CH644454A5

CH644454A5 - Produit destine a l'analyse par voie chimique de liquides a ph eleve.

Info

Publication number: CH644454A5
Application number: CH1329878A
Authority: CH
Inventors: Jon Nathan Eikenberry; Karl John Sanford; Richard Calvin Sutton
Original assignee: Eastman Kodak Co
Priority date: 1978-01-03
Filing date: 1978-12-29
Publication date: 1984-07-31
Also published as: GB2070770A; US4132528A; GB2011616B; DE2900136C2; GB2011616A; FR2413658B1; JPS616340B2; DE2900136A1; CA1120832A; JPS5877664A; FR2413658A1; JPS54101398A; GB2070770B

Description

La présente invention concerne l'analyse de liquides aqueux.

Il est souvent souhaitable ou nécessaire de déceler la pré-2o sence de certaines substances ou de doser des substances présentes dans les liquides aqueux, notamment dans des liquides aqueux d'origine biologique, tels que le sang, le sérum et l'urine. Diverses techniques chimiques, dites par voie humide, impliquent la dissolution ou la mise en suspension de réactifs 25 chimiques dans un liquide aqueux servant de fluide porteur. Malgré leur intérêt, ces techniques de dosage par voie humide, également désignées quelquefois sous le nom de dosages en solution, nécessitent des équipements complexes et coûteux dont la mise en œuvre implique des opérations délicates pour 3o la manipulation et le convoyage des solutions. C'est pourquoi, en vue de réaliser des analyses faciles, peu coûteuses et rapides, il a paru souhaitable d'opérer selon les techniques chimiques par voie sèche. Cette dénomination désigne les dosages réalisés.avec des compositions de réactifs incorporés 35 dans divers types de produits secs. Parmi les produits analytiques de ce type, on peut citer les produits en bande donnant un résultat simplement après avoir été plongés dans la solution et les produits analytiques à plusieurs zones, par exemple les produits analytiques à plusieurs couches.

40 Jusqu'à présent, le dosage de certaines substances devait être souvent réalisé dans un milieu de pH élevé, supérieur par exemple à 12,0, soit par suite de la nature de ces substances, soit par suite de la nature des réactifs analytiques à mettre en œuvre pour le dosage. Ainsi, le dosage des protéines dans des 45 fluides aqueux, tels que le sérum ou l'urine a été réalisé avec un réactif du biuret, c'est-à-dire un réactif comprenant un composé cuivrique en présence d'une base de façon à obtenir un pH supérieur à 12,0. Lòrsqu'une protéine, dans un milieu aqueux tel que le sérum, est en contact avec le réactif, il se proso duit une interaction entre cette protéine et le composé cuivrique dont le résultat est la formation d'une coloration violette. La réaction du biuret pour la caractérisation des protéines dans un fluide aqueux est faite généralement en solution, c'est-à-dire suivant une technique par voie humide. 55 On conçoit l'intérêt de remplacer ce dosage par voie humide par un dosage par voie sèche réalisé, par exemple, au moyen d'un produit analytique en bande simple si l'on désire faire un dosage semi-quantitatif, ou au moyen d'un produit à plusieurs zones ou à plusieurs couches, si l'on désire un résul-60 tat quantitatif plus précis. Toutefois, l'incorporation de composés très basiques dans un produit analytique de ce type soulève un problème dû au fait que, dans beaucoup de cas, les alcalis permettant d'obtenir un pH élevé, par exemple l'hydroxyde de sodium, subissent une évolution se traduisant 65 par un affaiblissement rapide de leur capacité à produire un pH élevé. Par exemple, un produit analytique sec qui contient les alcalis mentionnés ci-dessus, et qui fournit un pH initial élevé, lorsqu'il est mis en contact avec un échantillon aqueux

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contenant la substance à doser n'est plus capable au bout lui-ci de manière à fournir le milieu alcalin désiré dans une ou d'un délai de 8 à 10 jours d'assurer le maintien de ce pH élevé, plusieurs zones du produit.

Par suite, la réaction analytique réalisable seulement en mi- Suivant un autre mode de réalisation, le produit à plu-

lieu très alcalin se trouve notablement, sinon complètement, sieurs zones est constitué de couches assemblées de manière inhibée. s permanente. Dans ce qui suit, on le désignera sous le nom de

La présente invention a pour objet un produit analytique produit composite à structure indivisible. Ces couches sont permettant de faire le dosage par voie sèche d'un constituant superposées sur un support approprié, transmettant, par déterminé d'un liquide aqueux à un pH très alcalin c'est-à- exemple, le rayonnement électromagnétique.

dire supérieur à environ 12,0. Par l'expression «transmettant le rayonnement électroma-

Le produit analytique suivant l'invention comprend une 10 gnétique», on entend que les zones, les supports et les autres zone pour distribuer ou répartir le liquide à analyser, à la- couches du produit analytique laissent effectivement passer quelle est associé un réactif. Ce dernier, lorsque le produit est un rayonnement électromagnétique qui sert à déceler un ré-

mis au contact du liquide contenant la substance à doser, in- sultat analytique dans le produit. En conséquence, ceux des duit une modification décelable dans le produit analytique. produits analytiques suivant l'invention où le résultat analyti-

Le produit analytique suivant l'invention est caractérisé en ce 15 que peut être décelé grâce à une modification colorée visible qu'il comprend un agent alcalinisant stable, ne contenant pas qui survient dans le produit, doivent être transparents aux d'ions sodium et comprenant un mélange d'un polymère pro- rayonnements électromagnétiques dont la longueur d'onde,

tecteur d'alcalinité et d'une quantité d'alcali suffisante pour est comprise entre environ 400 nm et 700 nm. Lorsqu'on dé-

que le pH interne du produit soit supérieur à 12,0 dans les tecte le résultat analytique avec un rayonnement en dehors de conditions d'utilisation. 20 la région visible du spectre, une zone, une couche ou un sup-

Les agents alcalinisants sont ceux utilisables dans des pro- port «transmettant le rayonnement électromagnétique» doit duits analytiques de types divers, tels que les produits analyti- transmettre ce rayonnement spécifique quel qu'il soit, par ques en bande simple précités, et les produits analytiques à exemple un rayonnement ultraviolet, infrarouge, ou un plusieurs zones précités, par exemple les produits à plusieurs rayonnement produit par radioactivité.

couches et à structure indivisible du type décrit aux brevets 25 Comme indiqué précédemment, les différentes zones du des Etats-Unis d'Amérique 3 992 158 et 4 042 335 et aux bre- produit analytique sont, tout au moins dans les conditions vets français 2 377 630 et 2 377 632. d'utilisation, en relation d'échange de fluide entre elles. L'ex-

En outre, la mise en œuvre de l'invention peut être réalisée pression «en relation d'échange de fluide» signifie qu'un en associant les divers réactifs utilisables dans un produit fluide aqueux peut circuler entre les zones superposées ou analytique avec les agents alcalinisants décrits ci-après. 30 contiguës du produit analytique. Bien que les zones en rela-

Suivant un mode de réalisation préféré, on incorpore tion d'échange de fluide puissent être contiguës, elles peuvent l'agent alcalinisant stable dans un produit analytique conte- aussi éventuellement être séparées par des zones intermédiai-

nant une composition du biuret. En milieu très alcalin, une res, à condition, toutefois, que ces zones intermédiaires soient telle composition réagit avec les protéines, ce qui permet leur elles aussi en relation d'échange de fluide et ne fassent pas ob-

caractérisation dans un fluide aqueux. 35 stacle au passage du fluide de l'une à l'autre.

