"Composition, détecteur et méthode pour la recherche
d'un composant dans un échantillon" La présente invention concerne la recherche d'un composant dans un échantillon d'essai, par une méthode analytique dans laquelle un système réactionnel engendre, par contact avec ledit composant, une réponse qui peut être décelée et ladite réponse cesse d'être produite après qu'une période prédéterminée s'est écoulée.
La physique et la chimie appliquées au diagnostic ont progressé à une vitesse prodigieuse au cours des vingt-cinq dernières années, si bien que, en particulier dans le domaine de la médecine, l'étude des divers paramètres d'un organisme peut être effectuée rapidement, avec une incroyable facilité.
Par exemple, le diagnostic médical a progressé en ce sens que de nombreuses fonctions corporelles peuvent être étudiées en plongeant simplement un support chargé d'un réactif dans un échantillon de liquide corporel tel que l'urine et en observant une réponse décelable telle que le développement d'une couleur ou l'apparition d'un changement de couleur, ou bien un changement dans la quantité de lumière réfléchie par le support ou absorbée par ce dernier.
De nombreuses méthodes chimiques de détection des composants d'un liquide corporel ont découlé de ces méthodes d'immersion et lecture. La plupart de ces méthodes chimiques produisent une réponse qu'on peut déceler et qui est quantitative ou tout au moins semi-quantitative. Ainsi, en mesurant la réponse après une période prédéterminée, on peut obtenir, non seulement une indication positive de la présence d'un constituant particulier d'un liquide corporel, mais aussi une estimation de la quantité de ce constituant qui est présente. Par conséquent,
ces supports à réactifs constituent pour le médecin un outil pratique de diagnostic, tout en lui permettant d'estimer le degré de maladie ou de trouble physiologique.
Des exemples de ces "supports" en usage courant sont les produits de la filiale Ames Company de la firme Miles Laboratories, Inc., vendus sous les marques déposées "CLINISTIX", "MULTISTIX" , "KETOSTIX", "N-MULTISTIX", "DIASTIX", "PHENISTIX",
"DEXTROSTIX", etc. Les détecteurs analytiques de ce type comprennent, ordinairement, un ou plusieurs supports, par exemple en papier absorbant, qui sont imprégnés d'un système réactionnel particulier qui manifeste respectivement un changement de couleur ou l'apparition d'une couleur en présence d'un composant particulier dans l'échantillon d'essai. Selon le système réactionnel spécifique incorporé à un support particulier, ces détecteurs peuvent déceler la présence de glucose, d'albumine, de cétones, de bilirubine, de sang occulte, de nitrite, d'urobilinogène, la concentration en ion hydrogène (pH), etc.
L'apparition spécifique d'une couleur et l'intensité avec laquelle on peut l'observer dans un intervalle particulier de temps après la mise en contact de la bande de support avec l'échantillon donnent respectivement une indication sur la présence d'un composant particulier et sur sa concentration dans l'échantillon. Certains de ces détecteurs analytiques et de leurs systèmes réactionnels sont décrits dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique N[deg.] 3 123 443 ("CLINISTIX"),
N[deg.] 3 212 855 ("KETOSTIX"), N[deg.] 3 814 668, N[deg.] 3 164 534 et
No 2 981 606 ("DIASTIX") et N[deg.] 3 092 465, N[deg.] 3 298 789,
N[deg.] 3 164 534 précité et N[deg.] 2 981 606 précité ("DEXTROSTIX").
Les détecteurs destinés au diagnostic, tels que les bandes "immersion-lecture" portant un réactif sont ordinairement accompagnés d'instructions imprimées détaillées, qui doivent être soigneusement suivies pour que la précision reste assurée. Lorsque la réponse qui peut être décelée est un changement de couleur, un soin particulier est requis. Une échelle de diverses couleurs
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attendu que dans la plupart des cas, l'analyse quantitative que permet le détecteur est basée sur la détermination du degré de formation d'une couleur en fonction du temps, il s'impose que la variation de couleur puisse être comparée avec l'échelle dans un intervalle prédéterminé de temps après que le détecteur a été plongé dans l'échantillon. On doit s'en tenir avec précision aux périodes d'attente ; une lecture trop hâtive s'accompagne d'un trop faible développement de la couleur et une lecture trop tardive a pour conséquence un développement trop intense
de la couleur ou même l'apparition d'une couleur auxiliaire intermédiaire. Dès lors, si le développement d'une couleur est comparé trop top ou trop tard avec la gamme colorée, on peut ob-tenir et on obtient souvent un résultat dépourvu de précision.
