DE2801476C2

DE2801476C2 - Kolorimetrisches Verfahren für die Bestimmung von Bilirubin

Info

Publication number: DE2801476C2
Application number: DE2801476A
Authority: DE
Inventors: Glen Marshall Webster N.Y. Dappen; Tai-Wing Rochester N.Y. Wu
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1977-01-14
Filing date: 1978-01-13
Publication date: 1982-12-09
Also published as: FR2377632A1; SE443048B; DE2801476A1; SE7800403L; CH627555A5; JPS6222100B2; US4069017A; FR2377632B1; BE862956A; GB1591683A; JPS6339873B2; JPS57160063A; CA1094432A; JPS5389796A

Description

20. Element nach einem der Ansprüche 8 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensschicht für Stoffe mit einem Molekulargewicht gleich oder größer als Albumin undurchlässig ist.

21. Element nach einem der Ansprüche 8 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensschicht eine geringere Permeabilität oder Durchlässigkeit aufweist als die Ausbreitschicht.

Die Erfindung betrifft ein kolorimetrisches Verfahren für die Bestimmung von Bilirubin in einer wäßrigen Flüssigkeit sowie ein analytisches Element zur Durchführung des Verfahrens.

Es sind, z. B. aus dem Buch von R. J. Henry, D. C. Cannon und J. W. Winkelman »Clinical Chemistry-Principles and Technics«, Verlag Harper und Row Publishers, 2. Ausgabe (1974), Seiten 1042 bis 1079 sowie dem Buch von N. W. Tietz, »Fundamentals of Clinical Chemistry«, Verlag W. B. Saunders Co. (1970), Seiten 743 bis 762, zahlreiche analytische Verfahren zur Bestimmung von Bilirubin bekannt.

Das vermutlich am häufigsten angewandte Verfahren zur Bestimmung von Bilirubin ist das sogenannte Diazoverfahren, dem eine Kupplungsreaktion des Bilirubins mit einem Diazoniumsalz, z. B. der Diazosulfanilsäure unter Bildung eines Pigmentes mit einem Extinktionskoeffizienten, der größer ist als der Extink tionskoeffizient des Bilirubin selbst zugrundeliegt.

in typischer Weise besteht das Diazoverfahren zur Bilirubinbestimmung aus zwei kinetischen Phasen: Zunächst läuft eine »direkte Reaktion« ab, in der eine rasche Farbbildung auftritt, an die sich eine »indirekte Reaktion« anschließt, in der ein Farbton nach Zugabi von Methanol entwickelt wird.

Wie sich aus den zitierten Literaturstellen ergibt, is' bis heute noch nicht restlos geklärt, was diese beider kinetischen Phasen tatsächlich aussagen. Einige Forscher betrachten die direkte Reaktion als Maß für ungebundenes oder freies Bilirubin und die indirekte Reaktion als Maß für Albumin-gebundenes Bilirubin.

Andere Forscher wiederum sind der Auffassung, daß die direkte Reaktion ein Maß für konjugiertes Bilirubin und die indirekte Reaktion ein Maß für die unkonjugierte Form von Bilirubin ist.

Abgesehen von dieser Unklarheit werden im Hinblick auf die vielen Varianten des Diazoverfahrens und die Komplexizität der Diazoreaktion selbst oftmals sehr verschiedene analytische Ergebnisse erhalten. Im übrigen ist das Diazoverfahren auch deshalb nachteilig, weil zu seiner Durchführung verschiedene Reagenzien erforderlich sind, die erst kurz vor Durchführung des Verfahrens miteinander vermischt werden können und weil es vergleichsweise zeitaufwendig ist. Hinzu kommt, daß es auch störanfällig ist, weil andere Komponenten im menschlichen Serum und anderen biologischen Flüssigkeiten auf eine Diazotierung ansprechen.
Andere bekannte Verfahren zur Bestimmung von Bilirubin nutzen die dem Bilirubin eigene molare Absorptionsfähigkeit aus. Freies Bilirubin ist bekanntlich ein gelbes Pigment mit einer molaren Absorption von etwa 5XlO⁴, gemessen bei 435 Nanometern.

Obgleich die molare Absorption des Bilirubins groß genug ist, um in verschiedenen Lösungen verwendenden direkten spektrophotometrischen Verfahren ausgenutzt werden zu können, ist sie jedoch nicht stark genug, um eine verläßliche quantitative Bestimmung des Bilirubins unter Verwendung »trocken arbeitender« analytischer Testelemente zu ermöglichen, beispielsweise von Elementen, wie sie aus der US-PS 39 92 158 bekannt sind. Dies bedeutet, daß die bis heute bekannt gewordenen direkten spektrophotometrischen Bestimmungsverfahren für Bilirubin auf nasse Bestimmungsverfahren beschränkt sind, und zwar insbesondere in den Fällen, in denen genaue quantitative Ergebnisse erwünscht sind.
Aus den zitierten Literaturstellen ergibt sich des weiteren, daß bei den bekannten spektrophotometrischen Bestimmungsverfahren für Bilirubin oftmals spektrale Störungen aufgrund des Vorhandenseins von Hämoglobin, das Absorptionsspitzen bei 414, 540 und 576 Nanometer hat, auftreten. Des weiteren können auch andere Komponenten, die in Bilirubin enthaltenden biologischen Flüssigkeiten, wie beispielsweise menschlichem Serum enthalten sind, zu spektralen Störungen bei Anwendung derartiger direkter spektrophotometrischer Bestimmungsverfahren führen. So können beispielsweise Caratinoide die Bilirubinbestimmung stören, da 0-Carotin, d. h. eine der hauptsächlichen Carotinoid-Komponenten, eine Absorptionsspitze bei etwa 450 nm aufweist, die in dem Bereich des Spektrums liegt, der der Absorptionsspitze des Bilirubins sehr nahe ist.

Abgesehen von den erwähnten spektralen Störungsquellen bei der Bestimmung von Bilirubin auf direktem spektrophotometrischem Weg hat sich gezeigt, daß derartige Verfahren des weiteren durch das Vorhandensein von anderen Proteinen im menschlichen Serum, wie beispielsweise Albumin, gestört werden können. So kann Albumin Bilirubin binden, wobei als Folge einer solchen Bindung eine Verschiebung der Absorptionsintensität und Absorptionsspitze des Bilirubins erfolgt Trotz der beschriebenen Probleme hat man bisher an dem Diazo-Bestimmungsverfahren für Bilirubin und verschiedenen Modifikationen der beschriebenen direkten spektrophotometrischen Bestimmung für Bilirubin festgehalten. So ist beispielsweise aus der US-PS 35 69 721 ein weiteres direktes spektrophotometrisches Verfahren für die Bestimmung von Bilirubin bekannt geworden, bei dem die spektrale Störung durch Hämoglobin dadurch ausgeschaltet wird, daß die zu untersuchende Flüssigkeitsprobe bei einer Wellenlänge der maximalen Bilirubinabsorption getestet wird und bei einer zweiten Wellenlänge, bei der Hämoglobin allein eine Absorptionsspitze aufweist In diesem Falle muß man die Absorptionsspitze der Bilirubinkonzentration um einen Wert berichtigen, der äquivalent ist der Hämoglobinmenge, die in der Flüssigkeitsprobe vorhanden ist

Ein weiteres, z.B. aus den US-PS 33 48 920 und 36 07 093 sowie der BE-PS 8 16 927 bekanntes Verfah-

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fen für die Bestimmung von Bilirubin beruht auf der Verwendung eines Reagens für Bilirubin, das aus einer organischen Säure oder einem Salz hiervon, z. B. Trichloressigsäure oder einer organischen Sulfonsäure und Ferriionen besteht. Bei diesem Bestimmungsverfahren wird Bilirubin durch die organische Säure oder ihr Salz in Gegenwart der Ferriionen zu einem Reaktionsprodukt, wie beispielsweise Biliverdin und/oder Cholecyanin oxidiert, das einen charakteristischen blauen oder blaugrünen Farbton aufweist, wobei die Farbintensität der Konzentration des ursprünglich vorhandenen Bilirubins entspricht. Dieses bekannte Bestimmungsverfahren leidet jedoch unter vielen der Nachteile, unter denen auch das bekannte Diazoverfahren und die direkten spektrophotometrischen Bestimmungsmethoden leiden. So ist beispielsweise nachteilig an diesem Bestimmungsverfahren, daß in der Regel eine Zeitspanne von bis zu etwa 10 Minuten erforderlich ist, damit die Reaktion zwischen der Säure und dem Bilirubin vollständig ablaufen kann. Außerdem ist es erforderlich, das Endprodukt von dem ursprünglichen Reaktionsmedium abzutrennen, damit das Reaktionsprodukt spektrophotometrisch analysiert werden kann. Auch treten bei diesem Verfahren verschiedene, die spektrale Bestimmung störende Komponenten auf, die Absorptionsmaxima im blauen Bereich des Spektrums aufweisen, wie beispielsweise Hämoglobin und verschiedene Carotinoide.

