DE3132798A1 - Verfahren und vorrichtung zur bestimmung von bilirubin - Google Patents

Description

GRÜNECKER, KINKELDEY, STOCfeOVIAlR & RATtT^EFi..°

PATENTANWÄLTE

EUROPEAN RKrENTATTORNEVS:

A. GRÜNECKER. DH=UiNa DR. H-.KINKELOEY, oi=i_hng. DR. W. STOCKMAIR. ι DR. K. SCHUMANN.

OR. G. BE2OLD, ι

W. MEISTER. OPLIN8. H.HILGERS,af=LiNa DR. H. MEYER-PLATH. QPL.-«ga

80OO MÜNCHEN 22 MAXIMIUANSTRASSE 43

FUJI PHOTO PIIM CO., IffiD.

ITo. 210, Nakanuma, P 16 578

Minami Ashigara-shi, 19. August 1981

Kanagawa, Japan

Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung
von Bilirubin

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung der Bilirubinmenge, die in einer wäßrigen Flüssigkeitsprobe,- insbesondere der Körperflüssigkeit von lebenden Organismen,- enthalten ist.

Bilirubin ist das Stoffwechselprodukt von Hämoglobin, das ein Sauerstoffträger im Blut ist; Die Bestimmung der Bilirubinmenge in einer Körperflüssigkeit, insbesondere im Blut,- ist wichtig für den Nachweis bzwi die Bestimmung der Hämolyse und für die Prüfung der Leber funkt ion · Ein Symptom für überschüssiges Bilirubin im Blut ist die Gelbsucht; Die Bestimmung des Bilirubingehaltes im Blut ist ein wichtiger Punkt der klinischen chemischen Überprüfung und die

TELEFON(O89) 2228 02 TELEXOS-39380 TOS3RAMME: MONAPAT"

Diazotierung ist das gebräuchlichste Bestinanungsverfahrens Bei dem Diazotierungsverfahren wird das Bilirubin mit einem Diazoniumsalze wie ZaBi Diazosulfanilsäure, gekuppelt

und die Menge des dabei erhaltenen Farbstoffes wird in ei-5

nem Spektrophotometer bestimmt, um den Bilirubingehalt zu

ermitteln (abzuschätzen)„ Einzelheiten des Diazotierungs-Verfahrens werden von JiB. Landis und HiLi Pardue in "Clinical Chemistry",- 24 (10), 1690-1699 (1978)/ beschriebene 10

Bilirubin ist ein gelber Farbstoff, der selbst ein Absorptionsmaxiinura bei 435 nm oder 465 nm und einen molekularen

4 Absorptionskoeffizienten von etwa 5 χ 10 ^C33^36°6^£ k^· In Krankenhäusern und anderen medizinischen Einrichtungen ist es üblich, den Bilirubingehalt durch direkte Colorimetrie zu bestimmen, wobei eine Probe von Blutserum in eine Kapillare oder Küvette eingeführt und ihre Farbdichte di- .

rekt abgelesen wird. Dieses direkte colorimetrische Verfahren, bei dem die Absorptionseigenscbaf ten von Bilirubin ausgenutzt werden, ist in mehreren Publikationen/ beispielsweise in der US-Patentschrift 3 569 721/ beschrieben;

__ Das Verfahren wird mit Vorteil zur Diagnose der Gelbsucht

bei Kindern angewendet, weil es dabei nicht erforderlich ist/ einen vorher ermittelten Korrekturwert von dem gemessenen Wert abzuziehen/ der im Falle von Proben von Erwachsenenserum durch andere gelbe Farbstoffe als Bilirubin 30

verfälscht wirdi

Bei einem bekannten Verfahren wird der Bilirubingehalt bestimmt durch überprüfung der Dichte einer grünen Färbung/ die entsteht/ wenn Bilirubin mit einem Oxidationsmittel zu Biliverdin oxidiert wird, wobei man genau weiß/ in welchem Verhältnis diese Dichte zu dem Bilirubingehalt stehti Die-

ses Verfahren wird als Oxidationsverfahren bezeichnet und ist in verschiedenen Publikationen, beispielsweise in den US-Patentschriften 3 348 920 und 3 607 093,* beschrieben; Das Verfahren eignet sich für die Verwendung zur qualitativen Überprüfung,¹ es wurde aber auch bereits eine Abänderung vorgeschlagen,' die für die halbquantitative Bestimmung geeignet ist. Das Oxidationsverfahren wird nun, unabhängig davon,- ob es für die qualitative oder halbquantitative Bestimmung geeignet ist,¹ zur qualitativen Urinprüfung angewendet,¹ die erforderlich ist für die Diagnose der Hochkonjugations-Bilirubinämie. Bezüglich Einzelheiten dieser Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Biliru-

bin vergleiche "".Binsho Kagaku Bunseki (Analysis in Clinical Chemistry)", herausgegeben von Masayuki Saito, II,·· Seiten 248 bis 279; Da bei allen diesen Verfahren eine Reaktion in Lösung durchgeführt wird,- werden sie allgemein als "Lösungsverfahren'¹ bezeichnet.

Vor kurzem sind verschiedene Trockenverfahren zur Bestimmung der Bilirubinkonzentration vorgeschlagen worden; Bei einem solchen Verfahren wird eine Absorptionsmittel-Unterlage,' wie z;B; Filterpapier,- mit einem stabilisierten Diazoniumsalz imprägniert und nach dem Trocknen wird eine Serumprobe auf das Testpapier aufgetropft,- um die Menge der Farbbildung zu bestimmen; Die Bestimmung des Bilirubingehaltes nach diesem Verfahren wird beispielsweise in den japanischen Patentanmeldungen (OPI) Nr; 60 591/74 und 99 091/74 beschrieben (die hier verwendete Abkürzung ¹¹OPl"

steht für eine ungeprüfte publizierte japanische Patentan-35

meldung); Da jedoch der Bilirubingehalt in dem Blutserum eines gesunden Patienten sehr gering ist, d;h; weniger als 1 mg/dl beträgt,- war es bisher schwierig,' die Bilirubin-

ο ο β 0

konzentration unter Verwendung einer Papier-Testvorrichtung genau zu bestimmen;

Dieses Verfahren erlaubt jedoch eine schnelle und einfache Bestimmung des Bilirubingehaltes. Deshalb wird es allgemein angewendet als halbquantitatives Verfahren für eine erste grobe Bestimmung in Notfällen oder bei Reihenuntersuchungen sowie für die Eingruppierung von Verdachtsfälr

In der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 89 796/78 (die der US-Patentschrift 4 069 017 entspricht) ist ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Bilirubin mit einem Mehrschichtenfilm für die chemische Analyse beschrie· ben. Bei diesem Verfahren werden Methoden zum Beizen von Bilirubin mit einer Beizzusammensetzung und zum Verschieben der Absorptionswellenlänge und zur Erhöhung des molekularen Absorptionskoeffizienten um mindestens 50 % angewendet; Andere Methoden eignen sich für die Eliminierung von Störungen durch andere Substanzen als Bilirubin und diese Methoden werden mit \ . Methoden zur Bildung einer einheitlichen Schicht aus dem Reagens auf einem Film kombiniert; Dadurch ist es möglich,' eine Probenlösung durch eine Verteilungsschicht gleichmäßig zu verteilen und auf diese Weise wird mit diesem Verfahren eine hohe Genauigkeit und Empfindlichkeit der Analyse erzielt^ wie sie bisher mit der vorstehend beschriebenen Papier-Testvorrichtung nicht erreichbar waren;

Versuche, eine schnelle und einfache Bestimmung zu ermöglichen unter gleichzeitiger Erzielung einer hohen Genauigkeit und Empfindlichkeit sind auch in den japanischen Pa-

tentanmeldungen (OPl) Nr. 89 797/78 (entsprechend der US-Patentschrift 4 069 016) und 24 694/80 (entsprechend der, US-Patentschrift 4 204 839) beschrieben; Bei dem in der japanischen Patentanmeldung (OPl) Nr; 89 797/78 beschriebenen Verfahren wird die Fähigkeit von Bilirubin ausgenutzt,-an Albumin oder dgl; festgebunden zu werden; Nach der Theorie dieses Verfahrens wird auf einem hydrophilen