Les réactifs du biuret suivant l'invention sont particulière- On peut assurer la relation d'échange de fluide entre les ment utiles pour faire des dosages chimiques par voie sèche. zones du produit analytique, en préparant ce produit de ma-Ces réactifs sont toutefois utiles, d'une manière générale, pour nière que les zones soient contiguës dès l'origine pour perle dosage des protéines dans un échantillon de fluide aqueux mettre l'échange de fluide. Suivant une variante, on peut pré-et on peut donc les utiliser aussi bien pour les analyses chimi- 40 parer un produit dont les zones sont initialement non conti-ques des fluides aqueux par voie humide que par voie sèche. guës et peuvent être séparées les unes des autres, par exemple Au dessin annexé, la figure 1 est un graphique qui illustre par des intercalaires, des éléments formés d'un matériau élas-l'aptitude de certains polymères à être utilisés comme poly- tique, ou un support déformable. Bien entendu, si les zones du mères protecteurs d'alcalinité dans le produit analytique sui- produit analytique ne sont pas contiguës à l'origine, il peut vant l'invention. 45 être nécessaire de les comprimer, ou de prévoir un autre

Le produit analytique est de préférence un produit à plu- moyen permettant d'amener les zones non contiguës en rela-

sieurs zones, et en particulier un produit à plusieurs couches tion d'échange de fluide au moment où l'on met le produit en du type décrit au brevet français 2 377 632, ainsi qu'aux bre- œuvre pour faire une analyse.

vets des Etats-Unis d'Amérique 3 992 158 et 4 042 335, et au II est entendu aussi que le produit peut être une bande sim-

brevet français 2 377 630. Un tel produit analytique à plu- 50 pie ne permettant qu'une évaluation analytique approxima-

sieurs zones comprend habituellement une zone d'étendage tive. Bien que sa fabrication exige moins de précision et que sa pour convoyer l'échantillon de fluide aqueux à analyser et le structure physique soit moins complexe, un tel produit analy-

répartir au sein du produit analytique. tique peut avoir son utilité dans le cas où l'on désire obtenir

Un produit analytique à plusieurs zones comprend aussi des résultats qualitatifs, ou semi-quantitatifs. Sous sa forme la habituellement une zone analytique, contenant un réactif ou 55 pius simple, un produit analytique de ce type peut être consti-

une composition de réactifs. La structure du produit est telle tué d'une seule couche jouant le rôle de zone distributrice du que la zone analytique est associée à la zone d'étendage, ce qui fluide aqueux soumis à l'analyse. Habituellement, cette permet à celle-ci de répartir le liquide à analyser en établissant couche unique est constituée d'un matériau fibreux synthéti-

une relation d'échange de fluide avec la zone analytique. que ou naturel, par exemple un matériau en polyamide à

L'agent stable alcalinisant, qui constitue une caractéristi- «0 mailles, ou du papier filtre, imprégné d'un ou plusieurs réac-

que essentielle du produit analytique suivant l'invention, peut tifs. L'agent alcalinisant stable peut être présent aussi dans

être incorporé soit dans la zone d'étendage, soit dans la zone cette couche unique, ou dans une couche qui lui est associée,

analytique. Suivant une variante, il peut être présent dans une et se trouve en relation d'échange de fluide avec le réactif dans zone distincte qui, à son tour, est en relation d'échange de les conditions d'utilisation du produit analytique. Lors du do-

fluide avec la zone d'étendage et la zone analytique dans les 65 sage, on traite le produit analytique en bande par un fluide conditions d'utilisation. Un échantillon de fluide aqueux dé- aqueux contenant la substance à analyser, par exemple en posé sur le produit analytique peut donc venir en relation plongeant le produit en bande dans le fluide ou en mettant la d'échange de fluide avec l'agent alcalinisant et réagir avec ce- bande au contact de celui-ci, ce qui lui permet d'imprégner la

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bande. Il se produit alors une interaction dans le milieu très dénomination commerciale «Triton X-200», par la Société alcalin créé par l'activation de l'agent alcalinisant par le fluide Rohm et Haas. On pourrait bien entendu utiliser un agent aqueux, et il en résulte une modification décelable dans le pro- tensioactif autre que le produit Triton X-200 sans que les réduit en bande. sultats de l'essai soient sensiblement modifiés. On prépare des Comme indiqué précédemment, une caractéristique essen- 5 couches à partir de solutions dans l'eau distillée d'hydroxyde tielle du produit analytique suivant l'invention est la présence, de lithium, d'agent tensioactif et du polymère à tester et on dans ce produit, d'un agent alcalinisant stable. Cet agent alca- ajuste les quantités de chacun des constituants de la solution linisant comprend nécessairement deux ingrédients, d'une de couchage de manière que la couche humide appliquée sur part un alcali, en quantité suffisante pour que le pH soit su- le support de film souple contienne 2,7 g/m2 d'hydroxyde de périeur à 12,0 dans les conditions d'utilisation du produit îosodium (Li0H,H20), 8,0 g/m2 de polymère et 0,54 g/m2 d'a-analytique et, d'autre part, un polymère protecteur d'alca- gent tensioactif. On sèche ensuite la couche à l'air. Bien en-linité. tendu, les conditions particulières de couchage et de séchage à La stabilité de l'agent alcalinisant lui permet de créer un l'air, par exemple la température, l'humidité relative, etc., va-milieu très alcalin dans le produit analytique où il est incor- rient suivant les propriétés physiques du polymère essayé. Par poré, même lorsque ce produit a été exposé longtemps à la 15 exemple, la température de couchage est habituellement choi-température et à l'humidité relative ambiantes. Cette stabilité sie en fonction des propriétés de couchage uniforme du poly-semble dépendre, en grande partie, du maintien de l'absence mère, par exemple des propriétés filmogènes uniformes.

d'ions sodium dans l'agent alcalinisant et de l'incorporation à

ce dernier du polymère protecteur d'alcalinité précité. En par- 2) - Dans lés trois heures qui suivent l'application de la ticulier, bien que les ions sodium entrent dans la constitution 20 couche, on découpe un échantillon ayant la forme d'un carré de nombreux composés minéraux connus comme des alcalis de 1,6 cm de côté et l'on détermine la quantité d'alcali qu'il efficaces, tels que l'hydroxyde de sodium, le carbonate an- contient de la manière suivante:

hydre de sodium, l'orthophosphate de sodium, etc., ces déri- On prépare une solution indicatrice de phénolphtaléine en vés sodiques alcalins ont tendance à être très hygroscopiques, ajoutant 5 mg de phénolphtaléine à 10 mg d'eau distillée. On même lorsqu'on les mélange à un polymère protecteur d'alca- 25 obtient la dissolution de la substance indicatrice en ajoutant linité et qu'on les incorpore au produit analytique. Il en ré- une goutte de NaOH concentré (c'est-à-dire une solution consulte que les dérivés sodiques alcalins tendent à extraire la va- stituée, en masse, de 50/100 de NaOH et 50/100 d'eau) et en peur d'eau de l'atmosphère ambiante et celle-ci, à son tour, ajustant le pH de la solution à 8,9 avec 1M de HCl. On place peut se combiner au gaz carbonique qui est présent aussi dans ensuite l'échantillon, la couche vers le haut, dans une fiole à l'atmosphère ambiante, ce qui a pour effet la formation de bi- 30 scintillation de 25 ml. On ajoute 3 ml d'eau distillée, on place carbonate et d'autres carbonates dans le produit analytique. dans la fiole un petit agitateur magnétique et on agite la solu-En raison du pouvoir tampon de ces carbonates, le pH élevé tion pendant 5 mn. A la solution agitée, on ajoute 40 ^1 de la fourni initialement dans le produit analytique par les dérivés solution indicatrice de phénolphtaléine précitée et on titre la synthétiques tels que l'hydroxyde de sodium, décroît rapide- solution obtenue avec de l'acide chlorhydrique 0,0 IN jusqu'à ment jusqu'à un niveau notablement inférieur à 12,0. De ce 35 clarification. On note le volume d'acide nécessaire pour obte-fait, les réactifs qui exigent un milieu très alcalin, par exemple nir la clarification.