Aus der DE-AS 25 32 918 ist schließlich ein integrales analytisches Element bekannt, das unter anderem auch zur Bestimmung von Bilirubin verwendbar ist, und aus einem strahlungsdurchlässigen Schichtträger mit hierauf aufgetragenen Reagens-, Registrier-, Strahlungssperr- und Verteilerschichten besteht. Die Registrierschicht kann dabei auch ein Beizmittel zur Beizung eines Reaktionsproduktes aus der zu analysierenden Substanz enthalten.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein kolorimetrisches Verfahren und ein analytisches Element für die Bestimmung von Bilirubin in einer wäßrigen Flüssigkeit anzugeben, bei dem die beschriebenen Nachteile der bekannten Bilirubin-Bestimmungsverfahren ausgeschaltet sind.

Gelöst wird diese Aufgabe für das Verfahren gemäß dem Kennzeichen des Anspruchs 1 und für das analytische Element zur Durchführung des Verfahrens gemäß dem Kennzeichen des Anspruchs 8. Vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens bzw. des Elements sind in den Ansprüchen 2 — 7 und 9 — 21 beschrieben.

In vorteilhafter Weise wird die Absorptionsspitze des gebeizten Bilirubins nach einer Wellenlänge von 460 nm oder darüber verschoben, und der molare Extinktionskoeffizient des gebeizten Bilirubins wird auf einen Wert von 7,5 χ 10⁴ oder darüber erhöht

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich für die Bestimmung von Bilirubin in biologischen Flüssigkeiten, wie beispielsweise Blut, Blutserum und Urin, insbesondere Blutserum, da es die Effekte von die Bilirubinbestimmung normalerweise störenden Komponenten, wie beispielsweise Hämoglobin und Carotinoiden auf ein Minimum herabdrückt Erreicht wird dies teilweise durch den beträchtlichen Anstieg des molaren Extinktionskoeffizienten des gebeizten Bilirubins und teilweise durch die Verschiebung der Absorptionsspitze des gebeizten Bilirubins, wobei die beiden spektralen Veränderungen als Folge der Bilirubinbindung an das Beizmittel auftreten. Bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens für die Bestimmung des Bilirubingehaltes verschiedener biologischer Flüssigkeiten kann es trotzdem vorteilhaft oder wünschenswert sein, verschiedene aus höhermolekularen Proteinen bestehende Störungskomponenten, die Bilirubin zu binden vermögen, zu entfernen, beispielsweise Albumin, so daß eine quantitative Analyse des Gesamt-Bilirubingehaltes der zu untersuchenden Flüssigkeit möglich ist. Demzufolge wird gemäß einer Ausgestaltung der Erfindung die Testflüssigkeit zunächst einer Vorbehandlung unterworfen, in der derartige, die Bilirubinbestimmung störende Komponenten abgetrennt werden. Eine derartige Vorbehandlung kann aus einem üblichen Verfahren bestehen, beispielsweise einer Proteinausfällung oder einer Probenverdünnung.

Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung des Elements kann in der Ausbreitzone oder Ausbreitschicht eine oberflächenaktive Verbindung zugegen sein, und zwar in einer Konzentration, die den Transport des Bilirubins durch die Zone normalisiert, und zwar auch in Gegenwart von sehr verschiedenen Mengen an hochmolekularen Protein-Störungskomponenten für Bilirubin, wie beispielsweise Albumin und dergleichen. Wird die zu analysierende Flüssigkeitsprobe zunächst einer unabhängigen Vorbehandlung zur Entfernung von praktisch sämtlichen Protein-Störungskomponenten für Bilirubin unterworfen, z. B. durch Proteinausfällung oder Probenverdünnung, so läßt sich für die Durchführung des erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahrens ein analytisches Element verwenden, dessen einziges Merkmal eine Reagens-Zone oder Reagens-Schicht des beschriebenen Typs ist.

Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird ein analytisches Element mit einer Reagens-Zone oder Reagens-Schicht verwendet, die impermeabel oder undurchlässig für höhermolekulare Protein-Störungskomponenten ist, z. B. für Albumin und andere Proteine, mit Molekulargewichten von etwa 60 000 oder darüber, wodurch sich Störungen durch diese Stoffe weiterhin ausschalten lassen.

In besonders vorteilhafter Weise bestehen die erfindungsgemäß verwendbaren analytischen Elemente aus sogenannten integralen oder integrierten Elementen mit einer Ausbreitzone und einer Reagens-Zone oder übereinander angeordneten Ausbreit- und Reagensschichten, die auf einem geeigneten Schichtträger angeordnet sind, z. B. einem für Strahlung durchlässigen Schichtträger.

. Unter »strahlungsdurchlässigen« oder »für Strahlung durchlässigen« oder »für Strahlung durchlässigen« Zonen, Schichten und Trägern sind hier solche zu \ erstehen, die den Durchtritt elektromagnetischer Strahlung ermöglichen, die zur Bestimmung eines a iialytischen Ergebnisses, das im Element erzeugt wurde, verwendet werden. Besonders vorteilhaft oder zweckmäßig sind dabei Durchlässigkeiten für elektromagnetische Strahlung einer Wellenlänge oder von ' Wellenlängen innerhalb eines Bereiches von etwa 300nmbis700nm.

Gegebenenfalls können zwischen Reagens-Schicht und Schichtträgern oder zwischen Ausbreitschicht und Reagens-Schicht separate Zwischenschichten angeordnet sein. Derartige Zwischenschichten können zusätzliche Reagenzien enthalten, beispielsweise zur Entfernung verschiedener möglicher Störungskomponenten aus einer zu analysierenden wäßrigen Flüssigkeitsprobe. Andererseits können derartige Zwischenschichten auch hydrophile, in Wasser quellbare Stoffe enthalten oder aus solchen aufgebaut sein, z. B. aus Gelatine, um den

Transport der zu analysierenden Flüssigkeitsprobe durch das mehrschichtige Testelement zu erleichtern oder zu beschleunigen.

Die verschiedenen Zonen oder Schichten eines erfindungsgemäßen analytischen Elementes befinden sich mindestens unter den Anwendungsbedingungen des Elementes in Strömungs- oder Flüssigkeitskontakt miteinander. Dies bedeutet, daß eine Flüssigkeit im Falle von übereinander angeordneten Zonen oder Schichten oder aneinander angrenzenden Zonen oder Schichten von einer Zone in eine andere Zone oder von einer Schicht in eine andere Schicht gelangen kann. Anders ausgedrückt, bedeutet »Strömungskontakt« oder »Flüssigkeitskontakt«, daß für die Komponenten einer Flüssigkeitsprobe die Möglichkeit gegeben ist, aus einer Zone oder einer Schicht in eine andere Zone bzw. Schicht, die sich in dem Kontakt miteinander befinden, übertreten. Obgleich Zonen oder Schichten, die sich in Strömungskontakt oder Flüssigkeitskontakt miteinander befinden, einander benachbart sein können, können sie doch auch durch dazwischenliegende Zonen oder Schichten voneinander getrennt sein. Derartige Trennzonen oder Trennschichten befinden sich jedoch auch im Strömungskontakt oder Flüssigkeitskontakt mit den anderen Zonen bzw. Schichten und verhindern den Durchtritt oder den Obergang von Flüssigkeit zwischen den Zonen bzw. Schichten nicht.

Ein derartiger Strömungskontakt oder Flüssigkeitskontakt zwischen Zonen oder Schichten läßt sich erreichen durch Herstellung von Elementen mit entsprechenden Zonen oder Schichten, die von Anfang an einander benachbart sind oder aneinander angrenzen. Andererseits kann es jedoch auch zweckmäßig sein. Elemente herzustellen, die Zonen oder Schichten aufweisen, die zunächst nicht einander benachbart sind und die voneinander getrennt sind, beispielsweise durch Verwendung von Zwischenschichten oder Zwischenblättern, wie es beispielsweise aus der US-PS 35 11 608 bekannt ist oder durch Verwendung eines federnden absorbierenden Materials oder durch Verwendung von deformierbaren Trägern, wie sie beispielsweise aus den US-PS 39 17 453 und 39 33 594 bekannt sind. Weisen die erfindungsgemäß verwendbaren Elemente zunächst einander nicht benachbarte oder nicht miteinander in Berührung stehende Zonen bzw. Schichten auf, so kann es erforderlich sein, Druckkräfte anzuwenden oder andere Maßnahmen zu treffen, um die Zonen oder Schichten des Elementes in Strömungs- oder Flüssigkeitskontakt miteinander zu bringen, wenn die Elemente verwendet werden sollen.

