SE443048B - Sett och element for bestemning av bilirubin - Google Patents

Description

7soo4os-s 2 halter bilirubin i blodet kan leda till en icke önskad ökning av bilirubinkoncentrationen i kroppscellerna och störa olika cell- Jprocesser. Bilirubin har exempelvis inom vida kretsar ansetts vara en kraftig inhibitor vid många enzymatiska reaktioner, som alstrar energi, som är vital för cellen. Mot denna bakgrund är den -kliniska diagnostiska betydelsen av bilirubin vid prov med avse- ende på leverfunktionen och andra funktioner i besläktade organ självklar.

Litteraturen rörande bilirubinanalysmetoder är voluminös.

Goda Översikter, som skisserar många olika bilirubinanalysmetoder, återfinns genom hänvisning till texten i Clinical Chemistfy-prin- ciples and Technics, utgiven av R. J. Henry, D. C. Cannon och J. W. Winkelman, Harper and Row Éublishers, 2:a upplagan, sid lO42- 1079 (1974). En ytterligare översikt över bilirubinanalysmeto- derna återfinnas i Fundamentals of Clinical Chemistry utgiven av N. W. Tietz, sid 743-762 (l970). Den kanske mest använda analy- tiska metoden för bilirubinanalysarbete har varit den så kallade diazometoden, enligt vilken bilirubin kopplas för bildning av ett pigment medenxextinktionskoefficient högre än bilirubinet självt, (som ger gul färgning).

Förutom diazometoden och besläktade varianter därav har ett antal andra bilirubinanalysmetoder föreslagits eller använts vid olika tillfällen. Bland annat finns metriska (dvs kolorimetriska) analysmetoder för bilírubinf där man drar fördel av bilirubinets färg. Fritt bilirubin är ett gult pig- ment med en molär absorptivitet på cirka 5 x 104 mätt vid 435 nm.

Fastän bilirubinets molära absorptivitet är tillräckligt hög för att kunna användas i olika direkta spektrofotometriska lösnings- metoder är den ej tillräckligt hög för att ge en god kvantitativ analys av bilirubin med analytiska provelement utnyttjande “torr- kemi" t ex det analytiska element, som beskrivesi.GB PS l 440 464.

Därtill är de direkta spektrofotometriska analysbestämningarna av bilirubin behäftade med spektrala störningar på grund av närvaron av hemoglobin, som uppvisar absorptionstoppar vid 414, 540 och .S76 nm. Dessutom kan andra material, som finns i bilirubinhaltiga biologiska vätskor, såsom humanserum, också ge spektrala störningar.

Exempelvis kan karotenoider störa på grund av att beta-karoten, en av de huvudsakliga karotenoidkomponenterna, har en absorp- tionstopp vid cirka 450 nm. _ Ytterligare en metod, som används för analys av bilirubin av- 3 7800403-3 ser användning av en reagenskomposition för bilirubin, vilken kom- position innehåller en organisk syra eller ett salt därav, såsom triklorättiksyra eller en organisk sulfonsyra, tillsammans med en järn(III)jon. I denna metod oxideras bilirubin av den organiska syran eller saltet därav i närvaro av järn(III)jonen till en reak- tionsprodukt, vilken reaktion uppvisar en karaktäristisk blå eller blågrön färg och en intensitet, som står i förhållande till den bilirubinmängd, som fanns ursprungligen. Denna metod är också be- häftad med många av de nackdelar, som beskrivits ovan för diazo- analysmetoden och den direkta spektrofotometriska analysmetoden.

Föreliggande uppfinning avser ett sätt att bestämma fiïlirubin i en vattenhaltig vätska, varvid I (a) den vattenhaltiga vätskan bringas i kontakt med en betnings- komposition för bilirubin innefattande en hydrofob organisk grundmassa, som innehåller laddningsbärande katjoniska grup- per, varvid det betade bilirubinet uppvisar en absorptions- topp förskjuten minst 10 nm från det fria bilirubinets och en molär extinktionskoefficient, som är minst SO % högre än det fria bilirubinets, och (b) det betade bilirubinet påvisas kolorimetriskt.

Enligt vissa särskilt lämpliga utföringsformer av uppfinningen förskjutes absorptionstoppen för det betade bilirubinets till en våglängd på 460 nm eller längre och den molära extinktionskøeffi- cienten för det betade bilirubinet höjs till ett värde på“7,5 x 104 eller högre.

Metoden enligt uppfinningen är lämplig för analys av bilirubin i biologiska vätskor, såsom blod, blodserum eller urin, särskilt blodserum, eftersom den minimerar effekten av många vanliga bili- rubinstörämnen såsom hemoglobin, karotenoider. Detta upp- nås delvis genom den betydande ökningen av den molära extinktions- koefficienten för det betade bilirubinet och delvis genom förskjut- ningen av absorptionstoppen. Då man utnyttjar analysmetoden enligt uppfinningen för analys av bilirubininnehållet i olika biologiska vätskor är det naturligtvis alltjämt önskvärt att man avlägsnar och skiljer (från bilirubinet) olika proteinstörämnen med högre molekylvikt, till vilka bilirubinet kan bindas, t ex albumin, så att man får en kvantitativ analys med avseende pâ det totala bili- rubin, som finns i provvätskan. På grund härav kan provvätskan underkastas en preliminär behandling för separation eller avlägs- nande av sådana bilirubinstörämnen. En sådan preliminär behandling ,7sno4os-s 4 kan innefatta konventionella metoder, som är lämpade för att av- lägsna proteinstörämnen med högre molekylvikt,vilka störämnen påverkar bilirubínet, såsom proteinutfällning eller provutspädning.

