CH627555A5

CH627555A5 - Procede colorimetrique pour la detection et la dosage de la bilirubine.

Info

Publication number: CH627555A5
Application number: CH37978A
Authority: CH
Inventors: Tai-Wing Wu; Glen Marshall Dappen
Original assignee: Eastman Kodak Co
Priority date: 1977-01-14
Filing date: 1978-01-13
Publication date: 1982-01-15
Also published as: GB1591683A; DE2801476C2; FR2377632A1; BE862956A; SE7800403L; CA1094432A; JPS6339873B2; JPS57160063A; FR2377632B1; JPS5389796A; DE2801476A1; US4069017A; SE443048B; JPS6222100B2

Description

L'invention a essentiellement pour objets:

- un procédé colorimétrique pour la détection et le dosage de la bilirubine dans un liquide aqueux, dans lequel on met en contact dans une zone de réaction ce liquide aqueux et un mordant ayant au moins un site de fixation pour la bilirubine et comprenant au moins un groupe cationique porteur de charges, de sorte que la bilirubine est mordancée, et que, sur cette forme mordancée, son pic d'absorption spectrale est décalé d'au moins 10 nm par rapport à celui de la bilirubine libre et son coefficient d'extinction molaire à la longueur d'onde du pic est augmenté d'au moins 50% par rapport à celui de la bilirubine libre, et on examine ensuite colorimétriquement la bilirubine mordancée; et

- un produit analytique pour la mise en œuvre du procédé ci-dessus, comprenant une zone de réaction et une zone d'étalement, en relation d'échange de fluide dans les conditions d'utilisation, la zone de réaction comprenant la composition de morde la ige ; aucune zone où se produit une réaction ne contient de composé fluorescent ou fortement coloré ou de composé formateur d'un tel composé.

On a trouvé, suivant l'invention, un procédé colorimétrique direct pour doser la bilirubine dans les milieux aqueux; selon ce procédé, on met en contact la prise d'essai et un réactif mordant ayant au moins un site de liaison pour la bilirubine. Ce réactif comprend une matrice et au moins un groupe cationique portant une charge. A la suite de la réaction initiale, la bilirubine se trouve mordancée ; en d'autres termes, elle se trouve liée au mordant, ce qui produit un déplacement d'au moins environ 10 nm du pic d'absorption de la bilirubine et un accroissement d'au moins environ 50% du coefficient d'extinction molaire de la bilirubine (mesuré au nouveau pic d'absorption). Avantageuse

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ment, suivant des modes particulièrement souhaitables de mise en œuvre de l'invention, le pic d'absorption de la bilirubine mordancée est décalé de sorte que sa nouvelle longueur d'onde est d'au moins 460 nm, et le coefficient d'extinction moléculaire a crû jusqu'à au moins 7,5-10" 4 s

Le procédé suivant l'invention permet avantageusement de déceler et de doser la bilirubine dans les liquides biologiques tels que le sans, le sérum sanguin, l'urine, etc. ; dans le sérum, le procédé permet notamment de réduire l'influence de certaines matières qui interfèrent souvent dans le dosage de la bilirubine ; m ces matières sont, par exemple, l'hémoglobine, les caroténoïdes, etc. Ce résultat est obtenu en partie grâce à l'accroissement important au coefficient d'absorption de la bilirubine mordancée et en partie au décalage du maximum d'absorption; ces deux modifications des propriétés spectrales sont la conséquence de i5 la fixation de la bilirubine sur la composition de mordançage. En fait, quand on cherche ou quand on dose la bilirubine dans divers liquides biologiques, il peut toujours être avantageux d'éliminer et de séparer de la bilirubine diverses matières protéi-ques de plus grandes masses moléculaires, telle que l'albumine, 20 qui pourraient fausser le. dosage en fixant la bilirubine: on peut ainsi doser la bilirubine totale contenue dans le liquide analysé. Pour cette raison, suivant un mode de réalisation de l'invention, on peut soumettre le liquide étudié à un traitement préliminaire de séparation ou d'élimination de ces matières pouvant fausser 25 le dosage de la bilirubine. Ce traitement préliminaire peut comprendre les manipulations habituelles de séparation ou d'élimination de ces matières protéiques de grandes masses moléculaires interférant avec la bilirubine, telles que la précipitation de ces protéines, la dilution de la prise d'essai, etc. 30

Suivant un autre mode particulièrement avantageux de réalisation de l'invention, on fait la recherche et le dosage de la bilirubine dans un liquide au moyen d'un produit analytique défini ci-dessus. Ce produit analytique suivant l'invention comprend une zone de réaction qui peut être, par exemple, une 35 couche d'une composition contenant le mordant servant de réactif pour la bilirubine, et une zone ou couche dite «d'étalement» qui répartit l'échantillon de liquide analysé dans la zone de réaction. On peut, si l'on veut, introduire un agent tensioactif dans la zone d'étalement en quantité convenable pour régulari- 40 ser le transport de la bilirubine dans cette zone, même en présence de quantités très variables de protéines de grandes masses moléculaires, interférant dans le dosage de la bilirubine, telles que l'albumine par exemple. Si l'on soumet systématiquement l'échantillon de liquide à analyser à un traitement préliminaire 45 indépendant, éliminant pratiquement la totalité des protéines pouvant interférer dans le dosage (par exemple, un traitement de précipitation des protéines, ou une simple dilution), on peut mettre en œuvre l'invention en utilisant un produit analytique comprenant comme unique élément actif la zone de réaction 50 déjà définie.

Suivant un mode de réalisation de l'invention, la zone de réaction du produit analytique pour l'essai de la bilirubine est imperméable aux protéines de grandes masses moléculaires susceptibles de fausser le dosage de la bilirubine, c'est-à dire aux 55 protéines ayant des masses moléculaires d'au moins 60 000, de manière à supprimer l'interférence de ces matières.

Suivant un mode avantageux de réalisation, les produits analytiques suivant l'invention sont des produits composites dans lesquels la zone de réaction et la zone d'étendage sont des 60 couches déposées sur un support, tel qu'un support «transparent aux radiations». Dans la présente description, ce terme désigne une zone ou un support d'un produit analytique qui laisse passer la ou les radiations électromagnétiques utilisées pour détecter le résultat analytique obtenu dans le produit analytique. Cette f.s transparence peut concerner les radiations électromagnétiques ayant des longueurs d'onde comprises dans tout ou partie de l'intervalle de 300 nm à 700 nm. Dans ce mode de réalisation,

on peut placer des couches intermédiaires distinctes entre la couche de réaction et le support ou entre la couche de réaction et la couche d'étalement. Ces couches intermédiaires peuvent contenir des réactifs supplémentaires servant, par exemple, à éliminer du liquide à analyser des matières susceptibles de fausser le dosage ; si l'on désire, ces couches intermédiaires peuvent contenir des matières hydrophiles, gonflant à l'eau, par exemple, de la gélatine, servant à améliorer le transport du liquide dans les diverses couches du produit analytique.

Les diverses zones des produits analytiques suivant l'invention doivent être en «relation d'échange de fluide» l'une avec l'autre, au moins dans les conditions d'utilisation. On entend par ce terme que ces zones superposées ou aboutées doivent être telles qu'un liquide peut passer de l'une à l'autre. Des zones en relation d'échange de fluide peuvent être contiguës ou séparées par des zones intermédiaires, elles-mêmes en relation d'échange de fluide, permettant le passage des liquides.

On peut obtenir une relation d'échange de fluide entre deux zones en préparant un produit ayant des zones initialement contiguës ou initialement disposées pour permettre le passage du fluide. On peut aussi préparer un produit ayant des zones qui ne sont pas initialement contiguës et même des zones systématiquement séparées, par exemple par des intercalaires, comme décrit au brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 511 608, ou par une matière absorbante élastique ou par un support déformable, comme décrit aux brevets des Etats-Unis d'Amérique 3 917 453 et 3 933 594. Naturellement, si le produit a des zones qui ne sont pas initialement contiguës, il peut être nécessaire d'appliquer une force de compression ou un autre moyen pour mettre ces zones en relation d'échange de fluide au moment de son utilisation pour obtenir un résultat analytique.

Le terme «perméable» désigne la propriété d'une substance ou d'une zone de se laisser réellement pénétrer par une matière transportée, c'est-à-dire une matière distribuée dans un liquide, par exemple par dissolution ou dispersion.