Der Ausdruck »permeabel« oder »durchlässig« besagt, daß eine Substanz, Schicht bzw. Zone für eine Verbindung oder einen Stoff durchlässig ist, der in einer Flüssigkeit dispe.^-giert oder gelöst ist.

Wird auf ein erfindungsgemäßes analytisches EIement eine Flüssigkeitsprobe aufgebracht, die Bilirubinpositiv ist, so reagiert das Beizmittel der Reagens-Zone oder Reagens-Schicht mit dem Bilirubin, wobei eine Verschiebung der Absorptionsspitze gegenüber dem .freien Bilirubin von mindestens etwa 10 nm auftritt und der molare Extmktionskoeffizient des Bilirubins (gemessen bei der verschobenen Absorptionsspitze um mindestens 50% erhöht wird, und zwar vorzugsweise auf einen Wert von über etwa 7,5 χ 10⁴.

Unter »freiem Bilirubin« ist hier Bilirubin einschließlieh konjugiertem oder unkonjugiertem Bilirubin zu verstehen, das nicht an Serumprotein gebunden ist Freies Bilirubin weist in typischer Weise eine Absorptionsspitze bei einer Wellenlänge von etwa 435 bis etwa 440 nm auf sowie eine molare Absorption (E_m) von etwa 5xlO⁴, gemessen in wäßriger Lösung bei einer Temperatur von 22°C und einem pH-Wert von etwa 7,4. Sofern nichts anderes angegeben ist, wurden die molaren Absorptionswerte, die hier angegeben sind, in einem wäßrigen Medium bei ungefähr 22°C und einem pH-Wert von etwa 7,4 gemessen.

Weist ein erfindungsgemäßes analytisches Element eine Ausbreitzone oder Ausbreitschicht auf, so gelangt die aufgebrachte Probe zunächst durch diese Zone bzw. Schicht, bevor die Probe in die Reagens-Zone bzw. Reagens-Schicht gelangt, und das Bilirubin wird innerhalb der Ausbreitzone oder Ausbreitschicht verteilt, wodurch eine gleichförmige Ausbreitung der Verbindung an der Oberfläche der Ausbreitzone oder Ausbreitschicht erzeugt wird, die der Reagens-Zone bzw. Reagens-Schicht gegenüberliegt. Es ist möglich, eine derartige gleichförmige Ausbreitung innerhalb eines breiten Probenvolumenbereiches zu erzielen. Auf Grund des Strömungskontaktes zwischen der Ausbreitzone und der Reagens-Zone bzw. den entsprechenden Schichten und auf Grund der vorzugsweise gleichförmigen Permeabilität der Reagens-Zone oder Reagens-Schicht gegenüber dem in der Ausbreitzone oder Ausbreitschicht verteilten Bilirubin werden gleichförmig verteilte Bestandteile von der Ausbreitzone oder Ausbreitschicht in die Reagens-Zone bzw. Reagens-Schicht überführt und können die Reagens-Zone bzw. Reagens-Schicht durchdringen, ohne daß zu irgendeinem Zeitpunkt ins Gewicht fallende Veränderungen der Bilirubinkonzentration auftreten. Auf Grund des Vorhandenseins des Beizmittels in der Reagens-Zone oder Reagens-Schicht und infolge einer gleichförmig zugeführten Bilirubinkonzentration wird in dem Element eine gleichförmige, quantitativ bestimmbare Veränderung erzeugt. Diese Veränderung läßt sich quantitativ auf radiometrischem Wege erfassen, gegebenenfalls durch automatisch arbeitende radiometrische Abtastgeräte, wie beispielsweise photometrische Geräte.

Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Bilirubin-Bestimmungsverfahren unter Verwendung von analytischen Elementen des beschriebenen Typs durchgeführt, bei deren Verwendung die Bestimmung auf »trockenem Wege« erfolgt und die eine Ausbreitzone oder Ausbreitschicht aufweisen. Es wurde gefunden, daß sich bei Verwendung derartiger analytischer Elemente die eingangs beschriebenen Störungskompon^nten für Bilirubinanalysen wirksam ausschalten lassen. So ist es nicht nur möglich, bei Verwendung derartiger Elemente Störungen durch Carotinoide und Hämoglobin auszuschalten. Viermehr sind die erfindungsgemäßen analytischen F.Iemente auch nicht oder nur wenig störanfällig gegenüber Natriumchlorid oder dem Gesamtproteingenalt einer zu analysierenden Flüssigkeitsprobe.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich jedoch auch auf »nassem Wege« oder in Lösung durchführen. In einem solchen Falle befindet sich das reaktionsfähige Beizmittel für Bilirubin in einem geeigneten flüssigen Medium, das mit der zu analysierenden Probe in Kontakt gebracht wird. Wird das »nasse« Bestimmungsverfahren angewandt, so hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn die Bilirubin enthaltende Flüssigkeitsprobe zunächst einer Vorbehandlung unterworfen wird, bei der hochmolekulare Proteine, die die Bilirubinbestimmung stören können, entfernt werden. Die Entfernung dieser Proteine von vergleichsweise hohem Molekulargewicht kann nach den bereits erwähnten

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üblichen Trennungsmethoden erfolgen.

Die Zeichnungen dienen der näheren Erläuterung der Erfindung. Im einzelnen sind dargestellt in

F i g. 1 und F i g. 2 vergrößerte Ansichten von Ausfiihrungsbeispielen für analytische Elemente gemäß der Erfindung und in

F i g. 3 ein Diagramm, aus dem sich das spektrophotometrische Ansprechvermögen eines mehrschichtigen analytischen Elementes nach der Erfindung gegenüber verschiedenen Bilirubinkonzentrationen ergibt.

Kennzeichnend für das zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete Beizmittel ist eine hydrophobe organische Matrix und mindestens eine eine Ladung aufweisende kationische Gruppe. Es wurde gefunden, daß Stoffe mit diesen Eigenschaften Bilirubin zu binden vermögen und infolgedessen als Beizmittel für Bilirubin wirken. Derartige Stofle wirken jedoch nicht nur als Beizmittel für Bilirubin, sondern durch das Beizen des Bilirubins wird in dem gebeizten Bilirubin eine beträchtliche Veränderung der spektralen Charakteristika im Vergleich zum freien ungebundenen Bilirubin hervorgerufen. Ganz speziell trifft eine bemerkenswerte Verschiebung der Absorptionsspitze des gebeizten Bilirubins im Vergleich zum freien Bilirubin auf und eine beträchtliche Erhöhung des molaren Extinktionskoeffizienten des gebeizten Bilirubins, im Vergleich zum freien Bilirubin.

Als vorteilhaft hat sich die Verwendung von polymeren Beizmitteln erwiesen, insbesondere solchen, die bereits zur Herstellung verschiedener photographischer Filmmaterialien und photographischer Papiere verwendet wurden und die durch wiederkehrende Einheiten gekennzeichnet sind, die Ladungen tragende kationische Gruppen aufweisen und die in den gleichen oder anderen wiederkehrenden Einheiten organische Gruppen aufweisen, die zu der Hydrophobizität der Beizmittel führen. Außer diesen polymeren Beizmitteln können jedoch auch die verschiedensten anderen polymeren Stoffe verwendet werden, die die a igegebenen Eigenschaften und chemische Zusammensetzung haben und von denen bisher nicht bekannt gew irden ist, daß sie sich als photographische Beizmittel auf dem photographischen Gebiet verwenden lassen.

Besonders vorteilhafte aus Polymeren bestehende Beizmittel für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Beizmittel mit einer Poly nerkette mit oder aus monomeren Einheiten der folgenden Formel I:

VM^ffiJ

χ^θ

worin bedeuten:

A einen organischen Rest, der einen Teil der

Polymerkette bildet;
Q eine chemische Bindung oder einen chemischen

!Rest, wodurch M^ffi an A gebunden ist;
M® einen quaternären Ammonium- oder Phosphoni-

umrestund
Χ^θ ein Säureanion, z. B. ein Halogeniden, wie ein Chlorid- oder Bromidion öder ein Nitrat-, Methosulfat- oder p-Toluolsulfonatrest oder dergleichen.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung steht M® für einen quaternären Ammonium- oder Phosphoniumrest der Formeln II oder III:

Rl—N^ffl—R²

Ri-Ρ®—R²

R³

OD

(in)

worin R¹, R² und R³ die gleiche oder eine voneinander verschiedene Bedeutung haben können und für jeweils einen Aryl-, Aralkyl- oder Alkarylrest mit 5 bis weniger als 20 C-Atomen, z. B. 1 bis 19 C-Atomen oder einen Alkylrest mit 1 bis weniger als 10 C-Atomen, z. B. 1 bis 9 C-Atomen stehen.