Enligt en särskilt lämplig utföringsform genomföres den ovan beskrivna bilirubinanalysen enligt uppfinningen med hjälp av ett analytiskt element vilket innefattar en vätskeogenomtränglig transparant bärare, som uppbär ett betningsskikt innefattande en betningskomposition enligt ovan och ett därpå anbringat poröst 'skikt, som är lämpat för utspridning av den vätska, som pâförts det.

Om så önskas kan ett ytaktivt medel införlivas i spfïdnings- skiktet, särskilt i en mängd, som verksamt normaliserar transpor- ten av bilirubin genom denna zon, även i närvaro av mycket vari- erande mängder högmolekylära proteinstörämnen för bilirubin, såsom albumin. “ Enligt en annan aspekt av uppfinningen är betningsskiktet i det ovan beskrivna analytiska elementet för analys av bilirubin företrädesvis ogenomträngligt för högmolekylära proteinstörämnen för bilirubin, t ex albumin och andra proteiner, som har molekyl- vikter på 60 000 eller högre, för att undvika störning från sådana material.

Separata mellanskikt kan införlivas mellan betningsskiktet och bäraren eller mellan det porösa spridningsskiktet och xeagens- skiktet om så önskas. Sådana mellanskikt kan innehålla ytterligare reagens t ex för avlägsnande av olika eventuella störämnen från ett vattenhaltigt vätskeprov, som analyseras eller, om så önskas, kan sådana mellanliggande skikt innehålla hydrofila, vattensväll- bara material, t ex gelatin, för att påskynda transporten av vät- skeproven genom det flerskiktiga testelementet.

Frid:bilirubin.avseri.detta sammanhang att innefatta konju- gerat eller icke konjugerat bilirubin, som ej är bundet till serum- protein. Fritt bilirubin uppvisar normalt en absorptionstopp vid en våglängd inom intervallet 435 till 440 nm och en molär absorp- 4 mätt i en vattenhaltig lösning vid tivitet (Em) på cirka 5 x 10 22°C och ett pH på 7,4. Såvida ej annat angivits är alla molära abscrptivitetsvärden mätta i vattenhaltigt medium vid approxima- tivt 22°C och ett pH på 7,4. _ ' Företrädesvis genomföras bilirubinanalysmetoden enligt upp- finningen med användning av analytiska element, såsom beskrivits ovan, där man utnyttjar "torrkemi“, vilka innehåller en sprid- 7800403-3 ningszon. Detta beror på att dessa analyselement överraskande har visat sig effektiva då det gäller att eliminera de flesta vanliga störämnen vid bilirubinanalysen.Dessa ehammt eliminerar inte endast störning från karotenoider och hemoglobin utan dessutom uppvisar de mycket liten eller ingen störning orsakad av natriumklorid eller de proteiner, som ingår i ett givet vätskeprov.

Man bör emellertid också notera att sättet enligt föreliggande uppfinning också med fördel kan genomföras med olika "våtkemi-" eller lösningsanalysmetoder. I sådana fall bringas den interaktiva betningskompositionen för bilirubin, som är införlivad i ett lämp- ligt vätskemedium, i kontakt med ett vätskeprov, som innefiâller bilirubin. Då man använder en "våtkemi-" eller lösningsanalys är det lämpligt att utsätta det bilirubinhaltiga vätskeprovet för ett preliminärt behandlingssteg för att eliminera högmolekylära protein- störämnen för bilirubin. ' ' Betningskompositionen kan innefatta polymera betningsmedel, som tidigare använts i olika fotografiska filmer, papper eller inom andra områden och som har en sammansättning, som innehåller åter- kommande monomera enheter, som innehåller laddningsuppbärande kat- joniska grupper och som innehåller på samma eller på andra monomera enheter organogrupper, som ger hydrofobicitet. Naturligtvis kan andra polymera material med de ovan beskrivna egenskaperna men vil- ka material ej hittills identifierats såsom användbara fotografiska betningsmedel också användas i detta fall. * Särskilt lämpliga polymera interaktiva betningskompositioner, som kan användas enligt uppfinningen, innefattar en polymer med återkommande enheter med formeln _ _ 'l Q (I) I M* _ X vari Al betecknar en tvåvärd organisk grupp, Ql betecknar en bindning eller en gruppbindning M+ till Al, + M betecknar en kvarternär ammonium- eller fosfoniumgrupp och X- betecknar en anjon.

Exempel på anjoner, som X- kan beteckna,är klorid, bromid, nitrat, metosulfat och p-toluensulfonat.

Den föredragna M+~gruppen har formeln: 7sno4n3-3 6 Rl - NJ' - Rz (II) I Ra eller nl - P+ - :<2 (III) R3 vari Rl, R2 och R3 vardera betecknar en alkylgrupp med l-10 kol- atomer eller en aryl-, aralkyl- eller alkarylgrupp med 5-20 kol- atomer, företrädesvis en alkylgrupp med l-l0 kolatomer.

Företrädesvis betecknar Ql i formeln I en kolvätegrupp, som lämpligen utgöres av en arylen-, arylenalkylen-, alkylenarylen-, arylenbisalkylen- eller alkylenbisarylengrupp. Även om det-ej er- fordras är det lämpligt att Q innehåller mellan 5 och 10 kolatomer.

Såsom kommer att inses kan Al i formeln I variera beroende på det speciella polymerskelett, som man väljer att använda. Sär- skilt goda resultat har emellertid erhållits dâ A betecknar en alkylengrupp. Vanligen innehåller sådana alkylengrupper 2-10 kol- atomer. Ett lämpligt intervall är 2-4 kolatomer.

En föredragen betningskomposition innefattar en polymer med återkommande enheter med formeln: __ Qz (IV) vari A2 betecknar en alkylengrupp, _ Q2 betecknar en bindande kolvätegrupp innehållande 5-10 kol- atomer, Rl R2 och R3 betecknar vardera alkyl med l-10 kolatomer I eller en aryl-, aralkyl- eller alkarylgrupp med 5-20 kol- atomer och " X- betecknar en anjon.