Pour l'utilisation, un produit analytique suivant l'invention peut recevoir une prise du liquide à analyser qui, s'il contient de la bilirubine, réagit avec le mordant réactif dans la zone de réaction pour provoquer un déplacement du pic d'absorption de la bilirubine libre au moins égal à 10 nm et un coefficient d'extinction moléculaire au maximum du pic dépassant environ 7,5 • 10-4. Dans la présente description, le terme «bilirubine libre» comprend la bilirubine conjuguée, ou la bilirubine non conjuguée, qui n'est pas liée aux protéines du sérum. Typiquement, la bilirubine libre présente un pic d'absorption entre environ 435 nm et environ 440 nm et un coefficient moléculaire Em d'environ 5 • 104, quand elle est mesurée à 22 °C, à un pH d'environ 7,4. Sauf indication contraire, tous les coefficients moléculaires indiqués sont mesurés à 22 °C, à un pH d'environ 7,4.

Si le produit comprend une zone d'étalement, l'échantillon appliqué doit généralement traverser cette zone pour atteindre celle de réaction, et l'échantillon doit être réparti uniformément dans la zone d'étalement de manière que la concentration superficielle en échantillon à la surface de la zone d'étalement située en face de la zone de réaction soit apparemment uniforme. Il est possible d'obtenir cette concentration superficielle uniforme pour des volumes d'échantillon pouvant beaucoup varier. Par suite de la relation d'échange de fluide entre la zone de réaction et la zone d'étalement et aussi de la perméabilité, avantageusement uniforme, de la zone d'étalement pour la bilirubine étalée dans cette zone, les constituants de l'échantillon se trouvent uniformément déplacés de la zone d'étalement vers la zone de réaction et peuvent pénétrer dans cette dernière zone sans qu'aucune variation significative de la concentration apparente de la bilirubine ne se produise à un moment quelconque. Par suite de la présence du mordant dans la zone de réaction et de l'uniformité de la concentration apparente de la bilirubine trans-

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férée de la zone d'étalement vers la zone de réaction, on obtient un changement quantitatif uniforme dans le produit analytique. Ce changement peut être décelé par radiométrie et, si l'on veut, par un dispositif automatique de mesures radiométriques, tel qu'un photomètre. 5

Il est souhaitable d'utiliser le produit analytique décrit ci-dessus pour mettre en œuvre le procédé de dosage de la bilirubine suivant l'invention, en opérant par voie sèche, ce produit analytique comprenant une zone d'étalement. On a trouvé, en effet, qu'on élimine efficacement la plupart des composés en- m traînant les causes d'erreurs dans le dosage de la bilirubine, ce qui est surprenant. Non seulement, les interférences des caroténoïdes et de l'hémoglobine sont supprimées, mais encore le chlorure de sodium et l'ensemble des protéines contenues dans la prise d'essai n'ont que peu ou pas d'action. 15

Les produits analytiques décrits ci-dessus permettent la mise en œuvre du procédé d'analyse de la bilirubine suivant l'invention, non seulement par voie sèche, mais aussi par voie humide, avec des solutions, de manière classique. Dans ce cas, la composition réactive, introduite dans un milieu liquide convenable est 20 mise en contact avec une prise d'essai du liquide étudié contenant de la bilirubine.

Dans les deux cas, voie humide et voie sèche, il est conseillé de soumettre le liquide étudié à un traitement préliminaire d'élimination des protéines de grandes masses moléculaires qui faus- 25 sent le dosage de la bilirubine. Ceci peut être fait par l'une quelconque des techniques de séparation indiquées ci-dessus.

Divers produits analytiques à couches multiples contenant un mordant, ayant une structure proche des produits analytiques suivant l'invention font l'objet du brevet belge 831 660. Néan- 30 moins, ce brevet n'indique pas de réactif destiné à la recherche et au dosage de la bilirubine. De plus, le mordant qu'on préconise d'utiliser selon ce brevet est destiné à agir sur autre chose que le composé qu'on veut chercher ou doser. Le produit analytique suivant l'invention diffère fondamentalement de ceux de 35 ce brevet en ce que la zone de réaction contient un mordant qui est le réactif spécifique du composé cherché.

Au dessin annexé, illustrant l'invention:

- les figures 1 et 2 sont des vues en perspective, très agrandies, de produits analytiques composites suivant divers modes 40 de réalisation de l'invention ;

- la figure 3 est un graphique sur lequel on a porté en abcisses les concentrations en bilirubine (en milligrammes pour cent centimètres cubes) et en ordonnées la modification relative (en pourcentage) de densité optique mesurée par réflexion, ce 45 graphique formant ainsi une couche d'étalonnage.

Suivant certaines modes avantageux de l'invention, on a trouvé que des mordants polymères connus, utilisés dans l'industrie photographique, notamment dans les pellicules et papiers photographiques, contenant des motifs à groupes cationi- 50 ques porteurs de charges, ces motifs ou d'autres motifs contenant des groupes apportant des propriétés hydrophobes, sont des mordants particulièrement efficaces pour doser la bilirubine suivant l'invention. Néanmoins, d'autres polymères ayant les propriétés et les compositions chimiques indiquées ci-dessus, 55 mais n'ayant pas d'application photographique connue, peuvent être utilisés dans la mise en œuvre de l'invention.

Des mordants polymères particulièrement utilisables sont ceux qui contiennent des motifs de formule

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Q

I

M® X®

où:

- A représente un groupe organique intercalé dans la chaîne macromoléculaire ;

- Q représente une ou plusieurs liaisons chimiques, ou un groupe reliant M® à A ;

- M® représente un groupe cationique, tel qu'un groupe ammonium ou phosphonium quaternaire ;

- X® représente un anion, tel qu'un anion halogénure (par exemple, chlorure ou bromure), nitrate, méthosulfate, p-toluè-nesulfonate, etc.

Suivant des modes très avantageux de mise en œuvre de l'invention, M® désigne un groupe ammonium ou phosphonium quaternaire de formule:

I

II. R'-N ®—R2

I

R3

ou

I

III. R'-p ©-R1

I

R3

où R1, R2, R3, identiques ou différents, désignent des groupes aryle, arylalkyle, alkylaryle ayant de cinq à moins d'environ vingt atomes de carbone ou des groupes alkyle ayant de un à environ dix atomes de carbone.

Dans la formule I, Q désigne avantageusement un groupe hydrocarboné, tel qu'un groupe arylène, arylènealkylène, alky-lènearylène, arylènebis(alkylène) ou alkylènebis(arylène). Dans des exemples typiques, nullement limitatifs, Q contient d'environ cinq à environ dix atomes de carbone.

A, dans la formule I, dépend du type général de polymère utilisé. On obtient des résultats particulièrement bons quand A désigne un groupe alkylène contenant de deux à environ dix atomes de carbone, et avantageusement de deux à quatre atomes de carbone.

Les mordants polymères utilisables dans l'invention comme réactifs peuvent être des homopolymères ou, avantageusement, des copolymères. Ils peuvent contenir des motifs de formule I ci-dessus et, en plus, jusqu'à 75/100, en masse, de motifs «inertes», c'est-à-dire de motifs n'intervenant pas dans la réaction du mordant avec la bilirubine. Des exemples de comonomères formant ces motifs inertes et apportant des propriétés hydrophobes au polymère sont les composés suivants: hydrocarbures aliphatiques et aromatiques, tels que les oléfines, les olé-fines substituées, le styrène et les styrènes substitués, les acry-lates et méthacrylates d'alkyle et leurs dérivés, ainsi que les composés notoirement équivalents à ces comonomères. D'autre part, si l'on désire, on peut réticuler ces compositions polymères réactives, les chaînes polymères étant, par exemple, réticulées par des covalences, les groupes bi-fonctionnels réticulants dérivant du divinylbenzène, du diméthacrylate d'éthylène, et d'autres composés ayant de structures analogues à deux groupes servant à la réticulation. Typiquement, si ces groupes bi-fonctionnels réticulants sont présents dans la composition réactive, ils ne forment pas plus d'environ 5/100 et forment avantageusement d'environ 1/1000 à environ 20/1000 de la masse totale des comonomères polymérisables servant à faire la composition polymère réticulée. Typiquement, des copolymères représentatifs des mordants copolymères utilisés dans l'invention sont copoly-mérisés à partir d'un mélange de comonomères comprenant: (a) d'environ 25/100 à environ 90/100 de comonomères précurseurs des motifs de formule I; (b) d'environ 10/100 à environ 75/100 de comonomères précurseurs de motifs inertes; et,

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éventuellement (c) au plus environ 5/100 d'agents réticulants bifonctionnels.

Bien que certains mordants réactifs utilisés dans la mise en œuvre de l'invention soient des mordants polymères, on peut aussi utiliser des mordants non-polyméres ayant le caractère 5 hydrophobe requis et le groupe cationique nécessaire pour mor-dancer la bilirubine. Quand on utilise un tel mordant non polymère dans un produit analytique suivant l'invention pour l'analyse par voie sèche, il est souhaitable que la structure moléculaire, ou bien la masse moléculaire suffisamment grande de ce mordant permette son immobilisation dans la zone de réaction du produit.