In der Formel I steht Q vorzugsweise für einen Kohlenwasserstoffrest, insbesondere einen Arylen-, Arylenalkylen-, Alkylenarylen-, Arylenbisalkylen- oder Alkylenbisarylenrest. In typischer Weise, jedoch nicht notwendigerweise, enthält Q etwa 5 bis etwa 10 C-Atome.

A in Formel I kann sehr verschieden sein je nach dem Typ des verwendeten Polymeren. Besonders vorteilhafte Ergebnisse werden mit Polymeren erhalten, in denen A für einen Alkylenrest steht. Derartige Alkylenreste können dabei in vorteilhafter Weise 2 bis etwa 10 C-Atome aufweisen, insbesondere 2 bis 4 C-Atome.

Bei den polymeren Beizmitteln kann es sich um Homopolymere oder Copolymere handeln. Als besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung von Copolymeren erwiesen.
Typische vorteilhafte Copolymere sind solche mit wiederkehrenden Einheiten der Formel I sowie bis zu etwa 75 Gew.-% wiederkehrenden Einheiten aus nicht störenden Monomeren. Der Ausdruck »nicht störenden Monomeren« bezieht sich dabei auf solche Monomere, die zur Ausbildung von Einheiten führen, die weder chemisch noch physikalisch das Beizen des Bilirubins stören. Typische geeignete Monomere, welche sich zur Ausbildung von derartigen nicht störenden wiederkehrenden Einheiten eignen und die des weiteren für eine Hydrophobizität des herzustellenden Beizmittels sorgen, sind aliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe, wie beispielsweise Olefine, substituierte Olefine, Styrol sowie substituierte Styrole, Alkylacrylate und Alkylmethacrylate sowie Derivate hiervon und andere übliche bekannte Monomere, die üblicherweise zur Herstellung von Copolymeren des angegebenen Typs verwendet werden können.

Gegebenenfalls können die polymeren Beizmittel quervernetzt werden, in welchem Falle polymere •Ketten beispielsweise covalent quervernetzt werden

6ö durch difunktionelle Quervernetzungsmittel, beispielsweise Divinylbenzol, Äthylendimethacrylat und andere übliche bekannte difunktionelle Quervernetzungsmittel. Werden derartige difunktionelle Quervernetzungsmit-

- tel verwendet, so werden sie vorzugsweise in Konzentrationen von bis zu etwa 5 Gew.-°/o, vorzugsweise von etwa 0,1 bis etwa 2 Gew--%, bezogen auf das "Gesamtgewicht der in der copolymerisierenden Monomeren-Mischung vorhandenen Monomeren verwendet

Besonders vorteilhafte und typische erfindungsgemäß verwendbare Copolymere iassen sich herstellen durch Copolymerisation von monomeren Mischungen, die enthalten:

(a) etwa 25 bis etwa 90 Gew.-% Monomere für die Erzeugung von wiederkehrenden Einheiten der Formel 1;

(b) etwa 10 bis etwa 75 Gew.-% Monomere für die Erzeugung von nicht störenden wiederkehrenden Einheiten und

(c) 0 bis 5 Gew.-°/b eines difunktion eilen Quervernetzungsmittels.

Obgleich sich in vorteilhafter Weise Polymere als Beizmittel verwenden Iassen, Iassen sich erfindungsge-

maß jedoch auch nichtpolymere Stoffe als Beizmittel verwenden, wenn sie die erforderliche Hydrophobizität und mindestens eine kationische Gruppe für das Beizen des Bilirubins aufweisen. Werden derartige nichtpoly-

mere Beizmittel zur Herstellung analytischer Elemente verwendet, mit denen sich eine Bilirubinbestimmung auf »trockenem Wege« durchführen läßt, so hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn derartige nicht-polymere Beizmittel eine molekulare Konfiguration oder ein

ίο ausreichend hohes Molekulargewicht haben, so daß die

Verbindungen in der Reagens-Zone des Elementes oder

Reagens-Schicht des Elementes immobilisiert werden

können.

Im folgenden werden typische, erfindungsgemäß

verwendbare polymere Beizmittel für Bilirubin angegeben:

Tabelle 1

Name

Struktur

1. Poly(N,N,N-trimethyl-N-vinylb enzylammoniumchlorid

-CH₂—CH

2. Poly[styrol-co-benzyl-(dimethyl)-p-vinyl-benzylammoniumchlorid]

-CH,—CH-

3. Poly(N,N,N-trioctyl-N-vinylbenzylphosphoniumchlorid)

Tabelle 1 Fortsetzung

Struktur

4. Poly[styrol-co-(vinylbenzyl)-(trihexyl)-ammoniumchlorid]

-CH,— CH

-CH₂-CH-

CH₂-N-C₆H

₆H₁₃

Cl®

5. Poly(N,N,N-trimethyl-N-vinylb enzylammoniumchlorid-costyrol)

6. Poly(styrol-co-N-vinylbenzyl-Ν,Ν-dimethylbenzylammoniumchlorid-co-divinylbenzol)

Die erfindungsgemäß verwendbaren Beizmittel lassen sich nach üblichen bekannten Methoden herstellen, die bereits ausführlich im Zusammenhang mit der Verwendung von diesen Stoffen oder ähnlichen Stoffen auf dem Gebiet der Photographie beschrieben wurden. Infolgedessen erübrigt sich eine detaillierte Beschreibung der Herstellung verschiedener Beizmittel, die sich erfindungsgemäß verwenden lassen. Bezüglich Einzelheiten der Herstellung derartiger Beizmittel sei beispielsweise verwiesen auf die folgenden Patentschriften: GB-PS 12 61 925; US-PS 34 88 706; 35 57 066; 36 25 694; 37 09 690; 37 70 439; 37 58 445; 37 73 509; 38 59 096; 38 98 088; 39 44 424 und 39 58 995.

Die Konzentration an Beizmittel für die Bindung des Bilirubins bei der Durchführung einer Bilirubinbestimmung nach der Erfindung kann verschieden sein. Die im Einzelfalle optimale Konzentration an Beizmittel hängt von dem speziellen Bilirubingehalt der zu analysierenden Probe ab, d. h. dem »dynamischen Bereich« der der Bilirubin-Bestimmungsmethode zugrundegelegt werden soll.

Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung, bei der 1 Mol Bilirubin an ein Beizmittel mit einem molaren Äquivalent an Bindungszentren für Bilirubin gebunden wird, sollte eine ausreichende Menge an Beizmittel vorliegen, so daß mindestens ein molares Äquivalent an Bindungszentren für Bilirubin im Beizmittel .für die maximale Anzahl von Molen an Bilirubin vorliegt, zu deren Bestimmung das Element bestimmt ist. Besteht das Beizmittel für Bilirubin aus einem Polymeren, so hängt die optimale oder geeignete Menge an Polymer von der durchschnittlichen Anzahl von wiederkehrenden Einheiten mit Bindungszentren für das Bilirubin ab und, wie bereits dargelegt, von dem dynamischen Bereich, der der Bilirubinbestimmung zugrundegelegt werden soll.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung, bei der ein polymeres Beizmittel verwendet wird, beispielsweise ein Beizmittel des in der Tabelle I erwähnten Typs und im Falle von Beizmitteln, die aus einem Copolymeren aus Styrol und Vinylbenzylchlorid hergestellt werden und eine Inherent-Viskosität (gemessen bei 25° C in Benzol in einer Konzentration von 0,25 g/dl) von etwa 0,15 bis etwa 1,0 aufweisen, verwendet man die Polymeren in typischer Weise in einer Konzentration von etwa 0,01 bis etwa 1,0 g/dl Beizmittel bei einem dynamischen Bereich von etwa 0,1 bis 50 mg/dl Bilirubin.

Ganz allgemein hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn in der Reagens-Zone oder Reagens-Schicht eines erfindungsgemäßen Elementes ein Überschuß an Beizmittel vorliegt, wodurch die Reaktion zwischen Bilirubin und Beizmittel beschleunigt und infolgedessen die erwünschte Veränderung der spektralen Eigenschaften des gebeizten Bilirubins beschleunigt herbeigeführt werden kann.

Wie bereits dargelegt, läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren als Lösungs-Bestimmungsverfahren (nasses Verfahren) durchführen oder auf »trockenem Wege«, beispielsweise unter Verwendung eines analytischen Elementes nach der Erfindung.

