JPS61278761A - アンモニア生成基質分析用一体型多層分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 り発明の分野］ 本発明は、液体試料中のアンモニア生成基質を分析する
ための一体型多層分析要素に関するものである。さらに
詳しくは本発明は、血液、尿、リンパ液等の生物体液中
に含まれるクレアチニン、尿素等のアンモニア生成基質
を、内因性アンモニアの影響を排除して定量分析するの
に適した一体型多層分析要素に関するものである。

［発明の背景］ 生物体液中に含有されているクレアチニン、尿素等のア
ンモニア生成基質の定量分析は、腎臓病等の疾患の診断
、その疾患の経過コントロールのための検査および腎機
能の検査のために極めて重要である。

アンモニア生成基質の分析方法の例としては、アンモニ
ア生成基質からアンモニアを生成させる操作および生成
されたアンモニアを定量する操作からなる分析方法を代
表例として挙げることができる。このアンモニアへの変
換を利用する分析方法は、従来より湿式法または溶液法
と呼ばれる方法で広く一般に実施されてきた。

上記のアンモニア生成基質からアンモニアを生成させる
操作としては、酵素の作用によってアンモニアを生成さ
せる方法が一般的に用いられている。たとえば生物体液
中のクレアチニンの定量分析においては、クレアチニン
デイミナーゼ（ＥＣ３，５，４，２１）を用いて体液中
のクレアチニンを特異的にアンモニアとＮ−メチルヒダ
ントインに加水分解する方法が利用されている。また、
生物体液中の尿素窒素（以下ＢＵＮとも記す）の定量分
析においては、ウレアーゼを触媒として用い、尿素をア
ンモニアと二酸化炭素に加水分解する方法が利用されて
いる。

生成したアンモニアを定量する操作としては、一般にア
ンモニア定量法として知られている様々な定量方法が用
いられている。たとえば、生成したアンモニアをアンモ
ニアイオン選択電極を用いて定量する方法、あるいは生
じたアンモニアでｐＨ指示薬等を変色させ、その変色の
程度を測定することによりアンモニア量を定量する方法
等が用いられている。また、生成したアンモニア（アン
モニウムイオン）とα−ケトグルタル酸とをグルタミン
酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，４，１゜３）とＮＡＤＨ
にコチンアミドΦアデニン・ジヌクレオチド還元型）の
存在下でカップリング反応させてＬ−グルタミン酸と水
とを生成させ、このとき同時に起るＮＡＤＨからＮＡＤ
”にコチンアミド拳アデニン・ジヌクレオチド酸化型）
への変化により生ずるＮＡＤ　”の生を量またはＮＡＤ
Ｈの減少量を３４０ｎｍの近紫外光を利用した測定また
は蛍光測定により定量する方法も用いられている。なお
上記ＮＡＤＨの代りにＮＡＤＰＨにコチンアミド・アデ
ニン・ジヌクレオチド・ホスフェート還元型）を用いて
、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰ”　にコチンアミドφアデニ
ンΦジヌクレオチド・ホスフェート酸化型）への変化に
より生ずるＮＡＤ　Ｐ　”の生成量またはＮＡＤＰＨの
減少量を測定または定量する方法も用いられている。

上記二段階の操作からなるアンモニア生成基質の分析方
法は、アナリティカル・ケミストリーｒＡｒ＋ａｌｙｔ
ｉｃａｌ　ＧｈｅｍｉｇｔｒｙＪ　、　４８．２４８（
１９７４）、クリ二カ・キミカーアクタｒｃ］１ｎｉｃ
ａ　ＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａＪ　、　１８．４０９（１
９８７）、「臨床化学分析　■含窄素成分」第２１′Ｘ
ｊｉ、（東京、東京化学同人）１３〜１４頁、６７〜８
７頁（１９７９年発行）、「臨床検査」第５＠（第６号
）３８７〜３９１頁（１９６１年）等の文献に記載され
ている。

しかし、分析の対象となる生物体液中には、アンモニウ
ムイオンとして遊離した状態にあるアンモニア（内因性
アンモニア）が含まれていることが多く、この内因性ア
ンモニアによる誤差を無視することができない、従って
、アンモニア生成基質の正確な定量には、内因性アンモ
ニアの＃響を排除する必要があり、既にいくつかの内因
性アンモニアの除去の方法が提案されている。

内因性アンモニアを予め除去する操作を含むアンモニア
生成基質の分析方法の具体例としては、特開昭５８−５
１９８号公報記載のクレアチニン検体のための自動連続
流れ法を挙げることができる。この方法は、試料を内因
性アンモニア除去のための試薬（゛たとえば、グルタミ
ン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸およびＮＡ
ＤＨからなる試薬）で反応処理した後、透析器を用いて
試料反応液に未反応のまま含有されているクレアチニン
を透析する操作を、クレアチニンからアンモニアを生成
させる操作の前段階として行なうものである。

また、特開昭５９−２１３９８号および特開昭５９−３
１６８９号各公報に記載の検体の前処理方法は、内因性
アンモニアにＮＡＤＰＨ（またはＮＡＤＨ）、グルタミ
ン酸デヒドロゲナーゼおよびα−ケトグルタル酸を反応
させて消去する方法において、ＮＡＤＰ還元酵素（また
はＮＡＤ還元酵素）を用いることで、反応の副産物とし
て生成されるＮＡＤＰ”　（またはＮＡＤ”）を元のＮ
ＡＤＰＨ（またはＮＡＤＨ）に戻してサイクリックに利
用する方法である。この前処理方法を用いてアンモニア
生成基質の分析を行なう場合には、特開昭５９−３１６
９６号、同５９−３１６９８号および同５９−３１７０
０号各公報に記載の定量方法のように、前記処理を施し
た検体に、アンモニア生成基質からアンモニアを生成さ
せる酵素を添加して、発生したアンモニアを、ＮＡＤＨ
（またはＮＡＤＰＨ）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
およびα−ケトグルタル酸からなる試薬系を用いてアン
モニア生成基質の定量を行なう。

以上の分析方法は、従来より湿式法または溶液法と呼ば
れる方法で実施されてきたもの、あるいは湿式法を前提
として提案されたものである。一方、臨床検査の領域に
おいては診断に関与する医師等の医療関係者から、試料
が少量ですみ、操作が簡便であり、短時間で充分な精度
を有する結果が得られる分析方法を求める強い要請があ
る。これに答える方向として、従来用いられてきた湿式
法の代りに、取り扱い操作の容易な乾式分析方法の実用
化が検討されるようになっている。上記乾式分析方法を
用いたアンモニア生成基質の分析用具としては、米国特
許第３０１１８７４号明細書記載の血中尿素窒素（Ｂ　
Ｕ　Ｎ）定量分析用試験片などが提案されている。さら
に、定量操作がより簡易で充分な精度を有する一体型の
多層分析要素（以下、分析要素とも記す）を用いる分析
方法が開発され、その改良が進められている。

アンモニア生成基質の分析に用いることができる一体型
多層分析要素としては、特公昭５８−１９０６２号公報
記載の一体型分析要素、特開昭５８−７７６６０号およ
び同５８−７７６６１号の各公報記載のアンモニアまた
はアンモニア生成基質分析用一体型多層分析要素などを
挙げることができる。これらの分析要素は、基本的な構
成として、光透過性・液体不透過性支持体の上に、アン
モニアとの接触により検知可能な変化を生じる指示薬を
含むアンモニア指示薬層、液体を透過させることなくガ
ス状アンモニアを通過させるバリア一層、アンモニア生
成基質と反応してアンモニアを生成させる試薬を含有す
る反応層および多孔性展開層がこの順に積層されてなる
ものである。

しかし、これらの分析要素は、前述の体液中に含まれて
いるアンモニア（内因性アンモニア）の影響を排除する
ことができない、従って、これらの分析要素を用いてア
ンモニア生成基質を正確に測定するのは困難であった。

これに対して、前記特開昭５８−５１９８号公報記載の
内因性アンモニアの除去の方法等は、内因性アンモニア
の除去試薬および内因性アンモニアとの生成物を一度反
応系外に除去するための透析操作がなければ使用出来な
いものである等、一般に湿式分析方法に適用されるもの
であり、乾式の分析方法である一体型多層分析要素内に
そのまま組み込むことはできない、また前記特開昭５９
−２１３９８号公報等に記載の方法では、一度内因性ア
ンモニアを反応させて、ブランクのＯＤを測定してから
、クレアチニン・デイミナーゼを添加するという煩雑な
操作を行なってから、クレアチニンよりアンモニアを生
成させる反応でクレアチニンを測定する方法である。

