DE2846967A1

DE2846967A1 - Mehrphasen-pruefmittel

Info

Publication number: DE2846967A1
Application number: DE19782846967
Authority: DE
Inventors: William I White
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1977-10-28
Filing date: 1978-10-27
Publication date: 1979-05-10
Also published as: DE2846967C2; CA1100024A; US4129417A; GB2006957B; JPS5467495A; FR2407474A1; CS216810B2; FR2407474B1; AU3913378A; GB2006957A; AU515162B2; IT7851460A0; IT1109285B

Description

PR.-rNG. FRANZ WUESTHOFF

PATENTANWÄLTE ^ _{pHL pkEDA} ^_{UESTHOFF 979}

WUESTHOFF-v.PECHMANN-BEHRENS -GOETZ dipping, gerhard puls (i„2-i,₇i)

DIPL.-CHEM. DR. E. FREIHERR VON PECHMANN PROFESSIONAL REPRESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN ΙΛΓΕΝΤ OFFICE DR.-ING. DIETER BEHRENS

MANDATAIRES AGREES PRES l'oFFICE EUROPtEN DES BREVETS DIPL.-ING.; DIPL.-VIRTSCH.-ING. RUPERT GOETZ

if

D-8000 MÜNCHEN 90 sru :-!.k;erstrasse2

Tl' LF. FON : (0S9) 56 20 51

<» a « .. . _ Telegramm: protectpatent

2846967 telex: j24070

1A-51 151 Patentanmeldung

Anmelder : MILES LABORATORIES,!^.

Elkhart, Indiana 4-6514, USA Titel : . Melarphasen-Prüfmittel

909819/0720

DR. ING. F.WUESTHOFF

Dft. E. ν. PEOHMANN DJt. ING. D. JJETTHENS DIPL. ING, K. GOETZ

PATENTANWÄLTE

8000 mi;frei:en no S^HWEMIE'ISTHASSE 2 -E1.KFO-I (080» -30 20 Sl T K I. BX 3 24:070

ΤΚΙ.ΚΟΗΛΜΜΚ t PHOTKuTJ¹ATKNX MONOIIBW

Beschreibun

Die Erfindung betrifft ein Mehrphasen-Prüfmittel, ein Verfahren zu dessen Herstellung sowie die Bestimmung eines Bestandteils in einer Probe unter unterschiedlichen Reaktionsbedingungen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Mehrphasen-Prüfmittel zur Bestimmung eines Bestandteils in einer flüssigen Probe, umfassend mehrere Komponenten, die in mindestens zwei Reaktionssystemen enthalten sind, die jeweils unter unterschiedlichen Reaktionsbedingungen (Parametern) wirksam sind, wobei mindestens eine der Komponenten auf das Vorhandensein des Bestandteils anspricht und mindestens eine andere Komponenti^IllⁿRiai?ion auf die Berührung mit der Probe unter Reaktionsbedingungen zu reagieren, bei denen ein erstes dieser Reaktionssysteme wirksam istunter Änderung der Reaktionsbedingungen nach solchen Bedingungen hin, unter denen mindestens ein anderes der Reaktionssysteme wirksam ist. Das Prüfmittel wird mit einer zu untersuchenden Probe zusammengebracht und nach einer vorbestimmten Zeit führt mindestens eine Komponente zu einer Änderung der Reaktionsbedingungen.

Die Erfindung liegt allgemein auf dem Gebiet von Testreagentien und betrifft ein Mehrphasen-Prüfmittel und ein Verfahren zum Wachweis eines Bestandteils in Reaktionssystemen, die unter unterschiedlichen Reaktionsbedingungen wirksam sind.

Es sind viele Prüfmittel zur Bestimmung spezifischer Bestandteile in flüssigkeiten, wie Urin und Blut, bekannt. Diese Prüfmittel haben sehr unterschiedliche Formen, wobei mit dem Reagens imprägnierte Teststreifen vom "dip-and-read-Typ" besonders vorteilhaft sind. Einige dieser Prüfmittel sind ge-

909819/0720

eignet zur Bestimmung von Bestandteilen, wie Glukose, Protein, okkultem Blut u.a. in Körperflüssigkeiten, während andere geeignet sind zur Bestimmung verschiedener Bestandteile in anderen .Flüssigkeiten, wie Wasser von Schwimmbecken, Schneideflüssigkeiten u.a. .

Diese bekannten Testsysteme sind im allgemeinen vom Einphasen-Typ und enthalten in dem Reagens eine oder mehrere Komponenten, z.B. einen Puffer, um die Reaktionsbedingungen für die üJestreaktion in einem speziellen Bereich zu halten, wie einem einzigen speziellen pH-Bereich, der erforderlich ist, damit die gewünschte Reaktion stattfindet.

Solche Testsysteme umfassen solche, bei denen mehr als eine Reaktion stattfindet und soweit diese Reaktionen unter den gleichen Reaktionsbedingungen ablaufen können, waren diese Systeme zufriedenstellend. Ks gibt jedoch eine Reihe von Situationen, bei denen mehr als eine Reaktion eintritt, wobei die einzelnen Reaktionen notwendigerweise oder optimal unter verschiedenen Reaktionsbedingungen ablaufen, z.B. bei verschiedenen pH-Werten. Die Anwendung von Mitteln zur Aufrechterhaltung einer bestimmten Reaktionsbedingung oder Umgebung in einem solchen System, z.B. eines pH-Werts in einem spezifisch begrenzten Bereich führt dazu, daß eine oder mehrere der Reaktionen des Systems unter schlechteren als den optimalen Bedingungen durchgeführt werden.

Die bekannten Systeme, bei denen eine Mehrzahl von Reaktionen unter einer einheitlichen Kombination von Reaktionsparametern durchgeführt wird, besitzen den weiteren Nachteil, daß bestimmte, sonst mögliche Reaktionskomponenten, die eine bessere Wirksamkeit besitzen würden, nicht angewandt werden können, da sie als Komponente einer Reaktion unter solchen Reaktionsbedingungen, wie sie für ein anderes Reaktionssystem erforderlich sind, nicht wirksam sind.