Wird das erfindungsgemäße Verfahren auf nassem Wege durchgeführt, so wird zunächst eine »nasse« Reaktionszone hergestellt, indem man beispielsweise in einen strahlungsdurchlässigen Behälter ein Beizmittel gibt und dieses in einem niüit störenden flüssigen Medium löst oder dispergiert. Zur Bereitung derartiger Lösungen und Dispersionen sind die verschiedensten ,flüssigen Stoffe geeignet, die unter den Anwendungsbe- -Jiingungen die Reaktion zwischen Bilirubin und Beizmittel nicht stören und auch die Absorptionsspitze des freien wie auch des gebeizten Bilirubins nicht beeinträchtigen. Geeignet sind somit die verschiedensten wäßrigen wie auch organischen Flüssigkeiten. Im Hinblick auf die Analyse biologischer Flüssigkeiten hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, als flüssiges Medium in der Reaktionszone ein wäßriges Medium zu verwenden, beispielsweise Wasser oder verschiedene polare organischen Lösungsmittel, z. B. kurzkettige Alkylalkanole. Gegebenenfalls kann es vorteilhaft sein, je nach der Zusammensetzung des Beizmittels der Reaktionszone Puffersubstanzen zuzusetzen.

Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, im Falle der Anwendung der nassen Ausführungsform, in abgepufferten, wäßrigen Medien mit einem pH-Wert von etwa 6,8 bis etwa 9,5 und einer Temperatur von etwa 15 bis etwa 60°C, vorzugsweise von etwa 22 bis etwa 50° C, zu arbeiten. Es ist jedoch möglich, je nach dem im Einzelfalle verwendeten Beizmittel auch bei anderen pH-Werten und/oder anderen Temperaturen zu arbeiten, und zwar bei höheren oder tieferen Temperaturen. Wesentlich ist lediglich, daß man nicht bei pH-Werten und/oder Temperaturen arbeitet, die zur unerwünschten Nebenreaktion oder zu einem Abbau des Bilirubins oder des verwendeten Beizmittels führen. Wird das erfindungsgemäße Verfahren als Lösungs-Bestimmungsmethode durchgeführt, so kann es des weiteren vorteilhaft sein, die Bestimmung im Dunkeln oder unter gelbem Sicherheitslicht durchzuführen, um einen durch Licht induzierten Abbau des Bilirubins zu vermeiden.

Im Falle der »nassen« Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens hat es sich, wie bereits dargelegt, oftmals als vorteilhaft erwiesen, die Bilirubin enthaltende Testprobe zunächst vorzubehandeln, um das Bilirubin von verschiedenen Stoffen, an die es gebunden sein kann, abzudissoziieren oder abzuspalten. Besteht die zu analysierende Flüssigkeitsprobe beispielsweise aus Blutserum, so liegt ein beträchtlicher Anteil des Bilirubins im Serum an Albumin gebunden vor.

Es sind verschiedene Verfahren bekannt, um Bilirubin von Stoffen, wie Albumin abzuspalten. Derartige Methoden können hier angewandt werden, so daß das nachfolgende Bestimmungsverfahren eine genaue Bestimmung des Gesamt-Bilirubingehaltes in der Serumprobe ermöglicht Zu den bekannten Verfahren zur Abspaltung von Bilirubin von verschiedenen Serumproteinen, insbesondere Albumin, gehören die verschiedensten bekannten Protein-Fällungsmethoden, Proben Verdünnungsmethoden und dergleichen, wie sie beispielsweise in der bereits zitierten Literaturstelle »Clinical Chemistry-Principles and Technics«, 2. Ausgabe, 1974, Seiten ί 042 bis 1079 beschrieben werden.
Im Hinblick auf die leichte Handhabung und

ίο Bequemlichkeit, mit der sich quantitative analytische

- Ergebnisse erzielen lassen, hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens analytische Elemente zu verwenden, beispielsweise solche, wie sie in den F i g. 1 und 2 dargestellt sind, und die für die »trockene« Analyse von Bilirubin bestimmt sind.

Ein solches Element weist, wie sich aus F i g. 1 ergibt, eine praktisch trockene Reagens-Zone 7 oder Reagens-Schicht 7 auf, die das beschriebene Beizmittel enthält. In vorteilhafter Weise weist das Element des weiteren eine praktisch trockene Ausbreitzone oder Ausbreitschicht 6 auf. Des weiteren können zusätzlich Zwischenschichten vorhanden sein. Das Element weist somit mindestens zwei diskrete Zonen oder Schichten auf, die sich in Strömungs- oder Flüssigkeitskontakt miteinander unter Verwendungsbedingungen befinden. In besonders vorteilhafter Weise sind die Zonen zu übereinanderliegenden, einander benachbarten Schichten ausgebildet. In typischer Weise befinden sich diese Schichten auf einem Schichtträger 8, der vorzugsweise aus einem strahlungsdurchlässigen Schichtträger besteht.

Obgleich besonders vorteilhafte analytische Elemente nach der Erfindung aus übereinander angeordneten, einander benachbarten Schichten aufgebaut sind, lassen sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens jedoch auch andere Elemente einer anderen Struktur verwenden, beispielsweise Elemente des in F i g. 2 dargestellten Typs mit zwei aneinander angrenzenden Zonen, nämlich einer Ausbreitzone 6 und einer Reagens-Zone 7, die beide auf einem Träger 8, sofern ein solcher erforderlich ist, angeordnet sind.

Zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird im folgenden die Verwendung von analytischen Elementen beschrieben, bei denen differenzierte Zonen zu übereinander angeordneten, einander benachbarten Schichten ausgebildet sind, die auf einen strahlungsdurchlässigen Schichtträger aufgetragen sind.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird zur Durchführung des Verfahrens

so ein analytisches Element verwendet, das eine Ausbreitschicht und eine Reagens-Schicht aufweist, die vorzugsweise strahlungsdurchlässig sind. In vorteilhafter Weise weisen die Elemente einen Schichtträger auf, der ebenfalls vorzugsweise strahlungsdurchlässig ist. Die Anordnung der Schichten auf einem Schichtträger ist jedoch nicht erforderlich, wenn die Schichten selbst die erforderliche Festigkeit und Integrität aufweisen.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird ein Element verwendet, das einen strahlungsdurchlässigen Schichtträger aufweist, auf dem aufgetragen sind:

(1) eine Reagens-Schicht, die mindestens für Bilirubin durchlässig ist und die ein Beizmittel des beschriebenen Typs für Bilirubin enthält und

(2) eine Ausbreitschicht, die für Bilirubin durchlässig ist.

Die Reagens-Schicht ist dabei zwischen Schichtträger und Ausbreitschicht angeordnet Die Ausbreitschicht weist vorzugsweise eine praktisch gleichförmige Durchlässigkeit für Bilirubin auf. Vorzugsweise ist die Reagens-Schicht praktisch undurchlässig; für Proteine mit einem Molekulargewicht, das größer ist als das Molekulargewicht des Bilirubins, d. h. für Albumin und andere Proteine mit einem Molekulargewicht von 60 000 (Dalton-Einheiten) oder darüber.

Gemäß einer weiteren, besonders vorteilhaften Ausgestaliyng der Erfindung besteht, die Ausbreitschicht aus einer nicht-faserigen und vorzugsweise isotrop porösen Schicht. Derartige Schichten sind z. B. aus der US-PS 39 92 158 bekannt

In besonders vorteilhafter Weise sind sämtliche Schichten eines erfindungsgemäßen Elementes als nicht-faserige Schichten ausgestaltet, wodurch die Eignung der Elemente zur Durchführung quantitativer analytischer Ergebnisse weiter verbessert wird. Unter »nicht-faserigen« Schichten sind hier Schichten zu verstehen, die von faserigen Materialien frei oder praktisch frei sind, d. h. keine faserigen Komponenten in solchen Mengen enthalten, die ein Ausbreiten der Proben stören wurden oder die die Bestimmung des analytischen Ergebnisses auf radiometrischem Wege beeinträchtigen könnten.

Wie bereits dargelegt, sind Ausbreitschicht und Reagens-Schicht eines erfindungsgemäßen Elementes vorzugsweise gleichförmig durchlässig oder permeabel für Bilirubin, jedoch praktisch undurchlässig bzw. impermeabel und nicht porös für Proteine von höherem Molekulargewicht. Der Ausdruck »Durchlässigkeit« oder »Permeabilität« bezieht sich dabei beispielsweise auf eine Permeabilität auf Grund einer Porosität, Fähigkeit zur Quellung oder auf Grund anderer Charakteristika.

