CH619782A5 - - Google Patents

Description

La présente invention concerne des produits composites unitaires inséparables pour l'analyse des solutions protéiniques aqueuses telles que des liquides biologiques contenant des protéines, comme le sang, le sérum du sang, l'urine etc. Les produits suivant l'invention sont utiles pour analyser les substances dissoutes dans des solutions protéiniques aqueuses. On désigne par «produit composite unitaire inséparable» un produit contenant au moins deux couches superposées, avantageusement séparées, en contact intime dans les conditions d'utilisation. Suivant un aspect de l'invention, ces couches sont essentiellement inséparables sans aucun dommage pour le produit. Ces produits peuvent être utilisés pour de nombreuses analyses. Ils ne nécessitent pas des soins particuliers dans leur utilisation et peuvent donner des résultats d'analyse quantitatifs, sans qu'il soit nécessaire de déposer des gouttes de liquide déterminé, procédés qui sont habituellement nécessaires pour faire des analyses avec les produits des techniques antérieures. En outre, les résultats obtenus avec les produits suivant l'invention sont pratiquement reproductibles et ne présentent pas de variations importantes, de sorte qu'on peut utiliser des moyens automatisés pour obtenir des résultats d'analyse par des techniques de mesure de rayonnement électromagnétique, si cela est nécessaire ou souhaitable, avec des risques d'erreur réduits au minimum.

Définie de manière plus particulière, la présente invention concerne des produits pour l'analyse comprenant plusieurs couches superposées permettant d'obtenir des modifications décelables et quantitatives en réponse à la présence d'une substance à analyser en solution dans le liquide protéinique appliqué sur le produit. On peut appliquer le liquide à analyser d'une manière uniforme ou bien on peut l'appliquer localement, par exemple, sous la forme d'une goutte. Il est souvent préférable d'appliquer localement le liquide à analyser, car l'application locale nécessite une quantité d'échantillon moindre. Les produits pour l'analyse suivant l'invention comprennent une couche d'étalement et une couche de réactif qui sont en contact fluide dans les conditions d'utilisation.

La couche d'étalement comprend un agent tensio-actif capable de normaliser le transport dans la couche d'étalement de la solution protéinique et de ses constituants dissous. On entend par «normaliser» l'action permettant d'obtenir dans la couche d'étalement, une pénétration équivalente du solvant et des constituants dissous pour différents échantillons à analyser appliqués sur le produit, malgré les variations de teneur en protéine dans les différents échantillons. Des indicateurs convenables de cette équivalence sont la vitesse à laquelle on obtient un résultat d'analyse et le diamètre maximal de la tache colorée ou de tout autre résultat d'analyse qui est obtenu s

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dans chaque produit. Le diamètre de la tache est adjusté pour tenir compte des différences de volume entre les différents échantillons appliqués. H est souhaitable que la normalisation de l'étalement produise des vitesses pratiquement équivalentes d'obtention des résultats et des diamètres des taches dont la variation ne dépasse pas environ 10% pour l'intervalle prévu de la teneur en protéine de l'échantillon à analyser. Il est très souhaitable que la variation de la dimension des taches soit inférieure à environ plus ou moins 5 %. Dans le sérum humain, par exemple, les protéines sont habituellement présentes à une concentration d'environ 6/100 à 8/100 en masse et cette concentration peut atteindre jusqu'à 12/100 en masse dans des sérums prélevés sur des sujets fortement deshydratés. Dans la couche d'étalement, l'agent tensio-actif est avantageusement présent à une concentration efficace pour obtenir un étalement normalisé pour l'intervalle de concentration en protéine prévu dans les échantillons appliqués sur le produit pour l'analyse.

On peut appliquer les couches du produit selon l'invention sur un support qui, selon divers modes de réalisation préférés de l'invention, est transparent. L'expression «support transparent» se rapporte à des supports et autres couches d'un produit pour l'analyse qui laisse passer efficacement le rayonnement électromagnétique utilisé pour déceler un résultat analytique obtenu dans le produit. Une telle caractéristique de transmission comprend la transmission d'un rayonnement électromagnétique d'une ou de plusieurs longueurs d'ondes comprises entre environ 200 nm et 900 nm, de même que celle d'un rayonnement décelable tel que l'on peut l'obtenir par la radioactivité. Lorsque le produit comprend un support, on place la couche de réactif entre le support et la couche d'étalement.

La couche d'étalement du produit selon l'invention est apte à répartir à l'intérieur de la couche le solvant ou le milieu de dispersion d'un échantillon liquide aqueux appliqué et les substances contenues dans l'échantillon, y compris un ou plusieurs constituants dissous. Ainsi, on obtient à un temps donné, une concentration apparente uniforme (c'est-à-dire une concentration qui est apparemment uniforme, lorsqu'elle est mesurée par des procédés et des réactions chimiques de détection appropriés tels que décrits ci-dessous) de l'un ou de plusieurs constituants à la surface de la couche d'étalement faisant face, c'est-à-dire placée près de la couche de réactif.

Il n'est nullement nécessaire de délimiter l'application de l'échantillon, et une telle concentration apparente bien qu'elle soit uniforme à un moment donné, peut varier en fonction du temps sans procurer d'effets nuisibles. Le terme «substance contenue dans l'échantillon» appliqué à l'échantillon liquide se rapporte en général à un constituant du liquide soit à l'état libre ou sous forme d'un radical chimique qui représente une partie d'un constituant plus complexe. Il faut noter que de tels constituants peuvent être fournis dans le liquide après son application sur le produit, par exemple par des réactions chimiques appropriées. Dans divers cas, le constituant peut être une substance à analyser ou un précurseur de cette substance ou un produit de réaction d'une substance à analyser. Les produits de réaction des constituants tels que les substances à analyser comprennent les composés chimiques qui sont les produits de décomposition ou d'autres produits de réaction d'un constituant, de même que d'autres produits dérivés d'un constituant, tels que les produits de réaction résultant de l'activité enzyma-tique d'une substance à analyser ou d'un autre constituant.

La couche d'étalement est non fibreuse et poreuse de manière isotrope. Dans la description la porosité isotrope veut dire que la couche d'étalement est poreuse dans toutes les directions. Il faut savoir que l'on peut faire varier le degré de cette porosité si cela est nécessaire ou souhaitable par exemple, en agissant sur la taille des pores, le pourcentage de volume vide, etc.

La couche de réactif est une couche contenant au moins une substance qui réagit en présence de la substance à analyser appliquée sur le produit. Dans divers cas, cette substance peut réagir avec une substance à analyser ou un précurseur de cette substance ou un produit de réaction d'une substance à analyser de façon à produire une variation de caractéristiques dans le produit.

La couche de réactif est perméable à au moins un constituant de l'échantillon qui se répand dans la couche d'étalement ou à un produit de réaction d'un tel constituant et cette couche de réactif présente de préférence une perméabilité pratiquement uniforme aux substances étalées dans la couche d'étalement. Par «perméabilité», on entend l'aptitude d'une substance ou d'une couche à être pénétrée effectivement par une substance véhiculée, c'est-à-dire distribuée à l'état de solution ou de dispersion, par un liquide.

Par «perméabilité uniforme d'une couche», on entend que la perméabilité est telle que, lorsqu'un liquide homogène est réparti uniformément à la surface de la couche, des mesures identiques de la concentration de ce liquide au sein de la couche, réalisées dans différentes régions de la surface de la couche, donnent habituellement des résultats sensiblements égaux, par exemple, variant de moins d'environ ±10% et de préférence de moins d'environ ±3 à 5% mesurés par radiométrie, à petite ouverture telle que 3 (x à 10 ^ de large et de 50 fx à 100 de hauteur. Si on utilise un balayage continu pour faire les mesures, une amplification des traces d'environ 16 peut être utilisée avantageusement pour élargir l'échelle.

Comme décrit dans la présente description, une perméabilité uniforme n'est pas considérée comme une caractéristique des matières fibreuses telles que le papier filtre, les couches fibreuses, les tissus, etc.. On peut obtenir des résultats d'analyse significatifs dans des produits ne comprenant pas de couche de perméabilité uniforme, mais, l'efficacité de la lecture des résultats dans ces produits peut être réduite, par exemple si des discontinuités de concentration ou autres variations sont décelées au sein d'un produit par un moyen de détection.