le réactif du biuret dont l'activité est optimale à un pH supé- Si aucune fraction de l'hydroxyde de lithium n'est perdue rieur à 12,0, ne présentent plus qu'une activité réduite, ou de- pendant les opérations de couchage et de séchage de la phase viennent complètement inactifs. 1) ci-dessus, par exemple par adsorption de C02 au cours de

Un second facteur important qui contribue à la stabilité 40 ces opérations, la quantité théorique d'hydroxyde de lithium des agents alcalinisants présents dans le produit analytique présente dans l'échantillon, calculée d'après le procédé de ti-suivant l'invention est l'utilisation, dans ces agents, du poly- tration ci-dessus en utilisant de l'HCl, 0,01N est trouvée égale mère protecteur d'alcalinité précité. On a constaté que le pou- à 1,70 x 10-2 mEq. On conserve le reste du support portant voir alcalinisant de certaines bases fortes, même celles qui la couche en atmosphère ambiante pendant au moins 8 jours, sont exemptes d'ions sodium, telles que l'hydroxyde de h- 45 à ime température de 21 °C et à une humidité relative de 50% thium, l'hydroxyde de calcium, etc., tend à diminuer sensible- environ. Au cours de cette période, le quatrième et le huitième ment au bout d'un délai relativement court, par exemple 8 à jour, respectivement, on prélève à nouveau un échantillon 10 jours, lorsque ces bases fortes sont incorporées à un pro- carré de 1,6 cm de côté dont on détermine comme précédem-duit analytique. Toutefois, en associant les bases exemptes ment la teneur en alcali.

d'ions sodium avec certains polymères qu'on désigne ici sous 50 3) - On compare les quantités d'alcali présentes dans châle nom de polymères «protecteurs d'alcalinité», on dispose cun des trois échantillons. Si la quantité d'alcali mesurée dans d'un moyen efficace pour empêcher, ou tout au moins réduire chaque échantillon est au moins égale à 0,8 x 10~2 mEq notablement, la dégradation du pouvoir basique de ces d'hydroxyde de lithium, le polymère est utilisable comme pro composés. tecteur d'alcalinité dans un produit analytique suivant l'in-

On a mis au point un essai en parallèle, c'est-à-dire réalisé 55 vention. On trouvera ci-après plusieurs exemples de mise en en dehors du processus normal de dosage, relativement simple œuvre de cet essai. Les résultats de chaque essai sont portés et peu coûteux, pour vérifier si un polymère donné présente sur le graphique représenté à la figure 1. En abcisses on a un pouvoir «protecteur d'alcalinité» utile. Cet essai se déroule porté le nombre de jours de conservation et en ordonnées la comme suit. quantité d'hydroxyde de lithium en milliéquivalents.

1) - On utilise comme support un support de film souple 60 II est clair que grâce à l'essai précité, le choix des poly-tel qu'un film de polytéréphtalate d'éthylèneglycol dont la lar- mères spécifiques protecteurs d'alcalinité utilisables dans le geur est de 2,5 cm au moins et dont la longueur est supérieure produit suivant l'invention ne présente pas de difficulté. On à environ 1 m. On applique manuellement sur le support une peut donc déterminer en routine si un polymère est ou n'est couche continue d'une composition alcalinisante contenant pas un «protecteur d'alcalinité» utilisable dans le produit suide l'hydroxyde de lithium, un agent tensioactif et le polymère 65 vant l'invention. En conséquence, la signification de l'expres-dont on désire tester le pouvoir protecteur d'alcalinité. sion «protecteur d'alcalinité», utilisée dans la présente des-

L'agent tensioactif utilisé est un sel d'un acide alkylaryl poly- cription et dans les revendications, est liée aux résultats de éther sulfonique, vendu aux Etats-Unis d'Amérique sous la l'essai précité.

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Des polymères utiles comme protecteurs d'alcalinité sont, par exemple, la polyvinylpyrrolidone, le Polyacrylamide, l'agarose, et notamment les copolymères préparés par copoly-mérisation de mélanges de vinylpyrrolidone et d'acrylamide. On a constaté que ces derniers polymères sont particulièrement utiles, car non seulement ce sont de bons protecteurs d'alcalinité mais, en outre, ils ont de bonnes propriétés filmo-gènes et une adhérence satisfaisante (en présence de grandes quantités d'alcali) sur les supports de films souples usuels de polytéréphtalate d'éthylèneglycol, éventuellement traités comme on l'indique ci-après pour améliorer leur adhérence à des surcouches. En outre, ces copolymères s'appliquent facilement sous forme de couches dont le séchage ne nécessite pas des températures élevées, c'est-à-dire supérieures à 50 °C environ, et le temps de séchage n'est pas critique. On préfère utiliser des copolymères préparés à partir de mélanges contenant, en masse, de 20/100 à 80/100 environ de vinylpyrrolidone et de 80/100 à 20/100 environ d'acrylamide. On préfère notamment les copolymères préparés à partir de quantités en masse égales d'acrylamide et de vinylpyrrolidone.

Les agents alcalinisants utiles dans les produits analytiques suivant l'invention sont des composés fortement alcalins ne contenant pratiquement pas d'ions sodium, tels que l'hydroxyde de lithium, l'hydroxyde de calcium, des mélanges de ces composés, etc. On préfère tout particulièrement l'hydroxyde de lithium qui s'applique facilement en couches à partir de solutions de couchage aqueuses et qui, lorsqu'il est mélangé à un polymère protecteur d'alcalinité approprié, est remarquablement stable et permet de conserver une forte alcalinité. Bien entendu, d'autres composés fortement alcalins ne contenant pratiquement pas d'ions sodium sont aussi utilisables dans le cadre de l'invention.

Comme indiqué précédemment, la quantité d'alcali utilisée doit être suffisante pour fournir un pH supérieur à environ 12,0 à l'intérieur du produit analytique dans les conditions normales d'utilisation de celui-ci. La quantité effective d'alcali utilisée dans un produit donné varie suivant, par exemple, le degré particulier d'alcalinité qu'on désire maintenir dans le produit ou dans une partie de celui-ci, dans les conditions d'utilisation, et suivant la quantité de fluide aqueux qui imprègne le produit dans les conditions d'utilisation. En d'autres termes, si la composition de réactifs choisie produit une interaction avec la substance à doser dans un milieu de pH exceptionnellement élevé, de l'ordre de 13,5 à 14 environ, il est nécessaire d'utiliser des quantités d'alcali plus grandes que lorsque la composition de réactifs choisie produit une interaction avec la substance à doser dans un milieu dont le pH est compris entre 12,5 et 13,5 environ.