Die Reagens-Schichten können eine Matrix aufweisen, in der das Beizmittel verteilt ist, d. h. gelöst oder dispergiert ist. Besteht das Beizmittel selbst aus einem Polymer und hat es filmbildende Eigenschaften oder läßt es sich in anderer Weise leicht in Form einer gleichförmigen Schicht oder einer Zone auftragen, so ist die Verwendung einer zusätzlichen Matrix nicht erforderlich. Zur Herstellung der Schichten können die verschiedensten Matrixmaterialien verwendet werden, je nach dem im Einzelfalle verwendeten Beizmittel, das in der Matrix verteilt ist. In jedem Fall sollte das Matrixmaterial »nicht-störend« auf das Beizmittel einwirken, d. h. es sollte ein Matrixmateria¹ verwendet werden, das selbst nicht in der Lage ist, das Beizmittel zu binden oder zu beizen. Vorteilhafte Matrix-Materialien für die Ausbildung der Reagens-Schichten sind nicht-faserige Stoffe, beispielsweise nicht-störende, hydrophile Stoffe, einschließlich Säure-hydrolysierte Gelatinen (z. B. Schweins-Gelatine) und Derivate hiervon mit einem isoelektrischen Punkt von etwa 9,1, hydrophile Cellulosederivate, Polysaccharide, wie beispielsweise Dextran, Gummi arabicum, Agarose und dergleichen sowie synthetische Stoffe, wie beispielsweise in Wasser lösliche Polyvinylverbindungen, wie beispielsweise Poly(vinylalkohol) und Poly(vinylpyrrolidon), Acrylamidpolymere und dergleichen. In vorteilhafter Weise lassen sich auch nicht-störende organophile Stoffe, wie beispielsweise Celluloseester und dergleichen verwenden. Um die Permeabilität einer Reagens-Schicht zu steigern, falls diese nicht porös ist, kann es oftmals vorteilhaft sein, ein Matrixmaterial zu verwenden, das in dem Lösungsmittel oder Dispersionsmedium der zu analysierenden Flüssigkeit quellbar ist Gegebenenfalls kann es des weiteren zweckmäßig oder erforderlich sein, ein solches Material auszuwählen, das das Aufbringen einer benachbarten Schicht nicht stört oder beeinträchtigt, d.h. die Beschichtung während des Herstellungsprozesses des Elementes nicht beeinträchtigt Ist beispielsweise die Ausbildung von diskreten, kontinuierlichen Schichten erwünscht und ist beabsichtigt mit dem analytischen Element wäßrige Flüssigkeiten zu analysieren, so kann es zweckmäßig sein, eine im wesentlichen oder praktisch wasser-lösliche Matrix für die Reagens-Schicht auszuwählen und praktisch organolösliche oder organodispergierbare Komponenten oder Ingredienzien für eine benachbarte Schicht, wie beispielsweise eine Ausbreitschicht Auf diese Weise wird eine wechselseitige Lösungsmitteleinwirkung auf ein Minimum vermindert, und es wird eine klar definierte Schichtenstruktur erhalten. In manchen Fällen kann es vorteilhaft sein, um eine Diffusion von hochmolekularen Proteinen in die Reagens-Schicht zu vermeiden (bei den Proteinen kann es sich um potentielle Bilirubin-Störkomponenten handeln), eine Reagens-Schicht zu verwenden, die eine geringere Durchlässigkeit oder Permeabilität hat als die Ausbreitschicht. Dies läßt sich beispielsweise dadurch erreichen, daß man die effektive Porengröße der Reagens-Schicht vermindert.

Die relative Durchlässigkeit oder Permeabilität oder Porosität einer Schicht läßt sich nach üblichen bekannten Methoden ermitteln.

Die Verteilung des Beizmittels in der Reagens-Schicht kann durch Lösen oder Dispergieren des Beizmittels in einem Matrixmaterial erfolgen, sofern ein solches verwendet wird. Obgleich es oftmals vorteilhaft ist, wenn die Verteilung des Beizmittels gleichförmig ist, ist eine solche gleichförmige Verteilung jedoch nicht unbedingt erforderlich.

Wie im Falle des »nassen« Verfahrens kann auch bei der »trockenen« Arbeitsweise, d. h. bei Verwendung eines analytischen Elementes, eine pH-Puffersubstanz oder Puffersubstanzen verwendet werden. Diese Puffersubstanz oder Puffersubstanzen können in das analytische Element eingearbeitet werden, beispielsweise in die Reagensschicht oder in eine oder mehrere der anderen Schichten, und zwar vorzugsweise in Mengen, daß die Reagens-Schicht unter den Anwendungsbedingungen des Elementes einen pH-Wert aufweist, der identisch oder praktisch identisch ist mit dem pH-Wert, der vorzugsweise bei der »nassen« Methode angewandt wird. Zur Herstellung der Elemente können die verschiedensten üblichen bekannten Puffersubstanzen verwendet werden, beispielsweise Phosphatpuffer und andere, wie sie z. B. von Good in der Zeitschrift »Biochemistry«, 5 (1966), Seite 467 beschrieben werden.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter veranschaulichen.

Beispiel 1
Bestimmung von Bilirubin in Lösung

Aus diesem Beispiel ergibt sich, daß Bilirubin in einem flüssigen Bestimmungsmedium und in Gegenwart von bestimmten Beizmitteln seinen Ä_mflrWert (die maximale Absorptionsspitze) von 435 bis 440 nm auf 460 nm vei schiebt, unter einer bemerkenswerten Steigerung der molaren Extinktion bei dieser neuen Absorptionsspitze.

Um dies zu zeigen, wurden die Absorptionsspektren

(360 bis 600 nm, abgelesen mittels eines Spektrophotometers bei 37⁰C) von vier Flüssigkeitsproben, im folgenden als Flüssigkeitsproben A bis D bezeichnet, aufgezeichnet.

A) 0,05 M Natriumdihydrogenphosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,4;

B) 0,012%ige Lösung (Gewicht/Volumen) des Beizmittels Nr. 6 der Tabelle I in einer Natriumdihydrogenphosphatpufferlösung eines pH-Wertes von 7,4;

C) 1 mg Bilirubin/dl in einer Natriumdihydrogenphosphatpufferlösung eines pH-Wertes von 7,4;

D) 1 mg Bilirubin/dl + 0,012% (Gewicht/Volumen) des Beizmittels 6 der Tabelle I in einer Natriumdihydrogenphosphatpufferlösung eines pH-Wertes von 7,4.

Die erhaltenen Absorptionsspektren zeigen folgendes:

1. bei den getesteten Konzentrationen beeinflußt weder die Phosphatpufferlösung (Lösung A) noch das Beizmittel Nr. 6 allein (Lösung B) die Absorption innerhalb des angegebenen Spektralbereiches;

2. das Bilirubin allein (Lösung C) hat ein Absorptionsmaximum (A_ma,) bei 435 bis 440 nm; und

3. Bilirubin in Gegenwart des Beizmittels 6 von Tabelle I (Lösung D) führt zu einer Verschiebung seines X_max-Wertes auf 460 nm, wobei die Verschiebung begleitet ist von einem 2fachen Anstieg der Absorption bei der neuen Spitze, d. h.:

£„,460 40 χ 103 -* £i_m46080 χ 103

(Emm stellt den molaren Extinktionskoeffizienten von Bilirubin allein dar);

(.Fm «ο stellt den molaren Extinktionskoeffizienten von Bilirubin und Beizmittel 6 der Tabelle I dar).

Beispiel 2

Bilirubin-Bestimmung unter Verwendung eines
analytischen Elementes

Es wurde ein integrales analytisches Element wie folgt hergestellt:

Auf einen transparenten, bandförmigen Polyäthylenterephthalat-Schichtträger wurde zunächst eine Reagens-Schicht aus dem Beizmittel 4 der Tabelle 1 in einer Schichtstärke von 0,54 g/m² aufgetragen. Auf die Reagens-Schicht wurde eine Haftschicht aus 0,32 g Poly(n-isopropylacrylamid) pro m² Schichtträgerfläche aufgebracht Hierauf wurde dann eine Ausbreitschicht aus einem Blushed-Polymeren aus 6,45 g Celluloseacetat, 45,6 g TiO2, 2,51 g Octylphenoxypolyäthoxyäthanol (Triton X-405, Hersteller Rohm & Haas Company) und 0,64 g eines Polyäthylenglykol-Oleyläthers, jeweils pro m² Schichtträgerfläche aufgetragen.