Bindemittel ein Komplex aus einem Farbstoff und Albumin 10

gebildet,- das Molekül des Farbstoffes wird durch freies Bilirubin in einer Probenlösung ersetzt und der freigesetzte Farbstoff wird durch Spektrometrie gemessen;

Bei dem in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr; 24 694/80 beschriebenen Verfahren wird das durch ein Material ähnlich dem in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 89 796/78 beschriebenen gebeizte Bilirubin nachgewiesen (bestimmt); Es wird jedoch die Intensität der durch Bilirubin bei der Bestrahlung mit Anregungslicht erzeugten Fluoreszenz gemessen anstelle der Farbdichte im Bereich seiner Absorptionswellenlänge. Bei den in den japanischen Patentanmeldungen (OPI) Nr; 89 796/78 und 24 694/80 beschriebenen Verfahren ist das Beizen eines in Reaktion tretenden Polymerbeizmitteis für Bilirubin wesenfe· lieh; Ein Problem bei der Anwendung des Polymerbeizmittels

Q₀ besteht darin/ daß seine Beizwirkung leicht verloren geht,¹ da das aktive Zentrum (das quaternäre Ir) dazu neigt, mit einer Säure,- einem Aktivator oder einem neutralen Salz während des Aufbringens einer Beschichtungslösung und der Bildung anderer Schichten auf der Beizmittelschicht neu-⁶

tralisiert zu werden; Um dieses Problem zu lösen,- müssen Aceton,- Alkohol und andere organische Lösungsmittel als Lösungsmittel für die Beschichtungslösung des PolymerbeizmitW

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tels verwendet werden. Außerdem muß die Verwendung eines, anionischen Aktivators, einer Säure oder eines dissoziierenden Salzes bei der Herstellung einer Strahlungsab» schirmungsschicht oder anderer funktioneller Schichten auf der Beizmittelschicht vermieden werden; Das Aufbringen einer Bilirubin enthaltenden Probenlösung auf einen Mehr« schichtenfilm für die chemische Analyse mit dem Polymer« beizmittel führt ebenfalls zu Schwierigkeiten» Da die Pro» benlösung nicht nur Bilirubin/ sondern auch viele andere Substanzen enthält, die gebeizt werden können/ tritt eine Konkurrenz zwischen Bilirubin und diesen Substanzen in bezug auf die Adsorption an dem Beizmittel auf/ die häufig 15

zu einem geringen Adsorptionsvermögen und zu einem falschen photometrischen Wert führt; Ein anderer Nachteil besteht darin/ daß die bekannten Mehrschichtenfilme für die chemische Analyse nicht geeignet sind für die Verwendung

mit Gesamtblut/ so daß das Serum von einer Gesaratblutprobe abgetrennt werden muß., bevor es analysiert wird.

In der japanischen Patentpublikation 28 119/78 (entsprechend der deutschen Offenlegungsschrift 22 40 357) ist ein Verfahren zur Herstellung eines Testpapiers zum Nachweis bzw; zur Bestimmung von Bilirubin in der Körperflüssigkeit beschrieben; Das Verfahren beruht darauf/ daß durdi die Zugabe eines Phosphatdiesters sowie eines Diazonium« salzes die Geschwindigkeit der Farbbildungsreaktion merklich beschleunigt wird als Folge der Bindung des Diazoniumsalze s an Bilirubin;

Das genaueste Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Bilirubin/ das bereits seit vielen Jahren angewendet wird,-beruht auf der colorimetrischen Analyse von isoliertem Bi«

lirubin,- das mit einem hydrophoben organischen Lösungsmittel, wie Chloroform,· Benzol,- Schwefelkohlenstoff und Chlorbenzol,¹ aus einer wäßrigen Lösung extrahiert worden ist; Bei diesem. Verfahren wird die Eigenschaft dieser organischen Lösungsmittel ausgenutzt, Bilirubin in ausreichendem Maße zu lösen,- so daß es nach dem. Mischen mit der Probe und dem Stehenlassen . von einer wäßrigen Flüssigkeit sprobe,- bei der eine Schichtentrennüng auftritt,¹ leicht abgetrennt werden kann; Im Hinblick auf den ständigen Bedarf nach einem schnellen und einfachen Verfahren zur Blutanalyse,¹ das ein;... Minimum an Blutprobe erfordert und dennoch genaue Meßwerte liefert,- ist jedoch das Ver-

fahren, das auf der direkten Extraktion von Bilirubin aus einer wäßrigen Lösung beruht und eine ziemlich große Menge der Probe erfordert,¹ nicht sehr empfehlenswert;

Es wurden nun verschiedene Anstrengungen unternommen,- ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Bilirubin zu entwickeln,¹ das den vorstehend beschriebenen praktischen Anforderungen der klinischen Prüfung genügt; Dabei wurden nun erfindungs gemäß ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Nachweis bzw; zur Bestimmung von Bilirubin in einer Körper flüssigkeit (beispielsweise im Blut oder im Serum) gefunden; .

Gegenstand der Erfindung ist insbesondere ein Verfahren zum Nachweis bzw; zur Bestimmung von Bilirubin,' das darin besteht,¹ daß Bilirubin aus einer Probenlösung extrahiert wird,- indem man diese mit einer hydrophoben Extraktions*·

lösungsmittelzusammensetzung in Kontakt bringt, die mindestens ein öllösliches Amin enthält; Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Vorrichtung zur Durchführung die-

no« ο * 9 »φ «a *-«

ses Verfahrens« Die vorliegende Erfindung beruht darauf, daß gefunden wurde,- daß eine Zusammensetzung,- die ein bestimmtes öllösliches Amin enthält,- in der Lage ist,' das Bilirubin aus einer wäßrigen Lösung auf sehr wirksame Weise zu extrahiereni

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert· Dabei zeigen:

Fig; 1 eine Querschnittsansicht der 1-Schicht-Ausführungsform der vorliegenden Erfindung,' die eine

Schicht zeigt,¹ die eine hydrophobe,' Bilirubin ex-15

trahierende Zusammensetzung enthalt;

Figi 2 eine Querschnittsansicht einer . 2 .-Schichten-

Ausführungsform der Erfindung; .

Figi 3 eine Querschnittsansicht einer ' 3-Schichten-Ausführungsform der Erfindung;

Figi 4 eine Querschnittsansiiht eines 4-Schichten-Ausführungsform der Erfindung; und

Figi 5 eine Querschnittsansicht einer 5-Schichten-

Ausführungsform der Erfindungi

Die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete Vorrichtung wird nachstehend näher beschrieben; Die quantitative Bestimmung von Bilirubin in einer Körperflüssigkeit ist sehr wichtig bei der klinischen Prüfung und sie wird während der chemischen Analyse von Blut ziemlich häufig durchgeführt* Das Prinzip des erfindungsgemäs-

sen Verfahrens besteht darin,- das Bilirubin aus einer Probenlösung mit einer hydrophoben Zusammensetzung zu extrahieren,' die ein öllösliches Amin enthält; Das Verfahren kann mit bekannten Methoden kombiniert werden; So kann beispielsweise eine Bilirubin enthaltende Probenlösung mit der erfindungsgemäß verwendeten Zusammensetzung gemischt werden; Nachdem die Mischung eine bestimmte Zeitspanne stehengelassen worden ist,- so daß das Bilirubin auf wirksame Weise in die Zusammensetzung überführt worden ist,¹ wird der Gehalt unter Anwendung eines bekannten Verfahrens zur quantitativen Bestimmung von Bilirubin, beispielsweise durch direkte Colorimetrie,¹ Diazotierung,' Oxidation oder Fluorometrie,¹ bestimmt; Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren mit der direkten Colorimetrie kombiniert;

Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Bestimmung von Bilirubin ist am wirksamsten,- wenn sie in Form einer integralen Mehrschichtenfolie verwendet wird; Wie in den vorstehend angezogenen Publikationen beschrieben,' gehört zu .

den integralen Mehr schichten-Vorrichtungen für die chemische Analyse eine neue trockene analytische Vorrichtung/ die in der Lage ist,- die Konzentration der gewünschten Substanz in der Körperflüssigkeit durch einfaches Auftüp«

fein einer sehr geringen Menge einer Probe der Körperflüssigkeit (in der Regel 5 bis 20 jxl) auf die Oberfläche der analytischen Vorrichtung zu bestimmen; Spezifische Beispiele für solche integralen Mehrschichten-Vorrichtungen für die Bestimmung (Analyse) von Bilirubin sind in den japanischen Patentanmeldungen (OPI) Nr ;· 89 796/78,' 89 797/78 und 246 943/78 sowie in anderen Patentschriften beschrie-