Une liste de quelques mordants polymères utilisables dans l'invention forme le tableau ci-après.

Tableau

Noms

Structures

1. Polychlorure de N,N,N-triméthyl-N-vinyl-benzylammonium

-CH2 - CH •

R

CH. ^

3

-CH_

CH_

Cl*

J

2.Copolymère de styrène et de chlorure de benzyl-(diméthyl)-p-vinyl-benzylammonium

-CH„ - CH-

-CH„CH ■

Q

CH-

CH3 N CH3

Cl

+

CH„

3. Polychlorure de (N,N,N-trioctyl-N-vinylben-zylphosphonium)

CH2 CH

o

CH.

C8H17~ * C8H17 C8H17

Cl

7

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Tableau (suite)

Noms

4. Copolymère de styrène et de chlorure de (vi-nylbenzyl)-(trihexyl)ammonium

CH2 - CH-

Structures

-CH2 - ÇH

f6Hi3

^2—N<rC6H13

C6H13

5. Copolymère de chlorure de (N,N,N-trimé-thylammonium et de styrène)

-CH2 - CH-

•CH2 - CH

CH,

CH0 - N - CH,

1 I© 3

CH„

CI

ó.Terpolymère de styrène, de chlorure de N-vi-nyl-benzyl-N,N-diméthylbenzylammonium et de divinylbenzène

-CH2 - CH-

CH2 - CH

Ö

-CH-CH.-

CH3 - N - CH3

On peut préparer les compositions de mordançage servant de réactifs dans la mise en œuvre de l'invention par les techniques bien connues en chimie organique, abondamment décrites à propos de l'utilisation photographique de ces mordants et de matières analogues. Il est donc inutile de décrire les préparations détaillées de ces mordants. On pourra consulter, à ce sujet, le brevet britannique 1 261 925 et les brevets des Etats-Unis d'Amérique 3 488 706,3 557 066,3 625 694,3 709 690, 3 770 439, 3 758 445, 3 773 509,3 859 096, 3 898 088, 3 944 424 et 3 958 995.

La quantité de mordant nécessaire à un essai peut varier. Elle dépend de la gamme de concentrations en bilirubine pour laquelle on veut pouvoir faire le dosage. Dans divers modes avantageux de réalisation de l'invention, où une mole de bilirubine est liée ou mordancée à un produit contenant un équivalent molaire de sites de fixation de la bilirubine, la quantité de mordant du réactif doit fournir assez de sites réactifs pour fixer le nombre maximum de moles de bilirubine qu'on veut pouvoir doser.

Si le réactif contient un mordant copolymère, la quantité de mordant à utiliser dépend du nombre de motifs de mordants dans le copolymère et du nombre de sites réactifs dans chaque motif. Suivant un mode avantageux de réalisation de l'invention, dans lequel on utilise un mordant polymère tel que ceux du tableau, préparé à partir d'un copolymère intermédiaire de styrène et de chlorure de vinylbenzyle, ayant une viscosité inhé

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rente (mesurée dans le benzène à 25 °C sur une solution à 0,25 g pour 100 cm3) comprise entre environ 0,15 et environ 1,0, on utilise, dans des exemples typiques, d'environ 0,01 g à environ 1,0 g de mordant pour 100 cm3 pour pouvoir doser environ 0,1 mg à 50 mg de bilirubine pour 100 cm3 de liquide analysé. On a s trouvé qu'il est généralement utile d'avoir un excès de mordant dans la zone de réaction pour accélérer la réaction de la bilirubine sur le mordant et obtenir plus rapidement les propriétés spectrales de la bilirubine mordancée.

Comme il a été dit, le procédé suivant l'invention peut être io utilisé par la voie humide classique, en utilisant des réactifs liquides ou, suivant un mode très avantageux de mise en œuvre de l'invention, par voie pratiquement sèche, en utilisant un produit analytique sec. Quand on opère par voie humide, on prépare dans une zone de réaction convenant à l'analyse par voie hu- is mide, par exemple dans un récipient transparent aux radiations, une composition réactive de mordant telle que décrite ci-dessus, dissoute ou dispersée dans un milieu liquide sans action sur la réaction. Les liquides utilisables sont ceux qui, dans les conditions d'utilisation, n'ont pas d'action sensible sur la réaction de 20 mordançage de la bilirubine ou sur les pics d'absorption de la bilirubine libre ou mordancée. Les liquides utilisables sont nombreux; ils peuvent être des liquides aqueux ou des liquides organiques. Dans des exemples typiques, puisque l'invention concerne essentiellement des liquides biologiques, il est avantageux 25 de choisir comme milieu liquide dans la zone de réaction, un liquide aqueux tel que de l'eau ou un solvant organique polaire proche de l'eau, tel qu'un alcanol contenant un groupe alkyle inférieur. Si l'on désire, avec certaines compositions réactives, on peut ajouter dans la zone de réaction des réactifs formant un 30 tampon et plus de la composition de mordançage.

En général, quand on opère par voie humide, on opère avantageusement en milieu aqueux tamponné à un pH compris entre environ 6,8 et environ 9,5, à température comprise entre environ 15 °C et environ 60 °C, avantageusement entre environ 35 22 °C et environ 50 °C. En fait, ces valeurs ne sont pas impéra-tives et, suivant la composition de mordançage utilisée, on peut choisir des pH et des températures s'écartant, dans un sens ou dans l'autre, des intervalles indiqués ci-dessus, la condition importante étant qu'on ne doit pas choisir un pH ou une tempéra- 40 ture provoquant des réactions secondaires indésirables ou dégradant la bilirubine ou le réactif de manière notable. D'autre part, si l'on opère par voie humide, il est souhaitable de faire les manipulations au noir ou avec un éclairage jaune de sécurité pour éviter la dégradation de la bilirubine amorcée par la lu- 45 mière.

Quand on opère par voie humide, il est souhaitable, comme expliqué ci-dessus de commencer par traiter l'échantillon liquide de manière à séparer la bilirubine et les diverses matières auxquelles elle peut être liée. Par exemple, si le liquide étudié 50 est du sérum sanguin, une grande partie de la bilirubine est,

comme il est bien connu, liée à l'albumine du sérum. On a proposé divers moyens pour séparer la bilirubine de l'albumine et autres matières. Ces moyens peuvent être utilisés dans un traitement préliminaire, si bien qu'après un tel traitement, on 55 dose avec précision la bilirubine totale contenue dans le sérum sanguin. On a déjà indiqué qu'il est possible de séparer la bilirubine des diverses protéines, en particulier de l'albumine, par précipitation, ou par dilution de l'échantillon, etc. Ces divers procédés sont sommairement passés en revue par Winkelman, 60 Cannon et Henry dans Clinical Chemistry-Principles and Tech-nic, 2e éd., pages 1042 à 1079.

Comme indiqué précédemment, le procédé de recherche et de dosage de la bilirubine suivant l'invention est utilisable aussi 65 par voie sèche. Etant donné que les manipulations sont faciles,

plus commodes et qu'on peut obtenir des résultats quantitatifs, l'utilisation des produits analytiques des figures 1 et 2 est particulièrement recommandée. Le produit de la figure 1 comprend une zone 7 réactive initialement sèche, contenant le mordant. Le produit analytique composite peut comprendre une zone 6 d'étalement; il peut aussi comprendre des zones intermédiaires, si bien qu'un produit analytique composite suivant un mode particulièrement avantageux de réalisation de l'invention comprend typiquement au moins deux zones distinctes, qui sont en relation d'échange de fluide dans les conditions d'utilisation. De préférence, les différentes zones présentées par un produit analytique suivant l'invention sont des couches superposées, contiguës. Dans un exemple typique, ces couches sont déposées sur un support 8, avantageusement transparent aux radiations. Cependant, bien que les produits analytiques suivant les modes préférés de réalisation de l'invention soient formée de couches superposées contiguës, on peut préparer d'autres produits analytiques suivant l'invention ayant une structure différente: par exemple, celui de la figure 2 comprend au moins deux zones adjacentes bout-à-bout, par exemple une zone 6 d'étalement et une zone 7 de réaction, portées par un support 8, si c'est nécessaire ou seulement désiré. On décrira la structure et les caractéristiques d'un produit analytique composite, dans lequel les différentes zones sont des couches contiguës superposées, déposées sur un support transparent aux radiations.

Un produit analytique suivant l'invention comprendra une couche d'étalement et une couche de réaction, avantageusement toutes deux transparentes. Ces produits peuvent comprendre un support, avantageusement transparent, sur lequel les diverses couches sont déposées ; néanmoins, si les couches elles-mêmes ont des qualités mécaniques suffisantes, stables dans le temps, le support n'est pas indispensable.