De polymera betningskompositioner, som har visat sig lämpliga enligt uppfinningen, kan utgöras av homopolymerer eller sampolyme- rer, varvid sampolymererna har visat sig särskilt lämpliga. En 7800403-3 sådan betningskomposition innefattar en sampolymer, som innehåller enheterna med formeln I och därtill upp till 75 vikt% av ytterli- gare icke störande återkommande enheter. Uttrycket "icke störande återkommande enheter" användes i föreliggande uppfinning för att beteckna polymerenheter, som ej kemiskt eller fysikaliskt stör den ovan beskrivna betningen av bilirubin. Monomera förföreningar, som kan ge sådana enheter och som också ger hydrofobicitet till den erhållna betande polymeren,är alifatiska och aromatiska kolväten, t ex olefiner, substituerade olefiner, styren och substituerade styrener, och alkylakrylater och metakrylater och derivater därav.

Om så önskaskandessutom den polymera interaktiva betandefföreningen förnätas så att individuella polymerkedjor exempelvis förnätas med en lämplig monomer t ex divinylbensen eller etylendimetakrylat.

Om sådana difunktionella bryggbildande grupper föreligger,ingår de normalt i en polymer interaktiv betningskomposition enligt upp- finningen i en mängd upp till 5 vikt%, företrädesvis från 0,1 till 2 vikt%,räknat på den totala vikten monomerer, som finns närvarande i den sampolymeriserbara blandningen av de monomerer, som användes för framställning av sampolymeren.

En föredragen-betningskomposition innefattar en sampolymer, som innehåler 25-90 viktdelar av enheter med formeln II, 10-75 vikt- delar av icke störande enheter från alifatiska, aralifatiska eller aromatiska kolväten, alkylakrylater eller alkylmetakrylater°och O-5 viktdelar av enheter, som ger en difunktionell bryggbildande §rUPP- Även om de föredragna betningskompositioner, som användes i föreliggande uppfinning har beskrivits omedelbart ovan såsom poly- mera material inser man att icke polymera material med erforderlig hydrofobicitet och katjoniska grupper för betning av bilirubin kan användas. Då sådant icke polymert betningsmaterial användes enligt uppfinningen i analytiska element, som utnyttjar "torrkemi" är det lämpligt att det har en molekylär utformning eller en tillräckligt hög molekylvikt så att materialet kan immobiliseras inom ele- mentets betningsskikt.

En uppräkning av vissa enskilda representativa interaktiva polymera betningskompositioner för bilirubin enligt uppfinningen innefattar de polymerer, som uppräknas i tabell l nedan. 7800403-3 _U 1» . 14 »=u|2|»=o _ \~/a fw qzuwïull ø\ / fÛH ä. 4 IO l _ :O N 0 _=o w:u|@z|n:u N I Will Mø l Hßflvwflfunßm N mot Ioilll fiñøfluoflxësficoëemnflæmcmn |H%uoEHw|H>mcwnH>cH>1 |mV|0U|cwuä#w~>Hom .N Awfluofix lüøflcoåëmlfiæumäfluu |H>mcwnH>:«>vmHom .H GEMZ A Aflmmáß 7800403-3 J PwD I 0 _ bø0 bwß I Ulønl I 0 ._ N Io w/ HQ H Tafßölll! S. . .lll IQ' HÜQÅÜHHW ^mcflcuuwmu»ouv HAøfluofixësflcoëëmnfiæxwsfiuu |HmmcwnHmaw>vnooløwnæuwuæaom ^wfluoHx |EsHa0wmouHMuu0flHu| |fi>mcmnHæafl>xmv>Hom :Emz H Qåmmáfi .w 7800403-3 10 Iulzl IQ 4 U HÜUXSHQW .\ w / fl I ÖV a N IQ! Amcficßflwwpwøwv O / \% N .

I IU H Qflflmšü Hammcwnflænfl>fiU| uoouñmfluoflxäsfinoäëm aflæmamnaæumñfløfimwcmn |H>:fi>|mv|oo|øwumuwH>Hom ~:mu>»m|ou|^©flnoHxEøflnoEEm |Hæ@wE«uu|H>mawnH>cfl>H»Hem cëmz ll 7800403-3 Den betningskomposition, som kan användas enligt uppfinningen, kan framställas enligt välkända kemiska reaktionsmetoder. Om specifika detaljer för framställningen av sådana material önskas hänvisas till följande patentskrifter: GB PS l 26l 925 och US PS 3 488 706, 3 557 066, 3 625 694, 3 709 690, 3 770 439, 3 758 445, 3 773 509, 3 859 096z 3 898 088, 3 944 424 och 3 958 995.

Den mängd av betningskompositionen för bilirubin, som erford-' ras vid bilirubinanalysen enligt uppfinningen, kan variera. I varje givet fall beror normalt mängden av den interaktiva betningskompo- sitionen på det speciella intervallet för bilirubininnehållet, dvs det "dynamiska intervall", inom vilket en specifik bilirubinanalys betecknas såsom lämplig. Enligt olika föredragna utföringsformer av uppfinningen användes tillräckligt mycket betande medel för att l mol bilirubin skall bindas eller betas till ett material, som innehåller en molärt ekvivalent mängd bindningsställen för biliru- bin. Enligt en föredragen utföringsform av uppfinningen,använ- der man ett polymert betningsmaterial, som framställts från en sampolymer mellanprodukt av styren och vinylbensenklorid med en inre viskositet (mätt vid 25°C i bensen vid en koncentration av 0,25 g/dl) på 0,15 till 1,0. Man använder vanligen en mängd av en sådan sampolymer inom intervallet 0,01 till 1,0 g/dl betningskom- position för ett dynamiskt intervall på 0,1 till 50 mg/dl av bili- rubinanalysen. I allmänhet har det visat sig lämpligt attJi.bet- ningsskiktet i analyselementen enligt uppfinningen ha ett över- skott av betningskomposition så att man kan påskynda bilirubinets interaktion med de betande materialen och erhålla den önskade änd- ringen i de spektrala egenskaperna.