［発明の目的］ 本発明の目的は、アンモニア生成基質分析用一体型多層
分析要素における内因性アンモニアによる測定誤差を除
去することである。

本発明の他の目的は、煩雑な操作を行なうことなく、簡
易かつ迅速にクレアチニンまたは尿素窒素（Ｂ　Ｕ　Ｎ
）等のアンモニア生成基質を高精度にて定量分析するこ
とができる一体型多層分析要素を提供することである。

［発明の要旨］ 本発明は、 （Ｉ）光透過性・液体不透過性支持体；（ＩＩ）ガス状
アンモニアにより検知可能な変化を生じる指示薬を含む
アンモニア指示薬層；（ＩＩＩ）ガス状アンモニアを通
過させ得る液体透過遮断層： （ＩＶ）アンモニア生成基質と反応してガス状アンモニ
アを生成させ得る試薬を含有するアンモニア生成基質反
応層； （Ｖ）内因性アンモニアに作用して内因性アンモニアを
実質的に上記反応層に到達しえない状態に変化させ得る
試薬を含有する内因性アンモニア捕捉層： および。

（Ｖｌ）多孔性展開層 がこの順に積み重ねられていることを特徴とするアンモ
ニア生成基質分析用一体型多層分析要素を提供するもの
である。

本発明の一体型多層分析要素の機能を損なわない限り、
本発明の一体型多層分析要素には、公知の中間層、接着
層、光遮蔽層など公知の機能層が任意に付設されていて
もよい。

なお５本発明において「アンモニア生成基質」とは、特
定の試薬と反応してそれ自体からアンモニアを生成する
か、あるいは複数個の反応系を経由してアンモニアを生
成するような化合物または化合物群を意味するものであ
る。

［発明の効果１ 本発明の一体型多層分析要素は、内因性アンモニアをあ
らかじめ上層でトラップ除去し、その後にクレアチニン
あるいは尿素窒素（ＢＵＮ）等のアンモニア生成基質を
反応層で反応させ生成するアンモニアを指示薬層で発色
させて検出定量するものである。従って本発明の一体型
多層分析要素を用いることにより、内因性アンモニア量
の定量、前処理としての内因性アンモニアの除去あるい
は試料液の透析などの煩雑な操作を行なう必要がないた
め、簡便かつ迅速にクレアチニンや尿素の定量が出来る
。また、本発明の分析要素は、一体型であるから操作お
よび取扱いも簡便である。

また、本発明の一体型多層分析要素は、被検成分（アナ
ライト）であるアンモニア生成基質と、アンモニア生成
基質と反応してアンモニアを生成させる試薬とを反応さ
せ、生成するアンモニアを定量することによりアンモニ
ア生成基質を間接的に定量するものである。従って本発
明の一体型多層分析要素は、上記のアンモニア生成用の
反応試薬の種類を変えることにより、様々なアンモニア
生成基質の分析用として製造することができる。

［発明の詳細な記述］ 本発明のアンモニア生成基質分析用一体型多層分析要は
、添付の第１図に模式的に示されているように、 （Ｉ）光透過性・液体不透過性支持体：（ＩＩ）ガス状
アンモニアにより検知可能な変化を生じる指示薬を含む
アンモニア指示薬層：（ＩＩＩ）ガス状アンモニアを通
過させ得る液体透過遮断層； （ｒｖ）アンモニア生成基質と反応してガス状アンモニ
アを生成させ得る試薬を含有するアンモニア生成基質反
応層； （Ｖ）内因性アンモニアに作用して内因性アンモニアを
実質的に上記反応層に到達しえない状態に変化させ得る
試薬を含有する内因性アンモニア捕捉層； および、 （ＶＩ）多孔性展開層 からなる基本構成を有する。

本発明の一体型多層分析要素を構成する光透過性会液体
不透過性支持体（以下、支持体と記す）の具体例として
は、ポリエチレンテレフタレート、ビスフェノールＡの
ポリカルボネート、ポリスチレン、セルロースエステル
（例、セルロースジアセテート、セルローストリアセテ
ート、セルロースアセテートプロピオネート等）等のポ
リマーからなる厚さ約５０１Ｌｍから約ｉｎｍの範囲内
、好ましくは約８０１Ｌｍから約３００ｐｍの範囲内の
透明支持体を挙げることができる。

支持体の表面には必要により下塗層を設けて、支持体の
上に設けられる反応層あるいはその他、必要に応じて設
けられる層（例、吸水層）と支持体との接着を強固なも
のにすることができる。また、下塗層の代りに、支持体
の表面を物理的あるいは化学的な活性化処理を施して接
着力の向上を図ってもよい。

支持体の上には、（場合によっては下塗層等の他の暦を
介して）本発明の一体型多層分析要素を構成するガス状
アンモニアにより検知可能な変化を生じる指示薬を含む
アンモニア指示薬層（以下、指示薬層と記す）が設けら
れる。指示薬層には、少なくとも１種の呈色性アンモニ
ア指示薬が含まれる。呈色性アンモニア指示薬とは、ガ
ス状アンモニアにより検知可能な変化（たとえば、吸収
波長の変化による発色または変色）を生じるような化合
物である。

本発明の一体型多層分析要素に使用することができる呈
色性アンモニア指示薬としては、たとえば、ロイコシア
ニン染料、ニトロ置換ロイコ染料およびロイコフタレイ
ン染料のようなロイコ染料（米国再発行特許第３０２６
７号明細書または特公昭５８−１９０６２号公報記載）
ニブロムフェノールブルー、フロムクレゾールグリーン
、ブロムチモールブルー、キノリンブルーおよびロゾー
ル酸のようなｐＨ指示薬（共立出版■、化学大辞典、第
１θ巻６３〜６５頁参照）；トリアリールメタン系染料
前駆体；ロイコベンジリデン色素（特開昭５５−３７９
号および特開昭５６−１４５２７３号各公報に記載）；
ジアゾニウム塩とアゾ染料カプラー；塩基漂白可能染料
等を挙げることができる。

指示薬層は、通常これらの呈色性アンモニア指示薬の少
なくとも一種を、有機溶剤溶解性バインダーポリマーあ
るいは水溶性バインダーポリマーと混合して塗布液を調
製し、これを透明支持体上に塗布・乾燥することにより
形成する。上記バインダーポリマーの、１１例としては
、セルロース七ノアセテート、セルロースジアセテート
、セルローストリアセテート、セルロースアセテートブ
チレート、セルロースアセテートプロピオネート等のセ
ルロースエステル類；メチルセルロース、エチルセルロ
ース、プロピルセルロース等のアルキルセルロース類；
ポリメチルメタクリレート、ポリアクリレート、ポリス
チレン、ポリアクリロニトリル、ポリ酢酸ビニル、ポリ
ビニルブチラール、クロル化ポリ酢酸ビニル、ポリアク
リルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコ
ール等の合成ビニル重合体またはこれらの共重合体等を
挙げることができる。

バインダーの重量に対する呈色性アンモニア指示薬の配
合量は１０〜７０重量％の範囲内である−ことが好まし
い、また製造中あるいは保存中に、呈色性アンモニア指
示薬が発色または変色するのを防止するために、エタン
スルホン酸、アスパラギン酸、アゼライン酸、グルタル
酸、コハク酸、グルタコン酸、酒石酸、ピメリン酸、マ
ロン酸、リンゴ酸、３，３−ジメチルグルタル酸、クエ
ン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、過塩素酸、塩酸などの
有機酸あるいは無機酸などを指示薬層中に加えることで
、指示薬層のＰＨ値が呈色性アンモニア指示薬の呈色域
のｐＨ値の範囲内となるように調整することができる。

指示薬層を形成する塗布液は、これらの呈色性アンモニ
ア指示薬、バインダーポリマーおよび必要に応じて加え
られる上記ｐＨ調整用の酸等の試薬類を、アセトン、２
−メトキシエタノール、メチルエチルケトン、ジクロロ
メタン、ジクロロエタン、メタノール、エタノール等の
有機溶剤あるいは水に、固形分濃度が約１−ｙ２０重量
％、好ましくは約３〜１０重量％となるように加えて調
製することができる。この塗布液を、乾燥後の層厚が通
常は約１〜３０μｍの範囲内、好ましくは約２〜２０ｐ
ｍの範囲内となるように、前記支持体上に塗布、乾燥す
ることにより指示薬層を形成することができる。。

指示薬層の上に、ガス状アンモニアを通過させ得る液体
透過遮断層（以下バリア一層とも記す）を設ける。この
バリア一層は、多層分析要素の製造時（具体的には、後
述する反応層をバリア一層の上に塗布により設ける時）
および／または分析操作時において、塗布液、試料液等
の液体およびこれらの液体に溶解含有されている妨害成
分（例えば、アルカリ性成分等）を実質的に通過または
透過させず、かつガス状アンモニアが通過できる物質か
らなる暦であることを意味する。