Das hergestellte analytische Element wurde dann wie folgt getestet:

Zunächst wurde eine Reihe von Bilirubinlösungen mit 7 g menschlichem Serumalbumin/dl und 100 mM einer Salzlösung (Saline) und verschiedene Mengen von Bilirubin (0 bis 20 mg Bilirubin pro dl Lösung) hergestellt Die Lösungen wurden dann auf das hergestellte Element aufgetüpfelt, und zwar in Form von 10 Mikroliter Tropfen.

Ermittelt wurde die Veränderung der Reflexionsdichte, ADr des analytischen Elementes (gemessen bei 460 nm und 37°C) nach 7 Minuten.

Aus Fig.3 ergibt sich das Ansprechvermögen des Elementes im Falle des getesteten Bilirubin-Konzentrationsbereiches von 0 bis 20 mg/dl.

Mit dem analytischen Element ließen sich ausgezeichnet reproduzierbare Ergebnisse erhalten.

Beispiel 3

Bilirubin-Beizmittel-Reaktion in einem
analytischen Element mit Beizmittel und Gelatine

Es wurde ein weiteres analytisches, bandförmiges Element wie folgt hergestellt:

Auf einen bandförmigen transparenten Polyäthylenterephthalat-Schichtträger wurde zunächst eine Reagens-Schicht mit 2,2 g des Beizmittels Nr. 6 von Tabelle I und 4,1 g Gelatine, jeweils pro m² Schichtträgerfläche aufgetragen. Anschließend wurde eine Ausbreitschicht der in Beispiel 2 angegebenen Zusammensetzung aufgetragen.

Das hergestellte analytische Element wurde dann, wie in Beispiel 2 beschrieben, getestet.

Verwendet wurde eine Reihe wäßriger Lösungen mit verschiedenem Bilirubingehalt und einem pH-Wert von 7,4 sowie eine Reihe von Salzlösungen mit einem pH-Wert von 7,4 und 7 g/dl Albumin sowie verschiedenen Konzentrationen an Bilirubin.

Es zeigte sich, daß das analytische Element dieses Beispieles durch ein sehr lineares spektrophotometrisches Ansprechvermögen auf verschiedene Bilirubinkonzentrationen gekennzeichnet war. Die Unempfindlichkeit des Elementes gegenüber Albumin ergab sich aus den übereinstimmenden analytischen Werten, die bei Verwendung von Testlösungen mit und ohne Albumin erhalten wurden.

Beispiel 4

Bilirubin-Beizmittel-Reaktion in einem
analytischen Element unter Verwendung eines Gel-Pads

Zunächst wurde ein weiteres analytisches Element der folgenden Zusammensetzung hergestellt:
Ein Schichtträger, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurde mit einem Gel-Pad mit 1,1 g Rinder-Serumalbumin und 2,3 g Gelatine pro m² Schichtträgerfläche beschichtet Auf die aufgetragene Schicht wurde dann eine Reagens-Schicht aus 1,1 g des Beizmittels Nr. 6 von Tabelle I und 1,1 g Gelatine, jeweils pro m² Schichtträgerfläche aufgetragen. Auf die aufgetragene Reagensschicht wurde dann eine Ausbreitschicht, wie in Beispiel 2 beschrieben, aufgebracht

Das hergestellte, bandförmige Aufzeichnungsmaterial wurde dann, wie in Beispiel 2 beschrieben, getestet Wäßrige Lösungen (erhalten von der Firma American Monitor Corp., Indianapolis, Indiana), die 7 g/dl menschliches Serumalbumin in einer Salzlösung und verschiedene Konzentrationen an Bilirubin enthielten, wurden zum Eichen des Elementes verwendet

' Das geeichte Element wurde dann zur Untersuchung von verschiedenen, im Handel erhältlichen menschlichen Serumsurrogaten verschiedener Zusammensetzung mit bekanntem Bilirubingehalt verwendet. Die bei Verwendung des Elementes gemessenen Bilirubinwerte (bei Bilirubinkonzentrationen von 0,5 bis 20,0 mg/dl) stimmten ausgezeichnet mit den Bilirubinkonzentrationswerten überein, die die Hersteller der Serumsurrogate angegeben hatten.

Beispiel 5

28 Ol 476

Keine spektralen Störungen auf Grund von Hämoglobin

Die meisten bekannten, wenn nicht alle bekannten, direkt-spektrophotometrischen Bestimmungsverfahren für Bilirubin leiden unter spektralen Störungen auf Grund des Vorhandenseins von Hämoglobin, das im Serum in Konzentrationen von weniger als 20 mg/dl vorhanden ist. Um zu veranschaulichen, daß erfindungsgemäße mehrschichtige analytische Elemente praktisch frei von spektralen Störungen auf Grund des Hämoglobins sind, wurden auf mehrere Elemente des in Beispiel 3 beschriebenen Aufbaues Flüssigkeitsproben aufgetüpfelt, die entweder 1 mg oder 15 mg Bilirubin pro dl sowie verschiedene Konzentrationen an Hämoglobin von 0 bis 150 mg/dl enthielten. Von jedem Element wurde die Reflexionsdichte, Dr, bei 460 nm gemessen. Es wurden keine Veränderungen im Ansprechvermögen der Elemente über den angegebenen weiten Hämoglobinkonzentrationsbereich festgestellt, woraus sich ergibt, daß Hämoglobin das Bestimmungsverfahren bei 460 nm nicht stört.

Beispiel 6
Einfluß von pH-Wertsveränderungen

Um die Unempfindlichkeit des erfindungsgemäßen Bilirubin-Bestimmungsverfahrens gegenüber pH-Wertveränderungen zu veranschaulichen, die bei verschiedenen Proben, wie beispielsweise Blutserumproben, auftreten können, wurden zwei Reihen von Bilirubin-Standardlösungen mit Bilirubinkonzentrationen von 0 bis 20 mg/dl getestet. Die Lösungen der einen Reihe hatten einen pH-Wert von 7,4 und die Lösungen der anderen Reihe einen pH-Wert von 8,2. Die Lösungen enthielten pro dl 7 g menschliches Serumalbumin, Salz (Saline) und einen Natriumdihydrogenphosphatpuffer in einer 0,05molaren Konzentration. Die Lösungen wurden auf analytische Elemente des in Beispiel 2 beschriebenen Typs aufgetüpfelt. Die Elemente wurden dann in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise untersucht Aus den erhaltenen Meßergebnissen ergab sich keine Empfindlichkeit der Elemente gegenüber pH-Wertsveränderungen im angegebenen Bereich.

Beispiel 7

Einfluß von Temperaturveränderungen

Analytische Elemente des in Beispiel 3 beschriebenen Typs wurden dazu verwendet, um die Empfindlichkeit der Elemente gegenüber Temperaturveränderungen zu untersuchen. Für die Untersuchungen wurden Bilirubin-Standardlösungen eines pH-Wertes von 7,4 verwendet. Obgleich das Ansprechvermögen des Elementes bei 27°C etwas geringer war, wurden bei Temperaturen zwischen 37 und 42° C praktisch keine Veränderungen festgestellt.

Beispiel 8
Aufbewahrungseigenschaften

Urn die Stabilität der Elemente bei einer 1 monatigen Aufbewahrung bei Raumtemperatur (20° C) zu testen, wurden analytische Elemente und Bilirubin-Standardlösungen, wie in Beispiel 7 beschrieben, verwendet. Es ergab sich, daß die Elemente eine ausgezeichnete Stabilität aufwiesen. Es zeigte sich, daß sich das Ansprechvermögen der gelagerten Elemente gegenüber frisch hergestellten Elementen praktisch nicht veränderte.

Beispiel 9
Keine Störung durch Carotinoide

Aus der Literatur ergibt sich, daß j5-Carotin, das im menschlichen Serum hauptsächlich vorkommende Carotinoid eine potentielle Störungsquelle bei der direkten spektrophotometrischen Bestimmung für Bilirubin ist, da es bei 450 nm absorbiert.