En général, la quantité de polymère protecteur d'alcalinité présente dans une composition fournissant l'agent alcalinisant utilisé dans le produit analytique suivant l'invention dépend de la quantité d'alcali utilisée. On a constaté qu'on obtenait généralement des résultats corrects avec de 2 à 5 parties environ en masse de polymère pour une partie en masse d'alcali destiné à être mélangé à celui-ci et la structure du produit analytique auquel on incorpore l'agent alcalinisant, il est possible d'obtenir des résultats corrects en utilisant des quantités de polymère en dehors de l'intervalle précité.

Les compositions de réactifs incorporées au produit analytique suivant l'invention comprennent des substances actives très diverses qui par une réaction chimique ou physique créent une modification décelable dans le produit analytique lors du traitement de celui-ci par le fluide aqueux contenant la substance à analyser. Il n'est pas rare qu'une composition de réactifs comprenne plusieurs substances actives qui sont le siège de plusieurs réactions chimiques ou physiques lors du traitement du produit analytique. Le cas échéant, les différentes substances actives peuvent être réparties dans plusieurs zones du produit analytique. En conséquence, dans un produit analytique à plusieurs zones, il n'est pas nécessaire que chacune des substances actives qui constituent la composition de réactifs soit contenue uniquement dans la zone 5 analytique. Par exemple, dans un produit composite à plusieurs couches, une ou plusieurs substances actives de la composition de réactifs peuvent être incorporées à une couche d'étendage, ou à l'une des autres couches facultatives du produit, telles qu'une couche opaque, une couche d'enregistre-io ment, une couche filtre ou toute autre intercouche du produit, telles que celles décrites ci-après. Bien entendu, au moins une et souvent toutes les substances actives contenues dans une composition de réactifs donnée sont incorporées à la couche analytique du produit. En outre, le produit suivant l'inven-15 tion peut comprendre plusieurs zones réactives.

La composition de réactifs utilisée dans les produits analytiques suivant l'invention dépend de la substance particulière à analyser et du moyen utilisé pour détecter la présence d'une modification décelable dans le produit. 20 Les compositions de réactifs analytiques utilisées suivant l'invention contiennent généralement une ou plusieurs substances actives qui sont décelables soit directement, soit par l'intermédiaire d'une réaction entre elles, avec la substance à analyser ou un produit de décomposition ou de réaction de la 25 substance à analyser. Il faut donc mettre en présence les substances nécessaires pour provoquer une modification décelable dans le produit analytique lorsqu'on dépose sur celui-ci un échantillon aqueux contenant la substance à analyser.

On peut utiliser des substances très diverses pour consti-so tuer les compositions de réactifs utilisables suivant l'invention. On utilise, par exemple, des colorants et des pigments décelables par colorimétrie ou par fluorométrie, des substances marquées avec des éléments radioactifs, ou des complexes antigène-anticorps marqués, des enzymes, des précurseurs et 35 des produits de réaction de ces substances. Pour de plus amples détails sur ces substances, on consultera le brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 992 158 et le brevet français 2 377 630 précités.

Comme indiqué précédemment, l'invention est particuliè-40 rement utile avec un réactif du biuret. Les réactifs du biuret réagissent avec les protéines contenues dans les fluides aqueux tels que le sérum ou le plasma sanguin, en milieu très alcalin, par exemple à un pH de 12,0 et, de préférence, de 12,5 et plus. A la suite de cette réaction, le réactif du biuret subit une modi-« fication de coloration rapidement décelable et devient violet. Un réactif du biuret comprend un sel cuivrique soluble dans l'eau et, si on le désire, un agent de chélation pour réduire et empêcher la précipitation de l'hydroxyde de cuivre insoluble. Un réactif du biuret contient aussi facultativement divers 50 agents tensioactifs. Dans les réactifs du biuret antérieurement connus, on a utilisé différents sels cuivriques notamment des sels de cuivre-2 tels que le Perchlorate, le sulfate, l'acétate, le butyrate, le bromate, le chlorate, le bromure, le chlorure, le fluorure, le dichromate, le formate, l'iodate, le lactate, l'or-55 thophosphate, le laurate, le salicylate, le nitrate, le tartrate et 1'Oxalate cuivriques. On utilise de préférence le sulfate cuivrique.

Parmi les agents de chélation, qu'on nomme parfois agents stabilisants, on peut citer les tartrates, les citrates, 60 l'éthylènediamine, etc.

Les agents alcalinisants utilisés dans les produits analytiques suivant l'invention sont particulièrement utiles avec les réactifs du biuret précités du fait que ceux-ci exigent un milieu fortement alcalin. Lorsqu'on les utilise avec un réactif du bi-65 uret dans un produit analytique suivant l'invention, les agents alcalinisants peuvent se trouver dans une zone du produit qui est distincte de la zone contenant le réactif du biuret tout en étant en relation d'échange de fluide avec celle-ci. On préfère

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toutefois incorporer l'agent alcalinisant dans la même zone que le réactif du biuret, et l'alcali de l'agent alcalinisant devient alors un constituant du réactif du biuret.

Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, on utilise un réactif du biuret amélioré. Dans ce mode de réalisation, le réactif du biuret ne contient pratiquement pas d'ions sodium et comprend un sel cuivrique soluble dans l'eau, un précurseur d'agent de chélation du cuivre et une quantité d'alcali suffisante pour fournir un pH supérieur à 12,0 environ dans les conditions d'utilisation du biuret. Le précurseur d'agent de chélation du cuivre est une substance qui, en milieu très alcalin, se transforme en agent de chélation du cuivre, par exemple un tartrate dans le cas de l'acide tartri-que. Dans ce mode de réalisation, le réactif du biuret de préférence est constitué par un mélange pratiquement exempt d'ions sodium et comprenant du sulfate cuivrique, de l'acide tartrique et de l'hydroxyde de lithium.

Les quantités des divers constituants des réactifs du biuret peuvent varier suivant l'intervalle de concentrations dans lequel un réactif donné doit être actif. On utilise généralement de 0,5 g environ à 10 g environ de sel cuivrique soluble dans l'eau pour chaque gramme de protéine à analyser. La quantité de précurseur d'agent de chélation dépend généralement de la quantité de sel cuivrique présente, cette quantité variant habituellement de 0,5 mole environ à 2 moles environ d'agent de chélation pour chaque mole de sel cuivrique.

Ce réactif du biuret convient particulièrement pour un produit analytique destiné au dosage par «voie sèche», mais on peut l'utiliser aussi pour le dosage par «voie humide» des protéines contenues dans un échantillon de fluide aqueux. Les modes opératoires mis en œuvre pour réaliser les dosages par «voie humide» à l'aide du réactif du biuret sont bien connus et il n'est par nécessaire de les décrire davantage.

Dans le cas d'un produit analytique pour dosage par «voie sèche», il est avantageux d'associer le réactif avec un polymère protecteur d'alcalinité dans une zone réactive du produit. Outre le réactif et le polymère, la zone réactive peut contenir aussi des adjuvants qui n'ont pas d'action défavorable sur la réaction, tels que des agents tensioactifs, des liants polymères, etc.