バリア一層は構造上、二種類の態様に大別される。一つ
の態様は、連続した空隙を有する多孔性材料からなり、
実質的に空気層がバリア一層として作用する空気バリア
一層（以下、空気バリア一層と記す）であり、他の一つ
の態様は、疎水性（または親水性の乏しい）ポリマーか
らなる均質な非孔質薄層であるポリマーバリア一層（以
下、ポリマーバリア一層と記す）である。

空気バリア一層を構成する連続した空隙を有する多孔性
材料の例としては、メンブランフィルタ−；繊維状材料
が相互にからみあわされてなるか、あるいは接着または
結合されてなる多孔性材料（例１紙、濾紙、フェルト、
不織布等）；および織物生地、編物生地または細網状物
からなる多孔性材料を挙げることができる。

空気バリア一層として用いることができるメンブランフ
ィルタ−の具体例としては、アセテート（ジアセテート
またはトリアセテート等）、セルロースニトレート、再
生セルロース、余リアミド（ナイロン類）、ビスフェノ
ールＡのポリカルボネート、ポリエチレン、ポリプロピ
レン等を用いて製造されているメンブランフィルタ−を
挙げることができる０本発明の一体型多層要素に用いる
場合、上記メンブランフィルタ−の厚さは、約３０〜３
００μｍの範囲内、好ましくは約７０〜２００　ＪＬｍ
範囲内である。メンブランフィルタ−の気孔率は、約２
５％〜約ＳＯ％、好ましくは約６５％〜約８５％である
。また、メンブランフィルタ−の平均孔径は約０．Ｏ１
〜２０ｐｍ、好ましくは約０．１１−１ＯＪＬの範囲内
である。上記の特性を有するメンブランフィルタ−は、
たとえば米国特許第１４２１３４１号明細書、特公昭５
３−２１６７７号公報にそれぞれ記載の方法により製造
することができる。また、メンブランフィルタ−は、既
に多くのメーカーから様々な種類のものが市販されてお
り、これらの市販品の中から必要に応じて選択して用い
ることもできる。そのような市販品の例としては、ミク
ロフィルターＦＭ２２、ＦＭ３０、ＦＭ４５、ＦＭ５５
、ＦＭ８０、ＦＭ１２０、ＦＭ３００、ＦＭ５００等の
ＦＭシリーズおよびＦＲシリーズ（以上商品名、富士写
真フィルム■製）、５Ｍ１１３０１．５Ｍ１１１０３．
５Ｍ１１９０７、オヨび５Ｍ１３６０４　（以上商品名
、ザルトリウス社製）、ＦＡＬＰ１４２００、ＬＳＷＰ
１４２００等のＦＡ、ＦＨ，ＬＣ，ＬＳの各シリーズ（
以上商品名、ミリボア・コーポレーション製）、メンブ
ランフィルタ−ＴＭ、ＴＭ−Ｐ、ＴＭ−Ａおよびウルト
ラフィルターＵＨ，ＵＫ、ＵＰ　（以上商品名、東洋化
学産業■製）、微多孔膜セルポアＮＷ−０１，Ｗ−０１
（以上商品名、積木化学工業■製）などを挙げることが
できる。

空気バリア一層として用いることができる繊維状材料が
相互にからみあわされてなるか１．接着または結合され
てなる多孔性材料は、繊維状材料またはその集合体を物
理的にからみあわせるか、物理的および／または化学的
に接着または結合させた構成からなる連続した空隙を有
する多孔性材料である。

上記多孔性材料を構成する繊維状材料の具体例としては
、セルロース繊維、綿繊維、麻繊維、絹繊維、羊毛繊維
等の天然繊維性材料、レーヨン繊維、ビニロン繊維、セ
ルロースアセテート繊維等の再生または半合成材料から
なる繊維、グラスウール、ポリエチレン繊維、ポリエチ
レンテレフタレート繊維、ポリアクリロニトリル繊維状
物質およびポリ塩化ビニル繊維等の合成材料からなる繊
維状材料、またこれらを混合してなる繊維状材料を挙げ
ることができる。また、上記繊維状材料を用いて製造さ
れる多孔性材料の例としては、繊維状材料を抄造するこ
とにより製造した半紙、美濃紙や障子紙の和紙、濾紙、
硫酸紙、擬硫酸紙等の紙および繊維状材料から製造した
フェルトおよび不織布等を挙げることができる。

繊維状材料が相互にからみあわされてなるか、接着また
は結合されてなる多孔性材料の空隙率は、通常約２０〜
９０％の範囲内、好ましくは約５０〜８５％の範囲内で
ある。上記多孔性材料の平均空隙サイズは１通常約０．
０１〜２０ＩＬｍの範囲内、好ましく約０６１〜１０Ｊ
Ｌｍの範囲内である。また上記多孔性材料の厚さは、通
常約５０〜５００　ｐｍの範囲内、好ましくは約７０〜
３００　ＩＬｍの範囲内である。

空気バリア一層として用いることができる織物の例とし
ては、天然繊維からなる織物（例、綿ブロード等）半合
成繊維からなる織物（例、ビスコースレーヨン、銅アン
モニアレーヨン、フォルチザン等の再生セルロース繊維
からなるブロード織物等）、合成繊維からなる織物（例
、ポリアミド（ナイロン）、ポリエチレンテレフタレー
ト、ポリアクリルニトリル等の繊維からなるブロード織
物等）、天然繊維と半合成繊維または合成繊維との混紡
織物（例、綿繊維とポリエチレンテレフタレート繊維の
混紡糸等からなるブロード織物等）を挙げることができ
る。空気バリア一層として用いることができる編物の例
としては、前記織物の製造に用いることができる繊維と
同じ繊維または繊維の撚り糸からなる編物を挙げること
ができる。また、空気バリア一層として用いることがで
きる細網状物の例としては、合成繊維または糸（例、ポ
リアミド（ナイロン）、ポリエチレンテレフタレート、
ポリアクリロニトリル、ポリエチレン、ポリプロピレン
、ポリビニルクロリド等）からなる細ネットまたは細メ
ツシユを挙げることができる０以上の織物、編物、細網
状物の厚さは、通常約３０〜３００　＃Ｌｍの範囲内で
ある。また、織物、編物、細網状物の空隙率は通常的２
０％〜約６０％、好ましくは約４０％〜約５０％である
。

以上の連続した空隙を有する多孔性材料からなる空気バ
リア一層は、その内部空隙において、液体、特にアルカ
リ性材料等の妨害物を溶解含有する液体が、毛細管現象
にによってバリア一層を通過する危険性がある。したが
って、上記毛細管現象による毛細管流を生じない程度に
、空気バリア一層は疎水性または撥水性を有しているこ
とが好ましい、また、連続した空隙を有する多孔性材料
の疎水性または撥水性が弱い場合には、疎水化処理また
は撥水化処理を施すことが好ましい、上記多孔性材料の
疎水化処理または撥水化処理は、シリコーン樹脂、シリ
コーンオイル、弗素樹脂、弗素オイルに代表される一般
に疎水化処理剤または撥水化処理剤として公知の材料を
そのまま、あるいは必要により溶剤（例えば、ヘキサン
、シクロヘキサン、石油エーテル等）で固形分含有量が
約０．１〜５重量％の範囲内になるように稀釈し、これ
を含浸、塗布またはスプレー等の方法により、連続した
空隙を有する多孔性材料の少なくとも一表面およびその
近傍に適用することにより実施することができる。

空気バリア一層は、前述した指示薬層のマトリックスを
構成している有機溶剤性バインダーポリマーあるいは水
溶性バインダーポリマーに、連続した空隙を有する多孔
性材料を接着することで形成される。上記多孔性材料の
接着は、指示薬層が湿潤状態であるときに、多孔性材料
を貼り付けて、乾燥させることで接着する方法を用いる
ことができる。指示薬層が湿潤状態であるとは、バイン
ダーを溶解している溶媒が残っているか、あるいは乾燥
した膜が可溶性溶媒（有機溶媒がまたは水）で再び濡ら
されて、指示薬層のマトリックスを構成しているバイン
ダーが膨潤状態、分散状態または溶液状態にあることを
意味する。また、指示薬層のバインダーが、たとえばポ
リ酢酸ビニルのように粘着性を有する場合には、指示薬
層を特に湿潤状態とすることなく、連続した空隙を有す
る多孔性材料を、そのまま指示薬層に圧着することで接
着することができる。

