JPS5877661A - アンモニアまたはアンモニア生成基質分析用一体型多層分析材料および検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、液体試料中のアンモニアまたはアンモニア生
成基質を分析する丸めの一体型多層分析材料および検出
法に関するものである。更に詳細には、本発明は血液、
尿等の体液中の尿素窒素の分析に有用な分析材料および
方法に関するものである。

体液中の尿素窒素、アンモニア、クレアチニン等の測定
は、腎臓病等の疾患の診断および経過コントロールのた
めに非常に重要である。従来、この尿素窒素の測定は一
般に湿式法あるいｔ１溶液法と呼ばれる方法により行わ
れている。この溶液法としては、尿素をジアセチルモノ
オキシムと直接に反応させ、生成した化合物の色吸収を
光度計で測定する方法がある。また尿素にウレアーゼを
作用させてこれを炭酸アンモニウムに分解し、アンモニ
アを遊離させてこれをネスラー試薬と反応させるか、フ
ェノール／次亜塩素酸塩を用いて着色インドフェノール
に変換し、それぞれ生成した着色反応生成物を比色定量
して間接的に尿素量を測定する方法等もある。これらの
方法はそれ自体有用であるが、高価な装置と正確な測定
技術を８賛とし、また測定時間が長いという欠点がある
。

これら溶液法の欠点に鑑み、尿素窒素測定の簡易化、迅
速化をはかシ、測定者の個人差をなくすために、近年、
乾式法と呼ばれる方法が種々提案されている（例えば臨
床検査、Ｖｏｌ、２２　、Ａ／　／　。

７２０３〜１２１ｇ＜ｉｑｔｇ年）、実印清、参照二ま
たウレアーゼ活性を有する酵素系とｐＨ指示薬と障壁形
成体とを含有する尿素定量用組成物は特開昭５ｏ−ｑ３
ｙｑｌＩ号に開示されている。）。

乾式法として典型的なものは、ウレアーゼとアルカリ性
緩衝剤を含有する試薬層と、ガス状アンモニアを検出す
る指示薬層とを備え、両層の間にガス状アンモニアのみ
を選択的に透過させるような選択透過層をはさんで一体
化した分析要素を使用するものである。たとえば特開昭
５２５２−３ｑ号には、基本的に上記多層構造を有する
一体型分析要素が開示されている。この分析’Ｉ！業に
使用されているｆリマー薄膜から成るアンモニアガスの
選択透過層は、アンモニアガスがこの透過層を拡散通過
する速度が遅いので感度が低く、又この透過層の厚さを
薄くすればアンモニアの透過速度が大きくなって感度は
上がるが、液体も透過するようになって正確な測定がで
きなくなるという欠点がある。

さらに、この薄膜の厚さにより、アンモニアの拡散通過
時間が著しく異なるため、厚さを一定かつ均一にするた
めに極めて高度の技術を必要とし、しかも、試薬層の水
性マトリクスとこの疎水性ポリマー薄膜から成る選択透
過層との接着が難しく、一体型分析要素として製造する
際の問題点となっている。

一方、特開昭５ＩＩ−１５１０９６号にけ、上記技術の
欠点、特に拡散透過時間が長いために感度が低く々、る
という欠点を改良した分析要素が開示されている。この
分析要素は、織り一又は編みネット又は有孔フォイルか
ら成るスペーサーをアンモニアガスの選択透過層・とじ
て用いることにより、感度についての欠点を改良したも
のである。しかしながらこの分析要素は非一体型のもの
であるため、特に低濃度域の感度が低く、血液のように
微量でその成分測定を行うことが望ましい検体の分析に
は適当とはいえない。また、この分析要素は使用の際、
試薬層およびスイーサーを取除いて指示薬層を露出させ
、その色変化を測定するようになっており、操作、取扱
いが煩雑である。また実施例および図面に開示されてい
るアンモニア分析用具は、指示薬層として吸収性担体、
たとえば紙、多孔性合成樹脂を用いている。このような
不透明担体中の色変化を測光する方式では、不透明担体
上の乱反射、マスキング作用のために精度の良い測定が
できない。したがってこの分析用具に、半定量ないし比
較的精度の悪い定量分析域にしか適用することができな
いという欠点がある。

本発明者は上記の如きアンモニアまたはアンモニア生成
基質分析要素の欠点に鑑み、高感度かつ高精度で、短時
間に簡便に測定が可能な一体型多層分析材料につき鋭意
研究を行い本発明を完成するに至った０本発明＃′ｉ、
従来の選択透過層に代えて、アンモニアガスを透過する
が、液体を実質的に透過しないような空気バリヤ一層す
なわち液体遮断層を指示薬層と試薬層の間に設けたこと
を特徴とするものである。