Par «contact fluide» entre une couche d'étalement et une couche de réactif et/ou d'autres couches d'un produit composite unitaire inséparable pour l'analyse, on entend l'aptitude d'un fluide, qui peut être tant un liquide qu'un gaz, à passer dans un tel produit entre des régions superposées de ces couches. En d'autres termes, par «contact fluide», on entend l'aptitude des constituants d'un fluide à passer entre les couches et une telle aptitude est, de préférence, constante le long des couches en contact avec le fluide. Bien que les couches en contact fluide puissent être adjacentes, elles peuvent également être séparées par des couches intermédiaires. Cependant, les couches du produit qui sont intercalées entre les couches en contact fluide mutuel doivent également être en contact fluide avec ces dernières et ne peuvent empêcher le passage du fluide d'une couche à l'autre.

On peut obtenir un contact fluide entre les couches en préparant des produits à couches initialement adjacentes ou prévues pour l'être de façon à permettre le passage du fluide.

Selon une variante, on peut souhaiter préparer des produits qui présentent des couches initialement non adjacentes et qui ensuite peuvent être séparées, par exemple en utilisant des intercouches ou des substances absorbantes élastiques ou des supports déformables. Si le produit présente des couches initialement non adjacentes, on doit noter qu'il peut être nécessaire d'appliquer une force de pression ou des autres moyens similaires pour mettre les couches du produit en contact fluide au moment de son utilisation de façon à obtenir un résultat d'analyse.

A titre d'exemple, un produit pour l'analyse selon l'invention peut recevoir un échantillon liquide de substance à analyser qui est répartie, comme décrit ci-dessus, dans la couche s

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d'étalement contenant un agent tensio-actif choisi en quantité suffisante pour régulariser le transport du liquide dans cette couche. Par suite, on obtient de préférence à un temps donné, une concentration apparente uniforme des constituants de l'échantillon déposé à la surface de la couche d'étalement placée de façon adjacente à une couche de réactif. Il est possible d'obtenir une telle concentration apparente uniforme pour un large intervalle de volumes d'échantillon appliqués à l'élément, grâce à la présence d'un agent tensio-actif choisi dans la couche d'étalement et pour un intervalle approprié de concentrations en protéines présentes dans le liquide que l'on veut analyser. Les constituants de l'échantillon passent de la couche d'étalement vers la couche de réactif de façon à pénétrer dans cette dernière sans qu'il s'y produise, à aucun moment, des variations notables de concentration apparente pour les constituants de l'échantillon. On obtient dans le produit une variation de caractéristiques quantitatives, uniformes et décelables, grâce à la présence d'une substance active, par exemple chimiquement active, à l'intérieur d'une couche de réactif et grâce à une concentration apparente uniforme des constituants de l'échantillon, obtenue dans la couche de réactif.

Dans les planches présentées à la suite de la description, chaque fig. 1, 2, 3 est une coupe agrandie d'un mode de réalisation préféré représentant un produit pour l'analyse, composite non séparable, selon l'invention. Chaque fig. 4, 5, 6 et 7 est une courbe représentant un résultat d'analyse obtenu en utilisant un produit décrit dans les exemples. Le résultat représenté à la fig. 4 est celui d'un témoin et les résultats représentés aux fig. 5, 6 et 7 sont ceux des analyses obtenues en utilisant un produit selon l'invention.

Le produit composite non séparable pour l'analyse selon l'invention comprend une couche d'étalement et une couche de réactif. La couche d'étalement est une couche non fibreuse et poreuse de façon isotrope servant à étaler dans l'élément une substance comprenant un milieu solvant et au moins un constituant dissous provenant de l'échantillon liquide ou un produit de réaction de ce constituant, pour fournir une concentration apparente uniforme d'un ou de plusieurs constituants étalés à la surface de la couche d'étalement adjacente à la couche de réactif. On doit noter que l'on peut obtenir une telle concentration avec des gradients de concentration présents dans l'épaisseur de la couche d'étalement. De tels gradients ne présentent aucune difficulté pour obtenir des résultats de dosages quantitatifs et on peut y remédier par des procédés d'étalonnage bien connus.

Le mécanisme d'étalement n'est pas totalement élucidé,

mais on est porté à croire qu'il résulte et est limité par une combinaison de forces telles que la pression hydrostatique d'un échantillon liquide, l'effet capillaire au sein de la couche d'étalement, la tension superficielle de l'échantillon, l'effet de mèche des couches en contact fluide avec la couche d'étalement, etc. Il est évident que le degré d'étalement dépend en partie du volume de liquide à répartir. Cependant, il convient de noter que la concentration apparente uniforme obtenue par l'étalement dans les couches du produit suivant l'invention est pratiquement indépendante du volume de l'échantillon liquide. Il s'ensuit que les produits selon l'invention n'exigent aucune technique précise d'application de l'échantillon. Cependant, il peut être souhaitable que le volume de l'échantillon liquide ait une certaine valeur pour atteindre une durée de répartition préférée, ou pour d'autres raisons. Du fait que les produits suivant l'invention permettent d'obtenir des résultats quantitatifs avec de très petits volumes d'échantillon qui peuvent être entièrement absorbés dans une zone délimitée de la couche d'étalement, (par exemple une zone de 1 cm2 de diamètre), il n'est pas nécessaire d'éliminer l'humidité en excès du produit après avoir appliqué l'échantillon liquide. De plus, comme l'étalement se fait dans la couche du même nom et que la substance à étaler est amenée à la couche de réactif qui se trouve en contact fluide, sans pression hydrostatique latérale apparente importante, la difficulté de la formation d'anneau ou auréole qui se rencontre souvent avec les produits pour l'analyse déjà connus n'apparaît pas.

La couche d'étalement doit simplement présenter, à la face la plus proche d'une couche de réactif avec laquelle elle se trouve en contact fluide, une concentration apparente uniforme des substances à doser par unité de surface. Une méthode appropriée pour déterminer si une couche particulière peut convenir comme couche d'étalement comprend les techniques utilisant les densitométres ou les autres techniques analytiques telles que celles qui utilisent le balayage de la surface appropriée ou celles de la couche de réactif ou d'une autre couche associée, pour déterminer la concentration apparente des substances étalées ou de tout produit détectable basé sur la concentration de ces substances.

Le brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 992 158 décrit un exemple d'essai approprié.

Si, antérieurement à l'évaporation pratiquement complète du solvant ou du milieu de dispersion, le produit pour dosage décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 992 158, présente une tache colorée de préférence bien définie, de densité pratiquement uniforme lorsqu'il est balayé par un densitomètre dont l'ouverture est d'environ 5 |i par 100 [*, cela prouve qu'on a obtenu un étalonnement et une concentration apparente uniforme à la surface de la couche de dosage ou dans la couche de gélatine. Par «densité pratiquement uniforme» on entend que la densité de la tache, excepté sa périphérie, présente des valeurs maximale et minimale qui n'excèdent pas d'environ ±10% la valeur de la densité moyenne. Dans certains modes de réalisation de l'invention, la variation de la densité ou des autres résultats détectables n'excède pas ±5 %. Par suite des effets de bord, des gradients de densité non caractéristiques peuvent apparaître à la périphérie de la tache mais ne doivent pas intervenir sur la spécification des résultats d'analyse. La zone périphérique peut varier d'une tache à l'autre mais elle n'excède habituellement pas environ 20% de la surface de l'ensemble de la tache et peut être moins.

Comme mentionné plus haut, les couches à porosité isotrope conviennent comme couches d'étalement. Ces couches peuvent être préparées au moyen de divers constituants. Suivant un aspect, ces couches sont formées d'une matière particulaire et la porosité isotrope résulte des espaces vides reliant les particules. Plusieurs types de matières particulaires, qui avantageusement sont toutes chimiquement inertes à l'égard des constituants de l'échantillon soumis à l'analyse, conviennent. Des pigments, comme le dioxyde de titane, le sulfate de baryum, l'oxyde de zinc et l'oxyde de plomb, etc., sont appropriés. D'autres particules utiles sont la terre de diatomées et les matières colloïdales microcristallines issues de polymères naturels ou synthétiques. Ces matières microcristallines sont décrites dans un article intitulé «Colloïdal Macromolecular Phenomena, Part II, Novel Microcrystals of Polymers» de O. A. Battista et coll. publié dans le Journal of Applied Polymer Science, volume II, pages 481-498 (1967). Un exemple d'une telle matière colloïdale satisfaisant aux fins de l'invention est la cellulose microcristalline vendue sous le nom de Avicel® par la Société FMC Corporation. Il est possible également d'utiliser des particules sphériques d'un calibre uniforme, comme des billes de résine ou de verre, qui peuvent être particulièrement intéressantes lorsqu'il est avantageux que les pores soient uniformes, par exemple lorsqu'on désire une filtration sélective. Lorsque la matière particulaire choisie n'est pas adhérente telle que les billes de verre, elle peut être traitée de manière que les particules puissent adhérer entre elles à leurs points de contact, ce qui facilite la formation d'une couche à porosité isotrope. Un exemple de traitement approprié est s

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l'enrobage au moyen d'une mince couche adhérente, telle qu'une solution d'un colloïde hydrophile comme la gélatine ou l'alcool polyvinylique, de particules non adhérentes qui sont ensuite mises en contact mutuel en une couche. Le séchage de la couche de colloïde assure l'intégrité de la couche et le maintien entre les particules constitutives d'espaces ouverts.