Då metoden enligt uppfinningen genomföras såsom lösningsanalys genomföres analysen först genom att man i en lämplig "våt" reak- tionszon, såsom en strålningsgenomsläpplig behållare framställer en lämplig interaktiv betningskomposition såsom beskrivits ovan löst eller dispergerad i ett icke störande vätskemedium. Sådana icke störande vätskor är vätskor, som under användningsbetingel- serna ej väsentligen stör interaktionen av bilirubinet och bet- ningskompositionen eller stör absorptionstoppen för det fria och betade bilirubinet. Sådana icke störande vätskor kan utgöras av ett flertal båda vattenhaltiga och organiska vätskor. På grund av föreliggande metoders användning vid analys av biologiska fluida är det vanligen fördelaktigt att såsom icke störande vätska välja 7000403-3 12 en vattenhaltig vätska, t ex vatten eller olika liknande polära organiska lösningsmedel, t ex lägre alkanoler. Om så önskas kan det beroende på det speciella betande medlet vara lämpligt att låta olika buffrande material ingå i reaktionszonen förutom det betande medlet.

I allmänhet har de bilirubinanalyser, som genomförts med "våtkemi"-metoden enligt uppfinningen,visat sig ge fördelaktiga resultat då metoderna genomförts med en buffrad vattenhaltig vät- ska, som har ett pH från 6,8 till 9,5,och vid en temperatur inom området 15 till 60°C, företrädesvis från 22 till SOOC. Beroende på det speciella betande medlet kan man naturligtvis variera det angivna pH-värdet och temperaturen i reagenszonen till värden över eller under de nämnda områdena under förutsättning att man inte använder ett pH eller en temperatur, som ger icke önskade bíreaktioner eller betydande nedbrytning av bilirubinet eller betningskompositionen. Då sättet enligt uppfinningen genomföras såsom en lösningsanalys är det önskvärt att man genomför analysen i mörker eller vid gult ofarligt ljus för att undvika ljusframkal- lad nedbrytning av bilirubin.

Då sättet enligt uppfinningen genomföres såsom "våt"-analys är det önskvärt att man såsom tidigare förklarats först behandlar det bilirubinhaltiga flytande provet för dissociering av biliru- binet från olika material, till vilka det kan vara bundet._På exem- pelvis det flytande provet utgöres av blodserum är det känt att en stor mängd av bilirubinet i serumet är bundet till albumin.

Olika metoder har anvisats inom detta omrâde för att dissociera bilirubinet från material, såsom albumin, och sådana metoder kan användas såsom ett preliminärt behandlingssteg enligt föreliggande uppfinning så att den senare analysen ger en exakt bestämning av det totala bilirubininnehållet i serumprovet. Sådana kända metoder inbegriper användning av olika proteinfällningsmetoder och prov- spädningsmetoder. En kort översikt av många av dessa olika metoder återfinns i exempelvis den angivna publikationen av Winkelman et al, dvs Clinical Chemistry-Principles and Technics, 2:a upplagan 1974, sid 1042 till l079. _ På grund av den förenklade hanteringen och av andra bekvämlig- hetsskäl liksom på grund av att man erhåller kvantitativa analytiska resultat föredrar man särskilt att använda föreliggande uppfinning i analyselement enligt ovan för "torr" analys av bilirubin.

Betningsskikten i föreliggande analytiska element kan innefatta 7800403-3 13 en grundmassa, vari betningskompositionen är fördelad, dvs löst eller dispergerad. Såsom ofta är fallet i föreliggande uppfinning, där betningskompositionen är polymer och i sig filmbildande eller på annat sätt beläggningsbar såsom ett jämt skikt eller en zon er- fordras emellertid något sådant ytterligare grundmassematerial ej.

Valet av grundmassa varierar naturligtvis och beror på komponen- terna i den betningskomposition, som är fördelad i grundmassan.

Under alla omständigheter bör grundmassan vara "icke störande" i förhållande till betningskompositionen, dvs grundmassan får ej själv ha förmåga att binda eller beta betningskompositionen; Lämp- liga grundmassor för betningsskikten, som är förbundna med sprid- ningsskikten är icke fibrösa och kan inbegripa icke störande hy- drofila material innefattande syrahydrolyserade gelatíner (t ex "pig gel") och derivat därav med en isoelektrisk punkt på cirka 9,1, hydrofila cellulosaderivat, polysackarider, såsom dextran,.arabískt gummi, agaros och liknande och även syntetiska substanser, såsom vattenlösliga polyvinylföreningar, såsom poly(vinylalkohol) och poly(vinylpyrrolidon) och akrylamidpolymerer. Icke störande organo- fila material såsom cellulosaestrar och liknande kan också använ- das.

Analogt med fallet med lösningsanalys för bilirubin enligt ovan kan man också i ett "torrkemi"-analyselement införa en lämp- lig pH-buffrande komposition. Den buffrande kompositionen kan in- föras i betningsskiktet eller i ett eller flera av de andra skikt, som föreligger i det speciella analyselementet i en mängd, som är tillräcklig för att under elementets användsbetingelser ge rea- gensskiktet ett pH-värde som är väsentligen identiskt med det pH- värde, som användes vid en lösningsanalys. Olika buffrande kompo- sitioner kan användas,sâsom fosfatbuffrar och andra,exempelvis de som beskrives av Good i Biochemistry å, 467 (1966).