すなわち本発明は、透明支持体上に、（１）ガス状アン
モニア用の指示薬ＩＬ（１）液体遮断層、（１１１）ア
ルカリ性緩衝剤を含有し８豐により基質と反応してアン
モニアを生成することの出来る試薬を有する試薬層、お
よび６ｖ）展開層がこの順に一体に接着積層された、液
体試料中のアンモニア又はアンモニア生成基質分析用一
体型多層分析材料において、液体遮断層が多孔性物質よ
り成り、使用条件下に液体試料を実質的に遮断しかつガ
ス状アンモニアを透過させる空気孔を構成する事を特徴
とする液体試料中のアンモニア又はアンモニア生成基質
分析用一体型多層分析材料である。

本発明の多層分析材料は、アンモニア自体あるいは、ア
ンモニア生成基質と試薬との反応により生成するアンモ
ニアを測定することにより該アンモニア生成基質を間接
的に測定するのに有利に使用される。このアンモニア生
成基質と試薬との組合せとしては、たとえば、尿素／ウ
レアーゼ、クレアチニン／クレアチニンーデイミナーゼ
、アミノ酸／アミノ酸−デヒドロゲナーゼ、アミノ酸／
アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸／アミノ酸−デヒドラ
ターゼ、アミノ酸／アンモニア−リアーゼ、アミン／ア
ミン−オキシダーゼ、ジアミン／アミン−オキシダーゼ
、グルコース及び隣アミダート／燐アミダートヘキソー
ス燐トランスフェラーゼ、＾ＤＰ／カルバミン酸塩キナ
ーゼ及び燐酸カル・々モル、酸アミド／アミドヒドロラ
ーゼ、ヌクレオ塩基−デアミナーゼ、ヌクレオシド／デ
アミナーゼ、ヌクレオチド／デアミナーゼ、グアニン／
グアナーゼ等が挙げられる。このように本明細書及び特
許請求の範囲において「アンモニア生成基質」とは、特
定の試薬と反応してそれ自体からアンモニアを生成する
か、あるいは複数個の反応系を経由してアンモニアを生
成するような化合物または化合物群を意味するものであ
る。

本発明分析材料の支持体としては、このような分析要素
において一般的に用いられているような疎水性の透明支
持体、たとえば／　リエチレンテレフタレート、ポリカ
ーゲネート、Ｉリピニル化合物のようなポリマーから成
る透明支持体が使用される。

この支持体上に指示薬層が設けられる。指示薬層には、
ガス状アンモニアと反応して吸収波長に変化を生じるよ
うな化合物（以下、発色前駆体という）が含まれている
。本発明分析材料に使用可能な発色前駆体としては、た
とえば、ロイコシアニン染料、ニトロ置換ロイコ染料お
よびロイコ７タレイン染料のようなロイコ染料（％開昭
Ｓコー３ダｇざ号参照）；ブロムフェノールブルー、ブ
ロムクレゾールグリーン、ツロムチモールプルー、キノ
リンブルーおよびロゾール酸のようなｐＨ指示薬（共立
出版、化学大辞典、７０巻６３〜６５頁参照）；トリア
リールメタン系染料前駆体；ロイコベンジリデン色素（
特願昭！；！−１１１＞　／　９ｇ号明細書参照）ニジ
アゾニウム塩とアゾ染料カプラー：塩基漂白可能染料等
が挙げられる。

これらの発色前駆体の少なくとも７種を、有機溶剤性バ
インダーあるいは水溶性バインダーと混合し、透明支持
体上に塗布して指示薬層を得る。

使用できるバインダーとしては、七ｋ　Ｏ−スアセテー
ト（モノ、ジ、トリ）、セルロースアセテートブチレー
ト、セルロースアセテートプロピオネート等のセルロー
スエステル類：メチルセルロース、エチルセルロース、
プロピルセルロース等のアルキルセルロース類：／リメ
チルメタクリレート、？リアクリレート、Ｉリスチレン
、ポリアクリロニトリル、Ｉり酢酸ビニル、■■■■■
■？リビニルツチラール、クロル化Ｉり酢酸ビニル、４
リアクリルアミド、Ｉリピニルぎロリドン、ポリビニル
アルコール、ぼり無水マレイン＃１％ポリオレフィン蝉
の合成ビニル重合体又はこれらの共重合体等がある。

各々のバインダーはその溶解性や形状に応じて有機溶剤
や水系溶剤に均一に溶解した溶液又は水系媒体にラテッ
クス型分散した分散液又は有機溶媒中に分散した分散液
等の形態で使用される。