Selon une variante, en plus d'utiliser des matières particulai-res qui ne sont pas nécessairement poreuses de manière isotrope, on peut préparer la couche d'étalement avec des substances poreuses isotropes sous forme de particules par exemple.

Les substances poreuses de manière isotrope peuvent être des compositions de polymères telles que des compositions de polymères opalescents.

D'autres techniques utiles pour préparer des compositions de polymères poreux de façon isotrope comprennent celles ayant trait à l'utilisation d'un gaz ou autres agents de gonflement, de façon à créer une mousse poreuse, ou à l'utilisation dans un polymère comprenant un composé solide que l'on dissout ultérieurement pour former les pores. Les couches de polymères opalescents sont particulièrement utiles et peuvent être formées sur un substrat par dissolution d'un polymère dans un mélange de deux liquides dont l'un est un bon solvant du polymère et à bas point d'ébullition et dont l'autre est un nonsolvant ou au moins un médiocre solvant polymère et à point d'ébullition élevé. Cette solution de polymère est alors appliquée sur le substrat puis séchée dans des conditions imposées. Le solvant à bas point d'ébullition s'évapore plus aisément et le revêtement peut s'enrichir en liquide qui est un non-solvant ou un médiocre solvant. A mesure que l'évaporation progresse, dans des conditions convenables, le polymère forme une couche à porosité isotrope. Il est possible d'utiliser de nombreux polymères différents, isolément ou en combinaison, pour préparer les couches d'étalement à porosité isotrope de polymère opalescent, des exemples typiques étant les polycar-bonates, les polyamides y compris les nylons, les polyuréthannes et les esters cellulosiques tels que l'acétate de cellulose.

La couche d'étalement du produit suivant l'invention contient un ou plusieurs agents tensio-actifs efficaces pour régulariser le transport du liquide dans la couche d'étalement. On peut utiliser une grande variété d'agents tensio-actifs non ioniques, par exemple ceux décrits par Me Cutcheon dans la publication Detergents and Emulsifiers, 1974, North American Edition, the Allured Publishing Corporation.

Les agents tensio-actifs non ioniques préférés comprennent les alkaryl-polyéthers tels que les alkylphénoxypolyéthoxy-éthanols tels que ceux qui présentent la formule I suivante.

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ou R représente un radical alkyle de 1 à 9 atomes de carbone et n représente un nombre de 1 à environ 70. On peut utiliser une grande variété d'agents tensio-actifs tels que les octyl- et nonylphénoxypolyéthoxyéthanols de formule I, ou R représente un radical octyle ou un radical nonyle. Dans un mode de réalisation préféré, R représente un radical octyle et n représente un nombre de 9 à environ 40 et de préférence d'environ 40. On préféré les agents tensio-actifs solubles dans l'eau mais on peut utiliser avantageusement les composés organosolubles, plus particulièrement si l'on met une solution de l'agent tensio-actif dans la composition formant la couche d'étalement ou dans la couche elle-même.

On utilise l'agent tensio-actif dans la couche d'étalement à une teneur efficace pour régulariser l'étalement dans cette couche. Habituellement, la teneur est d'au moins 1 %, de préférence de 1 % à environ 15%. Sauf indication contraire, les concentrations se rapportent à la masse totale des composés solides de la couche dans laquelle le constituant désigné est introduit. De préférence, on utilise un agent tensio-actif dans la couche d'étalement à raison d'environ 1 %, à environ 10%, et de préférence d'environ 1 % à environ 6%. Lors du calcul de la concentration en agent tensio-actif, on doit tenir compte des constituants non actifs de n'importe quelle composition d'agent tensio-actif. Les concentrations en agent tensio-actif exprimées en titre de couchage varient habituellement d'environ 1,0 g/m2 à environ 6,0 g/m2.

La méthode de régularisation de l'étalement par l'agent tensio-actif n'est pas complètement connue mais on pense qu'une quantité efficace d'agent tensio-actif diminue la teneur en eau d'hydratation des protéines contenue dans l'échantillon liquide aqueux de telle sorte qu'une quantité plus importante d'eau et de substance à analyser contenues dans l'échantillon est capable de pénétrer rapidement à la fois dans la couche d'étalement et dans la couche de réactif. La pénétration rapide accéléré la vitesse des réactions et améliore aussi la formation dans le produit des plages imprégnées d'échantillon de dimensions équivalentes.

Dans le produit selon l'invention, la couche de réactif est perméable et, si nécessaire, éventuellement poreuse, aux substances que l'on peut répandre surla couche d'étalement ou aux produits de réaction de ces substances. Le terme «perméabilité» utilisé dans l'invention, comprend la perméabilité due à la porosité, à l'aptitude au gonflement ou aux autres caractéristiques. Les couches de réactif peuvent comprendre un liant dans lequel on a dispersé une substance active et qui est répartie dans cette couche c'est-à-dire qui y est dissoute ou dispersée. Le brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 992 158 décrit des couches de réactif appropriées pour le produit selon l'invention.

Dans tous les cas, le choix du liant de la couche de réactif peut aussi dépendre en partie de ses propriétés optiques ou autres propriétés qui pourraient altérer la détection radiomé-trique. La couche de réactif ne doit pas interférer avec le procédé mis en œuvre pour déceler le résultat. De même, il peut être nécessaire de choisir une substance compatible avec l'application d'une couche adjacente pendant la préparation du produit, par exemple au cours du couchage.

Dans de nombreux cas, de façon à faciliter la formation d'une concentration uniforme apparente dans la couche d'étalement comme décrit ci-dessus, on peut souhaiter que la couche de réactif présente une perméabilité relative par des techniques bien connues.

Dans des modes de réalisation préférés des produits selon l'invention, la substance active de la couche de réactif entre en réaction avec la substance à analyser pour laquelle le produit est sensible. Dans d'autres modes de réalisation, la substance active peut entrer en réaction avec un précurseur ou un produit de réaction de la substance à analyser selon le mécanisme d'analyse choisi. L'expression «substance active» concerne la réactivité chimique telle que la réactivité par addition, protonation et par décomposition, etc., l'activité telle que la formation d'un complexe substrat-enzyme, l'activité résultant d'une action enzymatique de même que toute autre forme d'interaction chimique ou physique apte à se produire ou à favoriser dans le produit tel que dans la couche de réactif, la formation d'une variation décelable par radiométrie c'est-à-dire une variation qui est décelable par une mesure appropriée de lumière ou de tout autre rayonnement électromagnétique.

Une substance active qui, par interaction appropriée, fournit directement une variation décelable dans le produit est appelée s

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aussi une substance indicatrice. Plusieurs substances comprenant au moins une substance active, réagissant ensemble pour fournir une variation décelable dans le produit sont appelées, dans leur ensemble, une composition indicatrice.

Les substances ou compositions chromogènes qui contiennent un motif oxydable et qui peuvent fournir des composés décelables comprennent certaines substances ou compositions formatrices de colorant. Selon un aspect de l'invention, on peut obtenir un colorant par un composé qui, à l'état oxydé, peut copuler avec lui-même ou avec sa forme réduite, de façon à fournir un colorant.

Des composés de cette classe sont bien connus et décrits dans la littérature, par exemple dans The Theory of the Photographie Process, Mees et James Ed. (1966), spécialement au chapitre 17. Selon un autre aspect de l'invention, on peut obtenir un colorant décelable par oxydation d'un colorant leuco de façon à fournir la forme colorée correspondante.

Dans un mode de réalisation de l'invention, on préféré utiliser les composés oxychromiques non stabilisés décrits dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 880 658. Selon un autre aspect, on peut obtenir un composé décelable par des compositions formatrices de colorants qui comprennent un composé oxydable apte à subir une condensation oxydante avec des coupleurs tels que ceux à radical phénolique ou à radical méthylénique actif. De tels coupleurs y compris un certain nombre de coupleurs copulant sur eux-mêmes sont décrits dans la littérature, par exemple dans l'ouvrage de Mees and James (références données ci-dessus) et dans l'ouvrage de Kosar intitulé «Light sensitive system» 1965 pages 215 à 249.