Comme indiqué précédemment, on peut utiliser les agents alcalinisants stables et les réactifs du biuret dans une grande variété de produits analytiques pour dosage par «voie sèche» ayant différentes structures et constitués de matériaux divers. Par exemple, on peut les incorporer dans des produits analytiques en bande simple, dans des produits analytiques à plusieurs zones constitués d'un support portant une zone d'étendage associée à une zone analytique contigue, du type décrit au brevet français 2 377 632, et dans des produits analytiques composites à structure indivisible constitués d'un support transparent portant au moins deux couches contiguës superposées, telles que des couches analytiques, des couches d'étendage, des couches d'enregistrement, des couches opaques, des couches filtres et des substratums, comme décrit aux brevets des Etats-Unis d'Amérique 3 992 158 et 4 042 335 et au brevet français 2 377 630. Pour des raisons de commodité et pour illustrer le meilleur mode actuel de réalisation de l'invention, on décrira ci-après la mise en œuvre de l'invention dans ces produits analytiques composites à structure indivisible mais, bien entendu, l'invention s'applique à d'autres types de produits.

Un produit analytique composite à structure indivisible comprend habituellement une couche d'étendage et une couche analytique qui, de préférence, transmet le rayonnement électromagnétique. Ces couches peuvent être appliquées sur un support, qui est de préférence transparent mais, si les couches sont suffisamment permanentes et stables, un support n'est pas nécessaire.

Selon un mode de réalisation préféré, les couches suivantes sont appliquées sur un support transparent

(1) une couche analytique perméable à l'eau, à laquelle est incorporé un réactif, par exemple un réactif du biuret, et s (2) une couche d'étendage perméable à l'eau.

La couche analytique est disposée entre le support et la couche d'étendage. La couche d'étendage présente, de préférence, une perméabilité pratiquement uniforme aux substances actives dissoutes du réactif du biuret, de manière à permet-îo tre à celles-ci de migrer dans la couche d'étendage. Dans ce mode de réalisation, la couche analytique est de préférence pratiquement imperméable aux protéines telles que l'albumine et les autres protéines ayant une masse moléculaire de l'ordre de 60 000 ou plus. Ceci permet aux substances dissou-i5 tes du réactif du biuret de réagir avec les protéines présentes dans la couche d'étendage du produit analytique.

L'invention concerne aussi un produit analytique constitué d'un support sur lequel sont appliquées une couche analytique et une couche d'étendage du type décrit dans le mode de 20 réalisation ci-dessus. Toutefois, suivant un mode de réalisation préféré, en outre, la couche d'étendage est formée d'un matériau non fibreux et présente, avantageusement, une porosité isotrope. En vue d'accroître l'aptitude du produit à la réalisation de dosages quantitatifs, toutes les couches sont de 25 préférence formées d'un matériau non fibreux. Le terme «non fibreux» désigne ici des couches et/ou des matériaux qui ne contiennent que peu ou pas de substances fibreuses susceptibles de gêner l'étendage de l'échantillon ou la détection du résultat analytique par radiometrie.

30 On peut préparer des couches d'étendage en utilisant les différents constituants décrits au brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 992 158. Notamment, on peut utiliser, pour former ces couches, un matériau sous forme de particules, la porosité isotrope de ces couches étant créée par les espaces in-35 ter-particulaires. Parmi les matériaux particulaires utilisables, et avantageusement inertes chimiquement vis-à-vis des constituants de l'échantillon soumis à l'analyse, on peut citer des pigments tels que le bioxyde de titane, des particules de terre de diatomée, des perles de verre, des perles de matières plasti-40 ques et des matériaux colloïdaux microcristallins dérivés de polymères naturels ou synthétiques, par exemple la cellulose microcristalline.

Pour préparer la couche d'étendage, on peut utiliser, à la place ou bien en plus des matériaux particulaires, des poly-45 mères présentant une porosité isotrope. Il est possible de préparer ces polymères avec les modes opératoires utilisés pour la préparation de polymères vinyliques, comme décrit, par exemple, au brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 555 129 et au brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 992 158 précité. D'au-50 très modes opératoires utilisables pour la préparation de polymères à porosité isotrope comprennent ceux où l'on a recours à un gaz ou à tout autre agent gonflant pour créer des pores, comme décrit aux brevets des Etats-Unis d'Amérique 2 960 728 et 2 940 095, ou bien ceux utilisant un solide qui se 55 dissout pour créer des pores, comme décrit, par exemple, au brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 816 575. On peut utiliser des polymères très divers, seuls ou en combinaison, pour préparer des couches d'étendage de polymères translucides à porosité isotrope utilisables dans les produits analytiques sui-60 vant l'invention, par exemple des polycarbonates, des polyamides, des polyuréthannes et des esters de cellulose tels que l'acétate de cellulose.

L'épaisseur de la couche d'étendage et la dimension de ses pores est variable et dépend en partie des dimensions des 65 constituants à analyser, du volume de l'échantillon soumis à l'analyse que, pour des raison de commodité et de propreté, la couche d'étendage doit être capable d'absorber. Cette épaisseur dépend également du volume des pores de la couche qui

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influence aussi la quantité de l'échantillon de fluide que la qué précédemment, on peut incorporer les agents alcalinisants couche peut absorber. Des couches d'étendage d'épaisseur dans la couche réactive.

comprise entre 50 |i environ et 300 |i environ à l'état sec sont L'épaisseur de la couche analytique et son degré de per-

particulièrement avantageuses. Toutefois, d'autres épaisseurs méabilité peuvent varier considérablement et dépendent de sont acceptables et peuvent être souhaitables pour des pro- 5 l'utilisation effective du produit. On obtient des résultats cor-

duits particuliers. Les dimensions des pores de la couche rects avec des couches dont l'épaisseur à l'état sec est comprise d'étendage sont avantageusement comprises entre environ 1 n entre environ 10 p. et envirion 100 |x mais, dans certains cas, il et environ 30 jx. peut être souhaitable que l'épaisseur de la couche analytique

Il est souhaitable que les couches réactives des produits soit en dehors de cet intervalle. On peut former des couches analytiques suivant l'invention soient uniformément perméa- 10 analytiques fibreuses par imprégnation d'une substance fi-bles à l'eau et aux substances dissoutes dans celle-ci, mais elles breuse, suivant des procédés connus.

doivent être pratiquement imperméables et non poreuses vis- Pour préparer des produits analytiques suivant l'inven-à-vis des protéines de masse moléculaire plus élevée. Le terme tion, on peut former les couches séparément à l'avance, puis «perméabilité» englobe la perméabilité résultant de la poro- les assembler avant utilisation, ou les maintenir séparées jus-sité, de l'aptitude à gonfler, ou de toute autre caractéristique. 15 qu'à ce qu'on les mette en relation d'échange de fluide lors de Les couches réactives peuvent comprendre une substance de l'utilisation du produit analytique. Si possible, on applique remplissage, par exemple un polymère filmogène dans lequel ces couches, à partir d'une solution ou d'une dispersion, sur la composition de réactifs est répartie, c'est-à-dire dissoute ou une surface d'où l'on peut décoller la couche après séchage, dispersée. Toutefois, comme la couche analytique comprend Toutefois, un mode opératoire commode qui peut permettre souvent l'agent alcalinisant stable qui contient lui-même le 20 d'éviter les problèmes créés par des opérations répétées de dépolymère protecteur d'alcalinité précédemment décrit, une collage et d'assemblage, lorsqu'on désire des couches conti-substance de remplissage distincte peut n'être pas nécessaire, à guës, consiste à appliquer une couche initiale sur un support condition que le polymère protecteur d'alcalinité soit présent décollable et à appliquer ensuite des couches successives direc-en quantité suffisante. tement sur les couches appliquées précédemment. Pour ce