バインダーの重量に対して、発色前駆体の使用量は１０
〜７０−程度が適当である。また、製造の際の発色防止
のために、エタンスルボン酸、３゜３−ジメチルグルタ
ル酸、クエン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、過塩素酸、
塩酸などの有機酸あるいは無機酸などを加え、ｐＨを発
色体の非発色域のｐｈにｇｕ−ｔ−る。これらを、アセ
トン、メチルセルロース、メチルエチルケトン、ジクロ
ロメタン、ジクロロエタン、メタノール、エタノール等
の有機溶剤あるいは水に固形分濃度／〜２ｏチ、好まし
くは３〜１０チ程度となるように加えて塗布液とする。

これを乾燥膜厚／−，１０μｍ程度となるように透明支
持体上に塗布、乾燥して指示薬層を形成する。

かぐして得られた指示薬層の上に液体遮断層を設ける。

本発明分析材料の液体遮断層は、使用条件下に液体が実
質的に透過せずがクガス状アンモニアが透過できるよう
な空気孔を有する多孔性物質で構成されている。この多
孔性物質は、液体、特に水による毛細管現象が実質的に
生じないような疎水性材料あるいは、毛細管現象が実質
的に生じない程度に疎水化処理（撥水性処理）された材
料でつくられているのが好ましい。たとえばセルロース
アセテート、セルロースニトレート、再生セルロース、
プリアミド、ビスフェノールＡのプリカーがネートなど
からつくられているメンブランフィルタ−あるいはこれ
らの材料を必要により撥水性処理したものが有利に用い
られる。本発明の目的に対しては、このメンブランフィ
ルタ−の厚さは３０〜３００＃墨、好ましくは７０〜２
０θμ墨であり、空孔率は２Ｓ−以上、好ましくはりＳ
チ以上である。また平均孔径は０．Ｏ／〜コＯμ１１好
ましくは０．／−１０μ島である。このようなメンブラ
ンフィルタ−はたとえば％金昭５３−２／ｌ、７７号記
載の方法により製造する仁とができる。また、容易に入
手できる市販のものもある。

たとえば、ミクロフィルターＦＭコニ、ＦＭ３Ｑ。

ＦＭダＳ％　ＦＭｊｊ、ＦＭｇＯ，ＦＭ／コＯ１ＦＭ３
００およびＦＭ！；００などのＦＭシリーズおよびＦＲ
シリーズ（富士写真フィルム■製）、ＳＭ／／３０／、
ＳＭ／／１０３、ＳＭ／／？０７、およびＳＭ／３ＡＯ
’ｌ　（デルトリウスＪｌｉｉ）、ＦＡＬＰｌダコＯＯ
およびＬＳＷＰ／９コＯＯなどのＦＡ。

Ｆ）ｌＳ　ＬＣ％　ＬＳシリーズ（ミリＩア羨）、東洋
科学産業製のメンブランフィルタ−ＴＭＳＴＭ−Ｐ。

ＴＭ−Ａ、　ウルトラフィルターＵＨ，ＵＫ％ＵＰある
いは金属多孔性薄膜のフィルターなどがある。

これらのメンブランフィルタ−はそのまま用いてもよい
が、親水性を有するメンブランフィルタ−を用いる場合
には、上記の如く撥水性処理をすることによシ、液体、
物に水の毛細管現象ｔ−実質的に阻止し、液体の透過阻
止効率を高くしておくことが望ましい。この撥水性処理
は、シリコーンオイル、シリコーンオイル、フッ素オイ
ル、フッ素系樹脂等、一般に撥水性処理剤として公知の
物質を、通常は溶剤で希釈し、含浸、１！ＩＪｆ５、ス
グレー等の方法でメンブランフィルタ−に適用すること
によシ答易に行うことができる。

これらのメンブランフィルタ−は、指示薬層のマトリク
スを構成している水性バインダーや有機溶剤性バインダ
ーをはじめとする多様な材料に対して案用的な強度をも
って接着する。接着は、指示薬層にメンプランフィルタ
ーを、必要によりウェット状態としてはりつけ、乾燥す
ればよい。ここにウェット状態とは、／苛イングーを溶
解している溶媒が残っているか、あるいは乾燥した膜が
可溶性溶媒（有機溶媒または水）でぬらされてバインダ
ーが膨潤状態、分散状態または溶液状態にあることを意
味する。また、指示薬層のバインダーが、たとえば／　
ＩＪ酢酸ビニルのように粘着性を有する場合には、指示
薬層を特にウェット状態とすることなく、タンブラ／フ
ィルターをそのまま圧着すればよい。