Im Falle dieses Beispieles wurde das spektrophotometrische Ansprechvermögen analytischer Elemente der Erfindung (hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben) im Falle von vier flüssigen Salztestiösungen mit 7 g Albumin, 1 bis 20 mg Bilirubin und 0,02 oder 0,2 mg J3-Carotin, jeweils pro dl Lösung ermittelt. Es zeigte sich, daß bei den angegebenen /S-Carotinwerten, die den üblichen Konzentrationen im menschlichen Serum entsprechen, keine nachteiligen Effekte auf Grund des Vorhandenseins von J?-Carotin feststellbar waren.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

330 249/336

Claims

Patentansprüche:

1. Kolorimetrisches Verfahren für die Bestimmung yon Bilirubin in einer wäßrigen Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) eine Probe der zu analysierenden Flüssigkeit mit einem eine oder mehrere Bindungsstellen für Bilirubin aufweisenden Beizmittel, welches aus einer hydrophoben organischen Matrix und mindestens einer eine Ladung aufweisenden kationischen Gruppe zusammengesetzt ist, in Kontakt bringt und das Bilirubin derart beizt, daß es danach eine Absorptionsspitze aufweist, die gegenüber der Absorptionsspitze des freien Bilirubins um mindestens 10 nm verschoben ist und einen molaren Extinktionskoeffizienter. der um mindestens 50% höher ist als der dt-, freien Bilirubins, und daß man

(b) das gebeizte Bilirubin kolorimetrisch bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Beizmittel in ein flüssiges Medium einmischt und hierin mit der zu analysierenden wäßrigen Flüssigkeit bei einem pH-Wert von 6,8 bis 9,5 und einer Temperatur von 15 bis 6O⁰C in Kontakt bringt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Probe Blutserum verwendet, das zur Herabsetzung seines Proteingehaltes vorbehandelt wurde.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Beizmittel für Bilirubin ein Polymer mit wiederkehrenden Einheiten der folgenden Formel verwendet:

X^e

in der bedeuten:

40

45

A einen organischen Rest;

Q eine chemische Bindung oder einen chemischen

Rest, wodurch M® an A gebunden ist, M® einen quaternären Ammonium- oder Phosphoniumrestund

Χ^Θ einSäureanion.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekenn zeichnet, daß man als Beizmittel für Bilirubin eil Polymer mit wiederkehrenden Einheiten der folgen den Formel verwendet:

R¹—N^ffl—R²

. 1.

worin bedeuten:

A einen Alkylenrest;

Χ^θ

60

65 Q einen Kohlenwasserstoffrest, der das Stickstoffatom an A bindet und 5 bis 10 C-Atome aufweist;

R¹, R² und R³ jeweils einen Alkylrest mit 1 bis weniger als 10 C-Atomen odei einen Aryl-, Aralkyl- oder Alkarylrest mit 5 bis weniger als 20 C-Atomen, wobei R¹, R² und R³ die gleiche oder eine voneinander verschiedene Bedeutung haben können und

Χ^θ ein Säureanion.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Beizmittel für Bilirubin ein Copolymer verwendet, das hergestellt wurde durch Copolymerisation einer monomeren Mischung aus:

(a) 25 bis 90 Gew.-°/o einer monomeren Vorläuferverbindung für die Erzeugung von Einheiten der folgenden Formel:

i_N®—R²

R³
worin bedeuten:

I Χ^θ

A einen Alkylenrest;

Q einen Kohlenwasserstoffrest, der das Stickstoffatom an A bindet und 5 bis 10 C-Atome aufweist;

R¹, R² und R³ jeweils einen Alkylrest mit 1 bis weniger als 10 C-Atomen oder einen Aryl-, Aralkyl- oder Alkarylrest mit 5 bis weniger als 20 C-Atomen und

X ein Säureanion und

(b) 10 bis 75 Gew.-% an copolymerisierbaren Monomeren, bestehend aus aliphatischen und/ oder aromatischen Kohlenwasserstoffen, Alkylacrylaten und/oder Alkylmethacrylaten und

(c) 0 bis 5 Gew.-°/o eines di-funktionellen Quervernetzungsmittels.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Beizmittel verwendet:

Poly(N,N,N-trimethyl-N-vinyI-benzyl-

ammonium)chlorid;
Poly[styrol-co-benzyl(dimethyl)-p-vinyl-

benzylammoniumchlorid];
Poly[styrol-co-vinylbenzyl-N,N-dimethyl-

benzylammoniumchlorid-co-divinylbenzol];
Poly(N,N,N-trimethyl-N-vinyIbenzylammonium-

chlorid-co-styrol);

Pory(N,N,N-triocty!-N-vinyIbenzylphosphonium-

chlorid) oder
Poly(styrol-co-(vinylbenzyl)-(trihexyl)-

ammoniumchlorid).

8. Analytisches Element für die Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 7, mit einer Ausbreitzone und einer Reagenszone, die bei

Verwendung des Elementes in Strömungskontakt miteinander stehen, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenszone ein eine oder mehrere Bindungsstellen für Bilirubin aufweisendes Beizmittel, welches aus einer hydrophoben organischen Matrix und mindestens einer eine Ladung aufweisenden kationischen Gruppe zusammengesetzt ^;st und das Bilirubin derart zu beizen vermag, daß es danach eine Absorptionsspitze aufweist, die gegenüber der Absorptionsspitze des freien Bilirubins um -nindestens 10 nm verschoben ist und einen molaren Extinktionskoeffizienten, der um mindestens 50% hoher ist als der des freien Bilirubins, enthält

9. Element «ach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausbreitzone und die Reagenszone zu übereinander angeordneten Schichten ausgebildet sind, die auf einem strahlungsdurchlässigen Schichtträger angeordnet sind, wobei die Reagensschicht zwischen dem Schichtträger und der Ausbreitschicht liegt.

10. Element nach einem der Ansprüche 8 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß es als Beizmittel ein Polymer mit wiederkehrenden Einheiten der folgenden Formel aufweist:

25

Χ^Θ

30

worin bedeuten:

A einen organischen Rest;

Q eine chemische Bindung oder einen chemischen

Rest, wodurch M® an A gebunden ist;
Μ® einen quaternären Ammonium- oder Phospho-

niumrestund
X® ein Säureanion.

11. Element nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausbreitschicht eine oberflächenaktive Verbindung zur Normalisierung des Transportes des Bilirubin durch die Schicht aufweist.

12. Element nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es als Beizmittel ein Polymer mit wiederkehrenden Einheiten der folgenden Formel enthält:

40

1—Ν^β—R²

Χ^θ

worin bedeuten:

45

50

55

60

A einen Alkylenrest;

R', R² und R³ jeweils einen Alkylrest mit 1 bis weniger als 10 C-Atomen oder einen Aryl-, Aralkyl- oder Alkarylrest mit 5 bis weniger als 20 C-Atomen, wobei R¹, R² und R³ die gleiche oder eine voneinander verschiedene Bedeutung aufweisen können, und
Χ^θ ein Säureanion.

13. Element nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Beizmittel erhalten wurde durch Copolymerisation einer Mischung von Monomeren aus:

(a) 25 bis 90 Gew.-% monomeren Verbindungen für die Erzeugung von wiederkehrenden Einheiten der folgenden Formel:

i_N^ffi—R²

worin bedeuten:

A einen Alkylenrest;

R¹, R^ und R³, die die gleiche oder eine voneinander verschiedene Bedeutung aufweisen können, jeweils einen Alkylrest mit 1 bis weniger als 10 C-Atomen oder einen Aryl-, Aralkyl- oder Alkarylrest mit 5 bis weniger als 20 C-Atomen und
ein Säureanion;

10 bis 75 Gew.-% an copolymerisierbaren Monomeren, bestehend aus aliphatischen und/ oder aromatischen Kohlenwasserstoffresten, Alkylacrylaten und/oder Alkylmethacrylaten und

0 bis 5.Gew.-% eines difunktionellen Querver-'netzurfgsmitfels.

14. Element nach einem der Ansprüche 8 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß es zwischen Reagensschicht und Träger eine Wasserquellbare Zwischenschicht aufweist.

15. Element nach einem der Ansprüche 8 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es zwischen Ausbreitschicht und Reagensschicht eine Zwischenschicht aufweist, die Glucuronidase enthält.

16. Element nach einem der Ansprüche 8 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es in der Ausbreitschicht Glucuronidase enthält.

17. Element nach einem der Ansprüche 8 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausbreitschicht aus einer porösen polymeren Masse oder einer teilchenförmigen Masse aufgebaut ist.

18. Element nach einem der Ansprüche 8 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausbreitschicht aus einem Polymer aufgebaut ist, in dem ein teilchenförmiges Material dispergiertist.

19. Element nach einem der Ansprüche 8 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß es als Beizmittel enthält:

Poly(N,N,N-trimethyl-N-vinylbenzylammonium)chlorid;

Poly[styrol-co-benzyl(dimethyl)-p-vinyl-

benzylammoniumchlorid]; Poly[styrol-co-(vinylbenzyl)-(trihexyl)-

ammoniumchlorid];
Polyfstyrol-co-N-vinylbenzyl-N.N-dimethyl-

benzylammoniumchlorid-co-divinylbenzol]; Poly(N,N,N-trimethyI-N-vinyIbenzylammonium-

chlorid-co-styrol) oder

Poly-iN.N.N-trioctyl-N-vinylbenzylphosphonium-

chlorid).