Während diese bekannten einphasigen Systeme sich weitgehend als

909819/0720

■ν

nützlicli erwiesen haben, sind die chemischen Verfahren, auf die sie anwendbar sind, begrenzt. Weite Analysebereiche konnten bisher mit üblichen Testsystemen noch nicht abgedeckt werden aufgrund der Begrenzungen, die durch Einhaltung von Reaktionsparametern in einem einzigen relativ engen Bereich auftreten. Die Analysebereiche, auf die bekannte Testsysteme nicht anwendbar sind, umfassen eine Vielzahl analytischer Verfahren, wie Mehrfach - Reaktionen, die optimal oder notwendigerweise unter unterschiedlichen Reaktionsbedingungen oder Parametern, z.B. bei verschiedenem' pH-Wert, verschiedener Ionenstärke, verschiedenen vorhandenen Eeaktionsteilnehmern u.a. ablaufen. Dazu gehören das Vorhandensein von störenden Substanzen, die inaktiviert werden müssen, um zuverlässige Bestimmung des Bestandteils zu ermöglichen, und eine spätere Zugabe von Komponenten, die entweder unter bestimmten Bedingungen nicht stabil oder schädlich sind.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Mehrphasen-Prüfmittel z.ur Bestimmung eines Bestandteils in einer Probe zur entwickeln, das nach Berührung mit der zu untersuchenden Probe unter Reaktionsbedingungen, die zur Wirksamkeit . mindestens eines der. Reaktionssysteme führen, andere Reaktionsbedingungen einstellt , die für die Wirk? mindestens eines weiteren Reaktionssystems erforderlich sind. In diesem Mehrphasen-Prüfmittel ist mindestens eine Komponente enthalten, die auf den zu bestimmenden Bestandteil, anspricht und mindestens eine andere Komponente, die eine Änderung der Reaktionsbedingungen herbeiführt.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung dieses Mehrphasen-Prüfmittels. Dieses Prüfmittel ist geeignet zur Durchführung von analytischen Verfahren, bei denen zwischendrin eine Änderung der Reaktionsbedingungen durch eine einfache Verfahrensstufe erforderlich ist. Mit Hilfe dieser Prüfmittel ist die Bestimmung eines Bestandteils in einer Probe leicht möglich, insbesondere dann, wenn das Prüfmittel in i'orm eines

909819/0720

1A-51 151

einheitlichen Prüfmittels bzw. einer Prüfvorrichtung, z.B. eines "dip-and-read-Prüfmittels" angewandt wird.

Die Erfindung "betrifft ein neues Mßhrphasen-Prüfmittel (Multisystem-Prüfmittel) , ein Verfahren zu dessen Herstellung sowie die Bestimmung eines Bestandteils in einer flüssigen Probe unter mehreren Reaktionsbedingungen mit Hilfe des Prüfmittels. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Mehrphasen-Prüfmittel zur Bestimmung eines Bestandteils in einer Probe, enthaltend mehrere Komponenten, die in mindestens zwei Reaktionssystemen enthalten sind, wobei die Reaktionssysteme jeweils unter unterschiedlichen Reaktionsbedingungen wirksam sind, mindestens eine der Komponenten auf das Vorhandensein des Bestandteils anspricht und mindestens eine andere der Komponenten wirksam ist bei Berührung mit der Probe unter Reaktionsbedingungen,unter denen das erste der Reaktionssysteme wirksam ist und dabei die Reaktionsbedingungen in solche verändert, unter denen zumindest ein anderes der Reaktionssysteme wirksam ist. Das Prüfmittel kann mehr als eine auf den Bestandteil ansprechende Komponente enthalten. Die auf den (zu bestimmenden)Bestandteil ansprechende Komponente kann vorzugsweise ein chromophorer Indikator, ein Antigen, Antikörper, Enzym oder anderer spezifischer Bindungspartner o.a. sein. JB¹Ur die Parameter bzw. Reaktionsbedingungen, die mit Hilfe des Prüfmittels geändert werden können, sind eine Modifikation bzw. Änderung des pH-Werts der Ionenstärke, der vorhandenen Reagentien, wie störender Substanzen und deren Reaktionsgeschwindigkeit besonders bevorzugt.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Mehrphasen-Prüfsystem mehrere Komponenten, die in mindestens zwei Reaktionssystemen vorhanden sind, die jeweils unter unterschiedlichen ersten und zweiten Reaktionsbedingungen wirksam sind, wobei mindestens eine der Komponenten auf das Vorhandensein des Bestandteils anspricht in einem ersten

909819/072Q

1A-51 ι51

Reaktionssystem unter ersten Reaktionsbedingungen und mindestens eine andere der Komponenten nach der Berührung mit der Probe unter Bildung der zweiten Reaktionsbedingungen wirkt, unter denen ein zweites Reaktionssystem wirksam ist.

Eine andere bevorzugte Ausführungsform betrifft ein Mehrphasen-Prüfmittel, bei dem zumindest eine der Komponenten, die zur Änderung der Reaktionsbedingungen wirksam ist, eingekapselt ist, so daß sie bei Berührung mit der Probe freigesetzt wird und imstande ist, nach der Freisetzung zweite Reaktionsbedingungen elnzustellen^unter denen ein zweites Reaktionssystem wirksam ist. Mikrokapseln sind zum Einkapseln bevorzugt und können hergestellt werden nach üblichen Verfahren zur Herstellung von Mikrokapseln (micro-encapsulation), um eine Komponente zu erhalten, die imstande ist, die Reaktionsparameter zu ändern. Die Mikrokapseln sind vorzugsweise osmotisch empfindlich, wodurch eine Freisetzung ihres Inhaltes erfolgt, üie können auch aus einem Material hergestellt werden, das in der Probe löslich ist. Außer der Komponente zur Änderung der Reaktionsbedingungen können auch andere Komponenten eingekapselt sein, z.B. solche, die unter Reaktionsbedingungen des zweiten Reaktionssystems optimal wirksam sind.