疎水性（または親水性の乏しい）ポリマーからなる均質
な非孔質薄層であるポリマーバリア一層は、ポリマーと
して、疎水性または親水性の乏しいポリマーを用いるこ
とが好ましい、疎水性または親水性の乏しいポリマーの
具体例としては、セルロースｅアセテート・プロピオネ
ート、セルロースφアセテート・ブチレート、ビスフェ
ノールＡのポリカルボネート、ポリエチレン、ポリプロ
ピレン、エチレン・酢酸ビニルコポリマー、ホリウレタ
ン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、塩化ビニルＯ酢酸
ビニルコポリマー、ポリアミド（ナイロン）、ポリメチ
ルメタクリレート、およびポリビニルブチラールなどを
挙げることができる。これらのポリマーは、単独でも、
これらのポリマー相互の混合物としても、用いることが
できる。

ポリマーバリア一層の厚さは１通常約０．１〜６ｇ、ｍ
の範囲内にあり、特に約０．２〜３ｇｍの範囲内にある
ことが好ましい、ポリマーバリア一層は特公昭５８−１
９０６２号公報および特開昭６０−２１４５２号公報に
それぞれ記載の方法によりポリマーの有機溶媒溶液を塗
布し乾燥することにより設けることができる。

バリア一層としては分析操作時間の短かさ、高感度、お
よび指示薬層の発色または変色の一様性の良好さの観点
からメンブランフィルタ−または撥水処理したメンブラ
ンフィルタ−からなる空気バリア一層が好ましい。

バリア一層の上に、直接、または後述する粘着性中間層
を介して、アンモニア生成基質と反応してガス状アンモ
ニアを生成させる試薬を含有する反応層（以下単に反応
層と記すこともある）を設ける０反応層は、アンモニア
生成基質と反応してアンモニアを生成させる試薬（一般
には、酵素または酵素を含有する試薬）１反応により生
成したアンモニアをガス状アンモニアとして効率良く遊
離させるためのアルカリ性緩衝剤およびフィルム形成１
＠を有する親木性ポリマーバインダーを通常含有する層
である。

アンモニア生成基質と反応してアンモニアを生成させる
試薬は酵素、または酵素を含有する試薬であることが好
ましく、アナライトであるアンモニア生成基質の種類に
応じて、分析に適した酵素を選択して用いることができ
る。上記試薬として酵素を用いる場合には、その酵素の
特異性から、アンモニア生成基質と試薬の組み合せが決
定される。アンモニア生成基質／試薬の組合せの具体例
としては、尿素／ウレアーゼ、クレアチニン／クレアチ
ニンディミナーゼ、アミノ酸／アミノ酸デヒドロゲナー
ゼ、アミノ酸／アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸／アン
モニアリアーゼ、アミン／アミンオキシダーゼ、ジアミ
ン／アミンオキシダーゼ、グルコース及びホスホアミダ
ート／ホスホアミダートヘキソースホスホトランスフェ
ラーゼ、ＡＤＰ／カルバミン酸塩キナーゼ及び燐酸カル
バモル、酸アミド／アミドヒドロラーゼ、ヌクレオ塩基
／ヌクレオ塩基デアミナーゼ、ヌクレオシド／ヌクレオ
シドデアミナーゼ、ヌクレオチド／ヌクレオチドデアミ
ナーゼ、グアニン／グアナーゼ等を挙げることができる
。

反応層に用いることができるアルカリ性緩衝剤としては
、ｐＨが７．０から１０．５、好ましくは７．５から１
０．０の範囲の緩衝剤を用いることができる。緩衝剤の
具体例としては、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴ
Ａ）、）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒ
ｉｓ）、燐酸塩緩衝剤、Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシ
エチル）グリシ７　（Ｂｔｃｔ　ｎｅ）、Ｎ−［）リス
（ヒドロキシメチル）メチル］−３−７ミノプロパンス
ルホンｅｌｌ　（Ｔａｐ　ｓ）　、　Ｎ−２−ヒドロキ
シエチルピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロ皐シプロパンー
３−スルホン酸（Ｈｅ　ｐ　ｐ　ｓ　ｏ）　、　　Ｎ−
２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−３−プロパン
スルホン酸（Ｅｐｐｓ）、Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキ
シエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、３−［Ｎ−
ビス（ヒドロキシエチル）アミン］−２−ヒドロキシプ
ロパンスルホン酸（Ｄｉｐｓｏ）、Ｎ−ヒドロキシエチ
ルピペラジン−Ｎ′−エタンスルホン酸（ＨｅｐｅＳ）
、ピペラジン−Ｎ、Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパ
ンスルホン酸）２永和物（Ｐｏｐｓｏ）。

３−［Ｎ−）リス（ヒドロキシメチル）メチルアミノコ
−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（Ｔａｐｓｏ）、
Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノエタンス
ルホン酸（Ｔｅｓ）、Ｎ−［２−ヒドロキシ−１，１−
ビス（ヒドロキシメチル）エチルコグリシン（Ｔｒ　ｉ
　ｃ　ｉ　ｎｅ）等またはこれらのリチウム塩、ナトリ
ウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、またはアルカ
リ土類金属塩等を挙げることができる。上記緩衝剤の詳
細は、バイオケミストリー「旧ロｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ
５巻４６７〜４７７頁（１９８８年）、アナリティカル
バイオケミストリーｒＡｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｅ膳ｔｒｙ　Ｊ１０４巻、　３００〜３１０頁（
１９８０年）、日本化学全編「化学便覧　基礎編」　（
東京、丸首■１１１Ｂ８年発行）　１３１２−１３２．
０頁等に記載されている。

反応層に用いることができるフィルム形成能を有する親
水性ポリマーバインダーとしては、前述の指示薬層に用
いることができる水溶性パインターポリマーのうち親木
性を有するポリマーから適宜に選択して用いることがで
きる。その他、反応層に用いることができる親木性ポリ
マーとしては、ゼラチン、ゼラチン誘導体、アガロース
、プルラン、プルラン誘導体、ポリビニルアルコール、
ポリアクリルアミド等を挙げることができる。これのポ
リマーのうちでは、ゼラチンまたはゼラチン誘導体を用
いるのが一般的には好ましい。

反応層には、アンモニア生成基質と反応してアンモニア
を生成させる試薬、アルカリ性緩衝剤およびフィルム形
成能を有する親木性ポリマーバインダー以外にも、必要
に応じて、湿潤剤、バインダー架橋剤（硬化剤）、安定
剤、重金属イオントラップ剤（錯化剤）等を含有させる
ことができる０重金属イオントラップ剤は、酵素活性を
阻害するような重金属イオンをマスキングするために使
用されるものである０重金属イオントラップ剤の具体例
としては、ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ＥＤＴＡ・４Ｎａ、ニト
リロトリ酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ
酢酸のようなコンプレクサン（ｃｏｍｐｌｅｘａｎｅ）
を挙げることができる。

反応層は、アンモニア生成基質と反応してアンモニアを
生成させる試薬、アルカリ性緩衝剤および必要に応じて
加えられる上記の試薬類を、フィルム形成能を有するゼ
ラチン等の親水性バインダーと混合℃て塗布液とし、バ
リア一層または粘着性中間層の上に塗布、乾燥すること
により形成することができる。

反応層に含まれるアンモニア生成基質と反応してアンモ
ニアを生成させる試薬の量は、バインダーの重量に対し
て通常的０．１〜５０重量％、好ましくは約２〜２０％
の範囲内である。アルカリ性緩衝剤の使用量は、バイン
ダーの重量に対して０．１〜１０重量％の範囲内である
のが適当である。また、重金属イオントラップ剤を使用
する場合、その使用量は、バインダーの重量に対して約
０．５〜２０％の範囲内であるのが適当である。

この反応層の乾燥層厚は通常１〜２０７ｚｍの範囲内、
好ましくは３〜ｌＯＢｍの範囲内である。

バリア一層と反応層の間に設けることができる粘着性中
間層は、湿度１０％〜８５％、通常の環境温度（約０℃
から約４０℃）の大気中で粘着性を示すポリマー組成物
からなる層である。上記粘着性中間層は、特願昭５８−
１２８７５９号明細書に記載の素材および方法に従って
設けることができる。粘着性中間層を構成するポリマー
組成物は、ガラス転移点（Ｔｇ）が０℃以下の公知のポ
リマーの単一物または二種以上の混合物、またはそれに
必要に応じて公知の粘着付与剤（タッキファイア−）や
界面活性剤などを添加した混合物である。粘着性中間層
の厚さは１通常約０，１〜６ＪＬｍの範囲内、好ましく
は約１〜４ＪＬｍの範囲内である。