η・＜シて形成され友液体遮断層Ｑ上に、試薬層を設け
る。試薬層には、尿素、クレアチニンのようなアンモニ
ア生成基質と反応してアンモニアを生成するウレアーゼ
、クレアチニ／−デイミナーゼ等の酵素をはじめとテる
試薬、および反応により生成し几アンモニアをガス状に
効率良く遊離させるだめのアルカリ性緩衝剤等が含まれ
ている。

アルカリ性緩衝剤としては、　ｐＨ値が７〜９．５のも
の、たとえば、エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）
、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、燐酸剤な
どが、通常含まれている。重金属イオントラップ剤は、
酵素活性を阻害するような重金属イオンをマスキングす
るために使用されるものであり、たとえば、ＥＤＴＡ・
、２Ｎａ、ＥＤＴＡ＠４Ｎａ。

ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミンイ
ンタ酢酸のようなコンプレクサン（ｃｃｒｙｐ　１ｅｘ
ａｎｅ）が用いられる。これらの試薬類をゼラチン等の
水性バインダーと混合して塗布液とし、液体遮断層上に
直接塗布することにより試薬層が形成される。この際、
液０体迦断層には多数の空気孔が存在するにもかかわら
ず、下層の指示薬層に水分は実質的に透過せず、悪影響
を与えることはない。

しかもその接着強度は、かくして形成される一体型分析
材料の加工工程における接着破壊が問題にならないｓｆ
の強固なものである。この試薬層に含まれるウレアーゼ
等の試薬は、バインダーの重量に対してＯ，／〜ｓｏ’
ｓ、好ましくはコ〜コＯＳ程度が適当であり、またアル
カリ性緩衝剤の使用量はバインダーに対してＯ０／〜１
０嘩程直が適当であり、重金属イオントラップ剤の使用
量は、パイン〆−に対して００Ｓ−二〇−！鼠が適当で
ある。この試ｌＫ層の膜厚は一般に、ｌ−コＯ＃鍋ｓｉ
度、好ましくは、３〜１０μｍ１１度である。

かくして形成された試薬層上に、展開層が設けられる。

この際、必要により、光反射層を設けてから展開層を設
けてもよい。光反射層は、次とえば二酸化チタン、ゼラ
チンおよび界面活性剤勢を含む水性液を乾燥膜厚Ｏ，Ｓ
−＋−−Ｏｓ解１１度となるように塗布乾燥すれはよい
。展、一層は、点着され良液体試料が急速に横方向ＫＰ
３＊に広がり、ついで櫟さ方向にも浸入し、試薬層Ｋｉ
Ｉ体試料が均−ＫＩＩ１１給されるようにするためのも
のである。亭ＪＲ１ｉＷＩＡに使用される展一層は、上
記の機能を有するものであれはどのような一〇でもよい
が、たとえは特開昭３６；−／Ａ’１３５Ａ号の親水化
処理織物、特公昭！；３−２／１，７７号の非稙維多孔
質媒体などが適当である。。特開昭５Ａ；−／　Ａ弘３
．Ｓｌ、号の親水化繊物を使用する場合には、試薬層上
、あるいは光反射層上に、ゼラチン等のバインダーおよ
び界面活性剤などを含む接着層をあらかじめ形成してお
くのが好ましい。

本発明の一体型多層分析材料を用いてアンモニア又はア
ンモニア生成基質を測定するには、層間層上に被験液Ｓ
〜３０μを程度を点着し、必要により３０〜ダＯ℃好ま
しくは、３５〜３９℃で７〜２０分、好１しくに３〜ｌ
Ｏ分程度インキュベーションを行った恢、透明支持体側
から指示薬層の色変化（発色または退色）の程ｋを反射
側光するか、標準色と視覚的に比較すれはよい。

本発明の一体型多層分析材料は、液体遮断層が空気層と
なっているためにアンモニアガスの拡散速度が高く、シ
たがって従来のものＫくらべて側足時間が著しく短縮さ
れ、また梢度が著しく向上している。しかも一体型であ
るから操作取扱も簡便である。本発明の一体型多層分析
材料は市販のメンブランフィルタ−を、必要により撥水
性処理するだけでそのまま液体遮断層として使用するこ
とができるので、大量生産に適する塗布、ラミネート工
程より成る実用的製造技術により効率よく安価に製造が
可能である。