Bien entendu, le choix d'une substance de remplissage va- 25 faire, on peut avoir recours à divers procédés de couchage rie et dépend des constituants de la composition de réactifs. connus, tels que ceux décrits au brevet des Etats-Unis d'Amé-

De toute manière, la substance de remplissage ne doit avoir rique 3 992 158 précité. On peut résoudre sans effet nuisible aucune action défavorable vis-à-vis de la composition de réac- les problèmes d'adhérence entre les couches grâce à des traite-

tifs, c'est-à-dire qu'elle ne doit pas réagir avec les substances ments de surface, y compris l'application de substratums ex-

actives de celle-ci. Les substances de remplissage qu'on utilise 30 trêmement minces tels que ceux utilisés dans les films photo-

de préférence dans les couches analytiques associées à des graphiques.

couches d'étendage sont non fibreuses et elles peuvent com- Comme indiqué précédemment, les produits analytiques prendre des substances hydrophiles sans action défavorable suivant l'invention peuvent ne pas nécessiter de support ou sur la réaction, par exemple les gélatines, les dérivés hydro- bien être portés par un support. Parmi les supports utilisables,

philes de la cellulose, les Polysaccharides tels que le dex- • 35 on peut citer les supports préparés à partir de divers poly-

tranne, la gomme arabique, etc., et en outre des substances mères tels que l'acétate de cellulose, le polytéréphtalate synthétiques telles que des composés polyvinyliques solubles d'éthylèneglycol, les polycarbonates, les composés polyvinyli-

dans l'eau, par exemple l'alcool polyvinylique, etc. On peut ques tels que le polystyrène, etc. Le support choisi pour un aussi utiliser des substances telles que les esters de cellulose, produit donné doit être compatible avec le mode envisagé de etc. Pour accroître la perméabilité de la couche réactive, si cel-40 détection du résultat analytique. On utilise de préférence des le-ci n'est pas poreuse, on peut utiliser une substance de rem- supports faits en matériaux transmettant un rayonnement plissage gonflable dans le solvant ou le milieu de dispersion électromagnétique de longueur d'onde comprise entre 300 nm du fluide soumis à l'analyse. En outre, il peut être nécessaire environ et 700 nm environ.

de choisir une substance qui soit compatible avec l'applica- Il peut être avantageux d'incorporer aux couches du pro-

tion d'une couche contigue au cours de la fabrication du pro- 45 duit analytique un ou plusieurs agents tensio-actifs ioniques duit analytique. Par exemple, lorsqu'on veut former des cou- ou non ioniques. Ces agents peuvent, par exemple, améliorer ches distinctes et contiguës et que l'analyse concerne des flui- l'aptitude des compositions de couchage à fournir des couches des aqueux, il peut être souhaitable de choisir une substance et accroître l'importance et la vitesse de l'étendage dans les de remplissage essentiellement soluble dans l'eau pour former couches d'étendage qui ne sont pas facilement mouillées par la couche analytique et une substance essentiellement soluble 50 les échantillons de fluides, en l'absence d'un adjuvant tel ou dispersable dans un solvant organique pour former une qu'un agent tensio-actif.

couche contiguë, par exemple une couche d'étendage. De On peut adapter les produits analytiques suivant l'inven-

cette manière, on réduit au minimum l'action mutuelle des tion pour permettre leur utilisation non seulement dans le do-

solvants et on peut former un produit dont les couches sont maine de la chimie clinique, mais aussi dans les domaines de nettement délimitées. Dans de nombreux cas, pour empêcher 55 la recherche chimique et de la surveillance des processus chi-

la diffusion des protéines de masse moléculaire élevée dans la miques. Ces produits conviennent particulièrement bien à

couche réactive, il peut être souhaitable que celle-ci présente l'analyse des fluides corporels tels que le sang, le sérum et l'u-

une perméabilité plus faible que celle de la couche d'étendage. rine, du fait que dans ce genre d'analyse on fait fréquemment

On peut facilement obtenir ce résultat en réduisant la dimen- un grand nombre d'essais répétitifs dont les résultats doivent sion des pores de la couche analytique. On détermine la per- 60 être accessibles très peu de temps après le prélèvement de méabilité ou la porosité par des procédés connus. l'échantillon.

Dans la couche analytique sont répartis un ou plusieurs Comme indiqué précédemment, les produits suivant Fin-

constituants de la composition de réactifs. On peut obtenir la vention peuvent contenir une couche opaque au rayonnement répartition de ce ou de ces constituants par dissolution ou dis- 65 électromagnétique spécifique utilisé pour le dosage. Une telle persion dans la substance de remplissage, si on en utilise une. couche contient un agent opacifiant qui, en raison de sa capa-

Bien qu'on préfère souvent des répartitions uniformes, cel- cité d'absorption, de son pouvoir réflecteur, etc., empêche le les-ci peuvent ne pas être nécessaires. En outre, comme indi- passage du rayonnement électromagnétique lorsqu'il est in-

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corporé à la couche. Suivant un mode de réalisation particulier, la couche opaque peut comprendre une substance de remplissage contenant un agent opacifiant, par exemple un pigment tel que du carbone, ou un autre pigment minéral tel qu'un sel métallique, par exemple le bioxyde de titane, l'oxyde de zinc, le sulfate de baryum, etc. L'agent opacifiant peut être contenu dans des polymères diaphanisés, ou translucides, qui sont en général naturellement réfléchissants et, pour former des couches opaques, on peut utiliser ces polymères qui servent habituellement à former des couches d'étendage.

Outre la couche opaque, le produit analytique peut comprendre d'autres couches, telles qu'une couche d'enregistrement pour recevoir les substances décelables, par exemple des colorants formés ou libérés dans le produit analytique,

comme décrit aux brevets des Etats-Unis d'Amérique 3 992 158 et 4 042 335 précités, ou des couches filtres. On peut utiliser aussi des intercouches contenant diverses substances actives d'une composition destinée à réagir, de manière à les éliminer, avec les substances qui pourraient fausser l'analyse.

Bien entendu, on peut préparer différents produits analytiques conformes à l'invention. Ces produits peuvent se présenter sous des formes diverses, par exemple des bandes de largeur variable, des feuilles ou des plaquettes.

On met en œuvre les produits composites à structure indivisible en déposant sur le produit un échantillon du fluide à analyser. Habituellement, la structure du produit est telle que l'échantillon vient au contact de la couche d'étendage avant la couche réactive et il entre en contact avec la face de la couche d'étendage qui est la plus éloignée de cette couche réactive. Du fait que des variations de volume des échantillons sont pratiquement sans effet sur la précision de l'analyse, le dépôt de l'échantillon peut se faire manuellement ou être automatisé. Toutefois, pour permettre de détecter commodément les résultats analytiques, une certaine uniformité du volume de l'échantillon peut être souhaitable.