Bei einer anderen Ausführungsform des Mehrphasen-Prüfmittels umfaßt die mindestens eine Komponente, die imstande ist die Reaktionsbedingungen zu verändern, mindestens zwei Komponenten, die nach Berührung mit der Probe miteinander reagieren und die zweiten Reaktionsbedingungen einstellen, unter denen ein zweites Reaktionssystem wirksam ist. Die miteinander reagierenden Komponenten sind bei einer bevorzugten Ausführungsform ein Katalysator, wie ein Enzym, und dessen Substrat. Eine oder beide der miteinander reagierenden Komponenten können gegebenenfalls in Mikrokapseln eingeschlossen sein und erfüllen damit mehr als eine Aufgabe der Erfindung.

Bei einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Prüf-

909819/0720

mittels umfaßt dieses eine Mehrzahl von Komponenten, die mit mindestens zwei Reaktionssystemen verbunden sind, die jeweils unter verschiedenen Eeaktionsbedingungen wirksam sind, wobei mindestens eine der Komponenten auf das Vorhandensein des Bestandteils in einem zweiten oder späteren Reaktionssystem anspricht und mindestens eine andere der Komponenten in einem ersten Reaktionssystem unter Inaktivierung einer Substanz in der Probe, die die auf den Bestandteil ansprechende Komponente stören würde. Die auf den zu bestimmenden Bestandteil ansprechende Komponente ist vorzugsweise eingekapselt oder auf andere Weise "eingefangen" (sequestered), so daß sie nach Inaktivierung der störendenSubstanz freigesetzt

werden kann. Die Bindung von Schutzgruppen an die determinierende Gruppe und andere bekannte Verfahren sind anwendbar.

Das Mehrphasen-Prüfmittel stellt ein Mittel dar, in dem die Komponenten entsprechend den oben angegebenen Ausführungsformen enthalten sind. Die Prüfmittel können auch in einem Träger, wie einer saugfähigen oder nicht-saugfähigen Matrix enthalten sein oder andere Bestandteile, wie Bindemittel, enthalten, unter Bildung von Prüfmitteln bzw. Vorrichtungen, wie "dip-and-read-Prüfmitteln" bzw. Tabletten.

Eine erfindungsgemäße Prüfvorrichtung kann hergestellt werden, indem man in eine Trägermatrix, z.B. durch gleichzeitiges oder aufeinanderfolgendes Imprägnieren mindestens eine Komponente, die auf den Bestandteil in der Probe anspricht, in mindestens einem Reaktions system und die Komponenten, die imstande sind, eine Änderung der Reaktionsbedingungen herbeizuführen, einbringt. Wenn die Trägermatrix mit einer Lösung imprägniert wird, wird die so erhaltene Matrix anschließend getrocknet. Wenn Mikrokapseln angewandt werden, um die Komponenten einzukapseln, wird diese Verkapselung üblicher V/eise vor und unabhängig von dem Einbau in x'rägermatrix. durchgeführt. Unabhängig davon, ob die Mikrokapseln Komponenten, die auf den Bestandteil ansprechen oder Komponenten, die wirksam sind zur Änderung der Reaktionsparameter enthalten, werde diese vorzugsweise

909819/0720

1A--51

nach den anderen Komponenten in die Matrix eingebracht. Die Mikrokapseln können in die gesamte Trägermatrix eingebaut (imprägniert), auf deren Oberfläche aufgebracht oder in einem zentralen Teil verfestigt werden. Das Prüfmittel kann einen Halter, wie einen Handgriff aus einem organo-plastischen Material umfassen.

Die Vorrichtung kann andererseits die Form einer Tablette besitzen. Irgend ein geeignetes Verfahren zur Herstellung von Tabletten, wie ein Verpressen oder Formen kann angewandt werden, um die Mittel in eine übliche Tablette zu formen. Bindemittel, besonders solche, die in dem Lösungsmittel der zu untersuchenden Probe zerfallen oder löslich sind, können angewandt werden, um eine strukturelle Stabilität vor der Anwendung zu erreichen.

Das Mehrphasen-Prüfsystem kann auch ohne Matrizes, Tablettierungsmittel und andere Trägern angewandt werden zur Untersuchung von flüssigen Proben, indem man es direkt mit der Probe zusammenbringt. Das Ansprechen auf den in der Probe enthaltenen zu bestimmenden Bestandteil wird erreicht bzw. sichtbar gemacht durch Bildung eines chromophoren Komplexes, eine Oxidation-Reduktion-Reaktion, eine Antigen-Antikörper- oder Enzym-Substrat-Komplex-Bildung oder eine andere nachweisbare Veränderung.

Vorzugsweise wird das Mehrphasen-Prüfsystem in Form einer festen Zubereitung, insbesondere einer Vorrichtung angewandt, die bequem und zuverlässig ist. Diese Vorrichtung wird in die zu untersuchende flüssige Probe eingetaucht oder auf andere Weise mit ihr in Berührung gebracht. Mindestens eine der in der. Trägermatrix enthaltenen oder darin imprägnierten Komponenten reagiert oder spricht auf andere Weise auf das Vorhandensein des nachzuweisenden Bestandteils an. Mindestens eine andere der Komponenten spricht auf die Berührung mit der Probe unter Reaktxonsbedxngungen an, bei denen ein

909819/0720

of _

Ig,

erstes Reaktionssystem wirksam ist zur Änderung der Reaktionsbedingungen nach solchen Bedingungen, unter denen zumindestens ein anderes Reaktionssystem wirksam ist. Das Ansprechen auf den nachzuweisenden bzw. zu bestimmenden Bestandteil kann unter Reaktionsbedingungen oder Parametern eintreten, die zur Zeit des Kontaktes zwischen dem Prüfmittel der zu untersuchenden Probe herrschen oder in einem späteren Reaktionssystem unter vorher veränderten Reaktionsbedingungen.