粘着性中間層に用いることができるポリマーの具体例と
しては、酢酸ビニル・プチルアクリレートコポリマー、
ポリ（エチルアクリレート）、スチレン・ブチルアクリ
レート・アクリル酸１１Ｎ−（ヒドロ午ジメチル）アク
リルアミド四元コポリマー、ブチルアクリレート−（ア
セト酢酸エチル）メタクリレート・２−アクリルアミド
−２−メチルプロパンスルホン酸三元コポリマー等を挙
げることができる。

バリア一層が疎水性（または親水性に乏しい）ポリマー
の均質な非孔質薄層からなるポリマーバリア一層の場合
には、粘着性中間層を設けることが好ましい。

反応層の上に直接、または後述する光遮蔽層または他の
中間層を介して、内因性アンモニアに作用して内因性ア
ンモニアを実質的に前記反応層に到達しえない状態に変
化させる試薬を含む内因性アンモニア捕１Ｆ！’　（以
下、単に内因性アンモニア捕捉層と記す）を設ける。内
因性アンモニア捕捉層は、アナライト（被検成分）であ
るクレアチニンまたは尿素窒素等のアンモニア生゛成基
質が反応層に到達してアンモニアが生成する反応が生起
するに先だって、併存する内因性アンモニアを捕捉する
機能を有する層である。

内因性アンモニアを捕捉するとは、内因性アンモニア捕
捉層に含有される試薬系が内因性アンモニアと結合して
内因性アンモニアを分析操作時間内に実質的に解離する
ことができない状態にするか、または内因性アンモニア
捕捉層に含有される試薬系が内因性アンモニアと化学反
応を起こして、内因性アンモニアを他の化学物質（具体
的には、アンモニウム塩、アンモニウムイオンあるいは
ガス状アンモニアとは異なる化学物質）に変化させるこ
とにより内因性アンモニアを内因性アンモニア捕捉層内
に固定して、実質的に反応層に到達させないことを意味
する。内因性アンモニア捕捉層としては、後者の内因性
アンモニアと反応して固定する機能を有する試薬系を含
有することが好ましい、内因性アンモニアと化学反応を
起こして、内因性アンモニアを異なる他の化学物質に変
化させる試薬系を本明細書では内因性アンモニア捕捉試
薬という。

内因性アンモニア捕捉試薬としては、アンモニアを基質
として他の材料に変化させる触媒能を有する酵素を含む
試薬組成物を用いるのが好ましい、内因性アンモニア捕
捉試薬の具体例としては、ＮＡＤＨにコチンアミドφア
デニン争ジヌクレオチド還元型）および／またはＮＡＤ
ＰＨにコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド・ホス
フェート還元型）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ
Ｃ１，４，１，３，以下、ＧＬＤＨと記す）およびα−
ケトグルタル＃（またはその塩；以下、α−ＫＧと記す
）を含む試薬組成物を挙げることができる。またアスパ
ルターゼ（ＥＣ４，３，１，１）と２マル酸またはフマ
ル酸塩を含む試薬組成物を用いてもよい１本発明の一体
型多層分析要素においては、ＮＡＤＨ，ＧＬＤＨおよび
α−ＫＧを含む試薬組成物を内因性アンモニア捕捉試薬
として用いることが好ましい。また。

ＧＬＤＨを含む試薬組成物またはアスパルターゼを含む
試薬組成物を用いる場合には、内因性アンモニア捕捉層
のｐＨ値を通常８．５以下、好ましくは７．０から８．
５の範囲内に維持できるように、適当な緩衝剤を用いる
ことが好ましい。

内因性アンモニア捕捉試薬に用いることができる。前述
のｐＨ値を維持する緩衝剤としては、日本化学合繊「化
学便覧　基礎編」　（東京、丸首■、１９６６年発行）
　１３１２−１３２０頁に記載の緩衝剤、ノーマシ―イ
ー拳グツド外（Ｎｏｒｍａｎ　Ｅ、　Ｇｏｏｄ　ｅｔａ
ｌ）著、バイオケミストリー［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙｌ、　　５（２）　、　４１１１？−４７７（１９８
Ｂ）　、ハイドロジエンφイオンーバッファー書フォア
・バイオロジカル番リサーチ、［Ｈｙｄｒｏｇｅｎ　Ｔ
ｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈｌ記載の緩衝剤、アール・エム・シー
・ドーソン外（Ｒ，Ｍ、　Ｃ，Ｄａｗ、ｓｏｎ　ｅｔ　
ａｌ）編のデータ・フォア−バイオケミカル・リサーチ
［Ｄａｔａｆｏｒ　Ｂｉｏｃｈｅａ＋１ｃａｌ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈｌ第５ｅａｒｃｈスフォード争アト・ザ・ク
ラレンドン・プレス）（Ｏｘｆｏｒｄ　ａｔ　ｔｈｅ　
Ｃ１ａｒａｎｄｏｎ　Ｐｒｅｓｓ　１９１３９年発行）
４７Ｂ−５０８頁、アナリティ力ル・バイオケミストリ
ー［Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｓ＋１ｓｔｒ
ｙｌ　、　　１０４．３００−３１０　　（１９８０）
に記載の緩衝剤等を挙げることができる、また、特公昭
５７−２８２７７号公報記載の一体型多層分析要素に用
いられる有機酸類またはそのアルカリ金属（またはアル
カリ土類金属）塩類、特開昭５９−１４３９５９号およ
び特開昭６０−１０１７１号各公報記載載の一体型多層
分析要素に用いられる塩基性ポリマー、酸性ポリマー、
酸性ポリマーのアルカリ金属（またはアルカリ土類金属
）塩類など、およびこれらの混合物等も上記緩衝剤とし
て用いることができる。

これらのｐＨ１！衝剤のうちで、特に好ましい緩衝剤の
具体例としては、燐酸水素二ナトリウムと３−モルホリ
ノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ。

ＣＡＳ　Ｒｅｇ、　Ｎｏ　［１１３２−８１−２１）と
水酸化ナトリウムの組合せ、燐酸二水素カリウムと燐酸
水素二ナトリウムの組合せ、燐酸水素二ナトリウムとク
エン酸の組合せ、ホウ酸と塩化ナトリウムとホウ砂め組
合せ、燐酸二水素カリウムと四ホウ酸ナトリウムの組合
せ等を挙げることができる。

内因性アンモニア捕捉層は、上記内因性アンモニア捕捉
試薬やｐＨ緩衝剤等の試薬類およびフィルム形成能を有
する親水性ポリマーバインダーからなる層である。上記
親水性ポリマーバインダーとしては、前述の反応層に用
いることができるとして挙げた親水性ポリマーバインダ
ーと同じものを用いることができる。これらのポリマー
のうちでは、ゼラチンまたはゼラチン誘導体を用いるの
が一般的には好ましい。

内因性アンモニア捕捉層の層厚は通常は約１〜２０ルｍ
、好ましくは約２〜１０ｇｍである。

本発明の分析要素の特徴的構成要素である内因性アンモ
ニア捕捉層は、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ１α−ケトグ
ルタル酸（α−ＫＧ）、およびグルタミン酸デヒドロゲ
ナーゼ（Ｇ　Ｌ　Ｄ　Ｈ）を含有することが好ましい、
これらの各成分の特に好ましい含有量（内因性アンモニ
ア捕捉層１ｒｎ”当り）およびその基準値を次に記す。

以下余白 基準値　好ましい範囲（／ｍ″） ＮＡＤＰＨ またはＮ　Ａ　Ｄ　Ｈ１８０８０〜１３００ｍ　ｇａ　
−Ｋ　Ｇ　　　　１８００　４００〜８０００ｍ　ｇＧ
ＬＤＨ１７０００２０００〜７００００ユニット従って
内因性アンモニア捕捉層は、ＮＡＤＰＨおよび／または
ＮＡＤＨを８０ｍｇ／ｒｎ”以上含有することが好まし
い、また内因性アンモニア捕捉層は、α−ケトグルタル
酸を４００　ｍ　ｇ　／　ｔｎ”以上含有することも好
ましい、さらに内因性アンモニア捕捉層は、グルタミン
酸デヒドロゲナーゼを２０００ユニット／ｒｎ′以上含
有することも好ましい。

なお、内因性アンモニア捕捉層がアスパルターゼと７マ
ル酸（フマル酸塩であってもよい）を含有する場合の、
それぞれの好ましい含有量の範囲は、アスパルターゼ１
０００ユニツ）／ｒｎ’以上、フマル酸（および／また
はフマル酸塩）２００ｍ　ｇ　／　ｒｎ’以上である。