Såsom tidigare nämnts kan ett element i ett stycke enligt upp- finningen normalt inbegripa ett spridningsskikt. Spridningsskiktet är ett skikt, som kan ta emot ett flytande prov, oavsett detta anbringas direkt på spridningsskiktet eller tillföres från ett skikt eller från skikt i fluidumkontakt med spridningsskiktet och inom vilket lösningsmedlet eller dispersionsmediumet för provet och bilirubinet är distribuerat så att en jämn koncentra- tion av bilirubin fås vidcüaisida av spridningsskiktet, som är vänd mot elementets reagensskikt. En sådan koncentration kan uppnås med koncentrationsgradienter, som finns över tjockleken 7soo4os-s M av, eller på annat sätt i, spridningsskiktet. Sådana gradienter medför inga svårigheter då det gäller att få kvantitativa test- resultat och de kan ackommoderas med kända kalibreringsmetoder.

Föreliggande analyselement kan vara självbärande men det är företrädesvis placerat på en bärare. Lämpliga bärarmaterial är ett flertal polymera material, såsom cellulosaacetat, poly(etylen- tereftalat), polykarbonater och polyvinylföreningar, såsom poly- styren. En bärare, som valts för ett visst element,bör vara kompa- tibel med det åsyftade sättet att påvisa resultatet. Lämpliga bärare är strålningstransmissiva bärarmaterial, som släpper_igenom elektromagnetisk strålning vid en våglängd ellervidvågläggderinom intervallet 300 nm och 700 nm. Detkan ocks vara lämpligt att ha en bärare, som släpper igenom ett eller flera smalare våglängds- band och som är opakt för intilliggande våglängdsband. Detta kan åstadkommas genom att man exempelvis impregnerar eller belägger bäraren med ett eller flera färgämnen, som har lämpliga absorp- tionsegenskaper.

Komponenterna i ett skikt i ett element enligt uppfinningen och skiktets utformning kan variera avsevärt. Såsom tidigare an- givits kan spridningsskiktets porstorlek väljas så att skiktet kan filtrera ut icke önskvärda provkomponenter, såsom proteiner med högre molekylvikt än bilirubin, vilka exempelvis skulle störa den analytiska utbytesreaktionen eller påvisandet av det resul- tat,-som åstadkommas inom elementet. För analys av helblod*är po- rösa skikt med en porstorlek från 1 till 5 mikron lämpliga för att välja ut blodceller, som normalt har en storlek från 7 till 30 mik- ron. Om så är önskvärt kan ett element innefatta ett flertal sprid- ningsskikt, vilka var och en kan ha olika förmåga att sprida och filtrera.

I elementskikten kan det också vara lämpligt att införa ett eller flera ytaktiva material, såsom anjoniska eller nonjoniska ytaktiva material. De kan exempelvis förhöja skiktberedningarnas beläggningsbarhet och öka omfattningen och hastigheten för sprid- ningen i spridningsskikt, som ej med lätthet vätes av flytande prov i frånvaro av ett hjälpmedel, såsom ett ytaktivt medel.

Speciellt kan det vara lämpligt att införliva en relativt stor mängd av ett ytaktivt medel, t ex ett nonjoniskt ytaktivt medel, i spridningsskiktet i elementen enligt uppfinningen för att norma- lisera transporten av det bilirubin, som ingår i ett vattenhaltigt, proteinartat vätskeprov,í och genom detta skikt. Sådana normalise- 7800403-3 15 ringarär tillför~attinon1spridningsskiktet ge en ekvivalent pene- trering av lösningsmediet och bilirubinet, som ingår i olika pâ- satta prov av vattenhaltiga proteinvätskor oberoende av varia- tioner i proteinkoncentrationen mellan proven. Därtill har det visat sig, att vid analys av den totala mängden bilirubin, där bilirubinet ofta föreligger i "bundet tillstånd",såsom bundet till andra proteiner, t ex serumalbumin, synes användningen av sådana ytaktiva i spridningsskiktet ge normalisering av bilirubintranspor- ten för dissociering av bilirubin, som är bundet till sådant pro- tein. Lämpliga mängder ytaktivt medel för âstadkommande av en normaliserad bilirubintransport är vanligen mellan l och A5 vikt% räknat på skiktets torrvikt. i Analyselementen enligt uppfinningen kan utformas för använd- ning ejendast inom klinisk kemi utan också för kemisk forskning och i laboratorier för styrning av kemiska processer. Det är.väl lämpade att använda i kliniska tester på kroppsvätskor, såsom blod, blodserum och urin, eftersom man här utför ett stort antal återkommande tester och testresultaten ofta behövs efter en mycket kort tidsperiod efter det att provet tagits. Vid analys av blod med analyselementet enligt uppfinningen kan blodcellerna först skiljas från serumet genom exempelvis centrifugering och serumet anbringas sedan på elementet. Det är emellertid ej nödvändigt att genomföra en sådan separation om exempelvis reflekterande spektro- fotometrisk analysteknik användes för att kvantifiera eller på annat sätt analysera med avseende på betat bilirubin. Helblod kan anbringas direkt på elementet och blodcellerna filtreras ut eller uteslutes från reagensskiktet genom inverkan av ett separat mellan- liggande skikt, som fungerar såsom filterskikt, som också kan vara ett strålningsblockerande skikt. Närvaron av dessa celler på ele- mentet stör ej den spektrofotometriska analysen om den genomföras med reflektionsteknik med ljus, som transmitteras genom bäraren och registreringsskikt och reflekteras från det strâlningsblocke- rande skiktet eller annat reflekterande skikt så att detekterande strålning ej uppfångar cellerna. En särskilt viktig fördel hos analyselement i ett stycke enligt uppfinningen är dess egenskap att kunna användas för analys av antingen serum eller helblod. 1 Såsom tidigare nämnts kan elementen enligt uppfinningen inbe- gripa ett strâlningsblockerande skikt, som lämpligen är placerat mellan bäraren och reagensskiktet. Strålningsblockerande skikt har till funktion att hämma passage av elektromagnetisk strålning, så- 7800403-5 16 som strålning vid den våglängd eller de våglängder, som användes för detektering. Sådana skikt inbegriper ett opacifierande skikt, som genom sin absorbans, reflektans eller liknande,ger strâlnings- inhiberande effekt då det införlivas skiktet. Enligt en utförings- form kan det strålningsblockerande skiktet inbegripa en grundmassa, som innehåller ett opacifierande medel, såsom ett svart pigment, såsom kol,eller andra oorganiska vita pigment, såsom titandioxid, zinkoxi eller bariumsulfat. Vitnade polymerer, som vanligen är reflekterande, kan innefatta det opacifierande medlet och skikt av sådana vitnade polymerer, som kan användas i spridningsskiktet, kan också användas såsom strâlningsblockerande skikt. " Förutom användningen av ett eventuellt strâlningsblockerande skikt i ett analyselement i ett stycke kan ocksåandra eventuella mellanliggande skikt användas om så önskas. Exempelvis kan ett separat mellanskikt, som sväller i lösningsmedlet eller disper- sionsmediet för vätskeprovet under analys,användas. Sådana sväll- bara mellanskikt, som lämpligen är strålningsgenomsläppliga, t ex ett svällbart gelskikt, kan införas mellan betningsskiktet och bäraren i ett analyselement i ett stycke och det kan användas för att öka permeationen eller "spridningsgraden" för det bilirubin- haltiga serumprovet genom spridningsskiktet till betningsskiktet i elementet. Såsom ett annat exempel må nämnas att ett mellanlig- gande skikt kan införas i analyselementet enligt uppfinningen mel- lan spridningsskiktet och betningsskiktet. Ett sådant skikt bör naturligtvis vara genomsläppligt för bilirubin och det kan användas för införlivande av reagensmaterial, som kan göra olika störämnen för bilirubin inaktiva eller också kan det användas för att fil- trera och därigenom avlägsna sådana störmaterial. Enligt en annan variant av uppfinningen kan ett sådant mellanskikt användas för att införliva ett reagens, som kan användas för reaktion med bili- rubin. Exempelvis kan ett gelatinmellanskikt innehållande enzymet glucuronidas användas mellan spridningsskiktet och betningsskiktet, varvid den enzymatiska inverkan av glucuridas användes för att omvandlakonjugerat bilirubin i vätskeprovet under analys till en icke konjugerad form av bilirubin. Alternativt införlivas enzymet glucurodinas i spridningsskiktet för mera direkt och effektiv in- teraktion med enzymet på den inkommande konjugerade formen av bili- rubin.