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.
ben;

Eine spezifische Ausführungsform der erfindungsgemäßen 5

Vorrichtung zur Bestimmung (Analyse) von Bilirubin ist in der Fig; 3 der beiliegenden Zeichnungen schematisch dargestellt; Die Vorrichtung besteht aus einem lichtdurchlässigen,' für Wasser undurchlässigen Träger 13/ auf dem sich ei»

ne Extraktions schicht 23 befindet,' in der eine hydrophobe Extraktionslösungsmittel-Zusammensetzung,¹ die ein öllösliches hydrophobes Amin enthält/ in einem hydrophilen Bindemittel dispergiert ist; Auf der Extraktionsschicht ist eine Verteilungsschicht 6.3 angeordnet,' die mit einem BiIirubin-Dissoziationsmittel aus konjugxertem Protein imprägniert ist. Bei dieser integralen Mehrschichten-Vorrichtung wird dann,- wenn eine Probe einer Bilirubin enthaltenden wäßrigen Lösung auf die Vorrichtung aufgeträufelt wird, die Lösung in der Weise gleichmäßig verteilt,¹ daß eine im wesentlichen kmstante Menge in die Verteilungsschicht eindringt und sich in Richtung auf die darunterliegende Ex-

_nrr traktionsschicht bewegt; Gleichzeitig wirüdas Dissozia-

tionsmittel auf die Lösung unter Bildung von diffusionsfähigem Bilirubin in freier Form;' Wenn die ProbenBsung in die Extraktionsschicht gelangt/ wird das nachzuweisende

bzw; zu bestimmende Bilirubin mit der ein öllösliches hy-30

drophobes Amin enthaltenden hydrophoben Extraktionslösungsmittelzusammensetzung extrahiert und konzentriert; Nach der Inkubation, für einen gegebenen Zeitraum unter gegebenen Bedingungen wird die in der Extrakt ions schicht konzentrierte Bilirubinmenge mit reflektiertem oder transmittiertem Licht photometrisch bestimmt; Der Bilirubingehalt der Probenlösung kann aus der Eichkurve ermittelt

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werden, die unter Verwendung einer Probe einer bekannten Bilirubinkonzentration aufgestellt worden ist; Die Komponenten der zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendeten Vorrichtung werden nachfolgend näher beschrieben; Bei der Bilirubin-Extraktionszusammensetzung/ die erfindungsgemäß verwendet wird,¹ handelt es sich um eine hydrophobe flüssige Zusammensetzung/ die ein primäres, sekundäres oder tertiäres Amin enthält; Die Zusammensetzung ist "hydrophob" bis zu einem solchen Grade,- daß sie mindestens eine Emulsion bilden kann/ wenn sie in neutralem Wasser dispergiert wird; Der hier verwendete Ausdruck

"hydrophob" bedeutet nicht/ daß die Zusammensetzung in 15

Wasser nicht löslich ist; Die Zusammensetzung ist bei der Inkubatiohstemperatur "flüssig"; Die Inkubationstemperatur variiert in Abhängigkeit von dem Aufbau der analytischen Vorrichtung und sie liegt in der Regel zwischen etwa 10 und etwa 50°C,- wobei der üblicherweise angewendete Bereich bei etwa 25 bis etwa 40⁰C liegt;

Bei dem in der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwendeten hydrophoben organischen Amin kann es sich um ein primäres/ sekun-däres oder tertiäres Amin handeln und es kann ein substituiertes oder unsubstituiertes Kettenalkyl- oder Alkenylamin/ aromatisches oder alicyclisches Alky larain: oder ein substituiertes oder unsubstituiertes cyclisches Amin oder ein substituiertes heterocyclische Amin sein;' Zu Beispielen für geeignete hydrophobe Amine gehören primäre Amine, ttie Heptylamin,- Octylamin und Nonylaminj sekundäre __ Amine/ wie Dicyclohexylamin,- Benzylmethylamin und (tri-

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alkylmethyl)-langkettige sekundäre Amine (z;B;^r Lauryl-(tributylmethyl)amin und Dodecenyl(tributylmethyl)amin; und tertiäre Amine/ wie p-Methyl-N/N-diäthylanilin/ Ben-

zyldimethylamin,· N-Phenylmorpholin, Dioctylmethylamin und Trioctylamin; Laurylamin, Tribenzylamin, Heptadecylamin, Bis[p(dimethylamine))phenyl]methan und andere Amine,-die bei Raumtemperatur fest sind,¹ können erfindungsgemäß ebenfalls verwendet werden,¹ wenn sie in einem hydrophoben Öl gelöst sind,' das als Extraktionshilfsmittel dient;

Diese Amine werden mit einem Extraktionshilfsmittel,' bei dem es sich um ein stabiles, hydrophobes,- hochsiedendes organisches oder anorganisches flüssiges Material handelt,' gemischt oder darin gelöst; Zu Beispielen für Extraktionshilfsmittel,' die mit Erfolg erfindungsgemäß verwendet wer-

den können,' gehören ein Phthalsäurederivate wie Dibutylphthalat oder DioctyIphthalatj eine organische Phosphorverbindung,^ wie Triphenylphosphat,' Tricyclohexylphosphat,' Triocty!phosphat oder Tributoxyäthylphosphinoxidj ein Adi-

pat,¹ wie Dibutyladipat; chloriertes oder alkylsubstituier-

tes Diphenyl oder Triphenyl oder alkylsubstituiertes Diphenyläthan; und ein Alkylamid,' wie z;B; N,N4)imethyllaurylamid,-Ν,'Ν-Diäthyllaurylamid oder N,'N-Dimethylnonylamid; 25

Die meisten dieser als Extraktionshilfsmittel verwendeten Öle weisen eine sehr geringe Löslichkeit in Bilirubin auf; Sie sind jedoch wirksam in bezug auf die Verbesserung des Extraktionsvermögens der Amine,' mit denen sie gemischt wenden; Alky!amide und organische Phosphorverbindungen können mit Erfolg bei der praktischen Durchführung der Erfindung eingesetzt werden; Es wurde gefunden,' daß dann,¹ wenn sie

O₅ mit dem hydrophoben Amin gemischt werden,' sie nicht nur eine gute Extraktionszusammensetzung ergeben,' sondern einen "synergistischen Effekt" aufweisen; Zu besonders wirksamen Alkylamiden gehören N,N-Dimethyllaurylamid,' N,-N-Di-

äthyllaurylamid und N,<N-Dimethylnonylamid; Organische Phosphorverbindungen, wie Tricyclohexylphosphat/ Trioctylphosphat und TributoxyäthylphosphinoxidjSind ebenfalls Extraktionshilfsmittel,die einen synergistischen Effekt auS· weisen; Eine Kombination aus einem organischen Amin und einem Extraktionshilfsmittel,· die eine besonders wirksame Extraktion ergibt,^ ist eine Zusammensetzung,- die ein (trialkyimethyl)langkettiges sekundäres Amin enthält/ und erläuternde Beispiele dafür sind die Kombination aus Dodecenyl( tr ibu ty !methyl) amin und Dimethyllaurylamid und diejenige aus Laury](tributylmethyl)amin und Diäthyllauryl-

amidi^: Ein spezifisches Beispiel für den synergistischen 15

Effekt wird nachstehend angegeben; Ν,'Ν-Diäthylkurylamid ist eine flüssige Substanz,¹ die eine geringe Fähigkeithat, Bilirubin aus einem Bilirubin enthaltenden Blutserum zu extrahierend Eine hydrophobe Extraktionslösungsmittelzusammensetzung,¹ in der das Amid mit Dodecenyl(tributylmethyl)amin in einem Volumenverhältnis von 1:1 gemischt ist,¹ ist jedoch in der Lage,¹ Bilirubin in einer.Menge zu extrahieren, die mindestens dem Doppelten der von dem Amin allein extrahierten Menge entspricht;

