｉｎｅ　Ｌｉｖｅｒｌより抽出
） 第３表 血清　　　　　実施例１　　　比較例 １　　　　　０．０４５　　０．０４０２　　　　　０
．０４５　　０．０１８３　　　　　０．１７０　　０
．１８０４　　　　　０．１６５　　０．０８４以上の
結果から明らかなように、血清中に含まれる微量のカタ
ラーゼ活性によっても比較例のスライドは大きく影響を
受ける。これに対し、本発明に従う実施例１のスライド
は、はとんどカタラーゼ活性の影響を受けていないこと
がわかる。

［実施例２］ 実施例１および比較例の分析スライドの各々について、
各種ヒト血清１９検体を用いて、溶液法（ＵＶ法）との
相関を調べた。溶液法は、テクニコン（ＴＥＣＨＮＩＣ
ＯＮ　）社生化学分析用アナライザＲＡ１００Ｏを用い
、Ｉ　ＦＣＣ法変法で実施した。

測定結果を第４図（実施例１のスライド）および第５図
（比較例のスライド）に示す。

第４図および第５図より明らかなように、比較例のスラ
イドは、溶液法より低値を示し、溶液法との相関性も悪
い。一方１本発明に従う実施例１のスライドは、測定値
および溶液法との相関性のいずれも良好であった。

し実施例３〕 実施例１で用いた基ｗｉｔ布液中のアジ化ナトリウムの
含有量を、下記第４表に示す塗布量となるように調整し
た以外は、実施例１と同様にして、分析スライドを作成
した０滴下サンプルとして、５０Ｕ／Ｌおよび５００Ｕ
／ＬのＡＬＴを含むコントール血清についてカタラーゼ
を含むサンプルとカタラーゼを含まないサンプルを、第
２表に示したサンプルと同様にして作成し、それらの各
々について測定を行なった。カタラーゼを含まないサン
プルの測定値に対するカタラーゼを含むサンプルに対す
る測定値を％で算出した。結果を第４表に示す。

第４表 アジ化ナトリウム　５０Ｕ／Ｌ　　５００Ｕ／Ｌ（ミリ
モル／ゴ）　　　　　ＡＬＴ　　　　　　ＡＬＴｏ、０
　　　　　２３％　　　　３５％０．２　　　　　９６
％　　　　９６％ｔ、ｏ　　　　　ｔｏｏ％　　　　９
５％２．０　　　　　９６％　　　１０３％１０．０　
　　　１００％　　　１００％第４表より明らかなよう
に、アジ化ナトリウムを含まないスライド（比較例に相
当するスライド）は、カタラーゼ活性の影響を受けるの
に対し、未発ＩＪ１に従うアジ化ナトリウムを含有する
ス゛　ライドは、そのアジ化ナトリウム含有量が０．２
ミリモル／ｍ′でもカタラーゼ活性の阻害効果がある。

また、アジ化ナトリウム含有量が０．２ミリモル／ｍ′
から１０ミリモル／ゴまでの間では、Ｅ記効果はほぼ同
等であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、参考例１において測定した溶血度とＡＬＴ活
性値およびＡＳＴ活性値の相関関係を示す図である。第
１図において、縦軸は酵素活性値を示し、横軸は溶血全
血希釈率を示す。 第２図は、参考例２において測定した各種コントロール
血清に含まれるカタラーゼ活性を示す図である。第２図
において、縦軸はカタラーゼ活性値を示す。 第３図は、参考例３において測定した溶血度とカタラー
ゼ活性値の相関関係を示す図である。第３図において、
縦軸はカタラーゼ活性値を示し。 横軸は血清の溶血全血希釈率を示す。 第４図は、ヒト血清１９検体について、実施例１の分析
スライドを用いた測定値とＩ　ＦＣＣ法変法による溶液
法の測定値との相関関係を示す図である。ｆｎ４図にお
いて縦軸は、実施例１の分析スライドを用いた測定値を
示し、横軸は溶液法による測定値を示す。 第５図は、ヒト血清１９検体について、比較例の分析ス
ライドを用いた。＋１１１１定植と溶液法による測定イ
１との相関関係を示す図である。第５図において縦軸は
、比較例の分析スライドを用いた測定値を示し、横軸は
Ｉ　ＦＣＣ法変法による溶液法の測定値を示す。 特許出願人　　富士写真フィルム株式会社代　　理　　
人　　　弁理士　　　柳　　川　　泰　　男Ａ　　　日 第４図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一または二以上の試薬よりなりトランスアミナーゼ
   生成物に作用して過酸化水素を発生させる機能を有する
   試薬系およびトランスアミナーゼ基質を含有する多孔性
   展開基質層、一または二以上の試薬よりなり過酸化水素
   を検出する機能を有する試薬系を含有する検出試薬層お
   よび支持体層を積層してなる一体型多層分析要素におい
   て、上記多孔性展開基質層または上記検出試薬層が、ア
   ジ化物を０．１ミリモル／ｍ＾２以上含有することを特
   徴とするトランスアミナーゼ活性測定用一体型多層分析
   要素。 ２、上記多孔性展開基質層または上記検出試薬層が、ア
   ジ化物を０．１ミリモル／ｍ＾２から１０ミリモル／ｍ
   ＾２の範囲で含有することを特徴とする特許請求の範囲
   第１項記載の分析要素。 ３、上記多孔性展開基質層または上記検出試薬層が、ア
   ジ化物を０．２ミリモル／ｍ＾２から２ミリモル／ｍ＾
   ２の範囲で含有することを特徴とする特許請求の範囲第
   ２項記載の分析要素。 ４、上記アジ化物が、アジ化ナトリウム、アジ化カリウ
   ム、アジ化リチウムおよびアジ化アンモニウムよりなる
   群より選ばれることを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載の分析要素。 ５、上記分析要素が、非溶血性または微溶血性の生体液
   中のトランスアミナーゼ活性測定用であることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項記載の分析要素。 ６、上記過酸化水素を検出する機能を有する試薬系が、
   ペルオキシダーゼおよび過酸化水素の存在下でペルオキ
   シダーゼの作用により自己顕色性を示す化合物からなる
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の分析要素
   。 ７、上記トランスアミナーゼ生成物に作用して過酸化水
   素を発生させる試薬系がピルビン酸オキシダーゼ、チア
   ミンピロリン酸、リン酸およびフラビンアデニンジヌク
   レオチドからなり、トランスアミナーゼ基質がＬ−アラ
   ニンおよびα−ケトグルタル酸であり、そしてアラニン
   アミノトランスフェラーゼ活性測定用であることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の分析要素。