Följande exempel är avsedda att ge en bättre bild av förelig- gande uppfinning. 7800403-3 17 EXEMPEL l - Lösningsanalys för bilirubin.

I detta exempel visas att bilirubin i ett flytande analys- medium och i närvaro av vissa betningsmedel, som tidigare angivits, förskjuter sin Amax (maximala absorptionstopp) från 435-440 nm till 460 nm med en markant ökning av den molära extinktionen vid denna nya absorptionstopp. För att visa detta registrerades absorp- tionsspetra (360-600 nm läst på en spektrofotometer vid 37°C) från fyra flytande lösningsprov identifierade såsom A till D nedan: A) 0,05 M natriumdivätefosfatbuffert, pH 7,4 _ B) 0,012 % (vikt/volym) betningsmedel 6 i tabell l i natriumdi- vätefosfatbuffert, pH 7,4 '_ ' c) 1 :ng/ai bilirubin i natriumdivätefosfatbuffert, pa 1,4 n) 1 mg/di bilirubin + 0,012 s (vikt/volym) av betningsmeaei e i tabell 1 i natriumdivätefosfatbuffert, pH 7,4.

\ Resultaten från de erhållna absorptionsspektra visar att 1. vid de testade nivåerna bidrar varken fosfatbufferten (lösning A) eller betningsmedel 6 enbart (lösning B) väsentligt till absorptionen någonstans inom detta spektralområde; 2. bilirubin ensamt (lösning C) har ett absorptionsmaximum (lmax) vid 435-440 nm; och 3. bilirubin i närvaro av betningsmedel 6 i tabell l (lösning D) leder till en förskjutning av dess lma till 460 nm följt av . x tvåfaldig ökning av dess absorption vid den nya toppen, dvs E 460 40 x 103 ----> E* 80 x 103 m m46O (Em46O betecknar den molära extinktionskoefficienten för bili- rubin enbart,och E; ficienten för bilirubin och betningsmedel 6 i tabell 1. 460 betecknar den molära extinktionskoef- EXEMPEL 2 - Användning av bilirubin-betningsmedelinteraktion i ett analyselement.

I en föredragen utföringsform av uppfinningen framställdes ett analyselement i ett stycke enligt följande: En transparent bärande väv av polyetylentereftalat täoktes med ett reagensskikt, som enbart bestod av betningsmedlet 4 i tabell l (O,54 g/m2); ett grundskikt som innehöll poly(n-isopropyl- akrylamid)(O,32 g/m2) och ett spridningsskikt av vitnad polymer innehållande TiO2 (45,6 g/m2) cellulosaacetat (6,45 g/m2), Tritonz X-405 (oktylfenoxipolyetoxietanol från Rohm & Haas Co), (2,5l g/m ) och oljeeter av polyetylenglykol (O,64 g/m2). ' 7000403-5 18 Elementet prövades sedan på följande sätt: En serie bilirubinlösningar innehållande 7 g/dl humanserum- albumin och 100 mM saltlösning och bilirubinmängder varierande från 0 till 20 mg bilirubin per deciliter lösning avsattes såsom fläckar (med droppar på ungefär lO Pl) på det belagda elementet. Ändringen i reflektionsdensitet, ADR, i analyselementet enligt detta exempel (mätt vid 460 nm och 3700) registrerades efter 7 min. Figur l på åtföljande ritning visar detta elements gensvar över det testade bilirubinområdet på 0-20 mg/dl.