I)ie Aktivierung des Bestandteils, der imstande ist, die Reaktionsbedingungen zu verändern, kann z.B. eine Freisetzung von

eine
eingekapselten Komponenten oder/Wechselwirkung zwischen einem Katalysator, wie einem Enzym und dessen Substrat, umfassen. So können ein Katalysator und ein Substrat vor, gleichzeitig mit oder anschließend an das Ansprechen der auf den Bestandteil der Probe ansprechenden Komponente miteinander in Wechselwirkung treten. Die Wechselwirkung zwischen Enzym und Substrat kann sogar beginnen, bevor der Bestandteil nachgewiesen ist, um daraufhin eine Änderung der Reaktionsbedingungen herbeizuführen, vorausgesetzt, daß sie (Enzym und Substrat) in solchen relativen Hengen vorliegen, daß sie die Reaktionsbedingungen erst nach einer bestimmten Zeit verändern.

Die Ausführungsform unter Verwendung von Mikrokapseln ergibt eine verzögerte Freisetzung der Komponente, die imstande ist, die Reaktionsbedingungen zu verändern oder die auf den zu bestimmenden Bestandteil anspricht.Mach einer vorbestimmten Zeit tritt das Lösungsmittel der Probe, für das die Kapselwand durchlässig ist, aufgrund osmotischer Kräfte in die Kapsel ein. Es entsteht ein ausreichender osmotischer Gradient, der zu einer Freisetzung des Kapselinhalts führt. Die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Freisetzung des Kapselinhalts sind eine Funktion des anfänglichen osmotischen Gradienten und der Eigenschaften der Kapselwand.

Die Probe wird beobachtet, nachdem die durch die Vorrichtung bzw.

909819/0720

1A-51 -151

durch das Prüfmittel ermöglichten Reaktionen abgelaufen sind. Neben einem visuellen Vergleich können verschiedene instrumentelle Verfahren angewandt werden, um die entstandene Veränderung zu beobachten, wodurch die Genauigkeit des Tests erhöht wird durch Vermeiden der subjektiven Bestimmung einer Färbung durch das menschliche Auge.

Obwohl in der folgenden Beschreibung spezielle Ausdrücke aus Gründen der Klarheit angewandt werden, beziehen diese sich leidglich auf besondere Ausführungsformen und stellen keine Einschränkung der Erfindung dar.

Der Ausdruck Tragermatrix bezeichnet saugfähige und nicht-saugfähige Matrizes, die, wenn sie physiologischen und anderen Flüssigkeiten ausgesetzt werden, ihre strukturelle Integrität bewahren. Geeignete saugfähige Matrizes, die angewandt werden können, sind u.a. Papier, Zellulose, Holz, Bahnen aus synthetischen Fasern, Glasfasern, Vliesstoffen, Geweben u.a. . Nichtsaugfähige Matrizes sind u.a. organo-plastische Materialien, wie Polypropylen. Aus Gründen einer bequemen Handhabung kann die Matrix an einem unlöslichen Träger bzw. Griff, z,B. aus Polystyrol, befestigt sein.

Wahlweise kann der inerte Träger in einer gepreßten oder geformten Tablette vorliegen, die ggf. übliche Hilfsmittel, wie Mittel zur Erleichterung des Zerfalls, z.B. Carboxymethylcellulose oder Stärke, Füllstoffe, wie Lactose oder Phosphate und Gleitmittel, wie Talkum, Stearinsäure oder Paraffin enthalten kann. "

Mikrokapseln, wie sie für die erfindungsgemäßen Prüfmittel geeignet sind, können nach einer Vielzahl bekannter Methoden hergestellt werden (US-PS 4- 015 462; Angew. Chem. Internat. Edit. 14:539 (1975) und US-PS 3 092 463). Solche Methoden umfassen chemische Einkapselungs-Verfahren, wie die Zwischenschichtpolykondensation oder Koazerierung und physiomechanische Verfahren, wie Zentrifugieren oder Sprühtrocknen.

909819/072 0

Grenzschichtpolykondensation, Phasentrennung und Polymerisationsverfahren sind wegen der Leichtigkeit der Herstellung von Mikrokapseln bevorzugt. Der Ausdruck osmotisch empfindlich bezieht sich auf die Fähigkeit der Kapselwand, auf eine Änderung des inneren hydrostatischen Drucks durch eine Änderung der physikalischen Eigenschaften zu reagieren und dadurch die Freisetzung der inneren Phase zu ermöglichen.

Die Aktivität der in den Beispielen angewandten Enzymzubereitungen wird angegeben in Anzahl der Einheiten pro mg Trockengewicht. Die Commission on Enzymes -of the>international Union of Biochemistry hat eine internationale Einheit (IE) der Enzymaktivität, definiert als 1 /uMol Substrat, das pro Minute unter speziellen pH- und iemperaturbedingungen verbraucht wird. Diese Definition gilt in der folgenden Beschreibung, soweit nichts anderes angegeben.

Die Erfindung wird durch die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele näher erläutert.

Beispiele 1 und 2

Beim lüitritnachweis mit Hilfe eines einphasigen Prüf mittels muß die Diazotierung eines aromatischen Amins bei einem niedrigen pH-Wert stattfinden und das diazotierte Amin muß dann mit einer anderen Substanz bei dem gleichen niedrigen pH-Wert gekuppelt werden. Dadurch tritt eine wesentliche Beschränkung der anwendbaren Kupplungskomponenten auf eine verhältnismäßig kleine Anzahl aromatischer Amine und ihrer Derivate ein.

Wenn der Versuch jedoch bei einem sauren pH-Wert beginnt, der anschließend ins Alkalische geht, wird die Anzahl der Kupplungskomponenten, die angewandt werden können, wesentlich größer und es kommen z.B. zahlreiche Phenole und Naphthole in Frage. Diese pH-Änderung kann bei einer einzigen Testoperation nur mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Prüfmittels durchgeführt werden, wie es zum Vergleich anhand der folgenden

909819/0720

1A- 51 -151

Mittel bzw. Zubereitungen, gezeigt wird.