Suivant un mode avantageux de réalisation, un produit analytique suivant l'invention comprend un support transparent aux radiations sur lequel sont déposées (1) une couche de réaction perméable au moins à la bilirubine et contenant une composition réactive qui comprend le mordant, comme décrit ci-dessus, et (2) une couche d'étalement qui est perméable à la bilirubine. La couche de réaction sépare le support de la couche d'étalement. Il est souhaitable que la couche d'étalement ait une perméabilité sensiblement uniforme pour la bilirubine. Il est préférable que la couche de réaction soit parfaitement imperméable aux protéines ayant des masses moléculaires nettement plus grandes que celle de la bilirubine, telles que l'albumine et les autres matières protéiques ayant des masses moléculaires de l'ordre de 60 000 ou plus grandes que 60 000.

La couche d'étalement présente une structure qui n'est pas fibreuse et, avantageusement, une porosité isotrope. De préférence, toutes les couches ont une structure non-fibreuse, ce qui améliore les résultats quantitatifs. On entend par structure «non-fibreuse» une structure dépourvue de toute matière fibreuse ou en contenant une quantité trop petite pour agir sur l'étalement de la prise d'essai ou sur les mesures radiométriques qui fournissent le résultat analytique.

Les couches de réaction, qui sont utilisées en association avec des couches d'étalement dans les produits analytiques suivant l'invention, ont avantageusement une perméabilité uniforme pour la bilirubine, mais sont totalement imperméables et non-poreuses pour les protéines de plus grandes masses moléculaires. On entend ici par le mot «perméabilité» le passage d'un fluide par porosité, par aptitude de la couche au gonflement ou par tout autre mécanisme. Les couches de réaction peuvent comprendre une matrice dans laquelle la composition contenant le mordant réactif est distribuée par dissolution ou par dispersion. Néanmoins, cette matrice, n'est pas nécessaire quand le mordant est un polymère filmogène ou pouvant former une couche ou une zone uniforme, ce qui est souvent le cas. Le choix de la matière de la matrice peut varier: il dépend des constituants de la composition réactive que cette matrice renferme.

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Dans tous les cas, celle-ci ne doit pas interférer avec la composition contenant le mordant, en se fixant sur cette composition ou en étant elle-même mordancée. Les matières servant à former les matrices des couches de réaction associées à des couches d'étalement sont de préférence non-fibreuses ; elles peuvent être 5 hydrophiles telles que de la gélatine (par exemple de la gélatine de peau de porc) hydrolysée et ses dérivés ayant un point isoélectrique d'environ 9,1, des dérivés cellulosiques hydrophiles, des Polysaccharides tels que le dextranne, la gomme arabique, l'agarose, etc., ou telles que des produits synthétiques, notam- 10 ment des composés polyvinyliques solubles dans l'eau comme l'alcool polyvinylique ou la polyvinyl-pyrrolidone, des polymères d'acrylamide, etc. Des composés organophiles n'interférant pas, tels que des esters cellulosiques, etc., peuvent aussi être utiles. Pour améliorer la perméabilité de la couche réactive, 15 quand elle n'est pas poreuse, il est souvent utile de former la matrice avec une matière qui gonfle dans le solvant ou dans le milieu de dispersion du liquide analysé. Il peut aussi être nécessaire de choisir une matière compatible avec l'application d'une couche adjacente, par exemple par couchage au cours de la 20 fabrication du produit analytique composite. On peut choisir une matrice essentiellement soluble dans l'eau pour la couche de réaction et une matrice essentiellement soluble ou sesceptible de dispersion en milieu organique pour une couche voisine, telle que la couche d'étalement. De cette manière, l'action solvante 25 mutuelle est réduite au minimum et on peut obtenir une structure stratifiée avec des couches nettement délimitées. Dans de nombreux cas, pour éviter la diffusion à l'intérieur de la couche de réaction de matières protéiques de grandes masses moléculaires, qui pourraient interférer dans le dosage de la bilirubine, il 30 peut être avantageux que la couche de réaction soit moins perméable que la couche d'étalement; ce résultat est facilement obtenu en réduisant les dimensions des pores dans la couche de réaction. La perméabilité et la porosité relatives peuvent être déterminées par des techniques bien connues. . 35

La composition réactive, comprenant au moins un mordant réactif de la bilirubine est répartie dans la couche de réaction. On peut distribuer cette composition de mordançage en la dissolvant ou en la dispersant dans une matrice, si l'on en utilise 40 une. On préfère souvent obtenir une dispersion uniforme, bien que ce ne soit pas toujours nécessaire.

Comme en analyse par voie humide, dans le cas d'une analyse par voie sèche, on peut utiliser un tampon qu'on introduit dans les produits analytiques de façon à fixer le pH à la valeur 45 voulue. On peut introduire une composition tampon dans la couche de réaction ou dans une ou plusieurs des autres couches d'un produit analytique spécifique suivant l'invention en quantité suffisante pour que, dans les conditions d'utilisation, le pH de la couche de réaction soit très sensiblement celui qu'on aurait 50 dans une analyse par voie humide, avec des réactifs en solution. On peut utiliser des mélanges tampon variés, notamment des tampons phosphatés. On pourra consulter à ce sujet le travail de Good: Biochemistry, tome 5, page 467 (1966).

Comme déjà dit, un produit analytique suivant l'invention 55 peut comprendre une couche d'étalement, c'est-à-dire une couche destinée à recevoir un échantillon de liquide, appliqué directement ou provenant d'une ou de plusieurs couches en relation d'échange de fluide avec la couche d'étalement, dans lesquels le solvant ou le milieu de dispersion de l'échantillon est 60 réparti, de sorte que la concentration superficielle en bilirubine sur la couche d'étalement en regard de la couche réactive soit manifestement uniforme, ce qui n'implique pas l'absence d'un gradient de concentration dans l'épaisseur de la couche. L'existence d'un tel gradient n'empêche pas d'obtenir des résultats 65 quantitatifs, si l'on établit une correspondance par les moyens connus d'étalonnage.

Le mécanisme de l'étalement est mal connu. On admet que ce phénomène est provoqué, mais limité par un ensemble de forces, à savoir: la pression hydrostatique de la prise d'essai d'un liquide, les forces capillaires dans la couche d'étalement, la tension superficielle de la prise d'essai, l'aspiration par capillarité par les couches en relation d'échange de fluide avec la couche d'étalement, etc. On note que l'étendue de l'étalement dépend en partie du volume du liquide à étaler, mais que la concentration apparemment uniforme obtenue par étalement est parfaitement indépendante du volume de la prise d'essai et est obtenue pour divers taux d'étalement. Il en résulte qu'il n'est pas besoin d'un procédé très précis d'étalement pour appliquer la prise d'essai à un produit suivant l'invention. Néanmoins, il peut être souhaitable de fixer le volume de la prise d'essai pour avoir une durée convenable d'étalement ou pour toute autre raison. Les produits suivant l'invention permettent d'obtenir des résultats quantitatifs avec de très petites prises qui peuvent être entièrement absorbées par une petite aire de la couche d'étalement (par exemple, un centimètre carré), si bien qu'il n'est pas nécessaire de l'excès d'humidité du produit après application de la prise d'essai. D'autre part, l'étalement se produit dans la couche d'étalement, et la substance étalée se trouve en relation d'échange de fluide avec la couche de réaction sans qu'il y ait pression hydrostatique sensible sur les côtés, si bien que les problèmes d'auréoles souvent rencontrés avec les produits analytiques connus, ne se posent pas.

La couche d'étalement sert uniquement à produire une concentration apparente uniforme de substance étalée par unité de surface située en face de la couche de réaction avec laquelle elle est en relation d'échange de fluide, et il est très utile de pouvoir déterminer si une couche donnée convient comme couche d'étalement. L'uniformité de la concentration apparente peut être contrôlée par densitométrie ou par d'autres techniques analytiques telles que celles du brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 992 158.

Les couches d'étalement utilisables sont avantageusement des couches à porosité isotrope, c'est-à-dire à porosité identique dans toutes les directions. On précise que le degré de porosité peut varier, si c'est nécessaire ou seulement souhaitable; ceci conerne les dimensions des pores, la proportion (qu'on peut exprimer en pourcentage: volume de vide/volume total de la couche), etc. Le brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 992 158 précité donne des renseignements à ce sujet. Ce brevet explique en détail qu'on peut préparer des couches d'étalement satisfaisantes à partir de matières diverses. On peut utiliser des matières en particules, la porosité étant créée par les vides entre les particules. Des types variés de matières divisées en particules sont utilisables ; il est souhaitable que ces matières soient inertes vis-à-vis des constituants du liquide analysé. On peut utiliser des pigments, tels que le bioxyde de titane, le sulfate de baryum, l'oxyde de zinc, l'oxyde de plomb, on peut aussi utiliser de la diatomite ou des produits microcristallins naturels ou synthétiques, par exemple de la cellulose microcristalline. On peut utiliser des particules sphériques de même dimension ou de plusieurs dimensions, par exemple des perles de verre ou de matière plastique ; ceci peut être très avantageux, quand on cherche à obtenir des pores uniformes, par exemple pour faire un filtrage sélectif. Si la matière choisie ne présente pas de propriétés adhé-sives, ce qui est le cas des perles de verre, et matières analogues, on peut traiter cette matière pour que les particules adhèrent aux points de contact, ce qui facilite l'obtention d'une couche à porosité isotrope.