バリア一層と内因性アンモニア捕捉層の間に設けること
ができる光遮蔽層は、光遮蔽性、または光遮蔽性と光反
射性とを兼ね備えた微粒子または微粉末（以下、単に微
粒子と記す）が、少量の被膜形成能を有する親木性（ま
たは弱親水性）のポリマーバインダーに分散保持されて
いる水透過性または水浸透性の層である。光遮蔽層は、
指示薬層にて発生した検出可能な変化（色変化、発色緩
衝剤等）を支持体側から反射測光する際に、後述する多
孔性展開層に点着供給された水性液体試料の色、特に全
血の場合のヘモグロビンによる赤色等を遮蔽するととも
に光反射層および背景層としても機能する。

光遮蔽性と光反射性とを兼ね備えた微粒子の例としては
、二酸化チタン微粒子、硫酸バリウム微粒子、アルミニ
ウム微粒子または微小フレーク等を挙げることができる
。また、光遮蔽性微粒子の例としては、カーボンブラッ
ク、ガスブラック、カーボンミクロビーズ等を挙げるこ
とができる。

これらのうちでは、特に二酸化チタン微粉末、硫酸バリ
ウム微粉末が好ましい。

被膜形成能を有する親木性（または弱親水性）ポリマー
バインダーの例としてはゼラチン（例、酸処理ゼラチン
、脱イオン化ゼラチン等）、ゼラチン誘導体（例、フタ
ル化ゼラチン、ヒドロキシメチルアクリレートグラフト
化ゼラチン等）、ポリビニルアルコール、再生セルロー
ス、セルロースアセテート（例、セルロースジアセテー
ト）等を挙げることができる。これらのうちではゼラチ
ン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド等が好ましい
、なお、ゼラチン、ゼラチン誘導体は公知の硬化剤（架
橋剤）を混合して用いることができる。

光遮蔽層に含有させる光遮蔽性微粒子とポリマーバイン
ダー（乾燥時）との比は１体積比で通常光遮蔽性微粒子
ｌＯに対しポリマーバインダー（乾燥体積）約２゜５か
ら約７．５の範囲、好ましくは約３．０から約６．５の
範囲である。光遮蔽性微粒子が二酸化チタン微粒子の場
合には、重量比で二酸化チタン微粒子ｌＯに対しポリマ
ーバインダー（乾燥重量）約０．６から約１．８の範囲
、好ましくは約０．８から約１．５の範囲である。光遮
蔽層の乾燥層厚は、通常３．Ｂｍから３０ＪＬｍの範囲
内、好ましくは約５ｐｍから約２０路ｍの範囲内である
。

光遮蔽層は、光遮蔽微粒子と親水性ポリマーの水性分散
液（必要に応じて界面活性剤等の試薬類を含有させるこ
とができる）を公知の方法によりバリア一層に上に塗布
し乾燥することにより設けることができる。また光遮蔽
層は、バリア一層と内因性アンモニア捕捉層の間に設け
る代りに、内因性アンモニア捕捉層と後述する多孔性展
開層の間に設けてもよい、あるいは、光遮蔽層を設ける
代りに、内因性アンモニア捕捉層中あるいは後述する多
孔性展開層中に光遮蔽層の成分を含有させてもよい。

なお、内因性アンモニア捕捉層の上に、場合によっては
光遮蔽層等の暦を介して、後述する多孔性展開層を接着
し積層するために、接着層を設けてもよい。

接着層は水で湿潤しているとき、または水を含んで膨潤
しているときに多孔性展開層を接着することができ、こ
れにより各層を一体化できるような親水性ポリマーから
なることが好ましい、接着層の製造に用いることができ
る親木性ポリマーの例としては１反応層の製造に用いら
れる親木性ポリマーがあげられる。これらのうちではゼ
ラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド等が好ま
しい、接ｌ′ｆ層の乾燥層厚は一般に約０．５μｍから
約２０ｇｍ、好ましくは約１ｇｍから約１０ｇｍの範囲
である。接着層は上記親水性ポリマーと、必要によって
加えられる界面活性剤等を含む水溶液を、塗布する等の
公知の方法により設けることができる。

これらの暦の上に、多孔性展開層（以下、展開層とす）
が設けられる。この展開層は、液体試料計量作用を有し
ていることが好ましい、液体試料計量作用を有する展開
層とは、その上側の表面（支持体から遠い側の表面）に
点着供給された水性液体試料を、その中に含有している
成分を実質的に偏在させることなしに、急速に横方向に
円形に広げ、反応層に水性液体試料が単位面積当りほぼ
一定容量の割合で供給する作用を有する層である。

以上の点から本発明の展開層のマトリックスを構成する
材料としては、濾紙、不織布、織物生地１編物生地、ガ
ラス繊維濾紙、プラッシュポリマーより形成されるメン
ブランフィルタ−あるいはポリマーミクロビーズ等から
なる三次元格子状構造物層等を用いることが好ましい。

展開層のマトリックスは、これらの材料から分析条件等
に応じて選択するが、全血など分析を阻害する非溶解性
物質（全血の場合は血球）を含む試料を用いる場合には
、阻害物質を除去する作用を有する織物生地または編物
生地を用いることが好ましい。

上記展開層に用いることができる織物生地（織布）とし
ては特開昭５５−１６４３５６号および特開昭５７−６
６３５９号の各公報に記載の広範囲の種類の織物生地が
挙げられる。織物生地のうちでは、たて（経）糸とよこ
（緯）糸とで織った平織物が好ましく、平織物のうちで
は細布生地、金山生地、ブロード生地、ボブリン生地等
が好ましい、織物生地を構成する糸としては後述する編
物生地を構成する糸と同様の素材からなる糸が挙げられ
、糸の形態としてはフィラメント糸、紡績糸（加捻糸）
のいずれをも用いることができ、これらのうちでは紡績
糸が好ましい、織物生地の糸の太さは綿紡績糸番手で表
わして約２０３から約１５Ｏ５、好ましくは約４０３か
ら約１２Ｏ８相当の範囲、または絹糸デニールで表して
約３５Ｄから約３００Ｄ、好ましくは約４５から約１３
０Ｄ相当の範囲、織物生地の厚さは約１００４ｍから約
５００μｍ、好ましくは約１２０鉢ｍか４約３５０ルｍ
の範囲、織物生地の有する空隙率は約４０％から約９０
％、好ましくは約５０％から約８５％の範囲である。

また、上記展開層に用いることができる編物生地Ｃ編布
、すなわち編んだ布状物）としては、広範囲の種類の編
物生地があげられ、それらのうちではたて（経）メリヤ
スとよこ（緯）メリヤスが好ましい、たてメリヤスとし
ては、−重アトラス編生地、トリコット編生地、ダブル
トリコット編生地、ミラニーズ編生地、ラッシェル編生
地等を用いることができ、よこメリヤスとしては、千−
生地、パール編生地、ゴム編生地、両面編生地等を用い
ることができる０編物生地を編成する糸としては、綿、
絹、羊毛等の天然繊維の糸、ビスコースレーヨン、キュ
プラ等の再生セルロース、セルロースジアゼテート、セ
ルローストリアセテート等の半合成有機ポリマー、ポリ
アミド（各種のナイロン類）、アセタール化ポリビニル
アルコール（ビニロン等）、ポリアクリロニトリル。

ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン、ポリプロ
ピレン２ポリウレタン等の合成有機ポリマーの細繊維か
らなる糸または単繊維からなる糸、天然繊維と再生セル
ロース、半合成または合成有機ポリマー繊維との混合繊
維からなる糸があげられる。糸の形態としては、フィラ
メント糸、紡績糸（加捻糸）のいずれをも用いることが
でき、これらのうちでは紡績糸が好ましい０ｍ物生地の
糸の太さは、綿紡績糸番手で表わして約４Ｏ８から約１
５０５、好ましくは約６Ｏ８から約１２０３相当の範囲
、または絹糸デニールで表わして約３５０から約１３０
Ｄ、好ましくは約４５０から約９００相当の範囲である
０編物生地の編成工程時のゲージ数としては、約２０か
ら約５０の範囲、編物生地の厚さは、約１００ルｍから
約６００　ｐｍ、好ましくは約１５０１Ｌｍから約４０
ＪＪ、ｍの範囲、編物生地の有する空隙率は、約４０％
から約９０％、好ましくは約５０％から約８５％の範囲
である。たてメリヤスのうちでは縦方向の伸縮が少なく
、編物からなる展開層の積層工程における操作のしやす
さ、裁断時の編目はどけのなさ等の観点でトリコット編
生地、ラッセル編生地、ミラニーズ編生地、ダブルトリ
コット編生地が好ましい。