Pour préparer les produits composites non séparables pour l'analyse selon l'invention, on peut former préalablement des couches séparées puis les assembler pour former le produit composite. On peut assembler les couches avant leur utilisation ou les conserver sous forme de couches séparées et les mettre en contact fluide au moment de l'utilisation du produit. On applique habituellement ces couches à partir d'une solution ou d'une dispersion sur une surface de laquelle on peut séparer physiquement les couches séchées. Cependant une méthode commode qui évite les étapes de séparation et de superposition multiples consiste à appliquer suivant les besoins une couche initiale sur une surface ou support pelliculable puis les couches successives directement sur celles déjà formées. Le brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 992 158 décrit des méthodes de couchage utiles et les couches ainsi préparées.

En plus de ses caractéristiques de perméabilité et de transmission du rayonnement qui sont appropriées pour son utilisation, la couche de réactif est, de façon souhaitable, exempte de toute caractéristique qui pourrait contribuer à la formation de bruits ou de parasites qui gêneraient la détection du résultat d'analyse obtenu dans le produit composite non séparable selon l'invention. Par exemple, toute variation de couleur ou de texture dans la couche de réactif, comme cela peut se produire si on utilise des matières fibreuses, telles que des papiers comme milieu perméable, peut avoir comme conséquences défavorables une réflectance ou une transmittance non uniforme de l'énergie de détection. De plus, bien que les substances fibreuses telles que les papiers filtres ou les autres papiers sont généralement perméables de manière uniforme, ils peuvent présenter une large gamme de perméabilité et non pas une perméabilité uniforme, par exemple à cause des variations de structure telles que les dimensions ou les espaces entre fibres. Pour ces raisons, et pour celles décrites ci-dessus, de telles substances ne sont pas souhaitables pour former les couches de réactif et les couches d'étalement du produit selon l'invention. On souhaite que ces couches soient formées de substances non fibreuses. Mais il faut noter que l'utilisation de matières fibreuses associées de façon appropriée à des substances non fibreuses est possible.

II est possible également de préparer les couches d'étalement par revêtement à partir d'une solution ou dispersion. Comme déjà indiqué, les couches d'étalement et les couches associées d'un produit sont superposées de manière qu'une couche d'étalement se trouve en contact fluide avec une couche de réactif au moins dans les conditions d'utilisation. La nature des matières utiles pour l'incorporation à une couche d'étalement varie beaucoup comme déjà indiqué et en plus de l'agent tensio-actif décrit précédemment, on choisit habituellement et principalement des matières qui sont résistantes à l'égard de l'eau ou des autres milieux solvants du liquide soumis à l'analyse, c'est-à-dire qui sont sensiblement insolubles et non gonflables lorsqu'elles viennent au contact de ce liquide. Un gonflement d'environ 10 à 40, de l'épaisseur à sec de la couche peut être normal. L'épaisseur de la couche d'étalement varie pour une part, avec le volume d'échantillon appliqué, qui, pour la commodité et la propreté de la couche d'étalement, doit pouvoir être absorbé par celle-ci, ainsi qu'avec le volume des vides de la couche qui influence également la quantité d'échantillon pouvant être absorbée dans la couche. Des couches d'étalement d'une épaisseur mesurée à sec d'environ 50 à 300 microns se sont révélées particulièrement utiles. Cependant, l'épaisseur peut varier davantage pour les produits particuliers.

Lors de la préparation d'une couche d'étalement à porosité isotrope, il est utile que le volume des vides représente au moins environ 25% du volume total de la couche, et un volume de vides d'environ 50 à 95 % peut être intéressant. Il est possible avantageusement de modifier les propriétés du produit, comme la perméabilité totale de la couche d'étalement ou la durée nécessaire pour répandre l'échantillon, en faisant varier le volume des vides des couches poreuses d'étalement. Il convient de noter que le volume des vides au sein de la couche peut être réglé, par exemple, par le choix de matières particulaires de granulométrie convenable ou par variation de la nature des solvants ou des conditions de séchage lorsque la couche d'étalement comprend des polymères opalescents à porosité isotrope. Il est possible de calculer le volume des vides d'une telle couche avec une précision raisonnable suivant diverses techniques, comme la méthode statistique décrite par Chalkley dans «Journal of the National Cancer Institute», 4, 47 (1943) et par pesée directe et détermination du rapport de la masse exacte de la couche à la masse des solides dont le volume est égal à celui de la couche et qui sont composés de constituants comparables à ceux de la couche. Il convient de noter que la dimension des pores dans tous les cas, doit suffire à permettre l'étalement des constituants de l'échantillon initial ou des autres substances devant parvenir à une couche de réactif.

Comme mentionné précédemment, les produits composites inséparables pour l'analyse suivant l'invention peuvent ou non se passer de support. Des matières utiles pour le support sont notamment divers polymères tels que l'acétate de cellulose, le poly(téréphtalate d'éthylène), les polycarbonates et les composés polyvinyliques, par exemple des polystyrènes. Le choix d'un support pour un produit particulier doit être compatible avec le mode envisagé de lecture des résultats. Des supports préférés comprennent des matières de support qui transmettent les rayonnements électromagnétiques. Pour la lecture des résultats analytiques par fluorimetrie à travers le support, il est désirable que celui-ci transmette les rayonnements sur une bande quelque peu plus large que celle nécessaire pour les mesures de non-fluorescence ou, selon une variante, qu'il transmette dans le domaine du spectre d'absorption et d'émission des matières fluorescentes utilisées pour la lecture. Il peut de plus être désirable que le produit comprenne un support qui transmette une ou plusieurs bandes étroites de longueurs d'ondes et qui soit opaque aux bandes adjacentes de longueurs

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9

619782

d'ondes. Ceci pourrait être obtenu, par exemple, par imprégnation ou revêtement du support au moyen d'un ou plusieurs colorants présentant des propriétés convenables d'absorption, lorsqu'un produit comprend un support, la couche de réactif, est habituellement interposée dans le produit entre le support et la couche d'étalement qui souvent est la couche la plus extérieure du produit.

Les constituants d'une couche particulière d'un produit composite inséparable pour l'analyse selon l'invention et la configuration de la couche dépendent de l'utilisation envisagée pour le produit. Si on le souhaite, un produit peut comprendre plusieurs couches d'étalement, chacune pouvant être différente en ce qui concerne son aptitude à étaler et à filtrer. En outre, on peut ajouter une couche filtrante ou couche de dialyse à un endroit approprié du produit s'il est nécessaire de restreindre la migration des substances dans le produit en plus de celle effectuée par la ou les couches d'étalement.

On peut aussi souhaiter incorporer au produit une ou plusieurs couches réflectrices, qui absorbent facultativement dans le rayonnement de lecture, par exemple pour faciliter la lecture des résultats par radiométrie de réflexion, par exemple par photométrie de réflexion ou une technique semblable. Un tel pouvoir réflecteur peut être obtenu par une couche jouant aussi le rôle, par exemple, de couche d'étalement ou bien par une couche supplémentaire qui n'a pas d'autre rôle dans le produit. Dans la couche réflectrice, on peut utiliser avantageusement des pigments tels que le dioxyde de titane, l'oxyde de zinc et le sulfate de baryum, etc.. Les polymères opalescents constituent aussi une substance réflectrice appropriée. Il faut noter que les couches d'étalement pigmentées peuvent être utilisées dans le but énoncé, et que les couches polymères opalescentes peuvent être utilisées comme couche d'étalement. Selon un aspect préféré, les couches polymères opalescentes peuvent comprendre un pigment pour améliorer l'étalement et/ou le pouvoir réflecteur. La teneur en pigment de la couche contenant le polymère opalescent est très variable et la teneur préférée est comprise entre 0,2 et environ 10 parties en masse de pigment pour une partie en masse de polymère opalescent et encore préférable est la teneur comprise entre 2 à 6 parties de pigment.

On peut souhaiter introduire dans les couches du produit des composés qui peuvent rendre inactives, dans l'analyse en cours, par réaction chimique ou autrement, des substances qui éventuellement pourraient être nuisibles à cette analyse.

On peut souhaiter introduire dans le produit une couche qui reçoive les produits de réactions d'autres substances dont la présence ou l'absence relative est une caractéristique du résultat d'analyse, de façon à faciliter la lecture de toute variation obtenue dans le produit telle qu'une variation de couleur, de densité optique ou de fluorescence. Une telle couche, appelée couche d'enregistrement est, de façon souhaitable, en contact fluide avec la couche de réactif et peut être séparée de cette dernière par une couche réflectrice et/ou une couche opaque pour faciliter la lecture des résultats par les diverses techniques radiométriques. Les couches d'enregistrement transmettent les rayonnements et peuvent comprendre des colloïdes hydrophiles tels que ceux utiles dans les couches de réactif. De plus, lorsque des colorants sont formés dans le produit, la couche d'enregistrement peut contenir des mordants tels que ceux utilisés dans les pellicules et les papiers photographiques en couleurs.