En vue d'éliminer le critère de précision de la lecture que constitue le facteur temps, qui est peu pratique et qui comporte un risque d'imprécision, de nombreuses recherches ont été entreprises afin de parvenir à éliminer la nécessité de tenir compte du temps dans la lecture des détecteurs analytiques antérieurs. On a tenté d'obtenir principalement que la production d'une réponse décelable s'arrête automatiquement au bout d'un temps prédéterminé et que la réponse reste constante pendant
des périodes d'attente relativement longues. Ainsi, une comparaison avec une gamme colorée pourrait être effectuée à la convenance de l'utilisateur ou à un moment qui se situe bien après le contact réel du détecteur avec l'échantillon. Pendant longtemps, dans le domaine de la chimie des réactifs destinés au diagnostic, il a été unanimement reconnu que de tels détecteurs feraient réaliser un progrès considérable à la technique. Pourtant, à l'heure actuelle, il n'a été proposé aucun détecteur capable d'apporter la solution depuis longtemps attendue. Celui de la présente invention est donc le premier.
En bref, la présente invention concerne une composition analytique, un détecteur et son procédé de préparation, et une méthode de détection de la présence d'un composant dans un échantillon. La composition comprend un système réactif qui agit avec le composant, par contact, pour produire une réponse qui peut être décelée, et un système inhibiteur qui, par contact avec l'échantillon, interrompt l'interaction du système réactif avec le composant à l'expiration d'une période prédéterminée. LE/détecteur consiste en un support auquel la composition analytique est incorporée.
La méthode de détection de la présence d'un composant dans un échantillon consiste à faire entrer un échantillon à analyser, susceptible de contenir le composant, en contact avec un support auquel la composition analytique est incorporée, à faire incuber le support contenant la composition et l'échantillon à analyser pendant une période prédéterminée, et à observer une réponse décelable.
La présente invention concrétise de nombreuses formes de la chimie diagnostique, par exemple des systèmes réaction-nels actuellement en usage, tels que des indicateurs de pH et d'autres indicateurs de concentration ionique, et des systèmes réactifs plus complexes tels que ceux que l'on utilise pour la recherche de composants dans les liquides corporels. Ces formes de réalisation conviennent très bien pour les concepts à la base de la présente invention et sont compatibles avec eux. Ainsi,
les détecteurs diagnostiques déjà existants, pour la recherche du sang occulte, du glucose, de la bilirubine, de l'azote de l'urée sanguine, de l'urée d'origine bactérienne, de l'urobilinogène,
du cholestérol, des protéines, etc., peuvent tous être modifiés conformément à l'enseignement de la présente invention.
La nouveauté de l'invention réside dans l'application avantageuse de systèmes réactifs connus ou nouveaux,de telle manière que l'interaction entre l'un de ces systèmes et le composant de l'échantillon cesse après un intervalle de temps prédéterminé. On constate ainsi que le quantum de réponse décelable est fixe pour tout système réactif donné: une couleur développée au cours de l'interaction ne gagne ni ne perd en intensité ; la quantité d'un produit sensible à la lumière ultraviolette formé ou consommé dans cette interaction reste constante.
Les effets mentionnés ci-dessus peuvent être produits de diverses façons. On choisit avantageusement un système inhibiteur qui s'oppose physiquement à toute poursuite de l'interaction par formation d'un gel ou d'un polymère ou par production d'un durcissement superficiel, de manière à interdire le contact physique entre le système réactif et le composant après expiration de l'intervalle de temps prédéterminé. Une autre possibilité consiste à pourvoir la composition analytique d'un système inhibiteur qui désactive le système réactif. Ainsi, lorsque la présence d'un enzyme thermolabile est déterminante pour le fonctionnement du système réactif, le système inhibiteur peut revêtir
la forme d'un agent thermogène qui élève la température de la composition analytique à un point suffisant pour désactiver l'enzyme après l'expiration de l'intervalle de temps prédéterminé.