多孔性展開層に用いられる織物または編物生地は水洗等
の脱脂処理により少なくとも糸製造時。

織物製造時あるいは編物編成時に供給または付着した油
脂類を実質的に除去した織物または編物生地であるが、
さらにその織物または編物生地は特開昭５７−６６３５
９号公報に開示の物理的活性化処理（好ましくはグロー
放電処理またはコロナ放電処理等）を生地の少なくとも
片面に施すか、あるいは特開昭５５−１６４３５６号、
特開昭５７−６６３５９号公報等に開示の親水性ポリマ
ー含浸処理等の親木化処理、またはこれらの処理工程を
逐次実施することにより織物または編物を親水化し、下
側（支持体に近い側）の層との接着力を強化することが
できる。

織物または編物生地からなる展開層を内因性アンモニア
捕捉層、光遮蔽層、または接着層に接着積層するには、
特開昭５５−１６４３も６号および特開昭５７−８６３
５９号各公報記載に開示の方法′に従って作成すること
ができる。すなわち、反応層または接着層の塗布後、未
乾燥のうちに、または乾燥後の層に水（または界面活性
剤を少量含む水）を実質的に均一に供給して層を膨潤さ
せ、ついで織物または編物生地を湿潤または膨潤してい
る層の上に実質的に均一に軽く圧力をかけながら接着、
積層し一体化する。

また展開層が、プラッシュポリマーまたはメンブランフ
ィルタ−からなる場合には特公昭５３−２１６７７号公
報等、ポリマーミクロビーズからなる三次元格子状構造
物層である場合には特開昭５５−９０８５９号公報等、
濾紙または不織布からなる場合には特開昭５７−１４８
２５０号公報等にそれぞれ記載の方法に従って設けるこ
とができる。

展開層を積層する内因性アンモニア捕捉層、光遮蔽層、
または接着層の親木性ポリマーバインダーがゼラチンま
たはゼラチン誘導体の場合には、層の塗布後、ゼラチン
（誘導体）が未乾燥のゲル状態の間に上記多孔性展開層
を構成する材料（織物または編物生地等）を接着、積層
し一体化する方法を採用することができる。

また多孔性展開層として、定面積多孔性層を用いてもよ
い、定面積多孔性層は、実開昭５７−４２９５１号公報
、特開昭５７−２０８９９８号公報等に記載の素材およ
び方法を用いて設けることができる。

また本発明における展開層には、光遮蔽性微粒子や界面
活性剤等の試薬を必要に応じて含有させることができる
。

本発明の一体型多層分析要素を用いてアンモニア生成性
物質を測定するには、展開層上に試料液５〜３０勝文程
度を点着し、必要により３０〜４０℃好ましくは３５〜
３９℃で、１〜２０分。

好ましくは２〜ｌＯ分程度インキュベーションを行った
後、支持体側から指示薬層の色変化（発色、変色または
退色）の程度を反射測光するか、標準色と視覚的に比較
すればよい。

次に実施例をあげて本発明を具体的に説明するが１本発
明がこれらに限定されるものでないことはいうまでもな
い。

［実施例１］ 透明ポリエチレンテレフタレー）　（ＰＥＴ）フィルム
（厚さ１８０ＪＬｍ）の上にアンモニア指示薬層（乾燥
層厚：４ＩＬｍ）を塗布、乾燥することにより形成した
０次に、撥水性が付与されたメンブランフィルタ−（商
品名：富士ミクロフィルターＦＭ１２０（富士写真フィ
ルム■製）：厚さ１４０　ｐｍ、空孔率約７５％、平均
孔径１．２ルｍを撥水性シリｐ−ン樹脂のヘキサン溶液
に浸漬後、乾燥することにより撥水性を付与したもの）
をアンモニア指示薬層（乾燥状態においても接着性を有
している）にはりつけ接着することによりバリア一層を
形成した。

次いで、バリア一層上に反応層（乾燥層厚＝８ルｍ）、
光遮蔽層（乾燥層厚：５１Ｌｍ）、内因性アンモニア捕
捉層（乾燥層厚：５ＩＬｍ）および接着層（乾燥層厚：
５ｇｍ）を順次塗布、乾燥することにより形成した。

さらに、乾燥状態にある上記各層を塗布した面を水で膨
潤させ、その上に展開層として、布（コツトンブロード
１００番）を圧着ラミネートして接着しクレアチニン定
量検出用の一体型多層分析要素を作製した。

なおアンモニア指示薬層、反応層、光遮蔽層、内因性ア
ンモニア捕捉層および接着層の形成に用いられる塗布液
の組成と調製法は、それぞれ以下に示すものである。（
組成物の量は、各層１ｍ″当りの塗布量である） アンモニア指示薬層−冷液 ブロムフェノールブルー　　　０．７ｇエタノール−水
　　　　　　　　２０ｍ１ポリ酢酸ビニル・アクリル酸
エステル 共重合体ラテックスバインダー　。

（固形物含有量的５０％ ｐＨ４，５）　　　　　　　　　１５ｇポリオキシエチ
レン ノニルフェニルエーテル　０．１５ｇ 水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０ｇ
以上の組成からなる塗布液を、クエン酸でｐＨ２，６０
に調整した。

反応層塗布液 ゼラチン　　　　　　　　　　　１５ｇ水　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　１２８ｇｐ−ノニルフェ
ノキシ ポリグリシドール　　　　　０，３ｇ エチレンジアミンテトラ酢酸 四ナトリウム塩　　　　　　０．３ｇ オルト燐酸二ナトリウム塩　　０．２ｇＴａｐｓ［（Ｎ
−トリス （ヒドロキシメチル）メチル−３− アミノプロパンスルホン酸］　　　３ｇＴｒｉｓ［（ト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）］３３ ｇレアチニンイミノヒドラーゼ ３５００ユニツト 以上の組成からなる塗布液を、水酸化ナトリウムでｐＨ
９，２に調整した。

光遮蔽層塗布液 二酸化チタン微粉末　　　　　　　４ｇゼラチン　　　
　　　　　　　　　４ｇｐ−ノニルフェノキシ ポリグリシドール　　　　　０．２ｇ 水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４２
ｇ内因性アンモニア捕捉層塗布液 ゼラチン　　　　　　　　　　　　５ｇ水　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　４０ｇＰ−ノニルフ
ェノキシ ポリグリシドール　　　　　０４２ｇ α−ケトグルタル酸　　　　８００ｍｇＮＡＤＰＨ１６
０ｍｇ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ ７５００ユニツト オルト燐酸−カリウム塩　　　０．３ｇ以上の組成から
なる塗布液を、Ｎａ２Ｂ４０フでｐＨ８，０に調整した
。

籠１」ＩＥ久麓 ゼラチン　　　　　　　　　　　　５ｇ水　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　６０ｇｐ−ノニルフ
ェノキシ ポリグリシドール　　　　　０．２ｇ ［比較例１］ 内因性アンモニア捕捉層を形成しなかった以外は、実施
例１と同様な操作を行ない比較用の分析要素を作成した
。

以上のようにして得られた本発明の分析要素および比較
用の分析要素を下記の方法で評価および比較を行なった
。

７％アルブミン水溶液（ブランク）、アンモニア窒素と
して硫酸アンモニウムをａｏｏＩＬｇ／ｄｉ含む７％ア
ルブミン水溶液及びクレアチニンを１．４．８及び２０
　ｍ　ｇ　／　ｄ　ｌ含む７％アルブミン水溶液を調製
した。さらに硫酸アンモニウムを４００．ｇ／ｄｆＬと
クレアチニンをそれぞれ１．４．８及び２０ｍｇ／ｄｊ
Ｌ含む７％アルブミン水溶液も調製した。これらの溶液
をＬＯＩＬｌずつ実施例１及び比較例１の分析要素の展
開層上に点着し、３７℃で６分間インキュベーションを
行った後、発色濃度を６００ｕｍの光で反射測光した。