次に実施例をあげて本発明を具体的に説明するが、本発
明がこれらに限定されるものでないことはいうまでもな
い。

実施例１ 次のようにして、透明ポリエチレンテレフタレ−）　（
ＰＥＴ）フィルムベース上に血中尿素室來定量検出用の
一体型多層分析材料を作製した。

透明フィルムベース、ポリエチレンテレフタレート上Ｋ
　／　ｍ２当シ ／）指示薬層 発色１ＩＩＩＩＩＡ体：１Ｉ−（ビス−（，２，ｌＩ、
−ジニトロフェニルツメチル〕− Ｎ−ヘキザデシルビリジニウム ベルクロレート　　　　　　　ｉ、ｏｏｔセルロースア
セテートｇｆ アセトン　　　　　　　　　　　　６５１メチルセロソ
ルブ　　　　　　　　３．！；Ｍｌエタンスルホン１１
！　　　　　　　　　２５μｔの組成溶液をＩ！［願し
た。

２）液体遮断層 シリコーン樹脂の・＼キサン浴液に浸漬後、乾燥するこ
とによりシリコーン撥水性処理したメンブランフィルタ
−（富士ミクロフィルターＦＭ！；００＠厚さ／ＩＩＯ
ａｍ、空孔率７！；％、平均孔径Ｓμｍ）を／）の指示
薬層の溶剤が未乾燥のうちに（ウェット状態で）はシつ
け接着し、乾燥させた。

３）　試薬層 ゼラチン　　　　　　　　　　　　ｌＯｔ水　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　１００虹ｐ−ノニル
フェノキシポリグリシドール（グリシ−ドールサーファ
クタント１０Ｇ）　　０．３０ｆウレアーゼ　　　　　
　　　　　ｏ、ｇｔエチレンシアミンテトラ酢酸・四ナ
トリウム塩　０．ｌｌｆオルト燐酸二ナトリウム及び水
醸化ナトリウムでｐＢざにｉ＊ｍし次溶液をメンブラン
フィルタ−上に塗布・乾燥させた。

ｌＩ＞　　光反射層 ＴＩＯ，微粉末　　　　　　　　　　　ダ２ゼラチン　
　　　　　　　　　　　ダｔ９−／ニルフェノキシ４リ
グリシドール　　　　　　　Ｏ・／Ｓｆ水　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　１Ｉ０８１浴液を
塗布乾燥させた。

この層の上に展開層を結合させるため、Ｓ）　接着鳩 ゼラチン　　　　　　　　　　　　コ、Ｓｆ水　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＳＯゴｐ−ノ
ニルフェノキシポリグリシドール（グリシドールサーフ
ァクタント１０ＧＩ　　　　Ｏ，／！；ｆの組成の溶液
を塗布乾燥させた。

６）　展開層 乾燥したものの表面を水で膨潤させ、展開層の蒲（コツ
トンブロード１００番）を圧着ラミネートして接着させ
た。

こうして得られた分析材料を下記のような方法で評価し
た。

７チアルプミン浴液中に０−１００−１Ｏ０’４（尿素
Ｉｍ素）／ｄｉの原票を含有している水溶液を調製し、
これらの溶液を１０μｉずつ分析材料の展開層上に点着
し、３７℃でインキュベーションを行い、６分後の発色
濃度を６００ｒ１ｆｒ１の光で反射測光した。その結果
下記のような値を得た。

このように感東の島い分析材料か侍らｔした。

実施例コ メンブランフィルターから成る液体遮断層を用いた本発
明の血中尿素窒素定量検出用の一体型多層分析材料と、
セルロースアセテートブチレートの？リマー薄膜（バリ
ヤ一層）から成る選択透過層を用いた特＃ｉ１紹！ｆコ
ー３りざざ号の一体型多層分析材料の性能を比較するた
め次のような実験を行つ友。透明支持体（ＰＥＴフィル
ム）上に７ｍ２当り、 ／）　指示薬層 Ｑ色前１１　：　４ｔ−（ビス（コ、４ｔジニトロフェ
ニル）メチル）−Ｎ−ヘキサデシルピリジニ ウム　ペルクロレート　　　　／、００ｆセルロースア
セテートブチレート６２ メチルエチルケトン　　　　　　　　ざＯｄジクロルメ
タン　　　　　　　　　２０ｍエタンスルホン駿　　　
　　　　　　！Ｏａｌの組成の溶液をｍ布し、 コ）　一方には、実施例１と同様にシリコーン撥水性処
埴したメンブランフィルタ−＜ｍ厚ｉｙ。

μｍ１空孔率りＳチ、平均孔径ｓ声、富士写真フィルム
■製）をウェット状態ではりっけ接着し、他方には、セ
ルロースアセテートプチレー）　（ＣＡＢ）のＡ％溶液
（メチルエチルケトン（ＭＥＫ）−ジクロルメタン混合
溶液）を塗布し、膜厚／〜コμｍのバリヤ一層（選択透
過層）をつくった。