Pour procéder à une analyse manuelle ou automatisée avec les produits composites suivant l'invention, on prend le produit à partir d'un rouleau débiteur, d'un distributeur de plaquettes ou de toute autre source, et on fait tomber sur le produit une goutte du fluide à analyser. Après le dépôt de l'échantillon et, avantageusement, après absorption du fluide par la couche d'étendage, on soumet le produit à tout traitement approprié, tel que chauffage, humidification, etc., qui peut être souhaitable pour accélérer ou faciliter l'obtention du résultat analytique.

Après obtention du résultat analytique sous la forme d'une modification décelable, on mesure ce résultat, habituellement en faisant passer le produit à travers un appareil de spectrophotométrie par réflexion ou par transmission. Cet appareil sert à diriger un rayonnement, par exemple un rayon lumineux, à travers le support et la couche analytique. La lumière est ensuite réfléchie, par exemple par un agent opacifiant incorporé à la couche d'étendage ou à une couche opaque du produit, et est renvoyée vers un dispositif de détection, ou bien elle traverse le produit vers un détecteur dans le cas de la détection par transmission. De préférence, on détecte le résultat analytique dans une plage du produit qui est totalement à l'intérieur de la plage où est survenu ce résultat. En général, on a recours à un rayonnement électromagnétique dont la longueur d'onde est située dans l'intervalle de 400 nm environ à 700 nm environ, mais il est possible d'utiliser tout rayonnement auquel le produit est perméable et qui permet de doser quantitativement la modification décelable survenue dans le produit analytique. On peut avoir recours à divers procédés d'étalonnage pour contrôler l'analyse. Par exemple, on peut déposer une solution étalonnée de référence sur une plage contiguë à celle qui reçoit la goutte de l'échantillon à analyser, de manière à permettre ensuite des mesures différentielles.

Les exemples suivants illustrent l'invention. Le premier exemple décrit la synthèse d'un polymère protecteur d'alcalinité utilisé suivant l'invention. Le deuxième exemple décrit les résultats obtenus lors de l'essai parallèle antérieurement dé-5crit, au cours duquel on évalue l'aptitude d'une série de polymères comme protecteurs d'alcalinité.

Exemple 1

Synthèse d'un copolymère d'acrylamide et de N-vinyl-2-pyr-îorolidone dont le rapport en masse des monomères est 50:50.

A 2700 ml d'eau distillée, on ajoute 900 g d'alcool dénaturé, 200 g d'acrylamide et 200 g de vinylpyrrolidone. On fait passer dans la solution un courant d'azote et on chauffe à 60°C dans un ballon à fond rond muni d'une arrivée de N2, îsd'un réfrigérant à reflux et d'un agitateur. On ajoute ensuite à cette solution de monomères une solution constibuée de 6 g de 2,2'-azobis-(2-méthylpropionitrile) dans 60 ml d'acétone pour amorcer la polymérisation. On chauffe pendant 16 h à 60°C. La solution visqueuse limpide obtenue présente une vis-2ocosité in situ de 125 mPl pour une teneur en matières solides de 108/1000. La viscosité inhérente mesurée dans le NaCl IN sur le polymère isolé est de 0,94.

Exemple 2

25 Essai parallèle concernant l'aptitude de certains polymères comme protecteurs d'alcalinité.

Dans cet exemple, on procède à des essais sur l'aptitude, comme protecteurs d'alcalinité, de six polymères en ayant recours à l'essai parallèle précédemment décrit. Les six poly-30 mères sont les suivants:

Polymère n° 1 - Copolymère d'acrylamide et de N-vinyl-2-pyrrolidone de l'exemple 1.

Polymère n° 2 - Copolymère d'acrylamide et de 2-hydr-oxyéthyl acrylate (rapport en masse des 35 monomères, 50:50).

Polymère n° 3 - Poly(acrylate) de 2-hydroxyéthyle.

Polymère n° 4 - Polyacrylamide.

Polymère n° 5 - Polyvinylpyrrolidone vendue aux E.U.A.

sous la dénomination «K-90 polymer» par G.A.F. Corp.

Polymère n° 6 - Produit vendu aux E.U.A. sous la dénomination «Sea Plaque Agarose» par Marine Colloids, Inc.

Les résultats sont représentés au graphique de la figure 1. 45 D'après ce graphique, on voit que le polymère n° 1 présente une excellente aptitude comme protecteur d'alcalinité pendant toute la période d'essai de 8 jours, alors que les polymères n° 2 et 3 n'ont qu'un aptitude très médiocre comme protecteurs d'alcalinité. Comme le montre la figure 1, les 50 compositions contenant les polymères n° 2 et 3 ont une faible teneur en alcali immédiatement après le séchage. On pense que la faible aptitude des polymères de ces compositions comme protecteurs d'alcalinité est due à la présence de sites d'hydrolyse dans les groupes esters de ces polymères qui peu-55 vent être hydrolysés par l'alcali. On voit sur la figure 1 que les polymères n° 4 et 5 présentent une aptitude correcte comme protecteurs d'alcalinité au cours de la période d'essais de 8 jours. Comme le montrent les courbes de la figure 1, on continue les essais avec les polymères n° 1 à 5 au-delà de la période 60 de 8 jours.

Dans un essai distinct, on prépare une composition de couchage identique à celle utilisée pour essayer les polymères n° 1 à 5, sauf qu'on utilise un sixième polymère, en l'occu-rence le produit vendu aux Etats-Unis d'Amérique sous la 65 dénomination «Sea Plaque Agarose» par Marine Co-loids, Inc. On fait l'essai à l'aide de ce produit en suivant une procédure analogue à celle de l'essai parallèle précité et on constate que ce polymère présente une excellente aptitude comme pro40

tecteur d'alcalinité. Sur le graphique, la ligne brisée indique simplement que l'aptitude du polymère n° 6 comme protecteur d'alcalinité n'a pas fait l'objet d'un essai au cours de la période couverte par cette ligne brisée. On continue aussi au-delà de la période de 8 jours l'essai avec le polymère n° 6.

Exemple 3

Produit analytique composite pour le dosage des protéines.

Cet exemple concerne un produit analytique composite comprenant à la fois un polymère protecteur d'alcalinité et un réactif amélioré du biuret suivant l'invention. On prépare le produit composite de la manière suivante. Sur un support de polytéréphtalate d'éthylèneglycol, on applique, d'une part, une couche analytique comprenant, comme polymère protecteur d'alcalinité, de l'agarose à raison de 16,0 g/m2 et, en outre, 10,8 g/m2 de CuS04.5H20,5,4 g/m2 de LiOH, 8,0 g/m2 d'acide tartrique et, d'autre part, une couche d'étendage constituée de particules de cellulose microcristalline, en l'occurrence le produit vendu aux Etats-Unis d'Amérique par F.M.C. Corp. sous la dénomination commerciale «Avicel», à raison de 64,5 g/m2 et de polyvinylpyrrolidone à raison de 1,6 g/m2.