Bei einer spezifischen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein bekanntes Bilirubin-Nachweis- bzw·' -Bestimmungsreagens in die vorstehend beschriebene hydrophobe Extraktionslösungsmittelzusammensetzung eingearbeitet und die Menge des Reaktionsprodukts des extrahierten Bilirubins mit dem Reagens wird durch Colorime-

__ trie oder unter Anwendung anderer geeigneter Verfahren be-

stimmt; Zu Beispielen für geeignete Bilirubinnachweis- bzw;" -Bestimmungsreagentien gehören eine Diazoniumverbin-

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dung,- ein halogeniertes (oder Alkoxy)benzoldiazoniumsalz und ein langkettiges äLkoxycarbonyl-substituiertes Benzoldiazoniumsalz,¹ das bei der Reaktion mit Bilirubin einen Farbstoff bildet; Für die erfindungsgemäße Verwendung besonders wirksam sind in Öl gut lösliche Diazoniumsalze,¹ wie 2-Chlor-5-hexadecyloxycarbonylbenzoldiazonium und 2-Methoxy-5-tetradecyloxycarbonylbenzo!diazonium;

Die in der erfindungsgemäßen Testvorrichtung verwendete hydrophobe Extraktionslösungsmittelzusammensetzung kann gegebenenfalls einen pH-Wert-Indikator,- ein Reagens,- eine

Säure,¹ ein Alkali, ein Salz oder ein Polymeres enthalten· 15

Ein öliges Produkt wird hergestellt durch Auflösen des öllöslichen Amins in einer Lösung,¹ die ein in einem organischen Lösungsmittel lösliches Polymeres,^ gelöst in einem mit Wasser im wesentlichen nicht mischbaren organisehen Lösungsmittel,¹ enthält; Zu Beispielen für solche Polymere gehören Cellulosediacetat,' Cellulosetriacetat,¹ Celluloseacetatpropionat,¹ Äthylcellulose,¹ Me thy !methacrylate Polystyrol und Bisphenol A-Polycarbonati

. ·

In der integralen Mehrschichten-Vorrichtung zur chemischen Analyse sind mikrofeine Teilchen der erfindungsgeäß verwendeten hydrophoben Extraktionslösungsmittelzusammensetzung in einem hydrophilen Bindemittel dispergierti Die Größe der mikrofeinen Teilchen liegt innerhalb des Bereiches von etwa 0,¹Ol bis etwa 20 m,¹ vorzugsweise von etwa 0,¹I bis etwa 10 pn;' Die hydrophoben mikrofeinen Teilchen sind deiart,¹ ^ daß der größere Teil der Komponenten der Zusammensetzung in den einzelnen Teilchen enthalten ist,' die für Wasser undurchlässig sind;

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Die hydrophilen Bindemittel, die in der Extraktionsschicht verwendet werden, welche die hydrophobe Extraktionslösungsraittelzusammensetzung enthält,¹ sind wasserlösliche polymere Substanzen,¹ wie z;B; wasserlösliches Protein (wie Gelatine,¹ Albumin und Kollagen),' Pflanzengummi (wie Agar,¹ Natriumalginat und Agar ο se) und synthetische Polymere,¹ wie Olefine,· MaleinsäureanhydridcopoIymere,' Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon,- Polyacrylamid und Poly(natriuravinylbenzolsulfonat); Diese Substanzen können einen Film bilden, der Körnchen aus der hydrophoben Extraktionslösungsmittelzusammensetzung darin enthält und nach dem Trocknen wird er für eine Bilirubin ent-

haltende wäßrige Probenlösung gut durchlässig*¹ Es ist klar,' daß das hydrophile Bindemittel einen pH-Wert-Indikator und andere Reagentien für verschiedene Zwecke enthalten kann;

Die Vertei lungs schicht in der integralen Mehr Schichten-Vorrichtung für die chemische Analyse kann aus einem nicht-faserigen isotropen porösen Material des in den oben angezogenen Publikationen beschriebenen Typs hergestellt sein; Alternativ kann sie aus einem hydrophilen Gewebe hergestellt werden;" Zu Beispielen für das nicht-faserige isotrope poröse Material gehören ein Bürstenpolymere:s (auch als Membranfilter bezeichnet),- ein Material mit einer mikroporösen Substanz,¹ wie Diatomeenerde,¹ oder eine mikrokristalline Substanz/(wie mikrokristalline Cellulose),^ die in einem Bindemittel gleichmäßig dispergiert ist} ein poröses Material,¹ in dem Mikroperlen aus Glas oder einer synthetischen polymeren Substanz, die in punktförmigem

Kontakt zueinander angeordnet sind,- in einem Bindemittel festgehalten werdenj und ein Bürstenpolymeres mit .-.'..·.-"

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raikrofeinen Teilchen aus Verbindungen,¹ wie TiO₂ und BaSO die darin gleichmäßig dispergiert sind; Zu Beispielen für hydrophile Gewebe gehören ein Gewebe,' das mit Wasser gründlich gewaschen, entfettet und getrocknet worden ist,- und ein Gewebe,' das mit Wasser gewaschen/ entfettet und mit einer geringen Menge eines oberflächenaktiven Mittels,-eines Schmiermittels (Gleitmittels) oder eines hydrophilen Polymeren imprägniert worden ist,' das gegebenenfalls feine Teilchen aus TiO₂ oder BaSO, enthält; Bezüglich Einzelheiten des Verfahrens/ in dem das hydrophile Bindemittel für die Verteilungsschicht verwendet wird,- und für das Gewebe selbst vergleiche die japanische Patentanmel-

dung Nr; 72 047/79 (entsprechend der britischen Patentschrift' 2 052 057 A); Das hydrophile Gewebe kann erfindungsgemäß entsprechend den Lehren dieser Patentschrift angewendet werden;
-

Wenn die Verteilungsschicht aus einem nicht-faserigen,¹ isotropen porösen Material besteht,- liegt ihre Dicke im allgemeinen innerhalb des Bereiches von etwa 50 bis etwa 500 «mg¹ vorzugsweise von etwa 80 bis etwa 300 um;' Wenn die Schicht aus einem hydrophilen Gewebe besteht,- liegt ihre Dicke im allgemeinen innerhalb des Bereiches von etwa 80 um bis etwa 1 mm,¹ vorzugsweise von etwa 100 bis etwa 400 tun,¹ ausgedrückt durch die Dicke eines hydrophilen Gewebes,¹ das unter natürlichen Bedingungen getrocknet worden ist;

Eine Vertei lungs schicht aus einem nicht- fas er igen ,-■ iso-35

tropen porösen Material kann auf der Schicht aus einem Reagens erzeugt werden unter Anwendung eines Verfahrens,¹ wie es beispielsweise in den japanischen Patentanmeldun-

gen (OPI) Nr. 53 888/74 (entsprechend der US-Patentschrift 3 992 158) und 137 192/75 (entsprechend der US-Patentschrift 3 977 568) beschrieben ist; Bei diesem Verfahren wird eine Lösung oder Dispersion, die ein nicht-faseriges,-isotropes poröses Material bilden kann, auf der Schicht aus dem Reagens verteilt (ausgebreitet) und getrocknet oder es wird eine dünne Schicht aus dem nicht-faser igen,-isotropen porösen Material mit der Reagensschicht verbunden. Eine Verteilungs schicht aus einem hydrophilen Gewebe kann aμf der Reagens schicht hergestellt werden durch Binden des Gewebes an die Reagensschicht; Die Verteilungsschicht kann je nach Bedarf verschiedene Reagentien ent-

"

halten; Zu besonders wichtigen Reagentien für die praktische Durchführung der Erfindung gehören ein Bilirubin-Dissoziationsagens, ein oberflächenaktives Mittel, ein

pH-Wertmodifizierungsmittel und ein Oxidationsmittel; 20

Es gibt zwei Typen von Bilirubin, das direkte Bilirubin und das indirekte Bilirubin, in der Körperflüssigkeit; Beide Typen sind an Albumin, ein proteinhaltiges bzw; proteinartiges Material gebunden und sie diffundieren daher sehr langsam durch einen Film aus einem hydrophilen Bindemittel; Die Diffusion und das Eindringen von Bilirubin sind jedoch wesentlich bei der integralen Mehrschichtenvorrichtung zur chemischen Bestimmung (Analyse) von Bilirubin; Wenn ein Bilirubin enthaltendes Bezugsserum auf eine unbehandelte Verteilungsschicht aufgeträufelt wird, wird das Bilirubin, das zum größten Teil nicht-diffusionsfähig ist, überhaupt nicht in die Extraktions schicht ex-