Le produit pour l'analyse selon l'invention peut être adapté à l'exécution de diverses analyses chimiques, non seulement dans le domaine de la chimie clinique, mais également en recherche chimique ou dans les laboratoires d'analyse utilisant des procédés chimiques. Les produits selon l'invention conviennent en particulier pour le dosage clinique des fluides corporels tels que le sang, le sérum sanguin et l'urine, du fait que ce dosage exige souvent des essais répétés et que les résultats des essais doivent souvent être connus très rapidement après le prélèvement de l'échantillon. Pour l'analyse du sang au moyen du produit analyseur selon l'invention, les cellules sanguines peuvent d'abord être séparées du sérum, par exemple par centrifugation, et le sérum être alors appliqué sur le produit. Cependant, il n'est pas nécessaire de réaliser cette séparation, en particulier si on utilise une technique spectro-photométrique de réflexion pour chiffrer ou analyser le produit de réaction formé dans le produit, suivant l'invention, du fait que le sang complet peut être appliqué directement sur le produit et que les cellules sanguines peuvent en être éliminées par filtration au moyen d'une couche de filtration. La présence de ces cellules sanguines sur le produit suivant l'invention ne nuit pas à l'analyse spectrophotométrique lorsque celle-ci est effectuée par réflexion, si la lumière est transmise à travers le support et à travers la couche d'enregistrement et si elle est réfléchie par la couche arrêtant les rayonnements ou par une autre couche réflectrice, de sorte que le rayonnement de mesure n'atteint pas les cellules sanguines. Un avantage particulièrement significatif du produit composite non séparable pour l'analyse selon l'invention est qu'il permet l'analyse tant du sérum que du sang complet sans qu'on ait besoin d'essuyer le produit ou d'enlever l'échantillon.

Il convient de noter qu'il est possible de préparer conformément à l'invention des produits très divers, suivant l'analyse envisagée. Les produits peuvent se présenter sous diverses formes, notamment sous forme de rubans de toutes largeur requise, de feuilles ou de morceaux plus petits. Un produit particulier peut être adapté à un ou plusieurs essais d'un seul type ou de divers types. Dans ce dernier cas, il peut être utile d'appliquer sur un support commun un ou plusieurs rubans ayant chacun éventuellement une composition différente pour former un produit composite permettant d'exécuter divers dosages requis.

Des produits conformes à l'invention sont décrits à titre d'exemple avec référence au dessin annexé. La fig. 1 représente un produit d'analyse qui comprend un support 10 transmettant le rayonnement sur lequel on a appliqué une couche de réactif 12, une couche réflectrice 14 arrêtant les rayonnements qui peut assurer la présence d'un fond pour la lecture du résultat analytique, par exemple par spectrophotométrie de réflexion, et une couche filtrante 16 et une couche d'étalement 18. La lecture peut être faite au travers du support qui avantageusement transmet le rayonnement de la longueur d'onde choisie pour la mesure. La couche de réactif 12 peut être constituée d'une solution ou dispersion d'un ou plusieurs réactifs d'essai dans un liant tel que la gélatine, cependant les couches 14,16 et 18 peuvent être constituées d'un polymère opalescent à porosité isotrope et/ou présentant une dimension de pores telles que nécessaire pour une filtration quelconque requise. La couche d'étalement 18 et la couche de réactif 12 sont en contact fluide. Suivant une autre forme de réalisation de l'invention illustrée à la fig. 2, le produit pour l'analyse comprend un support 20 sur lequel on applique une couche de réactif 22 en contact fluide avec une couche d'étalement 24 qui peut également jouer le rôle de filtre et en outre assurer un fond réflecteur convenable pour la lecture par spectrophotométrie de réflexion au travers du support 20. En variante, la couche 24 peut être de nature à ne pas réfléchir le rayonnement et la mesure peut être réalisée suivant le mode de transmission. La couche 24 peut, par exemple, être constituée d'un polymère opalescent à porosité isotrope et avoir été formée par revêtement ou stratification sur la couche 22. La fig. 3 illustre une autre forme de réalisation de l'invention suivant laquelle le produit pour l'analyse comprend un support 30, une couche de réactif 32, une couche de dialyse 34 qui peut être constituée par une membrane semi-perméable et une couche s

10

15

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25

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10

d'étalement 36 qui peut être constituée d'un polymère opalescent à porosité isotrope pouvant remplir les fonctions d'étalement et de filtration, et qui peut fournir un fond approprié pour la mesure spectrophotométrique par réflexion à travers le support. Les couches d'étalement et de réactif se trouvent en s contact fluide.

On peut utiliser les produits selon l'invention au cours de procédés d'analyse tels que décrits au brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 992 158.

Les exemples suivants illustrent l'invention. io

Exemple 1 Produit témoin

Pour préparer un produit pour l'analyse composite, non séparable, témoin, on applique sur un support transparent de îs polytéréphtalate d'éthylène, une couche de réactif comprenant, après séchage, les constituants énumérés ci-dessous, à des taux indiqués par mètre carré de support.

Gélatine

Sel de sodium de l'acide 1-naphtolsulfonique 4-aminoantipyrine Glycérol Péroxydase Oxydase de glucose Agent tensio-actif 10 GR*

21,5 g/m2

20

1,08 g/m2 0,54 g/m2 2,15 g/m2 7,000 motifs/m2 25 6,900 motifs/m2 0,39 g/m2

: L'agent tensio-actif 10 G est un éther de p-isononylphénoxy-polyglycidol possédant 10 motifs glycidol et vendu aux Etats-Unis d'Amérique par la société «Olin Mathieson Company». 30

On applique, sur la couche de réactif, une couche d'étalement comprenant, après séchage, les constituants suivants, à des taux indiqués par mètre carré de support:

35

Acétate de cellulose (opalescent) Dioxyde de titane Polyuréthanne élastomère (Estane® 5715, vendu par la Société B. F. Goodrich Co.)

6,6 46,0

g/m 2 g/m2

1,38 g/m2

Sur un premier échantillon A du produit résultant, on dépose sous forme de gouttes 10 |*1 d'une solution aqueuse de glucose à 400 mg% et sur un deuxième échantillon P, 10 u/1 d'une 45 solution de glucose à 400 mg% dans le produit Versatol.

Le produit Versatol est un substitut de sérum humain comprenant 14 constituants dont les teneurs moyennes sont celles d'un sérum d'adulte, et il est disponible sous forme lipophyli-sée auprès du Département «General Diagnostics» de la so

Société Américaine Warner-Lambert Co.. Lorsque la poudre est dissoute selon les instructions dans l'eau distillée adoucie, on obtient une solution contenant 81 mg % de glucose, 4,1 g% d'albumine et 3,0 g % de globulines totales (a/G = 1,4).

On contrôle pendant 8 mn la densité par réflexion de la ss tache de colorant obtenue dans la couche de réactif des deux échantillons. Pendant ce temps, on maintient les produits à la température de 37°C. On contrôle les résultats à 510 nm par un densitomètre. La couche d'étalement fournit un fond réflecteur pour la lecture densitométrique. Après la 8ème minute 60 d'étuvage, on mesure le diamètre de chaque tache colorée. Par le même mode opératoire, on dépose des gouttes sur au moins deux autres jeux d'échantillons et on mesure à la fois la densité et la taille des taches par réflexion. Dans chaque cas, la vitesse initiale de formation de colorant, mesurée et appelée Dr est ós supérieure pour les échantillons sur lesquels on dépose des gouttes de solution aqueuse de glucose non protéinique. De plus, le diamètre des taches de colorant des produits sur lesquels on a déposé des gouttes de solution aqueuse de glucose est approximativement 20% supérieur à la taille des taches de colorant obtenues dans les échantillons de produits sur lesquels on a déposé des gouttes de la préparation de Versatol. Une représentation graphique de la densité obtenue pendant les 8 mn, pour chaque échantillon A et P est donnée à la fig. 4.