On fait une série d'essais colorimétriques avec des produits ayant la structure ci-dessus. Sur chaque produit, on dépose sur le produit analytique une goutte d'une solution aqueuse à 37°C contenant une quantité connue de protéine, en l'occurrence d'albumine, comprise entre 2/100 et 12/100 en masse par unité de volume, et on mesure chaque fois le changement de la densité par réflexion (DR), en utilisant un rayon lumineux qui traverse un filtre interférentiel à 540 nm, puis le support du produit et est ensuite réfléchi à travers ce support par la couche d'étendage. On observe pendant une période de temps allant de 0 à 7 mn, la DR de chaque produit à la suite du dépôt sur celui-ci de l'échantillon particulier contenant de l'albumine. On constate que l'évolution de la coloration provoquée dans la couche d'étendage du produit par la réaction du biuret est très rapide. La réaction provoquée par un échantillon contenant de 2/100 à 7/100 (en masse par unité de vo-

9 644 454

lume) de protéine est terminée en moins d'une minute. Pour une teneur en protéine supérieure à 7/100, la durée de la réaction est de 7 mn environ. On a consigné au Tableau I les valeurs de Dr après 7 mn pour chaque échantillon testé.

5

Tableau I

Teneur de l'échantillon en protéine DR

(en masse par unité de volume) (540 nm)

2/100 0,10

10 4/100 0,20 6/100 0,37 7/100 0,42 8/100 0,58

10/100 0,64

i512/100 0,68

Exemple 4

Stabilité d'un agent alcalinisant ne contenant pas de sodium.

20 Pour mettre en évidence certaines améliorations et certains avantages de l'invention, on prépare deux produits identiques à celui de l'exemple 3; mais à l'un des produits, qui sert de témoin, on incorpore de l'hydroxyde de sodium, au lieu d'hydroxyde de lithium comme agent alcalinisant. On fait une 25 série d'essais comme à l'exemple 3 avec chacun de ces produits, en utilisant des solutions aqueuses dont la teneur en protéine est comprise entre 2/100 et 10/100 en masse par unité de volume. On mesure DR pour chaque produit immédiatement après sa fabrication, puis après conservation pendant 18 3o jours à 21 °C et 50% d'humidité relative. On a consigné au Tableau II les valeurs de DR. D'après ce tableau, il apparaît clairement qu'avec le produit analytique suivant l'invention qui contient de l'hydroxyde de lithium et est exempt d'ions sodium, les valeurs de DR sont tout à fait stables après 18 jours 35 de conservation. En revanche, sur le produit témoin contenant de l'hydroxyde de sodium on observe une perte considérable de sensibilité après avoir une conservation pendant 18 jours.

Tableau II

Produit

Produit avec

LiOH

do.

Produit témoin avec NaOH

do.

Teneur en protéine (en masse par unité de volume)

25/1000 50/1000 75/1000 100/1000

Dr mesurée immédiatement après la fabrication du produit

0,19 0,32 0,58 0,85

0,13 0,32 0,51 0,70

DR

mesurée après 18 jours de conservation

0,16 0,27 0,55 0,74

0,13 0,18 0,22 0,26

Exemple 5

Produit analytique composite pour le dosage des protéines.

On prépare un produit composite comme à l'exemple 3, mais on remplace l'agarose, qui dans l'exemple 3 est le polymère protecteur d'alcalinité, par un copolymère d'acrylamide" et de N-vinyl-2-pyrrolidone comme à l'exemple 1. Par le mode opératoire décrit à l'exemple 3, on fait des mesures en utilisant des solutions de sérum dont la teneur en protéine est comprise entre 4/100 et 12/100 en masse par unité de volume et on obtient de bons résultats. En raison de la linéarité amé-ôoliorée des résultats obtenus avec ce produit, on considère même que, dans l'ensemble, les propriétés de celui-ci sont supérieures à celles du produit de l'exemple 3. En outre, on constate que le copolymère précité confère à la couche analytique une meilleure adhérence et une meilleure aptitude à se 65 former en couche.

C

1 feuille dessins

Claims

644454

REVENDICATIONS

1. Produit analytique pour la détection d'un constituant dans un liquide aqueux et comprenant:

1) une zone de distribution ou d'étalement de ce constituant, associée à

2) un réactif fournissant une modification décelable dans le produit par suite d'une réaction avec le liquide, caractérisé en ce qu'il contient, en outre, un agent alcalinisant stable, exempt d'ion sodium, constitué essentiellement d'un mélange:

(a) d'un alcali en quantité suffisante pour engendrer un pH supérieur à 12,0 dans le produit, dans les conditions d'utilisation, et

(b) d'un polymère protecteur d'alcalinité.
2. Produit selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'alcali est choisi dans la classe constituée par l'hydroxyde de lithium, l'hydroxyde de calcium et les mélanges de ceux-ci.
3. Produit selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le polymère protecteur d'alcalinité est choisi dans la classe constituée par l'agarose, le Polyacrylamide et les polymères comprenant des motifs dérivés de la vinylpyrrolidone.
4. Produit conforme à la revendication 3, caractérisé en ce que le polymère est formé par des motifs monomères comprenant de 20% à 80% en masse de vinylpyrrolidone et de 80% à 20% en masse d'acrylamide.
5. Produit selon l'une des revendications I à 4, caractérisé en ce que l'agent alcalinisant comprend de 2 à 5 parties en masse de polymère pour une partie d'alcali.
6. Produit selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend une zone d'étalement, une zone analytique en relation d'échange de fluide avec la précédente et au moins un réactif analytique actif à un pH supérieur à 12,0.
7. Produit selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend deux couches superposées, en relation d'échange de fluide, à savoir:

(a) une couche d'étalement et

(b) une couche analytique contenant le réactif.
8. Produit selon l'une des revendications 1 à 7, pour le dosage d'une protéine dans un liquide aqueux, caractérisé en ce qu'il comprend un support transparent aux radiations et, sur ce support,

1) une zone d'étalement transparente aux radiations;

2) une zone analytique, en relation d'échange de fluide avec la précédente et contenant un réactif du biuret, exempt d'ion sodium et constitué essentiellement d'un sel cuivrique soluble dans l'eau, d'un précurseur d'agent de chélation du cuivre et d'un agent alcalinisant, stable, comprenant:

(a) un alcali en quantité suffisante pour permettre la réaction du sel cuivrique avec la protéine avec production d'un modification décelable par radiométrie dans les conditions d'utilisation, et

(b) un polymère protecteur d'alcalinité.
9. Produit pour le dosage d'une protéine dans un fluide aqueux, selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend, sur un support transparent aux radiations:

1) une couche d'étalement perméable au liquide aqueux,

2) une couche analytique, disposée entre le support et la couche d'étalement et qui comprend un réactif à base de biuret exempt d'ion sodium, constitué essentiellement d'un mélange d'un sel cuivrique soluble dans l'eau, d'acide tartrique et d'un agent alcalinisant stable comprenant:

(a) un alcali en quantité suffisante pour permettre la réaction entre la protéine et le sel cuivrique,

(b) un polymère protecteur d'alcalinité.
10. Produit selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'agent alcalinisant comprend un mélange d'hydroxyde de lithium et d'un polymère choisi dans la classe constituée par l'agarose et les polymères de vinylpyrrolidone.
11. Produit selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisé en ce que la couche d'étalement comprend une substance non-fibreuse.
12. Procédé pour la détection d'un constituant d'un li-

5 quide aqueux, caractérisé en ce qu'on met un échantillon de ce liquide en contact avec un produit conforme à l'une des revendications 1 à 11, de façon à former dans ce produit une modification décelable, dont on fait ensuite l'évaluation.

• 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce 10 que l'on fait l'analyse d'une protéine dans un liquide aqueux en produisant une modification de coloration par suite d'une réaction entre un échantillon de ce liquide et un réactif du biuret et en ce qu'on évalue cette modification.

15