La couche d'étalement peut être constituée en totalité ou en partie d'une composition poreuse polymère isotrope. On peut préparer ces compositions polymères en utilisant les procédés de préparation des couches microporeuses (dites parfois «couches blanches») décrites au brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 992 158 précité et aussi au brevet des Etats-Unis d'Amérique

10

627 555

3 555 129. D'autres techniques permettent de préparer des polymères microporeux isotropes: on peut, notamment, utiliser des gaz ou autres matières expansibles, comme décrit aux brevets des Etats-Unis d'Amérique 2 946 095 et 2 960 728 ; on peut aussi introduire dans la phase polymère un solide soluble 5 qu'on dissout pour former les pores, comme décrit, par exemple, au brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 816 575. On peut utiliser des polymères de types différents, seuls ou associés, pour préparer ces couches microporeuses d'étalement: les polycarbo-nates, les polyamides, les polyuréthannes et les esters celluiosi- 10 ques sont des exemples typiques de ces polymères. Divers filtres microporeux sont faits partiellement ou totalement avec des compositions polymères microporeuses, comme décrit, notamment, aux brevets des Etats-Unis d'Amérique 2 772 322 et

2 783 894. 15

L'épaisseur de la couche d'étalement est variable; elle dépend en partie du volume de la prise d'essai qu'on veut utiliser, qui, pour des raisons de commodité et de propreté, doit être absorbée par la couche d'étalement. Cette épaisseur dépend aussi du volume de vide dans la couche, ce volume agissant aussi 20 sur le volume de la prise d'essai pouvant être absorbée par la couche. L'épaisseur sèche de la couche d'étalement peut être très avantageusement comprise entre environ 0,05 mm et environ 0,30 mm. Néanmoins, ces limites ne sont pas impératives, et il est possible de s'en écarter dans des cas particuliers. 25

Quand on prépare une couche d'étalement à porosité isotrope, il est utile que le volume de vide forme au moins environ 25/100 du volume total de la couche, et, de préférence de 50/100 â 95/100 de volume total. Le volume de vide dans les couches poreuses d'étalement peut être avantageusement modi- 30 fié pour changer les caractéristiques du produit analytique telles que la perméabilité totale de la couche d'étalement ou la durée nécessaire à l'étalement. On notera qu'on peut régler la proportion de vide dans la couche, par exemple, en choisissant une matière en particules ayant des dimensions convenables, ou en 35 modifiant les solvants ou les conditions de séchage quand la couche d'étalement est une couche «blanche», définie ci-dessus. La mesure de la proportion de vide dans la couche d'étalement est décrite au brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 992 158.

40

Quand on prépare les produits analytiques suivant l'invention, on peut utiliser des couches distinctes qu'on applique ensemble avant leur utilisation ou qu'on maintient séparées jusqu'à leur mise en relation d'échange de fluide au moment de leur utilisation. Quand cela est possible, ces couches distinctes sont appliquées à partir de solutions ou de dispersions sur des surfaces permettant, après séchage, un décollement par voie physique. Un procédé satisfaisant évitant les multiples opérations de couchage et de laminage ou autre assemblage de couches, permet de préparer des couches accolées: il consiste à déposer une première couche sur une surface de coulée, ne présentant pas d'adhérence, puis de déposer les couches successives sur celles qui ont été déposées antérieurement. Ces couchages peuvent être faits par les techniques bien connues de couchage décrites au brevet des Etats-Unis d'Amérique

3 992 158 précité. Les problèmes d'adhérence entre couches peuvent être résolus sans conséquence fâcheuse au moyen de traitements superficiels comprenant l'application d'un substra-tum extrêmement mince, d'un type utilisé en technique photographique. fio

Pour former des couches de réaction, on peut préparer une solution ou une dispersion de couchage comprenant la matrice, si l'on en utilise une, et la composition de mordançage, puis la coucher comme exposé ci-dessus et sécher la couche, ce qui forme une couche stable en dimensions. L'épaisseur de la 65 couche réactive et son degré de perméabilité sont extrêmement variables et dépendent de l'utilisation du produit. Des épaisseurs, à sec, comprises entre environ 10 microns et environ 100

microns conviennent, généralement, mais on peut s'écarter de ces limites dans certaines circonstances. Les couches de réaction à structure fibreuse peuvent être formées par imprégnation d'une matière fibreuse suivant une des techniques usuelles.

Comme déjà expliqué, les produits analytiques suivant l'invention peuvent se passer de supports si les couches sont suffisamment résistantes; ils peuvent aussi comprendre un support portant les couches. La matière de support peut être une matière polymère banale, telle que de l'acétate de cellulose, du poly(téréphtalate d'éthylène), un polycarbonate ou un composé polyvinylique, par exemple du polystyrène, etc. Le support choisi pour un produit analytique déterminé doit être compatible avec le mode prévu d'examen des résultats. Les supports sont de préférence transparents aux radiations électromagnétiques de longueurs d'ondes comprises entre environ 300 nm et environ 700 nm. Il peut aussi être souhaitable que le support laisse passer une ou plusieurs étroites bandes de longueurs d'onde, en étant opaque pour les bandes adjacentes. Pour cela, on peut, par exemple, imprégner le support ou l'enduire avec un ou plusieurs colorants ayant les caractéristiques spectrales convenables.

Comme déjà exposé, on peut choisir la dimension des pores de la couche d'étalement pour que cette couche arrête les constituants indésirables de la prise d'essai, tels que les protéines ayant des masses moléculaires plus grandes que celle de la bilirubine. Pour le dosage du sang complet, les couches ayant des pores de un à environ cinq microns conviennent particulièrement pour retenir les globules dont les dimensions sont typiquement comprises entre environ 7 microns et environ 30 microns. Si c'est désirable, un produit suivant l'invention peut comprendre plusieurs couches d'étalement, pouvant avoir des propriétés différentes d'étalement et de filtrage.

Il peut être avantageux d'introduire dans les couches d'un produit suivant l'invention un ou plusieurs agents tensioactifs anioniques ou nonioniques. Ceux-ci peuvent, par exemple, améliorer l'aptitude au couchage des compositions, augmenter la faculté d'étalement (en surface et en vitesse) des couches d'étalement qui ne seraient pas facilement mouillées en l'absence d'un tel agent. En particulier, il peut être souhaitable d'introduire une quantité relativement grande d'agent tensioactif, non ionique, dans la couche d'étalement pour régulariser le transfert de la bilirubine contenue dans un échantillon de liquide protéi-nique aqueux sur cette couche et à travers celle-ci. Cette régularisation a pour but d'obtenir des pénétrations équivalentes du milieu solvant et de la bilirubine dans la couche d'étalement pour des échantillons divers de liquides protéiniques aqueux, indépendamment des variations de concentration de ces échantillons en protéines. De plus, on a trouvé que, dans le dosage de la bilirubine totale par le procédé suivant l'invention, la bilirubine se trouvant souvent à l'état lié, par exemple, à l'albumine du sérum ou à d'autres protéines, la présence d'un agent tensioactif non ionique dans la couche d'étalement prévue pour régulariser le transport de la bilirubine a pour conséquence avantageuse de dissocier la bilirubine liée à ces protéines. Les masses d'agent tensioactif assurant un transport correct de la bilirubine sont typiquement comprises entre environ 1/100 et environ 15/100 de celle de la couche sèche.

Les produits analytiques suivant l'invention peuvent être adaptés pour servir non seulement en analyse clinique, mais aussi en recherche chimique et au contrôle de fabrications chimiques. Ils conviennent bien pour les essais cliniques de fluides corporels, tels que le sang, le sérum sanguin et l'urine: dans ces essais, on fait, en effet, souvent de nombreuses analyses répétées, dont les résultats doivent être connus très rapidement. Quand on analyse du sang avec les produits suivant l'invention, il y a lieu de séparer d'abord les globules du sérum, par exemple par centrifugation, puis on applique le sérum au produit. Cette séparation peut parfois être évitée, par exemple en faisant par

11

spectrophotométrie de réflexion la recherche ou le dosage de la bilirubine mordancée.