1. (a) Eine Imprägnierlösung mit einem pH-Wert von ungefähr wurde in 75 ^l Methanol hergestellt durch Zugabe der folgenden Bestandteile:

1. 0,13 S p-Arsanilisäure (aromatisches Amin) 2-3,0 g Malonsäure

3· 25 ml 2,0%ige Lösung von hydrolysiertem Poly(maleinsäureanhydrid-Methylvinylather) (Gantrez AN 139 der

GAF Corp.,-New York, New York, 10020) 4. 0,75 g Natriumlaurylsulfat
5· 0,3 g 1-Naphthol-3,6-disulfonsäure-natriumsalz (Kupplungsmittel).

Filterpapier-Stücke (Whatman No. 17, Whatman Inc., Clifton, New Jersey, 07014) 10 cm χ 10 cm wurden bis zur Sättigung mit der oben angegebenen Imprägnierlösung imprägniert, 10 min bei 95 0 getrocknet und in Stücke von 1 χ 1 cm geschnitten.

(b) Ein anderes einphasiges Prüfmittel wurde genau wie unter (a) angegeben, hergestellt, mit der Ausnahme, daß der pH-Wert der Imprägnierlösung durch Zugabe von 15 ml 2m Citratpuffer zu der Lösung und Weglassen der Malonsäure auf ungefähr 6 eingestellt wurde.

(c)Ein erfindungsgemäßes Mehrphasen-Prüfmittel wurde folgendermaßen hergestellt: 10 χ 10 cm große Filterpapierstücke (Whatman) wurden mit der Imprägnierlösung entsprechend 1 a imprägniert und wie oben getrocknet. Sie wurden dann mit einer einfachen Schicht (Monolayer) von 0,177 mit 0,210 mm (70 bis' 80 mesh) großen Polyamid-Mikrokapseln beschichtet, die hergestellt worden waren durch Verkapseln einer wäßrigen Lösung, enthaltend 13,2 g/dl wäßrigesNaOH und Trocknen.

909819/0720

Die entsprechend (a), (b) und (c) ex'haltenen Prüfmittel wurden untersucht durch Aufbringen von drei Tropfen Probe auf ein 1 x 1 cm großes Prüfmittel. Die Probe enthielt 10 nig/dl NaHO₀ in destilliertem Wasser und die Ergebnisse wurden nach 3 min beobachtet. Hit Hilfe der entsprechend (a) und (b) hergestellten Prüfmittel war es nicht möglich, 10 mg/dl Nitrit nachzuweisen, während das Prüfmittel (c) einen deutlichen Nachweis ergab, indem es leuchtend orange wurde.

Ein erfindungsgemäßes Mittel wurde hergestellt durch Zusammengebeii von 0,13 g p-Arsanilsäure, 3iO g Malonsäure und 0,3 g 1-Naphthol-3,6-disulfonsäuredinatriumsalz mit den unter 1 (a) beschriebenen Polyamidkapseln. Der Anteil der verkapselten und nicht-verkapselten Bestandteile kann entsprechend der Geschwindigkeit und Stärke der gewünschten pH-Anderung variiert werden und es werden vorzugsweise ungefähr 10,0 g Mikrokapseln verwendet.

Las wie oben hergestellte Prüfmittel wurde untersucht durch Zusammenbringen mit drei Tropfen der oben erwähnten Probe in 2 ml große Vertiefungen einer Tüpfelplatte (Coors Porcelain Co., Golden, CoIo. 80401). Mit Hilfe des Prüfmittels konnte Nitrit leicht nachgewiesen werden, wie sich durch eine Farbänderung zeigte.

2. Bei diesem "Versuch wurden Einphasenprüfmittel (a) und

(b) genau wie unter 1(a) bzw. 1(b) angegeben, hergestellt.

(c) Ein erfindungsgemäßes Mehrphasen-Prüfmittel wurde folgendermaßen hergestellt: Ein 10 χ 10 cm großes Stück Filterpapier (Whatman) wurde bis zur Sättigung mit einer entsprechend 1(a) hergestellten Lösung imprägniert, mit der Ausnahme, daß das i-Naphthol-3,6-disulfonsäuredinatriumsalz weggelassen v/urde und anschließend wie oben getrocknet. Diese Stücke wurden dann mit einer Einfach- Schicht von 0,177 bis 0,210 mm

909819/0720

großen Polyamidkapsein überzogen, die hergestellt worden waren durch Verkapseln einer wäßrigen Lösung, enthaltend 3,3 /ö i-Hapafchol-^e-disulfonsäuredinatriumsalz und 13,2 g/dl wäßriges MaOH und anschließendes !Trocknen. Diese i'ilterpapierstücke wurden in 1 χ 1 cm große Quadrate geschnitten.

Die entsprechend 2(_a), (b) und (c) hergestellten Prüfinittel wurden untersucht durch Aufbringen von drei Tropfen einer Probe, enthaltend 10 mg/dl JJiaMX, in destilliertem Wasser auf ein 1 χ 1 cm großes Prüfmittel. Die Ergebnisse wurden nach 3 min abgelesen. Mit Hilfe der entsprechend (a) und (b) hergestellten Prüfmittel war es nicht möglich, 10 mg/dl Mitrit nachzuweisen, während mit dem Prüfmittel (c) der ■Nachweis durch Bildung einer leuchten orangen Färbung leicht möglieh war.

Wie aus den obigen Beispielen hervorgeht, kann, wenn der pH-V/ert ständig niedrig ist, zwar die Diazotierung stattfinden, jedoch keine Kupplung. Wenn der pH-Wert ständig hoch ist, kann eine Kupplung eintreten, aber keine Diazotierung. .Nur wenn der pH-Wert zunächst zur Diazotierung niedriger ist und dann zur Kupplung erhöht wird, ist es möglich, mit dem Prüfmittel .Nitrit nachzuweisen.