. trahiert; Dieses Problem wird gelöst durch Einarbeiten eines Dissoziationsagens in die Verteilungs schicht, welche die Bindung zwischen Bilirubin und Albumin trennt unter

Bildung von Bilirubin in freier Form* Es sind viele Verbindungen bekannt, die derartige Bilirubin-Dissoziations·» agentien darstellen, und es wurde gefunden, daß bei der praktischenDurchführung der Erfindung Coffeinnatriumben« zoat, Dipherin und ein oberflächenaktives Mittel wirksam sindi Coffeinnatriumbenzoat wurde lange als Bilirubin-Dissoziationsagens verwendet und es ist für die Durchfuhr rung der vorliegenden Erfindung besonders wirksami Seine Dissoziationswirkung wird in Gegenwart von Natriumacetat oder EDTA noch weiter verbessert. Oberflächenaktive Mittel^ die für die praictische Durchführung der Erfindung wirksam

sind,- sind Octylphenoxypolyäthoxyäthanol,- Ic tenon A und Bi 15

Diese Dissoziationsagentien sind zweckmäßig in der Vertei lungs schicht enthalteni Es kann aber auch unter der Verteilungsschicht eine Schicht aus Dissoziationsagentien

.

gebildet werdeni Ein höherer Dissoziationseffekt wird häufig erzielt durch Einarbeiten des Dissoziationsagens in andere Schichten, beispielsweise eine Strahlungsabschirmungsschicht, eineLichtreflexionsschicht, eine Schicht zur Verhinderung der Hämoglobindiffusion oder eine Klebstoff schicht,- die bei Bedarf vorgesehen sindi Die Vertei» lungsschicht muß eine ausreichende Menge des Dissoziations« agens enthalten, um das gesamte Bilirubin in der Probenlösung, vollständig zu dissoziiereni Eine große Menge Feststoff, wie ZiBi Dissoziationsagens,- die in der Verteilungsschicht enthalten ast, verstopft die Poren in der Verteilungsschicht und als Folge davon wird die freie Verteilung der Probenlösung in der Verteilungsschicht gehemmt, bzwi verhinderti Die Imprägnierung mit dem Dissoziationsagens führt zu einer beträchtlichen Änderung der Affinität der Oberfläche der Verteilungsschicht gegenüber WasseriAls

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Folge dieser Veränderung wird die freie Verteilung und das Eindringen der Probenlösung gehemmt bzw; verhindert· So erlaubt beispielsweise eine Verteilungsschicht aus einer nicht-faserigen porösen Membran (beispielsweise dem Fuji Microfilter FM-500 der Fuji Photo Film Co;, Ltd;) die normale freie Verteilung einer Probenlösung; Wenn sie j edoch mit etwa 5 g/m eines Dissoziationsagens (d;h; Goffeinnatriumbenzoat) imprägniert ist,¹ wird die Verteilung der Probenlösung in einem solchen Ausmaße gehemmt bzw; verhindert, daß eine quantitative Bestimmung der gewünschten Substanz unmöglich wird. Außerdem ist die Imprägnierung der Verteilungsschicht mit einem Dissoziations-

agens nach der Bildung der Schicht auf einem Mehr schichtenfilm nicht gut,¹ weil sie zu einer Ausfällung des Dissoziationsagens und zu anderen Problemen führt. Ein praktikableres Verfahren würde darin bestehen,· auf eine darunterliegende Schicht eine mit dem Dissoziationsagens imprägnierte Verteilu ig sschicht aufzulaminieren; Bei Anwendung dieses Verfahrens führt j edoch dann,_;wenn der Gehalt an dem Dissoziationsagens erhöht wird, die schlechte Haftung an der darunterliegenden Schicht häufig zu einer Ablösung oder ungleichmäßigen Verteilung der Probenlösung; Unter Berücksichtigung dieser Umstände wird eine Verteilungsschicht, die für die vorliegende Erfindung am besten geeignet ist, erhalten durch Auf laminieren eines mit einem Dissoziationsagens imprägnierten Stoffes (Gewebes) auf einen Überzugsfilm; Ein Stoff (Gewebe),¹ der (das) besonders vorteilhaft ist, weist eine Porosität und mechanische

_ Festigkeit auf, die so hoch ist, daß er (es) nicht nur mit 35

einer großen Menge des Dissoziationsagens imprägniert werden kann,- sondern seine Verteilungseigenschaften auch duich äußere Bedingungen am wenigsten beeinflußt werden; Der

2

Stoff (das Gewebe) kann mit bis zu etwa 100 g/m Dissoziationsagens imprägniert sein; Die Verteilungsschicht wird gebildet als eine Schicht (Laminat), welche die Oberfläche des Überzugsfilms bedeckt.

Die normale Konzentration des Bilirubins im Blut beträgt weniger als 1 mg/dl; Da eine Probe mit einem geringen Bilirubingehalt die Extraktion einer entsprechend geringen Bilirubinmenge erlaubt, erfordert der leichte Nachweis bzw. die leichte Bestimmung die Zuführung einer maximalen Probenlösungsmenge pro gegebene Fläche der Testvorrichtung;

Der lichtdurchlässige, für Wasser undurchlässige Träger in der erfindungsgemäßen integralen Mehrschichtenvorrichtung für die chemische Analyse besteht aus einem bekannten transparenten Träger,· wie ZiB. einem Kunststoffilm aus beispielsweise Polyäthylenterephthalat, Celluloseester (Cellulosediacetat, Cellulosetriacetat oder Celluloseacetatpropionat), Polycarbonat oder Polymethylmethacrylat, oder einer Glasfolie bzw; Glasplatte; Der Träger hat eine Dicke von etwa 50 yum bis etwa 2 mm; Wenn der Träger hydrophob ist und keine feste Haftung an dem hydrophilen Bindemittel in der Extrakt ions schicht aufweist,^ kann er einer bekannten Oberflächenbehandlung unterzogen werden; Zu Beispielen für solche Behandlungen gehören das Hydrophilmachen der Oberfläche des Trägers (beispielsweise durch Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen, Elektronenstrahlen_?· durch Flammenbehandlung oder durch Hydrolyse mit Alkali) oder das Grundieren der Oberfläche des Trägers mit einer Substanz mit einer geeigneten Haftung sowohl an dem Träger als auch an dem hydrophilen Bindemittel in der Extraktionsschicht oder das Erzeugen von feinen Erhebungen

ι
und Vertiefungen (durch Bürsten,· Elektroätzen und dgl;)

auf der Oberfläche des Trägers in der Weise,- daß sie die Lichtdurchlässigkeit des Trägers nicht in signifikanter ° Weise vermindern·

Eine Verteilungsschicht aus einem nicht-faserigen, isotropen porösen Material oder einem hydrophilen Gewebe wird an die Extraktions schicht gebunden unter Ausnutzung der Eigenschaften des hydrophilen Bindemittelpolymeren in der Extraktionsschicht; Während die Extraktionsschicht noch nicht vollständig trocken ist oder nach dem Benetzen der Oberfläche einer trockenen Extrakt ions schicht mit Wasser,' das ein oberflächenaktives Mittel enthalten kann oder nichy wird das nicht-faserige isotrope poröse Material oder das hydrophile Gewebe mit der Oberfläche der Extraktionsschicht in innigen Kontakt gebracht, wobei bei Bedarf