On peut appliquer directement du sang entier sur le produit en utilisant une couche filtrante qui peut être aussi une couche opaque aux radiations pour retenir les globules et les empêcher 5 d'atteindre la couche de réaction. La présence des globules sur le produit analytique ne gêne pas l'analyse spectrophotométrique, quand on opère par réflexion, la lumière étant transmise à travers le support et la couche d'enregistrement, puis renvoyée par la couche opaque aux radiations ou une autre couche réflé- 10 chissante, car la radiation servant à la mesure n'est pas interceptée par les globules. Un avantage particulièrement important des nouveaux produits analytiques est de permettre l'analyse doit du sérum, soit du sang complet.

Comme indiqué ci-dessus, les produits analytiques suivant l'invention peuvent comprendre une couche opaque aux radiations, placée avantageusement entre une couche réactive et le support. Cette couche opaque arrête les radiations électromagnétiques, telles que celles qui servent à l'examen colorimétri- 2Q que. Ces couches comprennent un agent opacifiant qui, par suite de son absorbance, de sa réflectance ou d'une autre propriété optique, arrête les radiations quand il est introduit dans la couche. Suivant un mode de réalisation, cette couche opaque comprend une matrice contenant un agent opacifiant, tel qu'un 25 pigment, notamment le carbone ou un autre pigment minéral tel qu'un composé métallique (sel ou oxyde), par exemple le bioxyde de titane, l'oxyde de zinc, le sulfate de baryum, etc. D'autre part, la structure des polymères poreux est telle qu'ils présentent généralement un grand pouvoir réfléchissant, si bien 30 que des couches dites «blanches», faites de ces polymères, analogues aux couches polymère d'étalement, peuvent servir comme couches opaques. Ces couches polymères poreuses peuvent, d'ailleurs, contenir un agent opacifiant.

Suivant un mode avantageux de réalisation, les couches d'é- 35 talement en polymère poreux contiennent aussi un pigment minéral renvoyant la lumière, tel que les pigments qu'on vient de citer. La quantité de pigment qu'on peut introduire dans une couche contenant un polymère poreux peut varier considérablement, le rapport massique pigment/polymère étant avantageu- 40 sement compris entre 0,05 et 10, de préférence entre 1 et 6.

Un produit analytique suivant l'invention peut comprendre encore d'autres couches auxiliaires. Par exemple, il peut comprendre une couche séparatrice, avantageusement transparente aux radiations, telle qu'une couche de gel pouvant gonfler, sépa-45 rant la couche de réaction du support: cette couche peut servir à améliorer la vitesse de pénétration du sérum contenant la bilirubine dans la couche de réaction, à travers la couche d'étalement. Un autre exemple de couche auxiliaire est une couche séparant la couche de réaction de la couche d'étalement. Cette couche 50 doit être perméable à la bilirubine et peut contenir des réactifs qui rendent inactives des matières qui fausseraient le dosage;

cette couche peut aussi avoir des propriétés filtrantes et, de ce fait, retenir ces matières indésirables.

55

Suivant un mode avantageux de réalisation, une couche auxiliaire peut contenir un composé réagissant sur la bilirubine. Par exemple, une couche de gélatine contenant de la glucuronidase peut séparer la couche d'étalement de la couche de réaction contenant la composition de mordançage: le rôle de cette 60 enzyme est de transformer la bilirubine conjuguée présente dans le liquide analysé en bilirubine non conjuguée. On peut aussi introduire de la glucuronidase dans la couche d'étalement pour que cette enzyme agisse plus directement et plus efficacement sur la bilirubine conjuguée. 65

On peut préparer des produits analytiques très divers, tous conformes à l'invention, notamment, sous forme de bandes de longueur quelconque de feuilles ou de petits fragments.

627 555

On met en service un produit analytique suivant l'invention en appliquant sur la zone d'étalement une prise du liquide à analyser. Quand ce produit est du type à couches superposées, on applique la prise sur la face de la couche d'étalement qui est le plus loin de la couche de réaction. La précision des résultats n'est pas sensiblement modifiée quand le volume de la prise d'essai varie, si bien que l'application peut se faire à la main ou mécaniquement. Néanmoins, il est commode, pour obtenir un résultat analytique que le volume de la prise soit raisonnablement constant. Le rôle important de la couche d'étalement est de réduire au minimum le phénomène d'auréoles qui peut se produire quand la couche de réaction contient un réactif soluble.

Dans un exemple typique, manuel ou automatique, d'un produit analytique suivant l'invention, est fourni à partir d'un rouleau, d'un paquet de feuilles ou de tout autre moyen de rangement ; on dépose une goutte libre, ou une touche par contact ou une prise liquide d'un autre genre, sur la surface du produit analytique, le liquide à analyser étant contenu dans un appareil distributeur convenable. Après application et, avantageusement après absorption par la couche d'étalement, on expose le produit à des conditions d'ambiance qui peuvent être désirables pour accélérer ou améliorer autrement les résultats: par exemple, on chauffe le produit ou on le soumet à l'action de l'humidité. Si l'on utilise un appareil automatique, il peut être désirable que l'étalement se fasse en plusieurs secondes, avec une répartition régulière, ce qui est en opposition avec la diffusion instantanée, mais irrégulière qu'on obtient avec les papiers fibreux absorbants.

Quand on a obtenu le résultat analytique sous forme de modification décelable du produit analytique, on mesure cette modification, généralement par spectrophotométrie par réflexion ou par transmission. L'appareil dirige un faisceau énergétique, tel qu'un faisceau lumineux, à travers le support et la couche de réaction. La lumière (ou un autre rayonnement) est ensuite réfléchie, par exemple par l'agent opacifiant de la couche d'étalement ou de la couche opaque, puis renvoye vers le détecteur, dans le cas d'un dosage par réflexion; dans le cas d'un dosage par transmission, la lumière frappe le détecteur après traversée du produit analytique. Suivant un procédé avantageux, on fait la mesure sur une zone du produit analytique qui est complètement incluse dans la zone où ce résultat a été obtenu. Généralement, la colorimétrie est faite entre environ 300 nm et environ 700 nm, bien qu'on puisse opérer avec n'importe quel rayonnement pour lequel le produit est transparent, si la mesure de ce rayonnement permet de quantifier la modification décelable dans la couche de réaction. On peut utiliser divers moyens pour étalonner l'appareil et obtenir des résultats quantitatifs. Par exemple, on peut déposer une prise d'une solution titrée à côté de la zone où on dépose la prise de solution à analyser de manière à faire une analyse différentielle.

Les exemples suivants illustrent l'invention.

Exemple 1

Modification par mordançage du spectre de la bilirubine

On montre, à cet exemple, que le pic d'absorption de la bilirubine, contenu dans une solution d'essai se déplace, en présence de certains mordants, spécifiés ci-dessus, la longueur d'onde passant de 435 nm-440 nm à 460 nm et le coefficient d'extinction molaire au nouveau pic d'absorption étant fortement accru.

On enregistre les spectres d'absorption de quatre solutions de 300 nm à 600 nm, au spectrophotomètre, à 37 °C. Ces solutions sont:

A) Tampon à pH 7,4 de phosphate monosodique 0,05 M;

B) Mordant 6 du tableau, en solution à 12 mg pour 100 cm3 de tampon A) (pH 7,4 ) ;

C) Bilirubine en solution à 1 mg pour 100 cm3 de tampon A) (pH 7,4);

627555

12

D) 1 mg de bilirubine et 12 mg de mordant 6 dans 100 cm3 de tampon A) (pH 7,4).

Les spectres obtenus montrent que:

1. aux concentrations indiquées, ni le tampon A), ni la solution B) n'ont une absorption notable, dans aucune partie du spectre;

2. le maximum d'absorption de la solution C) (bilirubine) est à435nm-440 nm;

3. à 460 nm, pic d'absorption de la bilirubine mordancée (solution D) ; le coefficient Em460 d'extinction molaire est doublé par la présence du mordant; plus précisément:

E,n460 avant mordançage: 40 • 103 Em460 après mordançage: 80 • 103

Exemple 2

Produit analytique pour doser la bilirubine par mordançage

On dépose sur un support en poly(téréphtalate d'éthylène) les couches suivantes (en matières sèches par mètre carré):

1. mordant 4 du tableau: 0,54 g

2. substratum: poly(N-isopropylacrylamide): 0,32 g

3. couche opaque d'étalement:

bioxyde de titane: 45,6 g acétate de cellulose: 6,45 g octylphénoxy polyéthoxyéthanol: 2,51 g éther oléïque de polyéthylèneglycol: 0,64 g L'octylphénoxy polyéthoxyéthanol est le produit «Triton

X-405R» de la firme Rohm et Haas.