Beispiele 3 bis 5

Bei der Analyse von saurer Phosphatase, wie sie bei krankhaften Zuständen, wie inetas basierenden Carcinomen der Prostata auftritt, muß die hydrolytische Wirkung des Enzyms bei pH 4,5 untersucht werden, während einige der günstigsten Substrate nur bei basischem pH-Wert beobachtbar sind. Dadurch wird die Anzahl von Substraten, die auf diese Weise nachgewiesen werden können, stark verringert.

909819/0720

1A-51 151

3 . Das kann durch das folgende Testsystem gezeigt werden:

p-Mtrophenyl-phosphat ^ 1_2 y p-Mtrophenol (farbsaure Phosphatase + Phosphat los)

p~Nitrophenol ■ > p-Mtrophenolatanion (gelbj

Diese ßeaktionsfolge kann mit einer einzigen Testoperation nur mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Prüfmittels durchgeführt werden, wie durch eine vergleichsweise Untersuchung der folgenden drei '.Teststreifen gezeigt werden kann.

(a) .Ein Einphasen-Prüfmittel wurde folgendermaßen hergestellt. Ein Stück .Filterpapier (Eaton-Dikeman 204 der Eaton-Dikeman, Mount Holly Springs, Pennsylvania 17065) von 10 χ 10 cm wurde zunächst bis zur Sättigung in 25 ml 0,02 m Matriumcitratpuffer (pH 5,0) imprägniert und bei 60⁰C getrocknet. Es wurde dann in 20 ml einer methanolischen Lösung, enthaltend 0,3 g p-öitrophenylphosphatnatriumsalz gesättigt und bei 60⁰C getrocknet. Die imprägnierten Pilterpapierstücke wurden in 1 χ 1 cm große Stücke geschnitten.

(b) Bei der Herstellung eines erfindungsgemäßen Mehrphasen-Prüfmittels wurden die gleichen ersten Tauchstufen durchgeführt wie oben unter 5(a) angegeben. Die Stücke wurden dann mit einer Einfachschicht Polyamidmikrokapseln (0,177 bis 0,210 mm) beschichtet, die erhalten worden waren durch Verkapseln einer wäßrigen Lösung, enthaltend 13,2 g/dl wäßriges KaOH und Trocknen. Die .Filterpapierstücke wurden wie oben angegeben zerschnitten.

(c) Bei der Herstellung der dritten Prüfmittel wurde das .Filterpapier zunächst bis zur Sättigung mit 0,1 m Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS) Puffer, pH 8,0, imprägniert und

909819/0720

bei 6O⁰G getrocknet. Die zweite Tauchstufe war die gleiche

unter 3 (a) angegeben. Die so imprägnierten Papierstücke wurden wie oben angegeben, zerschnitten.

Die so hergestellten Prüfmittel wurden untersucht durch Aufbringen von zwei Tropfen einer Lösung, enthaltend 10 mg/ml (20 Einheiten*/mg) saurer Weizensamenphosphatase (Research Products, Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana 46514-) in 0,02 m Citratpuffer und nach 5 min beobachtet.

Bei den Streifen (a) und (c) wurde keine .Farbänderung beobachtet, während der Streifen (b) sich gelb färbten. Das zeigt, daIi bei pH 5 zwar Hydrolyse eintritt, aber das p-Hitrophenol farblos bleibt (Streifen a). Bei pH 8 tritt keine Hydrolyse ein (Streifen c). JNur wenn der pH-Wert zunächst niedrig ist, damit die Hydrolyse eintreten kann und dann erhöht wird, um eine ii'arbbildung zu ermöglichen, entsteht eine Farbe, die die saure Phosphatase nachweist.

4- . Ein anderes System zum Machweis von saurer Phosphatase folgt dem folgenden Reaktionsschema:

Pnenolphthaieindiphosphat —^ Phenolphthalein (farb-

saureihosphatase los)

+ Phosphat

0H~
Phenolphthalein (farblos) ^ Phenolphthalein (rosa)

Bei diesem Versuch wurden Einphasen- und Mehrphasen-Prüfmittel (a), (b) bzw. (c) entsprechend 3 (u), (b) bzw. (c) hergestellt mit der Ausnahme, daß das p-.Nitrophenylphosph.at ersetzt wurde durch Phenolphthaleindiphosphat.

* Die Enzymmenge, die die Freisetzung von 1 /UMol p-Nitrophenol pro h bei 37 0 und pH 4,8 katalysiert.

909819/0720

1A-51 151

Me entsprechend 4 (a), 4 ("b) und 4 (c) hergestellten Prüfmittel wurden wie in Beispiel III untersucht. Die entsprechend (a) und (c) hergestellten Prüfmittel zeigten keine saure Phosphatase an, während das Mehrphasen-Prüfmittel sich rosa färbte und dadurch das Vorhandensein von Phosphatase anzeigte.

5, Die Analyse von saurer Phosphatase kann auch durchgeführt werden mit Hilfe einer einzigen Testoperation unter Verwendung eines Prüfmittels, das entsprechend einer anderen Ausführungsform gemäß der Erfindung hergestellt worden ist, bei der keine Mikrokapseln verwendet werden. Im folgenden sind Vergleichsversuche von drei Prüfmitteln angegeben.

(a) Ein Einphasen-Prüfmittel wurde folgendermaßen hergestellt: Ein 10,16 χ 10,16 cm großes Stück Filterpapier (E & D) wurde zunächst zur Sättigung in 25 ml 0,02 m Citratpuffer (pH 5?0) imprägniert und bei 60⁰C getrocknet. Es wurde dann mit 20 ml einer methanolischen Lösung, enthaltend 0?5 S p-Nitrophenylphosphatnatriumsalz gesättigt, bei 60⁰G getrocknet und in 1 x 1 cm große Quadrate geschnitten.