このそれぞれの塗布物に、実施例／記載の、？ｌＥ［Ｉ
、り九反射層、ｓ）接着ｍ　１ｋｍ布乾燥し、６）展開
／ＩＩ　をつけて分析材料をつくった。

実施例／と同様の方法で２ａ１類のものの性能を比較計
価した。

この結果から、バリヤ一層（ＣＡＢＮ）のものに比較し
、メンブランフィルタ−を使用したものが非常に高感度
であることが明らかである。

施例３ 血中尿素窒素定量検出用の一体型多層分析材料、実施例
／の指示薬層の発色前駆体をプロモフノールプルー１．
０θｔに代え、他の層を実施／と同様の組成のものを用
いて作製した。

実施例／と同様の方法で評価した結果下記のよな値を得
た。

施例弘 指示薬としてブロモチモールブルー２０岬を用い、これ
に３％メチルセルロース水溶液（メトロース■信越化学
、ｌ、ＱＳＨ−！ｊｒＯ）弘ｔを混会し、水酸化ナトリ
ウム水溶液でｐＨをダ、γにａＭｊ整し、て塗布液を得
た。

この塗布液を乾燥膜厚Ｓμｍ　となるように透明ＰＥＴ
支持体上に塗布し、次いで＋５℃のサーファクタントｌ
０ＧＯ，２チ水溶液に浸漬し＋、Ｓ−’Ｃに調節したシ
リコンプム製ローラーで水切シして実施例１と同様のメ
ンブランフィルタ−を圧崩し７ｔ、史に実施例／と同様
に試薬層、接着層及び展開層を密着・積増し尿素分析用
一体型多層分析材料を作製した。

実施例／と同様の方法で尿素′ｉｉ１索蓋に対応した発
色濃度管Ｊｕｌ！察した。

実施例Ｓ 指示薬層として、 ブロモクレゾールグリーン　　　　　１．Ｏｗｙポリ酢
ハビニル・アクリル酸エステル共重合体ラテックス（セ
ビアンＡ３８■　ダイセル製固形物含量約ＳＯ％、ｐｌ
ｌｌｌ、弘）Ｓ２３．３−ジメチルグルタル駿　　　　
λＯｑ水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　２１の組成よシなる塗布准を、乾燥膜厚１０−
となる様に透明ＰＥＴフィルム上に塗布した。乾燥後粘
着性の指示薬層と央り例／に１載したメンブランフィル
ターをラミネーターで圧着した。次いで実施例／と同様
にして、試薬層、接着層、展開１−を密着積層し尿素分
析用一体型多層分析材料を作製した。

実施例１と同様の方法により、市販コントロール血清及
び尿素添加試料について尿素窒素量に対応した反射光学
濃度を観察した。

米’７９６アルブミン生理食塩水を用いた。

実施例６ 指示薬層 グリオキザール　　　　　　　　　コ、５諷ｇブロモク
レゾールｙ　＋）　−ｙ　　　　　　２０　”９５％メ
チルセルロース水浴液 （メトロース■　信越イヒ学　６０ＳＨ−３０）　　　
　　　　Ｓ　ｆを混合し、アガロースを下塗シした与真
用？リエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）透明支持体上
に３μｍの乾燥膜厚になる様塗布して作製した。

液体遮断層 次いで実施例弘と同様の方法でシリコーン樹脂溶液で撥
水性処理したメンブランフィルタ−（富士ミクロフィル
ターＦＭｇＯ）（孔性ｏ、ｇμｍ）をラミネートした。

試薬層 脱イオンゼラチン　　　　　　　　　　１０２クレアチ
ニンデイミダーゼ　　　Ｓ０００単位Ｎ−トリス（ヒド
ロキシメチル）メチル−ニーアミノエタンスルホン酸−
リンｖ　　　　　Ｏ，０７ｆにＨ２ＰＯ４０，ＯＫ？ ホウ酸　　　　　　　　　　　　　コ、ＳノトリトンＸ
−，３０／　（アルキルアリルポリエーテルスルホン酸
ナトリウム塩）　　　　　　　　　　　０．θ乙Ｖ水　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１ｓ
ｏｙより成る試薬層塗布液を更に上記多層フィルム上に
積層塗布した。