Exemple 2

On prépare des produits tels que décrits à l'exemple 1 sauf que la couche d'étalement comprend, en outre, 3,2 g/m2 (5,6%) d'un agent tensio-actif non ionique, l'octylphénoxypo-îyéthoxyéthanol ayant environ 9 à 10 motifs éthoxy. Cet agent tensio-actif est le produit Triton X-100 vendu par la Société «Rohm et Haas Company». On dépose des gouttes sur ces échantillons A et P et on effectue les mesures comme décrit à l'exemple 1. L'écart de densité obtenu entre les produits A sur lesquels on a déposé une solution aqueuse de glucose et ceux P sur lesquels on a déposé une solution de glucose dans le produit Versatol, varie considérablement moins que celui des produits comparables de l'exemple 1. La différence des diamètres des taches de colorants entre la tache obtenue par une solution de glucose et par une solution de glucose dans le produit Versatol, varie seulement d'environ 8%. La représentation graphique de la densité obtenue dans les produits A et P décrits à l'exemple 2 est donnée à la fig. 5.

Exemple 3

On prépare des produits pour l'analyse puis on y dépose des gouttes et on les mesure comme décrit à l'exemple 2, sauf que l'agent tensio-actif Triton X-100 est introduit dans la couche d'étalement à raison de 6,4 g/m2 (10,5 %). La densité obtenue dans les échantillons A et P de ce produit est analogue à celle obtenue sur les échantillons correspondants du produit décrit à l'exemple 2 et la fig. 6 est la représentation graphique de la densité obtenue dans des échantillons A et P du produit tel que décrit dans cet exemple. La différence des diamètres entre les taches obtenues sur les échantillons de cet exemple par une solution aqueuse de glucose et une solution de glucose dans le produit Versatol varie seulement d'environ 9%.

Exemple 4

On prépare un produit pour l'analyse, on y dépose les gouttes et on le mesure comme décrit à l'exemple 2, sauf que ce produit comprend l'agent tensio-actif produit Triton X-100 dans la couche d'étalement à raison de 12,88 g/m2 (19,0%). La densité obtenue dans les échantillons A et P de ce produit sur lesquels on a déposé une solution aqueuse de glucose et de glucose dans le produit Versatol est moins semblable à celle des échantillons comparables préparés aux exemples 2 et 3. La fig. 7 est la représentation graphique de la densité obtenue sur les échantillons A et P d'un produit préparé par le mode opératoire de l'exemple 4. La différence des diamètres des taches de colorant obtenues par une solution aqueuse de glucose et par une solution de glucose dans le produit Versatol semble varier d'environ 12% mais des irrégularités sur les bords des taches rend la lecture quelque peu difficile.

Exemples 5 à 12

On obtient des résultats avantageux en utilisant des alkyl-phénoxypolyéthoxyéthanols à chaînes polyéthoxy soit plus longues ou plus courtes que celles des exemples précédents. Pour montrer leurs effets sur le temps d'étalement, la dimension et la qualité des taches, on prépare des échantillons selon le procédé suivant:

On prépare un produit témoin (exemple 5), en appliquant sur un support transparent de polyéthylène de glycol, une couche de réactif comprenant, après séchage des constituants énumérés ci-dessous, à un taux exprimé par mètre carré de support:

11

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Gélatine

Oléyl éther de polyéthylèneglycol Agent tensio-actif 10 G R Oxydase de glucose Peroxydase Glycérol

7-hydroxy- 1-naphtol 4-aminoantipyrine, HCl 5,5-diméthylcyclohexanedione-l,3

21,52 g/m2 0,646 g/m2 0,387 g/m2 6886 motifs/m2 6994 motifs/m2 2,152 g/m2 0,656 g/m2 0,635 g/m2 0,215 g/m2

Sur cette couche de réactif, on applique une sous-couche constituée de 0,323 g/m2 de poly-N-isopropylacrylamide.

Sur cette sous-couche, on applique une couche d'étalement comprenant, après séchage, les constituants suivants, à des taux exprimés par mètre carré de support.

TÌO2

Acétate de cellulose (opalescent) Estane R 5715

Oléyléther de polyéthylène glycol

55,73 g/m2 7,8 g/m2 2,29 g/m2 0,78 g/m2

Sur un premier échantillon du produit résultant, on dépose sous forme de gouttes 10 [xl d'une solution aqueuse de glucose à 400 mg% et sur un second échantillon du produit, 10 (xl d'une solution de glucose à 400 mg% dans le produit Versatol. 25

On mesure le temps d'étalement, le rapport des surfaces des taches et leur qualité. Le tableau I donne les résultats.

On prépare comme à l'exemple 5, sept jeux supplémentaires d'échantillons (exemples 6 à 12), sauf que dans la couche d'étalement de chaque jeu on utilise différents agents tensio- 30 actifs non ioniques. Dans les exemples 6 à 12, les agents tensio-actifs sont des octylphénoxypolyéthoxyéthanols comme aux exemples 2 à 4, présentant les nombres suivants de motifs éthoxy:

35

Exemple

Teneur, % en masse

Longueur de la chaîne polyoxyéthylène

(n)

6

4,1%

(2,87 g/m2)

1

7

4,1%

(2,87 g/m2)

3

8

4,1%

(2,87 g/m2)

7-8

9

4,1%

(2,87 g/m2)

9-10

10

4,1%

(2,87 g/m2)

12-13

11

4,1%

(2,87 g/m2)

30

12

2,9%

(2,01 g/m2)

40

40

45

On voit que, dans chaque cas, le temps d'étalement et le rapport des superficies des taches sont améliorés comparativement au témoin. (Le temps d'étalement s'améliore tandis qu'il décroît; et le rapport de la superficie des taches s'améliore lorsque ce rapport approche de la valeur de 1,0).

Tableau I

Exemple

Temps d'étalement

Rapport de la

Qualité de la tache*

dans dans surface des taches

Solution

solution le

Sérum aqueuse

aqueuse sérum solution aqueuse

Sérum

5

(témoin) 7,2

9,1

0,726

1

2

6

3,9

6,9

0,795

2

1

7

2,6

5,1

0,881

1

1

8

2,4

4,6

0,901

2

1

9

2,1

4,0

0,855

1

2

10

2,2

4,4

0,896

2

2

11

1,8

3,2

0,910

2

3

12

2,0

3,5

0,881

2 +

3

*0 = nulle

1 = médiocre

2 = bonne

3 = très bonne

4 = excellente

Exemple 13

On répète l'exemple 12 en tenant compte que les teneurs en agent tensio-actif sont respectivement 2,01 mg/m2 (2,9% en masse), 2,85 mg/m2 (4% en masse) et 3,4 mg/m2 (5% en masse) et la teneur en glucose est de 800 mg%. On trouve que le niveau de 4% en masse fournit la meilleure qualité de tache que l'on souhaite. Les autres couchages présentent des qualités similaires à celles de l'exemple 12 du tableau I.

Exemple 14

On répète l'exemple 12 sauf que l'octylphénoxypolyéth-oxyéthanol présente une longueur n de chaîne polyoxyéthylène d'environ 70. On obtient des résultats analogues à ceux de l'exemple 12.

3 feuilles dessins

Claims (4)

619 782

1. Produit pour l'analyse d'une substance contenue dans une solution protéinique aqueuse, produit qui comprend une couche d'étalement poreuse de façon isotrope et une couche de réactif, la couche d'étalement comprenant une substance non fibreuse, résistant à l'eau, caractérisé par la présence d'au moins 1 % en masse d'un agent tensio-actif non ionique dans la couche d'étalement.

2 761 813, 2 672 423, 2 677 647, 2 923 669, 3 814 670 et

2. Produit selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent tensio-actif non ionique présente la formule suivante:

R ■// ^Vo-(CH2-CH2-0-)n H

où R représente un radical alkyle de 1 à 9 atomes de carbone et n représente un nombre de 1 à 70.

2

REVENDICATIONS

3 843 452. Cependant, cette technique se situe habituellement dans un contexte des produits pour déterminer la présence de micro-organismes. Ces produits pour analyse ne présentent habituellement aucun moyen pour réaliser ou empêcher des concentrations uniformes, par exemple, des concentrations uniformes dans le sens latéral d'une couche et ces produits peuvent nécessiter des couches mélangées dont l'interface est caractérisée par la pénétration mutuelle des couches adjacentes.