(b) Zur Herstellung eines Mehrphasen-Prüfmittels nach der Erfindung wurde ein Stück Filterpapier (E & D) von 10,16 χ 10,16 cm bis zur Sättigung in 20 ml 0,02 m Citrapuffer, pH 5»0, enthaltend Urease (2000 IE/ml)* imprägniert und bei 60 C getrocknet. Das Filterpapier wurde dann mit 20 ml Methanol, enthaltend 0,3 g p-Mtrophenylphosphatnatriumsalz und 3₅O g Harnstof:
oben zerschnitten.

und 3₅O g Harnstoff gesättigt, bei 60°0 getrocknet und wie

(c) Bei dem dritten Prüfmittel wurde das Filterpapier zunächst zur Sättigung mit 0,01 m TRIS-Puffer, pH 8,0, imprägniert und dann bei 60⁰C getrocknet. Die zweite Tauchstufe war die

' IE Urease ist definiert als Anzahl /uMol Ammoniak, die pro min gebildet werden.

909819/0720

gleiche wie oben unter (a) angegeben.

Die so hergestellten Prüfmittel wurden wie in den Beispielen

3 und 4 untersucht. Die Prüfmittel (a) und (c) ergaben keine färbung, während das Prüfmittel (b) gelb wurde.

Es wurde ein Mittel hergestellt durch Lyophilisieren der ureasehaltigen Citratpufferlösung und Vermischen mit einem Träger (nicht imprägnieren). Bei Untersuchung des Prüfmittels durch Zusammenbringen mit einer Testprobe war die auftretende Farbänderung nach gelb identisch mit der bei dem Prüfmittel des Beispiels (5) beobachteten.

Daraus geht hervor, daß nur, wenn der pH-Wert zunächst niedrig ist,um die Hydrolyse zu ermöglichen und dann hoch, um die Farbbildung zu ermöglichen, eine Farbe entsteht, die saure Phosphatase anzeigt.

Beispiele 6 und 7

Prüfmittel zur Untersuchung auf ß-Glucuronidase wurden erfindungsgemäß wie in den folgenden Beispielen angegeben, hergestellt.

6 . Ein riehrphasen-Prüfmittel gemäß der Erfindung wurde für das folgende Reafctionsschema hergestellt:

p-Nitrophenyl-ß-glucuronid ^ ^s ^ p-Mtrophenol

ß-Glucuronidase + Glucuronat

p-Nitrophenol ^ p-Mtrophenolat (gelb).

Ein 10 χ 10 cm großes Stück Filterpapier (Whatman) wurde bis zur Sättigung imprägniert in 20 ml einer Lösung von 60 mg p-Witrophenyl-ß-glucuronid in 20 ml Wasser und 10 min bei 60⁰C getrocknet. Die Stücke wurden dann mit einer einfachen

909819/0720

1A-51 151

Schicht Polyamid-Mikrokapseln (0,177 ois 0,210 mm) überzogen, die hergestellt worden waren durch Verkapseln einer wäßrigen Lösung, enthaltend 13,2 g/dl wäßriges NaOH und Trocknen. Die so hergestellten Stücke wurden in 1 χ 1 cm große Stücke geschnitten.

Die so hergestellten Prüfmittel wurden untersucht durch Eintauchen in 1 ml einer Lösung, enthaltend 4 mg/dl ß-Glucuronidase (0,25 ΙΕ/mg)* in 0,01 m Acetatpuffer, pH 4,8 bei 40⁰C und dann 5 min lang beobachtet, während sie auf einem Heizblock bei 37°G gehalten wurde. Mit Hilfe dieses Prüfmittels kann das Vorhandensein von ß-Glucuronidase leicht nachgewiesen werden, wie aus dem Auftreten einer gelben Farbe hervorgeht.

7 . Ein anderes erfindungsgemäßes Mehrphasen-Prüfmittel wurde wie unter 6 angegeben hergestellt mit der Ausnahme, daß das Papier mit 20 ml einer Lösung, enthaltend 100 mg Phenophthalein-ß-glucuronid in 20 ml destilliertem Wasser imprägniert wurde. Das ist angegeben durch das folgende Reaktionsschema:

Phenolphthalein-ß-glucuronid —^ j $. Pkenolphthalein +

(farblos) ß-Glucuronidase Glucuronat

Phenolphthalein (farblos) ^ Phenolphthalein (rosa)

Mit Hilfe der so hergestellten Prüfmittel war es, wenn sie entsprechend Beispiel 6 untersucht wurden, leicht möglich, das Vorhandensein von ß-Glucuronidase nachzuweisen durch Auftreten einer rosa Farbe.

Beispiel 8

Bestimmte Nachweissysteme, wie solche für Hämoglobin in Urin

ß-Glucuronidase ist definiert durch Umsetzung mit Phenol phthalein-ß-glucuronid.

909819/0720

1A-51 ί51

v/erden leicht durch das Vorhandensein anderer Substanzen, wie Ascorbat, gestört. Wirksame, die Störung entfernende Mittel, wie Ascorbatoxidase, werden jedoch durch die Mittel zum Nachweis von Hämoglobin inaktiviert.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Prüfmittel ist es möglich, daß Ascorbatoxidase das störende Ascorbat in einem ersten Keaktionssystem entfernt, während die das Hämoglobin nachweisenden Reagentien von der Ascorbatoxidase durch Verkapselung ferngehalten werden. Die verzögerte Freisetzung der zum Nachweis von Hämoglobin geeigneten Eeagentien ermöglicht anschließend einermicht-gestörten Nachweis von Hämoglobin in einem zweiten Heaktionssystem. Das wird durch dieses Beispiel verdeutlicht.