On prépare une série de solutions contenant, pour 100 cm3, 7 g d'albumine de sérum humain et 100 mM de sel et de 0 à 20 mg de bilirubine, et on dépose des gouttes d'environ 10 mm3 sur le produit ainsi préparé. Après 7 mn, on mesure la variation de densité optique de la figure 3, qui est très bien reproductible, comme le montre la figure, les traits verticaux correspondant à l'amplitude des mesures.

Exemple 3 Produit analytique contenant de la gélatine

Sur un support transparent en poly(téréphtalate d'éthylène), on dépose (en matières-sèches par mètre carré):

1. couche de réaction:

mordant 6 du tableau: 2,2 g gélatine: 4,1 g

2. couche d'étalement:

identique à celle de l'exemple 2.

On prépare une série de solutions contenant des quantités variables de bilirubine, ayant un pH de 7,4 et une série de solutions salines, ayant un pH de 7,4 et contenant 7 g d'albumine pour 100 ml et des quantités variables de bilirubine, et on fait des mesures avec ce produit et ces solutions comme à l'exemple 2. La courbe spectrophotométrique est très sensiblement une droite dans un grand intervalle de concentrations en bilirubine. On constate encore que les solutions contenant de l'albumine et celles qui n'en contiennent pas donnent des résultats concordants, ce qui montre que l'albumine ne fausse pas les dosages.

Exemple 4

Produit analytique contenant une sous-couche de gélatine

On dépose sur le support utilisé à l'exemple 2 une couche contenant 2,3 g de gélatine et 1,1 g d'albumine de sérum bovin (par mètre carré), puis une couche de réaction contenant 1,1 g de mordant 6 du tableau et 1,1 g de gélatine (toujours par mètre carré), puis la couche d'étalement de l'exemple 2.

On étudie dé manière analogue à l'exemple 2 la bande ainsi formée. On fait l'étalonnage avec des solutions aqueuses salines s contenant 7 g d'albumine de sérum humain pour 100 cm3 et des quantités variables de bilirubine (provenance firme American Monitor Corp. de Indianapolis, Indiana, Etats-Unis d'Amérique). On utilise la bande ainsi étalonnée pour analyser plusieurs produits synthétiques de remplacement de sérum humain, ayant io des teneurs connues en bilirubine (de 0,5 mg à 20 mg pour 100 ml). Les teneurs trouvées correspondent bien à celles qu'indiquent les fabricants des sérums synthétiques.

Exemple 5 15 Interférence de l'hémoglobine

La plupart des dosages connus de la bilirubine par spectrophotométrie directe (pour ne pas dire tous ces dosages) sont faussés par la présence d'hémoglobine à raison de 20 ml pour 100 cm3, au plus.

20 On recommence les essais de l'exemple 3 avec des solutions contenant 1 mg ou bien 15 mg de bilirubine et des quantités 1 d'hémoglobine échelonnées entre 0 et 150 mg par 100 cm3. On fait les mesures de densité par réflexion à 460 nm. On constate que la présence d'hémoglobine est sans action sur les mesures 25 spectrophotométriques à 460 nm faites avec le produit analytique suivant l'invention.

Exemple 6

Action du pH

30 On fait deux séries de mesures sur des solutions ayant des teneurs en bilirubine échelonnées de 0 à 20 mg par 100 ml, un premier groupe de solutions étant tamponné au pH de 7,4 et un second groupe étant tamponné au pH de 8,2, contenant, pour 100 cm3,7 g d'albumine de sérum humain, du sel et un tampon 35 0,05 M de phosphate monosodique. On analyse ces solutions avec le produit préparé à l'exemple 2. Les résultats sont insensibles à la variation du pH entre 7,4 et 8,2.

Exemple 7 40 Action de la température

On utilise le produit de l'exemple 3 pour analyser des solutions tamponnées au pH de 7,4. La réponse est faible à 27 °C, mais pratiquement constante entre 37 °C et 42 °C.

45 Exemple 8

Conservation des réactifs

On opère comme à l'exemple 7, après avoir abandonné les produits analytiques à 20 °C pendant un mois, sans précautions spéciales au point de vue de l'humidité. L'étalonnage initial so reste valable et les résultats obtenus avec le produit ainsi conservé ne se distinguent absolument pas de ceux obtenus avec un produit frais.

Exemple 9 55 Interférences des caroténoïdes

Le bêta-carotène, qui est le caroténoïde principal du sérum d'adulte, absorbe à 450 nm et trouble dans la spectrophotométrie de la bilirubine à 450 nm, suivant les données connues. On étudie le produit de l'exemple 2 avec quatre solutions 60 contenant 7 g d'albumine, 1 mg ou 20 mg de bilirubine et 0,02 mg ou 2,2 mg de bêta-carotène pour 100 cm3. La présence du bêta-carotène à ces teneurs, normales pour du sérum humain, est sans action sur les résultats obtenus.

1 feuille dessins

Claims

627 555

2

REVENDICATIONS

1. Procédé colorimétrique pour la détection et le dosage de la bilirubine dans un liquide aqueux, caractérisé en ce que (a) on met en contact dans une zone de réaction ce liquide aqueux et un mordant ayant au moins un site de fixation pour la bilirubine 5 et comprenant au moins un groupe cationique porteur de charges, de sorte que la bilirubine est mordancée, et que, sous cette forme mordancée, son pic d'absorption spectrale est décalé d'au moins 10 nm par rapport à celui de la bilirubine libre et son coefficient d'extinction molaire à la longueur d'onde du pic est 10 augmenté d'au moins 50% par rapport à celui de la bilirubine libre, et (b) on examine ensuite colorimétriquement la bilirubine mordancée.
2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on mélange le mordant avec un liquide inerte, et que, dans la 15 zone de réaction, le pH est compris entre 6,8 et 9,5 et la température entre 15 °C et 60 °C.
3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on dose la bilirubine dans un liquide aqueux biologique, tel que du sérum sanguin.
4. Procédé suivant la sous-revendication 2, caractérisé en ce qu'on dose la bilirubine dans du sérum sanguin préalablement traité pour réduire sa teneur en protéines.
5. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise comme mordant un polymère ayant des motifs de formule:

20

25

. A

I

Q

I

M©,X©

où A représente un groupe organique, Q représente au moins une liaison chimique ou un groupe reliant A à M®, M® représente un groupe ammonium ou phosphonium quaternaire, et X© représente un anion.
6. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que lesdits motifs ont pour formule

30

35

40

A

I

Q

I

Ri-N e_R2, x©

I

R3

50

où A représente un groupe dérivant d'un groupe alkylène par perte d'un atome d'hydrogène, Q représente un groupe hydrocarboné contenant de cinq à dix atomes de carbone, R1, R2 et R3 désignant indépendamment, des radicaux alkyle ayant de un à 55 dix atomes de carbone, des radicaux aryle, arylalkyle ou alkyl-aryle ayant de cinq à moins de vingt atomes de carbone, et X© représente un anion.
7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce qu'on utilise, comme mordant une substance résultant de la co- 60 polymérisation a) de 25/100 à 90/100 en masse de comonomères donnant les motifs définis à la revendication 6;

b) de 10/100 à 75/100 en masse d'un hydrocarbure polymé-risable aliphatique ou aromatique ou d'un acrylate ou méthacry- 65 late d'alkyle ou d'un mélange entre ces comonomères ; et c) de 0 à 5/100, en masse, d'un agent bifonctionnel de réti-culation.
8. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que le mordant est au moins l'un des polymères suivants:

homopolymères de chlorure de N,N,N-triméthyl-, N-vinyl-benzylammonium ;

copolymères de styrène et de chlorure de N-benzyl-, N,N-diméthyl-, N-para-vinylbenzylammonium ;

homopolymères de chlorure de N,N,N-trioctyl-, N-vinyl-benzylphosphonium, copolymères de styrène et de chlorure de N,N,N-trihexyl-, N-vinylbenzylammonium ;

copolymères de styrène et de chlorure de N,N,N-triméthyl-, N-vinylbenzylammonium ;

terpolymères de styrène, de divinylbenzène et de chlorure de N-benzyl-, N,N-diméthyl-, N-vinylbenzylammonium,
9. Produit pour la mise en œuvre du procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend une zone d'étalement et une zone de réaction en relation d'échange de fluide dans les conditions d'utilisation, cette zone de réaction comprenant le mordant réactif de la bilirubine, aucune zone où une réaction se produit ne contenant de composé fluorescent ou fortement coloré ou de précurseur d'un tel composé.
10. Produit suivant la revendication 9, caractérisé en ce que la zone d'établement et la zone de réaction sont deux couches superposées sur un support, la zone d'étalement formant la couche externe.
11. Produit suivant la revendication 10, caractérisé par la présence de glucuronidase entre les couches d'étalement et de réaction.
12. Produit suivant la revendication 10, caractérisé par la présence de glucuronidase dans la couche d'étalement.
13. Produit suivant la revendication 10, caractérisé en ce que la couche de réaction imperméable aux matières ayant des masses moléculaires égales ou supérieures à celle de l'albumine.
14. Produit suivant la revendication 10, caractérisé en ce que la couche de réaction a une perméabilité nettement plus faible que la couche d'étalement.