Jusqu'à une période très récente, il n'y a pas eu de suggestions valables, relatives à des produits pour analyse comprenant une couche ou un autre milieu pour recevoir les constituants de l'échantillon à analyser et inciter ces derniers à une répartition dans ce milieu, de manière à réaliser une concentration apparente uniforme de la substance à analyser, laquelle substance peut être répartie, dans cette concentration apparente uniforme, sur une couche associée où s'effectuent les réactions d'analyse ou des réactions analogues. Les dispositifs qui utilisent des substances fibreuses pour former des couches absorbantes ont dû surmonter les inconvénients provenant de cette non uniformité, mais ces dispositifs n'ont pas réussi à résoudre ce problème. Par exemple, le brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 715 192 décrit un produit pour analyse qui présente une cavité en communication avec la surface d'une substance capillaire absorbante, avantageusement fibreuse, imprégnée d'un réactif. Ces cavités permettent apparemment de réaliser une absorption plus rapide du liquide dans la substance capillaire et de réduire au minimum l'effet de lavage et de Chromatographie des réactifs, permettant ainsi une utilisation accrue des réactifs qui sont solubles dans le liquide à analyser. En outre, le brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 723 064 décrit un produit pour analyse qui présente des plages de perméabilité efficace différentes pour une substance à analyser ou le produit de réaction d'une substance à analyser, ce produit d'analyse produisant plusieurs échelons de couleurs variant graduellement, en tant que résultats analytiques. Bien que la nécessité d'une réponse d'analyse lentement continue soit manifeste, un produit pour analyse, préparé suivant les indications du brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 723 064, peut fournir seulement un résultat d'analyse approché, dont la précision varie en fonction inverse de l'espacement séparant deux échelons. Lorsqu'on diminue la différence de perméabilité entre les plages, dans le but d'accroître la précision de la mesure dans l'intervalle dynamique désiré, la complexité des produits pour analyse préparés suivant le brevet précédent augmenterait considérablement. En outre, ce brevet ne donne aucune précision permettant d'améliorer le caractère uniforme, et la précision des résultats d'essais variant de manière continue, et même lorsqu'ils présentent leur qualité optimale, les produits d'analyse du brevet précédent produiraient une réponse discontinue qui serait apparemment de caractère non uniforme à l'intérieur de chaque plage de perméabilité, à cause des propriétés non uniformes associées à l'utilisation de papiers filtres et autres substances fibreuses.

Des produits pour analyse, composites unitaires inséparables, à plusieurs couches, améliorés, sont décrits au brevet belge 801 742. Ces produits avantageusement préparés à partir de substances essentiellement non fibreuses, peuvent recevoir un échantillon liquide et effectuer une répartition de l'échantillon à l'intérieur d'une couche d'étalement du produit pour analyse, de manière à obtenir une concentration apparente uniforme de la substanae à analyser et produire des résultats d'analyse reproductibles, pratiquement quantitatifs, qui, grâce à leur précision, peuvent être déterminés de manière sûre par des dispositifs automatisés qui utilisent des techniques telles que la spectrophotométrie, la fluorométrie, etc. Les produits décrits au brevet belge 801 742 contiennent des couches d'étalement et des couches de réactif qui contiennent une substance réactive qui, grâce à son activité, provoquent dans le produit une s

10

15

20

25

30

35

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3

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res inséparables pour analyse, pourraient altérer la précision des résultats analytiques à cause des effets de Chromatographie, des contraintes physiques, de migrations capillaires non-uniformes et autres passages non uniformes des constituants de l'échantillon analysé ou pour des raisons de liaison chimique indésirable. En outre, les substances fibreuses peuvent provoquer des déviations et amoindrir la précision de la mesure d'une analyse à cause des variations dans la propriété de ces substances.

On a déjà proposé des moyens variés pour surmonter les effets indésirables provoqués par les auréoles provenant de la présence des substances fibreuses dans les produits pour analyse. La gélatine et d'autres substances du même type, sont décrites dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique 3 061 523 et 3 104 209 comme constituants des solutions d'imprégnation des substances fibreuses absorbantes. Cependant, la présence de gélatine ou des substances analogues contenues dans le composé fibreux absorbant contenant le réactif fait décroître la vitesse d'analyse de l'échantillon par comparaison avec un composé beaucoup plus absorbant dépourvu de gélatine. Cette diminution de l'absorption peut conduire à laisser du liquide à la surface de ces produits pour analyse, et peut nécessiter un lavage du produit pour éliminer l'excès de l'échantillon avant de faire l'analyse.

On a proposé aux brevets des Etats-Unis d'Amérique 3 368 872 et 3 526 480 de faire décroître les effets chromato-graphiques indésirables en immobilisant les réactifs dans le produit pour analyse, ou en introduisant dans ce dernier, un moyen pour faire décroître la tendance de l'échantillon à analyser, appliqué en goutte ou d'une autre manière, à exercer un effet de lavage sur le réactif incorporé, par exemple, en utilisant certains éléments poreux sur les substances absorbantes contenant le réactif, par exemple, une feuille de papier filtre poreux.

Les effets indésirables dus aux auréoles précédemment mentionnés sont décrits aussi aux brevets des Etats-Unis d'Amérique 3 552 929 et 3 802 842 qui proposent, respectivement, une couche de polymère et une surcouche en forme de mailles, utilisées en liaison avec des couches fibreuses contenant le réactif dans le but de réduire au minimum ces effets indésirables.

On a aussi proposé une technique de pseudo-immersion, que l'on peut aussi appeler «technique de délimitation par taches» comme moyen pour fournir un e bonne précision des résultats lorsqu'on passe d'un échantillon à un autre, par exemple, lorsqu'on passe d'un liquide protéinique à analyser à un liquide étalon sans protéine. Selon cette technique, comme il est décrit, par exemple, aux brevets des Etats-Unis d'Amérique 3 216 804, 3 368 872 et 3 526 480, on incorpore habituellement dans le produit pour analyse, une couche barrière pour délimiter l'échantillon appliqué, par exemple, une petite goutte, dans une région choisie à la surface du produit. Un excès de liquide est habituellement présent sur le produit après l'application de l'échantillon. Cet excès de liquide peut être un inconvénient dans la manipulation si le produit pour analyse est un produit composite unitaire inséparable et de façon plus exigente, si ce dernier nécessite une distribution précise du volume de l'échantillon, lorsqu'on applique cet échantillon à analyser sur le produit et s'il est nécessaire de conserver une bonne précision d'analyse.

On a reconnu la nécessité, soit d'accélérer, soit d'éviter comme on le désire, la migration des réactifs et des constituants de l'échantillon à analyser, par exemple, entre les couches des produits composites unitaires inséparables, comme cela est décrit aux brevets des Etats-Unis d'Amérique

3. Produit selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'agent tensio-actif contient 9 à 40 motifs éthoxy.

4. Produit selon la revendication 1, caractérisé en ce que le produit comprend un support qui transmet le rayonnement, revêtu d'une couche d'étalement poreuses de façon isotrope et une couche de réactif gonflable à l'eau et qui est placée entre le support et la couche d'étalement.

5. Produit selon la revendication 4, caractérisé en ce que la couche d'étalement et la couche de réactif sont en contact fluide avec le support et en ce que la couche de réactif présente une perméabilité inférieure à celle de la couche d'étalement.

6. Produit selon la revendication 5, caractérisé en ce que la couche de réactif comprend un liant colloïdal hydrophile dans lequel est répartie une substance active en présence d'une substance à analyser ou un précurseur ou un produit de réaction de cette substance active de façon à produire une variation décelable dans le produit.

7. Produit selon la revendication 1, caractérisé en ce que la substance non fibreuse résistant à l'eau de la couche d'étalement est choisie dans le groupe constitué par un polymère opalescent, une substance colloïdale micro-cristalline dérivée d'un polymère synthétique ou naturel et un pigment.

Il est souvent souhaitable et nécessaire de faire l'analyse chimique de liquides, tels que l'eau, des aliments comme le lait, et des liquides biologiques. Divers produits pour l'analyse de ces liquides sont bien connus. Ces produits contiennent souvent un réactif pour la substance à analyser, ce réactif, au contact d'un échantillon liquide contenant la dite substance, produisant une substance colorée ou une autre modification d'état décelable en réponse à la présence de cette substance à analyser. On a cherché récemment à préparer des produits utiles dans l'analyse chimique pour diagnostics, qui permettent d'analyser des liquides biologiques comprenant des fluides corporels tels que le sang, le sérum sanguin, l'urine, etc., pour obtenir des résultats tout à fait quantitatifs, de manière rapide et commode.

On a utilisé abondamment les techniques d'analyse chimique en solution dans les laboratoires cliniques, en particulier, dans les procédés d'analyse automatisés. Ces techniques, cependant, nécessitent un équipement avec des moyens mécaniques élaborés pour la manipulation et le transport des solutions à analyser. L'équipement pour l'analyse en milieu liquide qui est illustré, par exemple, par le brevet des Etats-Unis d'Amérique 2 797 149, peut mettre en œuvre des manipulations complexes de liquides et peut nécessiter un personnel très qualifié à la fois pour les opérations d'analyse et pour le nettoyage délicat de l'appareillage qui peut être nécessaire pour éviter la contamination d'un échantillon par un autre échantillon.