Ein 10 χ 10 cm großes Filterpapierstück (E&D) wurde in 20 ml 0,1 m Phosphatpuffer, pH 7₅ enthaltend 2 mg Ascorbatoxidase (500 ΙΕ/mg) eingetaucht und bei 60⁰O getrocknet. Es wurde dann mit 20 ml einer Suspension von Mikrokapseln (37 bis 200 /um) überzogen, die hergestellt worden waren aus Celluloseacetatbutyrat (Product No. 381 - 20 Eastman Chemical Products, Inc. Kingsport, Tenn. 37622), enthaltend 0,35 g Cumolhydroperoxid, 1?35 g· Triäthanolaminborat, 0,08 g l'oluidinhydrochlorid und 0,08 .g 6-Methoxychinolin. Das Papier wurde dann mit doppelseitigem Klebband auf Polystyrolstreifen aufgeklebt.

Diese Streifen färbten sich,-wenn sie in Urin, enthaltend 0,03 mg/dl Hämoglobin und 50 mg/dl Ascorbat getaucht wurden, blau, was das Vorhandensein von Hämoglobin im Urin anzeigt, während Streifen, die die gleichen Bestandteile enthielten, aber wie oben aus einer einzigen homogenen Lösung, die alle Bestandteile enthielt, imprägniert worden waren, kein Hämoglobin anzeigten. Nur wenn die Ascorbatoxidase die Oxidation von Ascorbat zu Dehydroascorbat katalysieren kann vor der Freisetzung der Bestandteile für den Hämoglobinnachweis ist es möglich, Hämoglobin mit dem

309819/0720

1A-51 151

nachzuweisen. Im anderen ü'alle wird, die Ascorbato:-:idfiCG durch die Hachvreisreagentien inaktiviert und der iiaino^iobiimachvreiG wird durch das Vorhandensein von 50 mg/dl AscorbaL unmöglich.

Patentansprüche:

909819/0720

Claims

Ansprüche

'{Λ )\llehrphasen-Prüfmittel zum Nachweis und zur Bestimmung eines Bestandteils in einer Probe, dadurch gekennzeichnet , daß es eine Mehrzahl von Komponenten enthält, die mit mindestens zwei Reaktionssystem verbunden sind, wobei die Reaktionssysteme jeweils unter verschiedenen .Reaktionsbedingungen wirksam sind, mindestens eine der Komponenten auf das Vorhandensein des nachzuweisenden Bestandteils anspricht und mindestens eine andere Komponente imstande ist, bei Berührung mit der Probe unter Reaktionsbedingungen anzusprechen, bei denen ein erstes der Reaktionssysteme wirksam ist zur Änderung der Reaktionsbedingungen nach solchen Bedingungen, unter denen zumindest ein anderes der Reaktionssysteme wirksam ist.

(2) Prüfmittel nach Anspruch 1, dadurch gekenn

zeichnet

daß es mindestens zwei Komponenten enthält, die auf das Vorhandensein des Bestandteils ansprechen.

(3) Prüfmittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet , daß die auf den Bestandteil ansprechende Komponente ein chromogener Indikator ist.

(4) Prüfmittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet , daß die auf den Bestandteil ansprechende Komponente ein spezifischer Bindurigspartner für den nachzuweisenden Bestandteil ist_a

Prüfmittel nach Anspruch 1 bis 4·, dadurch gekennzeichnet , daß mindestens eine der Komponenten, die zur Änderung der Reaktionsbedingungen wirksam ist, imstande

909819/0720

ORIGINAL

1Δ-51 151 - 2 -

ist, den pH-Wert eines ersten Reaktionssystems zu verändern unter Bildung von Reaktionsbedingungen, unter denen zumindest ein anderes Reaktionssystem wirksam ist.

(6) Prüfmittel nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß mindestens eine Komponente, die zur Änderung der Reaktionsbedingungen wirksam ist, imstande ist, eine Substanz zu inaktivieren, die die auf den Bestandteil ansprechende Komponente stört.

(7) Prüfmittel nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß mindestens eine der Komponenten in einem ersten Reaktionssystem unter ersten Reaktionsbedingungen auf das Vorhandensein des Bestandteils anspricht und mindestens eine andere Komponente nach Berührung mit der Probe wirksam ist zur Einstellung von zweiten Reaktionsbedingungen, unter denen ein zweites Reaktionssystem wirksam ist.

(ü) Prüfmittel nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß mindestens eine der Komponenten, die zur Änderung der Reaktionsbedingungen v/irksam ist, eingekapselt ist, so daß sie bei Berührung mit der Probe freigesetzt werden kann iind nach der Freisetzung imstande ist, die zweiten Reaktionsbedingungen einzustellen.

Prüfmittel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß die Kapseln osmotisch empfindlich

Prüfmittel nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß mindestens eine Komponente, die wirksam ist zur Änderung der Reaktionsbedingungen, mindestens zwei Komponenten umfaßt, die miteinander nach Berührung mit der Probe unter Bildung der zweiten Reaktionsbedingungen _?

909819/0720

1A-51 151

unter denen ein zweites Reaktionssystem wirksam ist, reagieren.

(11) Prüfmittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß die miteinander reagierenden Komponenten spezifische Bindungspartner sind.

(12) Prüfmittel nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet , daß die spezifischen Bindungspartner ein Enzym und dessen Substrat sind.

(13) Prüfmittel nach Anspruch 1 bis 12, dadurch g e k e η η zeichnet , daß mindestens eine der auf den Bestandteil ansprechenden Komponenten auf das Vorhandensein eines Bestandteils in einem zweiten oder späteren Reaktionssystem anspricht und mindestens eine der Komponenten imstande ist, in dem ersten Reaktionssystem eine bubstanz der Probe zu inaktivieren, die die auf den Bestandteil ansprechende Komponente stört.

(14) Prüfmittel nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , daß die auf den Bestandteil ansprechende Komponente (in einer Kapsel) eingekapselt ist und nach Reaktion der die störende Komponente inaktivierenden Komponente freigesetzt wird.

(15) Prüfmittel nach Anspruch 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet , daß es zusätzlich einen Träger umfaßt.

62XXIV

909819/0720