次いで実施例／と同様の接着層、綿ブロードよりなる展
開層を重積してクレアチニン分析フィルムを得た。

／　ＯｐＬ　のサンプルを展一層に点着し、３７℃イン
キュベーション３分後の発色論度を６００ｒｗ′ＴＩの
九で反射測光した。

実施例７ 実施例６において指示薬をブロモフェノールブルーに代
え７ｔｔｘ　ｉ・は同様にしてクレアチニ分析フィルム
を得た。

手　　続　　補　　正　　書 ３、補正をする者 事件との関係　　出願人 名　称　（５２０）富士写真フィルム株式会社４、代理
人 ６゜ ７・　補正の対象　明細書の発明の詳細な説明の欄１、
　明細書第２３頁第６〜７行の１／リカー−ネート１０
次にｌ’−１／リエチレン」を挿入する０２　　同１に
／４４頁＠７行ト１１１ｆ行の間に「、微多孔膜セルポ
アＦ４Ｗ−０／、Ｗ−０１（種水化学工業■製）」を挿
入する・ ３、　同第１ｔ員第７行の後に下記を挿入する。

「　なお試薬層、光反射層、接着層、展開層は上記のよ
うに液体遮断層上に直接塗布しないで、四層を積層した
多層構成物を別に作成しておき、接着性物質を介して、
液体遮断層と試薬層面を圧着ラミネートさせて分析材料
を作製することも出来る。

接着性物質はたとえば、アクリル酸エステル、メタクリ
ル酸エステル、およびアクリルアンド誘導体の共重合体
のラテックス、界面活性剤等を含む水性液を乾燥膜厚０
．　／〜ｊ＃ｍ好ましくは０．５Ｎ２μ＋＠桐度となる
ように塗布乾燥すればよい。」 弘　同１１！ｊ、？頁末尾に下記を加入する・Ｕ実施ｓ
ｒ 実施例よと同様の指示薬層をＰＥＴフィルム上に塗布し
、乾燥後粘着性指示薬層に撥水処理しないメンブランフ
ィルタ−を′ｙｔ＊−ターで圧着した。

次いで実施例／と同様の組成の試薬層、光反射層１接着
層、８Ｉ″″開層を別に剥離性のよいＰＥＴフィルム上
に塗布、ラミネートして作製した。これを剥騙し接着性
物質（アクリル酸ブチルエステルＩｊ−Ｔ−ル襲、コー
アセトアセトオ中ジエチルメタクリレ−）Ｊ−モル％、
Ｎ−（，２−スルホ−ｔ−ブチル）アクリルアζド１０
４ル襲の共重合体ツテックスボリマー）を介して上記メ
ンブランフィルタート試祷層面とを圧着′ｙζネートし
て分析材料をつくった。

こうして得られた分析材料を実施例／と同様の方法で評
価し′た結果下記のような値を得た＠ 昭和　　年　　月　　日 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 １、事件の表示 昭和５６年　特許間　第１７６２７５号２、発明の名称
　　アンモニアまたはアンモニア生成基質分析用一体型
多層分析材料および検出法３、補正をする者 事件との関係　　　出願人 名　称　　（５２０）富士写真フィルム株式会社４、代
理人 ５、補正命令の日付　　自　　発 （！）　　特許請求の範囲を別紙のとおり訂正する。

（２）　　明細書第８頁第６行乃至第７行の“アルカリ
性緩衝剤を含有し′を削除する。

（３）　　明細書第１６頁第７行の“が、通常音まれて
いる。′を「を含有させることができ、通常はこれらの
助剤を含有させることが好ましい、」に訂正する。

特許請求の範囲 ＋ｌ）　　透明支持体上に、（ｉ）ガス状アンモニア用
ノ指示薬層、（ｉ）液体遮断層、（ａ必要により基質と
反応してアンモニアを生成することの出来る試薬を有す
る試薬層、および０展開層がこの頃に一体に接着積層さ
れた、液体試料中のアンモニア又はアンモニア生成基質
分析用一体型多層分析材料において、液体遮断層が、多
孔性物質より成り、使用条件下に液体試料を実質的に遮
断しかつガス状アンモニアを透過させる空気孔を構成す
る事を特徴とする液体試料、中のアンモニア又はアンモ
ニア生成基質分析用一体型多層分析材料。

（２）　　多孔性物質が、厚さ５０〜３００μｍ、空孔
率２５％以上のメンブランフィルタ−である特許請求の
範囲第（１）項記載の分析材料。

（３）　　アンモニア生成基質が尿素であり、該基質と
反応してアンモニアを生成することができる試薬がウレ
アーゼである特許請求の範囲第１１）項または第（２）
項記載の分析材料。

（４）アンモニア生成基質がクレアチニンであり、該基
質と反応してアンモニアを生成することができる試薬が
クレアチニンーディミナーゼである特許請求の範囲第１
１１項または第（２）項記載の分析材料。