En remplacement des procédés d'analyse chimique en solution, on a proposé différents produits composites unitaires à

plusieurs couches pour l'analyse chimique sans solution. Bien que l'analyse chimique par un procédé pratiquement à sec peut présenter des avantages appréciables en ce qui concerne la conservation et la manipulation des produits pour l'analyse, comparativement aux procédés d'analyse chimique par voie humide, les procédés d'analyse par voie sèche ont eu jusqu'à présent, un succès limité et ont été utilisés essentiellement pour faire des analyses qualitatives et semi-quantitatives.

Un modèle fondamental de produit composite unitaire, non séparable, pour l'analyse de substances, est décrit au brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 092 465. Ce produit composite unitaire inséparable comprend une couche de substance fibreuse absorbante telle qu'une feuille de papier filtre imprégnée d'un ou de plusieurs réactifs comprenant, par exemple, une substance formatrice de colorant sur laquelle est appliquée une membrane semi-perméable. Lorsqu'on met un tel produit au contact d'un liquide à analyser, la substance à analyser traverse la membrane qui empêche le passage et l'absorption par la couche de substance fibreuse de certains constituants indésirables, par exemple, les cellules sanguines, qui altéreraient les résultats d'essai.

Les produits pour l'analyse qui contiennent une feuille de papier filtre absorbant ou une autre substance fibreuse, pour recevoir et distribuer un liquide, n'ont pas reçu un accueil favorable dans les laboratoires d'analyse clinique, par comparaison avec les procédés d'analyse par voie humide, car ces produits pour l'analyse ne permettent pas d'obtenir des résultats quantitatifs très précis. A la présente description et aux revendications qui suivent, l'adjectif «fibreux» s'applique à des composés, tels que des papiers, qui sont constitués de fibres, de filaments, ou de torons distincts.

On a décrit, dans la littérature, que les produits pour diagnostics qui utilisent des substances absorbantes, telles que des papiers filtres, peuvent produire des résultats non reproductibles. Au brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 050 373, on mentionne qu'il peut se produire une précipitation dans les solutions à analyser introduites dans le produit pour l'analyse, ce qui dérègle la répartition uniforme du réactif dans la substance absorbante. En outre, les produits pour l'analyse qui utilisent ces substances fibreuses absorbantes sont susceptibles de fournir des auréoles qui sont dues, apparemment, à une diffusion et une Chromatographie indésirables des réactifs chimiques et des substances à analyser, dans le composé absorbant.

Des produits composites, unitaires, inséparables, pour l'analyse, utiles dans les procédés automatisés sont décrits aux brevets des Etats-Unis d'Amérique 3 368 872 et 3 526 480. Bien que, dans ce dernier brevet, des substances colloïdales sont proposées dans des couches contenant le réactif chimique, des substances fibreuses sont aussi décrites. Ces substances fibreuses sont aussi utilisées dans les couches de réactif décrites au brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 368 872.

Une description plus récente d'un dispositif d'analyse qui utilise des substances fibreuses est mentionnée au brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 791 933, qui décrit un dispositif à plusieurs constituants pour le dosage de substrats d'enzymes et de métabolites, dosage effectué, par exemple, dans les fluides corporels. On décrit, dans ce brevet, une feuille de fibre de verre utilisée pour répartir un mélange réactionnel vers une fenêtre d'observation en matière plastique, cette feuille étant avantageusement poreuse pour réduire au minimum les problèmes de lamination provenant de l'air emprisonné.

Les dispositifs qui utilisent des substances fibreuses présentent de difficultés variées d'utilisation, en particulier, dues à la formation d'auréoles précédemment mentionnées. Comme il est bien connu, les caractéristiques chimiques des substances fibreuses absorbantes, utilisées habituellement comme substances absorbantes préférées dans les produits composites unitai-

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modification décelable par des moyens photométriques, par exemple, une modification de coloration.

On a remarqué que le résultat d'analyse obtenu en utilisant les produits du type général décrit au brevet belge 801 742, destinés à analyser des solutions protéiniques aqueuses, dans lesquelles les substances à analyser sont solubles dans l'eau, peut être altéré par la concentration en protéine de ces solutions. Plus particulièrement, on pense que l'augmentation de la concentration en protéine peut restreindre la vitesse et l'étendue de la diffusion du liquide et de la substance à analyser dans la couche d'étalement. Pour un volume d'échantillon à analyser déterminé, lorsque la substance à analyser se trouve dans une solution à forte concentration en protéine, on obtient au début, un résultat donnant une concentration en substance à analyser plus faible que celle qu'on obtiendrait avec une solution à teneur en protéine plus faible et, ensuite, on obtient habituellement un résultat donnant une concentration en substance à analyser plus élevée que celle qu'on obtiendrait avec des solutions à concentration en protéine plus faible. On pense que ces résultats sont dus à une diminution de la vitesse de diffusion du solvant de l'échantillon et des constituants dissous dans la couche d'étalement, produisant initialement dans un échantillon de la substance à analyser une réaction plus lente de la substance à analyser avec la composition d'indicateur ou tout autre réactif et, ensuite on obtient une plage imprégnée, un peu plus petite pour une dimension d'échantillon déterminée. Quand on laisse la réaction mise en jeu dans l'analyse se poursuivre pratiquement jusqu'à son terme, une quantité plus importante de substance à analyser parvient à chaque échelon de la couche de réactif touché par l'échantillon à analyser et indique une quantité de substance à analyser plus importante. Pour des déterminations précises, il pourrait être nécessaire de faire un dosage de protéine servant d'étalon pour le dosage de la substance à analyser, de manière à éviter des variations dans les résultats dues à des différences en teneur en protéine. Ces modes opératoires seraient longs et présenteraient, en outre, une source potentielle d'erreur dans la détermination de la substance à analyser.

On a découvert, suivant l'invention, que les agents tensio-actifs non ioniques peuvent, lorsqu'on les incorpore en quantité suffisante, en particulier, dans la couche d'étalement des produits, tels que décrits au brevet belge 801 742, éliminer cet effet dû aux protéines.

On a déjà décrit des agents tensio-actifs ou surfactifs utilisés dans les produits pour analyse. La publication «Research Disclosure» volume 126, article 12 626, octobre 1974, décrit des produits pour analyse du type qui est divulgé dans le brevet belge 801 742, produits destinés à analyser la teneur en cholestérol contenu dans les solutions, en utilisant l'enzyme oxydase de cholestérol. On décrit que, dans ces produits, il est possible d'utiliser des agents tensio-actifs non-ioniques comme adjuvants de couchage. On ne spécifie aucune concentration, mais le brevet belge 801 742 mentionne une concentration d'environ 1/1000 comme étant utile pour ces utilisations. En outre, cette publication mentionne qu'il est important qu'un tel agent tensio-actif soit en présence de l'oxydase de cholestérol pour assurer l'oxydation complète du cholestérol. On ne suggère aucunement que l'agent tensio-actif serait utile dans les produits pour analyse pour tout autre but ou dans un produit destiné à la détermination des substances dissoutes à analyser. Le cholestérol n'est pas dissous dans le sérum, mais est transporté par l'intermédiaire d'association avec des lipoprotéines. L'utilisation d'agents tensio-actifs pour dissocier les complexes d'esters de cholestérol et de protéine est également décrite dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 907 645.

Des agents tensio-actifs sont également décrits dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 050 373 comme étant utiles pour accroître la densité des colorants formés dans une substance absorbante, au cours de la réaction mise en œuvre pour détecter le glucose, en utilisant une oxydase du glucose, une Peroxydase et un chromogène. L'agent tensio-actif est également décrit comme étant un agent qui réduit au minimum l'effet de formation d'auréoles précédemment décrit. Le brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 050 373 ne suggère aucunement la présence d'un agent tensio-actif ailleurs que dans la couche d'un produit qui contient les réactifs chimiques, et ce brevet mentionne que les agents tensio-actifs non-ioniques comme les agents tensio-actifs anioniques sont utiles. Des agents mouillants sont également décrits comme des constituants utiles des couches des réactifs dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 802 842.

Le produit suivant l'invention pour l'analyse d'une substance contenue dans une solution protéinique aqueuse, produit qui comprend une couche d'étalement poreuse de façon isotrope et une couche de réactif, la couche d'étalement comprenant une substance non fibreuse résistant à l'eau, est caractérisé par la présence d'au moins 1% en masse d'un agent tensio-actif non-ionique dans la couche d'étalement.