結果を下記の第１表に示す、なお第１表におけるＮＨ４
”は、硫酸アンモニウムを意味する。

第１表 試験液　　　　　　　反射光学濃度 （７％アルブミン水溶液）　実施例１　比較例１（ブラ
ンク）　　　　　０．３５０　０．３５２Ｎ）１４゜４
００μｇ／　ｄ文　０．３５５　０．４７０クレアチニ
ン１膳ｇ／ｄｆＬ　　０　、３８５　０　、３９０クレ
アチニン４磯ｇ／ｄｉＯ、４６００、４７２クレアチニ
ン８膳ｇ／ｄｌ　　０　、５３０　０　、５４３クレア
チニン２０濡ｇ／ｄｉ　　０　、８００　０　、８１５
クレアチニン１層ｇ／ｄｌ＋ Ｎ　Ｈａ　”　　４００ｕ−ｇ／　ｄ文　０．３８７　
０．５３５クレアチニン４腸ｇ／ｄＪＬ　＋ ＮＨ４”４００終ｇ／　ｄ見　０．４６５　０．６１０
クレアチニン８塵ｇ／ｄｉ＋ ＮＨ４°　４００ルｇ／　ｄ文　０．５４０　０．６７
５クレアチニン２０ｍｇ／ｄＪＬ　＋ ＮＨ，”　　４００ＪＬｇ／ｄＪ１　０．８１３　０．
９６０以上の結果で明らかなように、内因性アンモニア
捕捉層のない比較例１の分析要素では内因性のアンモニ
アの影響を受けるが、内因性アンモニア捕捉層を有する
実施例１の分析要素ではその影響を受けないことがわか
る。（ＮＨ，９４００３４ｇ７６文の列を参照） ［実施例２］ 透明ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム（
厚さ１８０４ｍ）の上にアンモニア指示薬層（乾燥層厚
：４μｍ）を塗布、乾燥することにより形成した０次に
、撥水性が付与されたメンブランフィルタ−（富士ミク
ロフィルターＦＭ３００：厚さ１４０ｐｍ、空孔率的７
５％、平均孔径ｌ。２４ｍ；撥水性シリコーン樹脂のへ
キサン溶液に浸漬後、乾燥することにより撥水性を付与
した）を指示薬層（乾燥状態においても接着性を有して
いる）にはりつけ接着することによりバリア一層を形成
した。

次いで、バリア一層上に反応層（乾燥層厚：８１Ｌｍ）
、光遮蔽層（乾燥層厚：５ｇｍ）、内因性アンモニア捕
捉層（乾燥層厚：５ｐｍ）および接着層（乾燥層厚＝５
ルｍ）を順次塗布、乾燥することにより形成した。

さらに、乾燥状態にある上記各層を塗布した面を水で膨
潤させ、その上に展開層として、布（コツトンブロード
１００番）を圧着ラミネートして接着しクレアチニン定
量検出用の一体型多層分析要素を作製した。

なお指示薬層１反応層、光遮蔽層、内因性アンモニア捕
捉層および接着層の形成に用いられる塗布液の組成と調
製法は、それぞれ以下に示すものである。（組成物の量
は、各暦１ｒｎ’当りの塗布量である） 批ｊ」１１１鬼羞 ブロムフェノールブルー　　　０．７ｇエタノール−水
　　　　　　７．５ｍ文ポリ酢酸ビニル・アクリル酸エ
ステル 共重合体ラテックスバインダー （固形物含有量的５０％ ｐＨ４，５）　　　　　　　　１５ｇ ポリオキシエチレン ノニルフェニルエーテル　０・１５ｇ 水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０ｇ
以上の組成からなる塗布液を、クエン酸でｐＨ２，６０
に調整した。

反応層塗布液 ゼラチン　　　　　　　　　　　１５ｇ水　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　１２８ｇＰ−ノニルフ
ェノキシ ポリグリシドール　　　　　０．３ｇ エチレンジアミンテトラ酢酸 四ナトリウム塩　　　　　　０．３ｇ オルト燐酸二ナトリウム塩　　０．２ｇＴａｐｓ　　　
　　　　　　　　　　３ｇＴｒｉｓ　　　　　　　　　
　　　　３ｇクレアチニンイミノヒドラーゼ ４４００ユニツト 以上の組成からなる塗布液を、水酸化ナトリウムでｐＨ
９，５に調整した。

ｘｍ主蓋 二酸化チタン微粉末　　　　　　　４ｇゼラチン　　　
　　　　　　　　　６ｇｐ−ノニルフェノキシ ポリグリシドール　　　　　０．２ｇ 水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０
ｇ内因　アンモニア捕　層塗冷液 ゼラチン　　　　　　　　　　　　５ｇ水　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　４０ｇｐ−ノニルフ
ェノキシ ポリグリシドール　　　　　０．２ｇ α−ケトグルタル酸　　　　８００ｍｇＮＡＤＨ１６０
ｍｇ グルタミン酸デヒ、ドロゲナーゼ ７５００ユニツト オルト燐酸二カリウム塩　　　０；１ｇＭ０ＰＳ　　［
３−（Ｎ−モリホリノ）プロパンスルホン酸］　　　　
　０．５ｇ以上の組成からなる塗布液を、ＮａＯＨでｐ
Ｈ８，０に調整した。

接着層塗布液 ゼラチン　　　　　　　　　　　　５ｇ水　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　６０ｇｐ−ノニル
フェノキシ ポリグリシドール　　　　　０．２ｇ ［比較例２］ 内因性アンモニア捕捉層を形成しなかった以外は、実施
例２と同様な操作を行ない比較用の分析要素を作成した
。

以上のようにして得られた本発明の分析要素および比較
用の分析要素を、実施例１および比較例１と同様の方法
で、評価および比較を行なった。

結果を下記の第２表に示す。

以下余白 第２表 試験液　　　　　　　反射濃度 （７％アルブミン水溶液）　′Ｘ施例２　比較例２（ブ
ランク）　　　　　０．４０５　０．４１ＯＮ　Ｈａ“
　２００弘ｇ／　ｄｌ　　Ｏ、４１００、４８０クレア
チニン１ｍｇ／ｄｉ　＋ Ｎ）１４”２００鉢ｇ／ｄ！Ｌ　Ｏ，４４００，５１５
クレアチニン４ｍｇ／ｄＪＬ　＋ ＮＨ４０２００終ｇ／　ｄｌ　０．５２０　０％５８５
クレアチニン８層ｇ／ｄＪＬ　＋ Ｎ１（４°　２００終ｇ／　ｄＪＩ　　０　、５９０　
０　、６７２クレアチニン２０■ｇ／ｄｌ＋ ＮＨ４°　２００終ｇ／　ｄｌ　０．８６０　０．９３
５以上の結果で明らかなように、内因性アンモニア捕捉
層のない比較例２の分析要素では内因性のアンモニアの
影響を受けるが、内因性アンモニア捕捉層を有する実施
例２の分析要素ではその影響を受ないことがわかる。（
ＮＨ４”２００ルｇ／ｄｆＬの列を参照）

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のアンモニア生成基質分析用一体型多
層分析要素の基本構成を示す模式図である。 Ｉ：光透過性・液体不透過性支持体 ■：アンモニア指示薬層 ■：液体透過遮断層 Ｉｖ：アンモニア生成基質反応層 ■＝内因性アンモニア捕捉層 ｖＩ：多孔性展開層

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ I ）光透過性、液体不透過性支持体； （II）ガス状アンモニアにより検知可能な変化を生じる
   指示薬を含むアンモニア指示薬層； （III）ガス状アンモニアを通過させ得る液体透過遮断
   層； （IV）アンモニア生成基質と反応してガス状アンモニア
   を生成させ得る試薬を含有するアンモニア生成基質反応
   層； （Ｖ）内因性アンモニアに作用して内因性アンモニアを
   実質的に上記反応層に到達しえない状態に変化させ得る
   試薬を含有する内因性アンモニア捕捉層； および、 （VI）多孔性展開層がこの順に積み重ねられていること
   を特徴とするアンモニア生成基質分析用一体型多層分析
   要素。 ２、前記内因性アンモニア捕捉層が、ＮＡＤＨおよび／
   またはＮＡＤＰＨ、α−ケトグルタル酸およびグルタミ
   ン酸デヒドロゲナーゼを含有し、かつ該捕捉層のｐＨ値
   が７．０〜８．５の範囲内にあることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載の一体型多層分析要素。 ３、前記内因性アンモニア捕捉層がＮＡＤＨおよび／ま
   たはＮＡＤＰＨを８０ｍｇ／ｍ＾３以上、α−ケトグル
   タル酸を４００ｍｇ／ｍ＾２以上、およびグルタミン酸
   デヒドロゲナーゼを２０００ユニット／ｍ＾２以上含有
   することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の一体
   型多層分析要素。 ４、前記内因性アンモニア捕捉層がアスパルターゼおよ
   びフマル酸を含有し、かつ該層のｐＨ値が７．０〜８．
   ５の範囲内にあることを特徴とする特許請求の範囲第１
   項記載の一体型多層分析要素。 ５、前記反応層がクレアチニンと反応してアンモニアを
   生成させる酵素を含有し、クレアチニン分析用であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至４項のいずれ
   かの項記載の一体型多層分析要素。