Utomordentlig reproducerbarhet, såsom framgår av det verti- kala strecken vid varje punkt på kurvan,erhölls med dettafelement.

EXEMPEL 3 - Utnyttjande av bilirubin-betningsmedelsinteraktion i ett analyselement med betningsmedel och gelatin.

Ieæxannan utföringsfonnav'uppfinningen framställdes en väv- struktur enligt följande: ' En transparent bärande väv av polyetylentereftalat täcktes med ett reagensskikt, som innehöll betningsmedel 6 i tabell 1 (2,2 g/m2) och gelatin (4,1 g)m2) och samma spridningsskikt som i exempel 2.

Väven undersöktes sedan såsom beskrivits i exempel 2. En se- rie vattenhaltiga lösningar innehållande varierande mängder bili- rubin och med ett pH på 7,4 och en serie saltlösningar med ett pH på 7,4 och vilka innehåller 7 g/dl albumin och varierande mängder bilirubin användes såsom flytande prov. Härvid fann man att-elemen- ' tet enligt detta exempel uppvisade ett synnerligen linjärt spek- trofotometriskt respons inom ett brett intervall med olika bili- rubinkoncentrationer. Elementetsokänslighet för albumin visades av den goda överensstämmelse, som erhölls av elementet enligt detta exempel oavsett det flytande provet innehöll albumin eller inte.

EXEMPEL 4 - Utnyttjande av intraktionen mellan bilirubin och bet- ningsmedel i ett analyselement med en gel.

I en ytterligare utföringsform av uppfinningen framställdes ett analyselement enligt följande: v Den bärare, som användes i exempel 2, belades med ett gelskikt, som innehöll serumalbumin från nötkreatur (1,1 g/m2) ggn gelatin (2,3 g/m2); ett reagensskikt, som innehöll betningsmedel 6 i tabell l (1,1 g/m2) och gelatin (1,1 g/m2); och ett spridningsskikt som beskrivits i exempel 2. ' 'Väven undersöktes sedan på samma sätt som beskrivits i exem- 19 7800403-3 pel 2. vattenhaltiga lösningar (från American Monitor Corp., Indianapolis, Indiana), som innehöll 7 g/dl humant serumalbumin i saltlösning och varierande halter bilirubin användes såsom kali- brator för elementet. Därefter användes det kalibrerade elementet för att testa olika kommersiellt tillgängliga humanserumsurrogat med olika sammansättningar och med en känd bilirubinhalt. De bili- rubinvärden, som mättes med elementet enligt detta exempel (inom ett bilirubinkoncentrationsintervall på 0,5 till 20,0 mg/dl) över- ensstämde mycket bra med de värden, som angivits av tillverkarna av humanserumsurrogaten.

EXEMPEL 5 - Avsaknad av spektrala störningar på grund av'Eemoglobin.

De flesta, om ej alla, andra direkta spektrofotometriska ana- lyser av bilirubin störs på grund av det hemoglobin, som finns i serumet i mängder mindre än 20 mg/dl. För att visa att föreliggande flerskiktsanalyselement är fullständigt fria från spektrala stör- ningar framkallade av hemoglobin, fläckades identiska element .enliqt uppfinningen framställda såsom beskrivits i exempel 3 med flytande testprov innehållande antingen l mg/dl eller l5 mg/dl bilirubin och varierande mängder hemoglubin varierande från 0 till l50 mg/dl, och reflektionsdensiteten, DR,vid 460 nm mättes på varje element. Ingen ändring i elementens respons observerades inom detta vida hemoglobinkoncentrationsintervall, vilket visar att hemoglobinet ej störde vid denna analys vid 460 nm. _.

EXEMPEL 6 - Inverkan av pH-variationer.

För att visa okänsligheten hos denna bilirubinanalys för pH- variationer, som kan förekomma i prov, såsom blodsera, fläckades två serierznfbilirubinstandardprover'medbilirubinkoncentrationer vari- erande inom ett område på 0-20 mg/dl), varvid den ena hade ett pH- värde på 7,4 och den andra ett pH-värde på 8,2 och vilka innehöll 7 g/dl humanserumalbumin, saltlösning och 0,05 M natriumdiväte- fosfatbuffert, på analyselement, som framställts såsom i exempel 2.

Elementen utvärderades på samma sätt som beskrivits i exempel 2.

Resultaten tydde på att analyselementen var okänsliga för pH-vari- ationer inom det testade intervallet.

EXEMPEL 7 - Inverkan av temperaturvariationer.

Analyselement, som framställts såsom beskrivits i exempel 3, användes för att undersöka elementens känslighet för temperatur- variationer. En serie standardlösningar av bilirubin vid pH 7,4 användes. Fastän elementresponset var betydligt lägre vid 27°C var det praktiskt taget oförändrat mellan 37°C och 4200.

EXEMPEL 8 - Hållbarhetsegenskaper.

Analyselement och en serie standardlösningar av bilirubin såsom beskrivits i exempel 7 användes för att undersöka elemen- tens stabilitet under en en-månadsperiod vid rumstemperatur (ZOOC).

Härvid fann man att elementen var extremt stabila vid rumstempe- ratur under denna tidsperiod utan någon speciell reglering av fuktigheten. Elementet förblev ej endast kalibrerbart utan svaret från det âldrade elementet var praktiskt taget omöjligt att skilja frândet resultat,son1erhölls från det nya elementet.

EXEMPEL 9 - Avsaknad av karotenoidstörning.