La bilirubine est un produit de dégradation de l'hémoglobine. On estime que 6 g à 7 g d'hémoglobine sont libérés chaque jour par les globules rouges du sang vieillis ou altérés. Cette masse d'hémoglobine est rapidement détruite par le foie, la rate ou la moelle des os, si bien qu'il se forme approximativement de 200 mg à 230 mg de bilirubine et de ses dérivés chez un homme adulte. Ultérieurement, la majeure partie de cette production quotidienne de bilirubine est évacuée, transformée en d'autres composés, etc., ce qui est un processus normal du métabolisme humain.

Néanmoins, dans certains cas, un excès de bilirubine se trouve dans le corps humain, par suite de surproduction, par exemple dans le cas d'une hémolyse excessive ou par rétention de la bilirubine due, par exemple à une déficience hépatique. Le résultat d'un excès de bilirubine dans le sang humain est toujours une jaunisse. Cet état pathologique sérieux se caractérise par une teneur anormalement grande du sérum en bilirubine, par exemple de 10 mg de bilirubine dans 100 cm3 de sérum, tandis que la teneur chez un adulte normal est comprise entre 0,1 mg et 10 mg par 100 cm3 ; presque toujours, on observe une pigmentation jaune-brun de la peau, du blanc des yeux et des muqueuses. D'autre part, il est de plus en plus manifeste qu'un excès de bilirubine dans le sang peut provoquer une concentration indésirable de bilirubine dans les cellules et agir sur divers phénomènes cellulaires. Par exemple, on admet que la bilirubine est un inhibiteur potentiel de nombreuses réactions enzy-matiques qui produisent l'énergie vitale nécessaire aux cellules. Etant donné ce qui précède, il est évident que le dosage de la bilirubine est un élément important du diagnostic, dans les examens du fonctionnement du foie et des organes liés au foie.

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La littérature sur les dosages cliniques de la bilirubine est extrêmement abondante. Les lignes générales d'un grand nombre des diverses méthodes de dosage de la bilirubine sont bien passées en revue dans l'ouvrage suivant: Clinical Chemistry -Principles and Technics, rédigé par R.J. Henry, D.C. Cannon et s J.W. Winkelman (Harper and Row, éditeurs; 2e éd., 1974) aux pages 1042 à 1079; les méthodes de dosage de la bilirubine sont aussi passées en revue dans l'ouvrage suivant: Fundamentals of Clinical Chemistry, rédigé sous la direction de N.W. Tietz (W.B. Saunders Co., éditeur, 1970) aux pages 743 à 762. La méthode m de dosage de la bilirubine peut-être la plus utilisée est la méthode dite «au diazoïque». La méthode au diazoïque utilise une réaction de copulation entre la bilirubine et un sel de diazonium, tel que le diazo de l'acide sulfanilique, pour former un pigment ayant un coefficient d'extinction plus grand que celui de la bili- 15 rubine elle-même (qui est colorée en jaune). Typiquement, la réaction du diazoïque dans le dosage de la bilirubine comprend deux phases cinétiques: d'abord une phase de «réaction directe», dans laquelle la couleur se forme très rapidement, puis une phase de «réaction indirecte», dans laquelle la couleur ne se 20 forme qu'après addition de méthanol. Comme expliqué aux ouvrages précités, notamment dans celui de Winkelman et consorts, les spécialistes ne sont pas pleinement d'accord sur la signification respective des deux phases cinétiques de la réaction. En effet, certains auteurs considèrent la réaction directe 25 comme une mesure de la bilirubine libre (non combinée) et la réaction indirecte comme une mesure de la bilirubine liée à l'albumine; d'autres auteurs pensent que la réaction directe concerne la bilirubine conjuguée, tandis que la réaction indirecte concerne la bilirubine non conjuguée. 30

Dans son examen critique de la méthode au diazoïque, Winkelman, qui note cette incertitude d'interprétation des résultats, conclut que, par suite des nombreuses variantes de la méthode au diazoïque et de la complexité de la réaction avec le diazoïque, les résultats obtenus sont souvent différents. D'autre part, cette 35 méthode utilise plusieurs réactifs qu'on doit mélanger peu de temps avant le dosage, si bien que, d'une manière générale, l'analyse est assez longue et peut être inexacte par suite de la présence d'autres composés diazotables dans le sérum humain et les autres fluides biologiques analysés. 4o

Un certain nombre de méthodes de dosage de la bilirubine autres que les méthodes au diazoïque ont été proposées et parfois utilisées. Notamment, il existe divers dosages spectrophoto-métriques directs de la bilirubine, utilisant l'absorption propre du produit à doser. La bilirubine est, en effet, un pigment jaune 45 ayant une absorption moléculaire d'environ 5 • 104 à 435 nm.

Bien que cette valeur soit assez grande pour permettre la spec-trophotométrie directe, elle est trop petite pour permettre un dosage au moyen de produits secs pour analyse, notamment les produits analytiques secs, tels que les produits décrits au brevet 50 des Etats-Unis d'Amérique 3 992 158. Actuellement, les dosages spectrophotométriques de la bilirubine sont généralement limités à l'analyse des solutions, surtout quand on cherche des résultats quantitatifs précis. D'autre part, comme indiqué dans les articles généraux cités ci-dessus, notamment celui de Win- 55 kelman, la spectrophotométrie directe de la bilirubine est faussée par l'interférence de l'hémoglobine dont les pics d'absorption sont à 414 nm, 540 nm et 576 nm. D'autres constituants du sérum humain et des autres fluides biologiques contenant de la bilirubine peuvent aussi interférer dans les dosages spectropho- 60 tométriques directs; par exemple les caroténoïdes interfèrent, le bêta-carotène, qui est un de leurs constituants principaux ayant un pic d'absorption à environ 450 nm, dans une région du spectre voisine d'un des pics d'absorption de la bilirubine.

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Le dosage spectrophotométrique direct de la bilirubine est ainsi gêné par la présence éventuelle de composés absorbant le rayonnement utilisé; il peut aussi être gêné par la présence dans le sérum humain d'autres matières protéiques, telle que l'albumine, sur lesquelles se fixe la bilirubine, ce qui peut produire un décalage des pics d'absorption de la bilirubine et modifier l'intensité de l'absorption.

Pour les raisons exposées ci-dessus et pour d'autres raisons, on a dû, en fait, se baser sur la méthode au diazoïque et sur diverses variantes de la spectrophotométrie directe pour doser la bilirubine. Par exemple, le brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 569 721 décrit un dosage spectrophotométrique direct de la bilirubine, dans lequel on prétend éliminer l'interférence spectrale de l'hémoglobine par une première mesure au pic d'absorption de la bilirubine et une seconde mesure à une longueur d'onde pour laquelle l'hémoglobine seule présente un pic d'absorption, en corrigeant la première mesure en fonction de la quantité d'hémoglobine mesurée dans le liquide étudié.

Un autre procédé proposé pour doser la bilirubine utilise un mélange de réactifs contenant un acide organique, tel que l'acide trichloroacétique, ou un acide organique sulfonique, sous forme libre ou sous forme de sel, et un ion ferrique: l'acide organique, ou son sel oxyde la bilirubine en présence de l'ion ferrique, avec formation d'un produit de réaction tel que la biliverdine ou la cholécyanine: cette réaction produit une coloration caractéristique (bleu ou bleu-vert). L'intensité de cette coloration est fonction de la quantité initiale de bilirubine. Cette technique est décrite notamment aux brevets des Etats-Unis d'Amérique 3 348 920 et 3 607 093, ainsi qu'au brevet belge 816 927. Cette méthode présente une grande partie des défauts notés pour la méthode au diazoïque et pour la spectrophotométrie directe. Par exemple, quand on fait réagir l'acide organique ou son sel et l'ion ferrique avec la bilirubine, il faut habituellement attendre environ 10 mn pour que la réaction soit complète, et la séparation du produit final et du mélange de réaction, nécessaire pour la mesure spectrophotométrique, demande encore un certain temps. D'autre part, la présence de certains corps qui présentent un maximum d'absorption dans la région bleue du spectre, par exemple d'hémoglobine ou de certains caroténoïdes, peut fausser la mesure spectrophotométrique.