/ ·

ein geeigneter Druck angewendet werden kann; Das nichtfaserige,· isotrope poröse Material oder das hydrophile Gewebe kann auch mit der Extrakt ions schicht verbunden werden unter Verwendung eines Klebstoffes,- der für die Probenlösung durchlässig ist,- oder durch Aufbringen einer Klebstoff schicht (wie nachstehend näher, beschrieben),' ': die für eine wäßrige Probenlösung durchlässig ist,' auf

die Extraktionsschicht»
30

Erforderlichenfalls kann die erfindüngsgemäße integrale Mehrschichten-Vorrichtung für die chemische Analyse ferner eine Reagensschicht, eine Nachweisschicht oder eine Sperrschicht enthalten; Einzelheiten bezüglich dieser . Schichten sind in den obengenannten Patentschriften zu finden und die gewünschte Schicht kann entsprechend den

darin angegebenen Lehren hergestellt werden. Die erfindungsgemäße integrale Mehrschichten-Vorrichtung für die chemische Analyse kann auch eine Strahlungsabschirmungsschicht oder eine Lichtreflexionsschicht zwischen der Extraktions schicht und der Verteilungsschicht enthalten Ferner kann zwischen der Verteilungsschicht und der Extraktionsschicht oder der Strahlungsabschirmungsschicht oder Lichtreflexions schicht eine für die wäßrige Flüssigkeitsprobe durchlässige Klebstoff schicht angeordnet sein,-die eine feste Haftung gegenüber der Verteilungsschicht ergibtj Einzelheiten bezüglich der Strahlungsabschirmungsschicht,¹ der Lichtreflexionsschicht und der Klebstoffschicht sind ebenfalls in den obengenannten Patentschriften beschrieben und die gewünschte Schicht kann entsprechend den daraus zu entnehmenden Lehren hergestellt werden;
20

Die Strahlungsabschirmungsschicht (Strahltmgsblockierungsschicht) oder die Licht reflektierende Schicht wird hergestellt aus weißen mikrofeinen Teilchen aus TiO₂,- BaSO, und dgl;,- die in einem hydrophilen Bindemittel-Polymeren dispergiert sindi Die Dicke dieser Schichten liegt im allgemeinen innerhalb des Bereiches von etwa 1 bis etwa 50 um,¹ vorzugsweise von etwa 2 bis etwa 20 um; Eine Schicht aus feinen Teilchen aus einer Verbindung mit einem weißen oder blaßmetallischen Glanz,¹ wie z;B; Aluminium, dispergiert in einem hydrophilen Bindemittelpolymeren,' kann in einer Dicke von etwa 2 bis etwa 50 um, vorzugsweise von etwa 3 bis etwa 20 um, aufgebracht werden; Alternativ kann I

eine dünne poröse Metallschicht, die für die wäßrige Flüssigkeitsprobe durchlässig ist,- aus einem weißen oder blaß gefärbten Metall, wie Aluminium, in einer Dicke von etwa

5 bis etwa 100 im,- vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 50 um,-hergestellt werden;

Die Klebstoff schicht kann aus einem Polymeren der gleichen Art wie das als Bindemittel in der Extraktions schicht,- der Strahlungsabschirmungsschicht oder der Lichtreflexionsschicht verwendete, für die wäßrige Flüssigkeitsprobe durchlässige hydrophile Polymere bestehen; Die Dicke der Klebstoffschicht liegt im allgemeinen innerhalb des Bereiches von etwa 0,5 bis etwa 10 um, vorzugsweise von etwa 0,7 bis etwa 5 um; Die Verteilungsschicht kann auf die

nachstehend beschriebene Weise an die Klebstoff schicht 15

aus einem hydrophilen Polymeren gebunden sein; Eine.wäßrige Lösung eines hydrophilen Polymeren wird auf der Extraktionsschicht,' der Strahlungsabschirmungsschicht oder der Lichtreflexionsschicht ausgebreitet und bevor der Überzug

vollständig trocken ist oder nach dem Benetzen der Oberfläche eines trockenen Überzugs mit Wasser, das ein oberflächenaktives Mittel enthalten kann oder nicht,¹ wird das nicht-fas er ige,- isotrope poröse Material oder das hydrophile Gewebe mit der Oberfläche der resultierenden Klebstoff schicht unter einem geeigneten Druck in Kontakt gebracht. Auf diese Weise kann ein einheitlicher Überzug aus der Verteilungs schicht mit der Klebstoff schicht verbunden werden; Eine integrale Mehr schicht en-Vorrichtung für die chemische Analyse,· in der die Verteilungs schicht fest an die Klebstoff schicht gebunden ist,- kann auch erhalten werden durch Ausbreiten einer Lösung oder Dispersion, die eine nicht-faserige,- isotrope poröse Schicht bilden auf der Klebstoffschicht.

Für die praktische Durchführung der Erfindung kann eine Schicht so hergestellt werden, daß das Hämoglobin,-das die Analyse des Bilirubin am meisten stört,- nicht in die Extraktionsschicht diffundiert; Eine solche Schicht hat vorzugsweise eine Dicke von etwa 1 bis etwa 10 um; Die Störung durch Hämoglobin stellt stets ein großes Problem bei der quantitativen Bestimmung von Bilirubin dar; Erfindungsgemäß wird dieses Problem fast vollständig gelöst durch Aufbringen einer solchen Schicht aus einem hydrophilen Polymeren (wie Gelatine, Polyvinylalkohol oder Carboxymethylcellulose) zwischen der Verteilungsschicht und der Extraktions schicht; Das zugrundeliegende

Prinzip besteht darin,- daß das Diffusionsvermögen von Hämoglobin in der Schicht aus dem hydrophilen Polymeren sehr gering ist, während die Diffusion des dissoziierten Bilirubins durch die Polymerschicht nicht wesentlich be-

hindert wird; Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin,- daß es damit möglich ist,- den nachteiligen Effekt des "Chyle-Serums",· das in Form einer Emulsion von freien Fetten vorliegt,- zu eliminieren; Die Diffusion der emulgierten Fette in die Extraktionsschicht wird durch diese Schicht vollständig verhindert;

Nachfolgend werden unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen spezifische Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Testvorrichtung näher beschrieben;

Die Fig; 1 zeigt eine schematische Darstellung der Vorrichtung in Form einer Folie (Platte) 21,- die besteht aus einem porösen Träger, beispielsweise Filterpapier,' einer porösen Membran oder Stoff (Gewebe), bei dem mindestens die Oberfläche hydrophil ist,- die mit einer hydrophoben Ex-

ι
traktionslösungsmittelzusammensetzung, die mindestens ein öllösliches Amin enthält, gemäß der vorliegenden Erfindung imprägniert ist; Eine Bilirubin enthaltende Probenlösung wird auf die Vorrichtung aufgeträufelt ader die Vorrichtung wird unter gegebenen Bedingungen in die Lösung eingetaucht und es wird die extrahierte Bilirubinmenge bestimmt·

Die Fig; 2 zeigt eine Vorrichtung/ in der ein für Wasser undurchlässiger Träger 12 mit einer Extraktionsschiht 22 beschichtet ist/ in der die erfindungsgemäß verwendete hydrophobe Extraktionslösungsmittelzusammensetzung in einem hydrophilen Bindemittel dispergiert ist;

Die Fig;' 3 zeigt eine integrale Mehr Schichten-Vorrichtung/ die besteht aus einem für Wasser undurchlässigen Träger 13/ der mit einer Extraktions schicht 23 beschichtet ist/ die ihrerseits mit einer Verteilungsschicht 63 beschichtet ist; ----·

Die Fig; 4 zeigt eine integrale Mehr schichten-Vorrichtung, die besteht aus einem für Wasser undurchlässigen Träger 14/ der mit einer Extrakt ions schicht 24/ einer Strahlungsabschirmungs schicht 34 und einer Verteilungs schicht 64 in der genannten Reihenfolge beschichtet ist;

Die Fig; 5 zeigt eine Vorrichtung/ die besteht aus einem für Wasser undurchlässigen Träger 15, der mit einer Extraktionsschicht 25,· einer Strahlungsabschirmungsschicht 35/ einer Schicht 45, welche die Diffusion von Hämoglobin in die Extraktions schicht verhindert,- und einer Verteilungsschicht 65 in der genannten Reihenfolge beschichtet

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ist.

Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen,' die Iediglich der Erläuterung der Erfindung dienen, ohne sie jedoch darauf zu beschränken,· näher beschrieben;

Beispiel 1

Es wurde eine hydrophobe Extrakt ions lösungsmittelzusammensetzung hergestellt durch Mischen von 5 g Dodecenyl-(trialkylmethyl)amin (flüssiger Ionenaustauscher IA-I der Firma Rohm und Haas Co.) mit 5 g Ν,Ν-Dimethyllaurylamidi Eine 0,5 ml-Probe eines Kontrollserums (Versatol A, alternierend),- das 2,7 mg/dl Bilirubin enthielt,- wurde in ein Reagensglas gegeben und mit 4,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung und 2 ml der hydrophoben Extraktionslösungsmittelzusammensetzung unter Rühren gemischt; Nach 30-minütigem Stehenlassen wurde die ölige Schicht von der wäßrigen Schicht getrennt und ihre optische Dichte bei 550 mn wurde mit einem Spektröphotometer gemessen; Es wurde gefunden,- daß etwa 92 % des Bilirubins in der wäßrigen Schicht mit der hydrophoben Extraktionslösungsmittelzusammensetzung extrahiert worden waren;

Beispiel 2

Es wurde eine hydrophobe Extraktionslösungsmittelzusammensetzung hergestellt durch Auflösen von 1,75 g Dodece~ nyl-(trialkylmethyl)amin (flüssiger Ionenaustauscher IA-I der Firma Rohm und Haas Co;) in 1,75 g N,N-Diäthyllaurylamid; Es wurde eine Lösung eines hydrophilen Reagens hergestellt durch Auflösen von 300 mg des Tetranatriumsalzes

der Äthylendiamintetraessigsätire (EDTA4Na) und 175 mg
Glycerin in 525 g einer 6 gew;-%-igen wäßrigen Gelatinelösung. Es wurde eine O/W-Emulsion hergestellt durch Dispergieren der hydrophoben Extraktionslösungsmittelzusammensetzung in der Lösung des hydrophilen Reagens mit einem Homogenisator unter Anwendung eines konventionellen Verfahrens; Die Dodecenyl(trialkylmethyl)amin enthaltenden hydrophoben Körnchen wiesen eine einheitliche Große von weniger als 200 /um auf; Die Emulsion wurde auf einem mit einem Gruiidierüberzug versehenen transparenten Polyäthylenterephthalat. (PET)-FiIm einer Dicke von 185 um ausgestrichen und getrocknet zur Herstellung einer Bilirubin- ·

extraktionsschicht; Die Dicke der trockenen Schicht betrug etwa 20 pm; Eine mikroskopische Betrachtung der Ex--. traktionsschicht zeigtej daß sie feine Öltröpfchen,- dis-

pergiert in der Gelatine schicht,- enthielt;
20

Das resultierende Produkt wurde zu kleinen Stücken (5
mm χ 20 mm) zerschnitten, die 15 Minuten lang in 7 %
Albumin eingetaucht wurden,¹ das Bilirubin in verschiede« nen Konzentrationen enthielt,- und es wurde die in Abhängigkeit von dem extrahierten Bilirubin variierende Farbintensität bestimmt; Die Farbintensität nahm proportional zur Konzentration des Bilirubins innerhalb des Bereiches von 2 bis 50 mg/dl zu;

Beispiel 3

Ein Filterpapier (Produkt Nr. 7 der Firma Toyo Roshi
Kaisha Ltd;) wurde mit einer wäßrigen Lösung imprägniert, die 44 g Goffein,¹ 72 g wasserfreies Natriumbenzoat,- 82 g wasserfreies Natriumacetat und 1000 g Wasser enthielt,

und das dibei erhaltene Papier enthielt Feststoffe in ei-

ner Menge von 10 g/m . Drei Scheiben (mit einem Durchmesser von etwa 8 mm) wurden aus dem Filterpapier ausgeschnils· ten und auf die Extraktions schicht einer wie in Beispiel 2 hergestellten Testvorrichtung aufgelegt. Auf die Scheiben wurden 10 nl jedes Kontrollserums mit den Bilirubinkonzentrationen 2,7 mg/dl, 5,5 mg/dl und 19 mg/dl aufgeträufelt und nach 10-minütigem Erhitzen auf 37 C wurde die optische Dichte (OD₁₃) bei 450 nm unter Verwendung eines Reflexionsdensitometers gemessen; Der OD-Wert war proportional zur Bilirubinkonzentration;

Beispiel 4

Es wurde eine hydrophobe Extraktionslösungsmittelzusammensetzung hergestellt durch Auflösen von 1,75 g Dicyclo-

hexylamin (Produkt der Firma Wako Pure Chemical Industries,· Ltd;) in 1,75 g N,-N-Dimethyllaurylamid; Es wurde eine Lösung eines hydrophilen Reagens hergestellt durch Auflösen von 300 mg EDTA4Nä . und 175 mg Glycerin in 525 g einer 6 gew;-%-igen wäßrigen Gelatinelösung; Es wurde eine O/W-Emulsion hergestellt durch Dispergieren der hydrophoben Extraktionslösungsmittelzusammensetzung in der hydrophilen Reagenslösung mit einem Homogenisator unter Anwendung eines konventionellen Verfahrens; Die Dicyclohexylamin enthaltenden hydrophoben Körnchen hatten eine einheitliche Größe von weniger als 2 um; Die Emulsion wurde auf eiifemmit einem Grundierüberzug versehenen transpa- renten PET-FiIm einer Dicke von 185 pn ausgestrichen und getrocknet zur Herstellung einer Bilirubinextraktionsschicht; Die Dicke der trockenen Schicht betrug etwa 20 ums Die mikroskopische Betrachtung der Extraktionsschicht er-

gab,' daß sie feine Öltröpfchen,· dispergiert in der Gelatineschicht, enthielt·

Die Emulsionsschicht wurde mit Wasser benetzt und ein Mikrofilter (FM-500 der Firma.Fuji Photo Film Co^- Ltd;) wurde gegen die Emuls ions schicht gepreßt zur Herstellung einer Verteilungsschicht; Das dabei erhaltene Produkt wurde wie in Beispiel 3 einer photometrischen Bestimmung unterworfen,- wobei die gleichen Ergebnisse wie in Bei- ; spiel 3 erhalten wurden;

Beispiel 5

Es wurde eine hydrophobe Extraktionslösungsmittelzusammensetzung hergestellt durch Auflösen von 1,75 g Dodecyl-(trialkylmethyl)amin (flüssiger Ionenaustauscher IA-2 der Firma Rohm und Haas), in 1,75 g Ν,Ν-Diäthyllaurylamid; Es wurde eine Lösung eines hydrophilen Agens hergestellt durch Auflösen von 300 mg EDTMNa' und 175 mg Glycerin in 525 g einer 6 gew;-%igen wäßrigen Gelatinelösung;" Es wurde eine O/W-Emulsion hergestellt durch Dispergieren der hydrophoben Extraktionslösungsmittelzusammensetzung in der hydrophilen Reagenslösung mit einem Homogenisator unter Anwendung eines konventionellen Verfahrens; Die Dodecyl(trialky!methyl)amin enthaltenden hydrophoben Körnchen hatten eine einheitliche Größe von weniger als 2 um; Die Emulsion xyurde auf eimmmit einem Grundierüberzug versehenen transparenten PET-FiIm einer Dicke von 185 ium ausgestrichen und getrocknet zur Herstellung einer BiIirubinextraktionsschicht; Die Dicke der trockenen Schicht betrug etwa 20 um; Die mikroskopische Betrachtung der Extraktionsschicht zeigte,- daß sie feine Öltröpfchen, dis-

pergiert in der Gelatineschicht,- enthielt;

Eine 35 Gew;~% feine Titandioxidkörnchen enthaltende 5 gew;-%-ige»wäßrige Lösung wurde auf die Emulsionsschicht auf gestrichen und getrocknet zur Herstellung einer 15 jum dicken Strählungsabschirmungsschicht; Auf die Strahlungsabschirmung sschicht wurde eine 5 gew.-%-ige wäßrige GeIatinelösung aufgestrichen und getrocknet zur Herstellung einer 3 pn dicken Klebstoffschicht;

(a) Eine Lösung von 66 g Coffein, 108 g wasserfreiem Natriumbenzoat,' 123 g wasserfreiem Natriumacetat und 1000 g Wasser wurden mit 150 g einer 10 %-igen wäßrigen Gelatinelösung und 20 g 1 % Triton X-100 (ein Produkt der Firma Rohm und Haas Co;) gemischt zur Herstellung einer einheitlichen Lösung; Ein Cotton-Samtgewebe (Produkt Nr; 22 000 der Firma Kanebo Ltd;) wurde mit der Lösung imprägniert;

2
Das Samtgewebe enthielt 30 g/m der Lösung,- bezogen auf

■ Trockenbasis; Die Oberfläche der Klebstoffschicht wurde mit Wasser benetzt und das Baumwoll-Samtgewebe wurde auf

die Titandioxidschicht gepreßt zur Herstellung einer Verteilungsschicht; Eine 10 iil-Bilirubinbezugsprobe,' hergestellt aus der wäßrigen Bilirubinlösung von Warner-Lambert Co;,wurde auf die Verteilungsschicht aufgeträufelt und 10 Minuten lang auf 37°C erhitzt; Die optische Dichte (OD-.) bei 450 nm wurde unter Verwendung eines Reflexionsdensitometers gemessen; Die dabei erhaltenen Daten, welche die Differenz (AOD-) zwischen den mit der erfindungsgemäßen Testvorrichtung und den mit einer Phosphatpufferlösung (pH 7,'3) von 4 % Rinderalbumin erhaltenen optischen Dichten zeigen, sind in der folgenden Tabelle I angegeben;

Tabelle I

Gesamt- .