B-karoten, den huvudsakliga karotenoiden i serum fråfi vuxna, har ansetts vara ett potentiellt störämne vid direkt spektrofoto- netrisk;analysmed.avseende på bilirubin,eftersom det absorberar vid 450 nm. I detta exempel registrerades det spektrofotometriska responset från ett analytiskt element enligt uppfinningen (fram- ställts såsom beskrivits i exempel 2) för fyra saltinnehâllande flytande testlösningar innehållande 7 g/dl albumin, l eller 20 mg/dl bilirubin och 0,02 eller 0,2 mg/dl B-karoten. Närvaron av ß-karo- ten vid dessa nivåer, som spänner över ß-karotenets normala om- råde i humanserum, visade sig ej ha någon påvisbar effekt på ele- mentet.

Claims (15)

21 7800405-3 PATENTKRAV

1. l. Sätt att bestämma bilirubin i en vattenhaltig vätska, k ä n n e t e c k n a t därav, att (a) den vattenhaltiga vätskan bringas i kontakt med en betnings- komposition för bilirubin innefattande en hydrofob organisk grundmassa, som innehåller laddningsbärande katjoniska grupper, varvid det betade bilirubinet uppvisar en absorptionstopp, som är minst 10 nm förskjuten från absorptionstoppen för fritt bilirubin, och en molär extinkticnskoefficient, som är minst 50 % högre än den för fritt bilirubin, och (b) det betade bilirubinet detekteras kolorimetriskt.

2. Sätt enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t därav, att betningskompositionen innefattar en polymer med återkommande en- heter med formeln: _ _. \ '1 Q (I) I M+ x' vari Al betecknar en tvâvärd organisk grupp, l Q betecknar en bindning eller en gruppbindning M+ till Al, + M betecknar en kvarternär ammonium- eller fosfoniumgrupp och X- betecknar en anjon. _.

3. 43. Sätt enligt krav 1 eller 2, k ä n n e t e c k n ä t därav, att betningskompositionen innefattar en polymer med återkommande enheter med formeln: - N - R x' (IV) vari A2 betecknar en alkylengrupp, Q2 betecknar en bindande kolvätegrupp innehållande 5-10 kol- atomer, Rl, R2 och R3 betecknar vardera alkyl med 1-lO kolatomer eller en aryl-, aralkyl- eller alkarylgrupp med 5-20 kolatomer och X- betecknar en anjon. 7800403-3 22

4. Sätt enligt krav 3, k ä n n e t e c k n a t därav, att betningskompositionen innefattar en sampolymer med 25-90 vikt- delar av enheten med formeln IV, l0-75 viktdelar enheter från alifatiska, aralifatiska eller aromatiska kolväten, alkylakrylater eller alkylmetakrylater och O-5 viktdelar enheter, som ger en två-värd bryggbildande grupp. A

5. Sätt enligt något av kraven l-4, k ä n n e t e c k n a t därav, att betningsmedlet innefattar någon av polymererna: poly(vinylbensyltrimetyl-ammoniumklorid),poly[styren-co-(p- -vinylbensyl-dimetylbensyl-ammoniumklorid)], poly(p-vinylbensyl- -trioctylfosfoniumklorid), poly[styren-co-(vinylbensyltrihexyl- -ammoniumklorid)], poly[vinylbensyl-trimetylammoniumklorid)- -co-styren], poly[styren-co-(p-vinylbensyldimetylbensylammonium- klorid)-co-divinylbensen].

6. Sätt enligt något av kraven l-5, k ä n n e t e q k n a t därav, att betningskompositionen är löst eller dispergerad i vatten eller ett polärt organiskt lösningsmedel och bringas i kontakt med den vattenhaltiga vätskan i en reaktionszon vid ett pH på 6,8-9,5 och en temperatur på 15-60°C.

7. Sätt enligt något av kraven l-5, i k ä n n e t e c k - n a t därav, att betningskompositionen föreligger i form av ett torkat pàlagt skikt, som uppbäres på en bärare.

8. Sätt enligt något av kraven l-7, k ä n n e t e c k - n a_t därav, att den vattenhaltiga vätskan utgöres av en' biologisk vätska. I _

9. Sätt enligt något av kraven l-8, k ä n n e t e c k - n a t därav, att den vattenhaltiga vätskan utgöres av blodserum.

10. Sätt enligt kravet 9, k ä n n e t e c k n a t därav, att blodserumet förbehandlas för sänkning av den mängd protein, som finns i provet. l

11. ll. Element för bestämning av bilirubin i en vattenhaltig vätska, k ä n n e t e c k n a t därav, att det innefattar ett vätskeimpermeabelt transparent bärarmaterial, som uppbär ett bet- ningsskikt} som innefattar en betningskomposition för bilirubin inne- fattande en hydrofob organisk grundmassa, som innehåller laddnings- bärande katjoniska grupper, varvid det betade bilirubinet uppvisar en absorptionstopp, som är minst 10 nm förskjuten från absorp- 7800403-3 23 tionstoppen för fritt bilirubin, och en molär extinktionskoef- ficient, som är minst 50 % högre än den för fritt bilirubin, varjämte på betningsskiktet är anbringat ett poröst skikt, som är avsett att sprida ut vätska, som anbringats därpå.

12. Element enligt krav ll, k ä n n e t e c k n a t därav, att spridningsskiktet innehåller ett ytaktivt medel.

13. Element enligt krav ll eller 12, k ä n n e t e c k n a t därav, att det innehåller ett i vatten svällbart skikt mellan betningsskiktet och bärarmaterialet.

14. Element enligt något av kraven 11-13, k ä n n e t e c k - n a t därav, att det innehåller glucuronidas i spridningšskiktet eller i ett mellanskikt mellan spridningsskiktet och betnings- skiktet.

15. l5. Element enligt något av kraven ll-14, k ä n n e t e c k - n a t därav, att spridningsskiktet är praktiskt taget impermea- belt för material med molekylvikter lika med eller högre än 60 OOO.