（５）　　試薬層にアルカリ性緩衝剤が含有されている
特許請求の範囲第＋１１〜（４）項のいずれが１項に記
載の分析材料。

（６）　　試薬層が付加的に安定剤、界面活性剤を含ん
でいる特許請求の範囲第（１１〜（５）項のいずれか１
項記載の分析材料。

（７）指示薬層が、アンモニアの存在において染料を形
成することができる発色前駆体を含んでいる特許請求の
範囲第＋１１〜（６）項のいずれか１項記載の分析材料
。

（８）　　メンブランフィルタ−の平均孔径が０．０１
〜２０μｍである特許請求の範囲第（２）〜（７）項の
いずれか１項記載の分析材料。

（９）溶液中のアンモニアまたはアンモニア生成基質を
検出するに当り： 透明支持体上に、（ｉ）ガス状アンモニア用の指示薬層
、（ｉ）液体遮断層、■必要により基質と反応してアン
モニアを生成することの出来る試薬を有する試薬層、お
よび０展開層がこの順に一体に接着積層された、液体試
料中のアンモニア又はアンモニア生成基質分析用一体型
多層分析材料において、液体遮断層が、多孔性物質より
成り、使用条件下に液体試料を実質的に遮断しかつガス
状アンモニアを透過させる空気孔を構成する事を特徴と
する上記分析材料の展開層に、アンモニアまたはアンモ
ニア生成基質を含む被検液を点着し、試薬層で遊離され
液体遮断層を通過したアンモニアとの反応により発色ま
たは退色した指示薬層の発色または退色濃度を、透明支
持体側から視覚的または光学的に測定することを特徴と
するアンモニアまたはアンモニア生成基質の検出法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 口１　透明支持体上に、（１）ガス状アンモニア用の指
   示薬層、（■）液体遮断層、（ｉｉｌ）アルカリ性緩衝
   剤を含有し必要により基質と反応してアンモニアを生成
   することの出来る試薬を有する試薬層、および６ｖ）展
   開層がこの順に一体に接着積層された、液体試料中のア
   ンモニア又はアンモニア生成基質分析用一体型多層分析
   材料において、液体遮断層が、多孔性物質より成り、使
   用条件下に液体試料を実質的に遮断しかつガス状アンモ
   ニアを透過させる空気孔を構成する事を特徴とする液体
   試料中のアンモニア又はアンモニア生成基質分析用一体
   型多層分析材料。 ＋２１　　多孔性物質が、厚さＳＯ〜３００ｂ島、空孔
   率コＳチ以上のメンブランフィルタ−である特許請求の
   範囲第口：項記載の分析材料。 （３１アンモニア生成基質が尿素であり、該基質と反応
   してアンモニアを生成することができる試薬がウレアー
   ゼである特許請求の範囲第１１１項または第１２１項記
   載の分析材料。 （４）　アンモニア生成基質が一クレアチニンであり、
   該基質と反応してアンモニアを生成することができる試
   薬がクレアチニンーデイミナーゼである特許請求の範囲
   第１１１項または第（２）項記載の分析材料。 （５）　　試薬層が付加的に安定剤、界面活性剤を含ん
   でいる特許請求の範囲第（１１〜１４１項のいずれか７
   項記載の分析材料。 （６＋　指示薬層が、アンモニアの存在において染料を
   形成することができる発色■前駆体を含んでいる特許請
   求の範囲第…〜１５１項のいずれか１項記載の分析材料
   。 （７：　　メンブランフィルタ−の平均孔径が０．０／
   〜２０ｐｗｈである特許請求の範囲第（２）〜１６＋項
   のいずれか１項記載の分析材料。 （８１溶液中のアンモニアまたはアンモニア生成基質を
   検出するに当り： 透明支持体上に、（１）ガス状アンモニア用の指示薬層
   、（―）液体達断層、（１Ｍ）アルカリ性緩衝剤を含有
   し必ｌ！により基質と反応してアンモニアを生成するこ
   との出来る試薬を有する試薬層、および６ｖ）展開層が
   この順に一体に接着積層された、液体試料中のアンモニ
   ア又はアンモニア生成基質分析用一体型多層分析材料に
   おいて、液体遮断層が多孔性物質より成り、使用条件下
   に液体試料を実質的に纏断しかつガス状アンモニアを透
   過させる空気孔を構成する事を特徴とする上記分析材料
   の展開層に、アンモニアまたはアンモニア生成基質を含
   む被検液を点着し、試薬層で遊離され液体遮断層を通過
   したアンモニアとの反応により発色または退色した指示
   薬層の発色または退色濃度を、透明支持体側から視覚的
   または光学的に測定することを特徴とするアンモニアま
   たはアンモニア生成基質の検出法。