Bilirubin 0,5 1,7 2,8 5,1 7,4 9,-8 14,4 19 (mg/dl)

£0D_R 0,014 0,059 0,109 0,190 0,264 0,329 0,404 Q5D6

(b) Blätter aus einem Filterpapier (Durchmesser 6 mm), behandelt wie in Beispiel 3 angegeben, wurden "auf eine Mehrschichten-Testvorrichtung,bestehend aus einem PET-Träger,' einer Extraktions schicht und einer Strahlungsäbschirmungs-(TiO₂)-Schicht,-auf laminiert; 10 ul jedes Kontroll serums (DADE) mit den Bilirubinkonzentrationen 1,-2 mg/dl/ 4,5 rag/dl und 11 mg/dl wurden auf die jeweiligen Scheiben aufgeträufelt und 10 Minuten lang auf 37 C erhitzt und es wurde die Reflexionsdichte (OD ) gemessen; Die Daten- wel-λ

ehe die Differenz ( AOD ) zwischen den mit der erfindungsgemäßen Testvorrichtung erhaltenen Dichten und denjenigen,' . die mit gepuffertem Albumin erhalten wurden/ anzeigen^

sind in der folgenden Tabelle II angegeben; 25

	Bilirubin- Konzentration (mg/dl)	Tabelle	II	11
30	ÄODR	V2 4	,5	0,-55
	Beispiel 6	0,12 0	,60
35

Es wurde eine hydrophobe Extraktionslösungsmittelzusarnmensetzung hergestellt durch Auflösen von 1,75 g Dodecyl(trialkylmethyl)amin (flüssiger Ionenaustauscher LA-2 der Fir-

ma Rohm und Haas Co;) in 1,75 g Ν,-N-Dimethyllaurylamid; Es wurde eine Lösung eines hydrophilen Reagens hergestellt durch Auflösen von 300 mg EDTA4Na". . und 175 mg Glycerin in 525 g einer 6 gew;-%-igen wäßrigen Gelatinelösung; Es wurde eine O/W-Emulsion hergestellt durch Dispergieren der hydrophoben Extraktionslösungsmittelzusammensetzung in der hydrophilen Reagenslösung mit einem Homogenisator unter Anwendung eines konventionellen Verfahrens; Die Dodecyl(trialkylmethyl)amin enthaltenden hydrophoben Körnchen wiesen eine einheitliche Größe von weniger als 2 um auf; Die Emulsion wurde auf einem mit einem Grundierüberzug versehenen transparenten PET-FiIm einer Dicke von 185 um ausgestrichen und getrocknet zur Herstellung einer Bilirubinextraktionsschicht; Die Dicke der trockenen Schicht betrug etwa 20 pa; Die mikroskopische Betrachtung der Schicht zeigte, daß sie feine Öltröpfchen, dispergiert in der Gelatine schicht,^ enthielt; Wie im Beispiel 5 angegeben,-wurden eine Strahlungsabschirmungsschiebt und eine Klebstoff schicht hergestellt,' wobei diesmal jedoch zwischen beiden Schichten eine Schicht zur Verhinderung der Hämoglobindiffusion einer Dicke von 3 um hergestellt wurde durch Ausstreichen und Trocknen einer 5 gew;-%-igen wäßrigen Polyvinylalkoholbsung; 10 «al einer Gesamtblutprobe, die mit 0,\L % Saponin hämolysiert worden war,- wurde auf

3Q die Testvorrichtung aufgeträufelt und 10 Minuten lang auf 37°C erhitzt; Es trat keine Störung durch Hämoglobin auf;

Die Erfindung wurde zwar vorstehend unter Bezugnahme auf spezifische bevorzugte Ausführungsformen näher erläutertes'ist jedoch für den Fachmann selbstverständlich,- daß sie darauf laLneswegs beschränkt ist,· sondern daß diese in vielfacher Hinsicht abgeändert und modifiziert werden können,

ohne daß dadurch der Rahmen der vorliegenden Erfindung

verlassen wird; 5

Claims (1)

1. P 16 578

   Pa t e η t a η s ρ r ü ehe

   Iy Verfahren zur quantitativen Bestimmung des Bilirubinge» haltes in ei.ner wäßrigen Probe,' dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Stufen umfaßt: Inkontaktbringen einer Bilirubin enthaltenden wäßrigen Flüssigkeitsprobe mit einer hydrophoben,· Bilirubin extrahierenden Zusammensetzung, die ein hydrophobes Amin enthält, das Bilirubin extrahieren kannj Extrahieren des Bilirubins in der wäßrigen Probe mit der Bilirubin extrahierenden Zusammensetzungj und photometrisches Bestimmen der Konzentration des mit der Bilirubin extrahierenden Zusammensetzung extrahierten Bilirubins .

   2i Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein hydrophobes Amin verwendet wird, das bei der Inkubationstemperatur flüssig ist.

   3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,· daß eine Inkubationstemperatur angewendet wird, die innerhalb des Bereiches von etwa 10 bis etwa 50 C liegt.

   4i Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein hydrophobes Amin verwendet wird, das öllöslich ist.

   5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die quantitative Bestimmung des Bilirubins durchgeführt wird unter Verwendung einer Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung der Bilirubinmenge.in einer wäßrigen Flüssigkeitsprobe, die eine Schicht aufweist, die enthält oder besteht aus einer hydrophoben, Bilirubin extrahierenden Zusammensetzung, die ein hydrophobes Amin enthält, das Bilirubin extrahieren kann i 10

   6. Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung der Bilirubinmenge in einer wäßrigen Flüssigkeitsprobe, gekennzeichnet durch eine Schicht, die enthält oder besteht aus einer hydrophoben,Bilirubin extrahierenden Zusammensetzung,- die ein hydrophobes Amin enthält,- das Bilirubin extrahieren kann. ·

   7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophobe Amin bei der Inkubationstemperatur flüssig ist.

   8. Vorrichtung, nach Anspruch 7,- dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubationstemperatur innerhalb des Bereiches von etwa 10 bis etwa 50 C liegt.

   Q₀ 9 i Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 6 bis 8,- dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophobe Amin öllöslich ist.

   10. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 6 bis 35

   9,- dadurch gekennzeichnet, daß das Amin in einem hydrophilen Bindemittel dispergiert ist.

   11. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie außerdem einen lichtdurchlässigen, für Wasser undurchlässigen Träger aufweist,

   auf dem die Schicht angeordnet ist, die eine hydrophobe,-5

   Bilirubin extrahierende Zusammensetzung enthält;

   12; Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie außerdem eine Verteilungsschicht aufweist,- die auf der die hydrophobe, Bilirubin extrahierende Zusammenset-, zung enthaltenden Schicht angeordnet ist.

   13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß in die Verteilungsschicht ein Dissoziationsmittel für Bilirubin eingearbeitet ist.

   14. Vorrichtung nach Anspruch 12 und/oder 13, dadurch gekennzeichnet,daß sie außerdem eine Strahlungsabschirmungsschicht aufweist, die zwischen der Verte.ilungs schicht und der die hydrophobe, Bilirubin extrahierende Zusammensetzung enthaltenden Schicht angeordnet ist.

   15» Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet,

   daß sie außerdem eine Schicht aufweist, welche die Diffusion des Hämoglobins verhindert, die zwischen der Verteilungsschicht und der Strahlungsabschirmungsschicht ange-30

   ordnet ist;