Il est encore possible de prévoir un système inhibiteur qui empoisonne un ou plusieurs composants du système réactif ou interfère chimiquement avec.ce ou ces composants, en supprimant
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tervalle de temps prédéterminé. Ces systèmes inhibiteurs, ainsi que d'autres, entrent dans le cadre de la présente invention, le facteur principal étant l'aptitude du système inhibiteur à permettre l'interaction entre le système réactif et le composant au moment du contact entre l'échantillon et la composition analytique, à condition d'interdire cette interaction à un certain moment ultérieur prédéterminé.
De nombreuses possiblités existent lorsqu'on désire
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système réactif/composant, c'est-à-dire un système inhibiteur qui durcit ou se gélifie. Parmi les matières gélifiables ou durcissables que l'on peut utiliser, on mentionne celles qui réagissent rapidement à la température ambiante et qui commencent à réagir ou dont la réaction est déclenchée par contact avec l'échantillon à analyser. Ces compositions inhibitrices doivent durcir ou se gélifier à une vitesse suffisante pour inhiber la production d'une réponse décelable lorsqu'une période relativement courte s'est écoulée. Il est tout aussi désirable que l'inhibiteur gélifié ou durci empêche ou prévienne d'autres changements de
la couleur ou une autre dissipation de la réponse qui peut être décelée.
Des exemples représentatifs de ces systèmes inhibiteurs comprennent des polymères hydrosolubles polymérisables ou réticulables, des mélanges époxyde/polyamine, des polyisocyanates réagissant avec l'eau, des esters acryliques et acryliques substitués polymérisables par l'ion hydroxyle, des mélanges d'alcool polyvinylique avec divers composés métalliques (par exemple borates, vanadates, Cr (III) et Ti (IV)), le sel de sodium de la carboxyméthylcellulose et Al (III), des mélanges d'alcool polyvinylique avec des composés polyphénoliques (par exemple résorcinol, catéchol, phloroglucinol , ainsi que des colorants et des sels de diazonium), un mélange d'alcool polyvinylique et de diméthylolurée avec du chlorure d'ammonium
(catalyseur),
des mélanges de diméthylolurée avec une hydroxyalkylcellulose et des copolymères d'anhydride maléi.que hydrolysé ou l'acide polyacrylique, des mélanges d'alcools polyvinyliques et d'un composé polyaldéhydique, des complexes de polyvinylpyrrolidone (c'est-à-dire des complexes formés avec des substances telles que des acides polycarboxyliques, un copolymère d'éther
de méthyle et de vinyle et d'anhydride maléique produit par
la firme GAF Corporation, ou un acide polyacrylique), des mélanges d'un copolymère acide et de polyéthylène-glycol et des mélanges d'alcools polyvinyliques avec des agents précipitants(tels que Na2C03, Na2S04 ou K2S04).
La polymérisation ou la réticulation du polymère hydrosoluble peut être retardée en isolant les amorceurs de.réaction du polymère hydrosoluble jusqu'à ce que la composition analytique soit entrée en contact avec l'échantillon à analyser. Pour réaliser cette séparation du polymère et de l'amorceur, il est possible d'encapsuler ce dernier dans des capsules microscopiques solubles dans l'eau ou dans des capsules microscopiques qui se rompent par contact avec l'humidité. Par conséquent, des capsules microscopiques de gélatine renfermant l'amorceur peuvent se dissoudre par contact avec un échantillon aqueux à analyser, en libérant ainsi l'amorceur déclenchant la formation du polymère hydrosoluble.
Des microcapsules qui se rompent en s'humidifiant ont des parois membraneuses semi-perméables fragiles vis-à-vis de l'osmose, qui encapsulent une phase aqueuse contenant l'amorceur. La phase aqueuse a une densité relativement élevée par rapport à l'échantillon à analyser. Lorsque les capsules entrent en contact avec cet échantillon, un gradient osmotique s'établit et/travers
de la membrane et provoque une élévation de la pression dans
la capsule, à un degré suffisant pour rompre ses parois et libérer ainsi l'amorceur.
L'inhibition physique réalisée en séparant le système réactif du composant peut aussi être obtenue avec un système inhibiteur comprenant un époxyde et une source de polyamines désactivées, qui donne des polyamines disponibles par contact avec l'eau. Des exemples représentatifs de ces sources de poly-
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prégnés d'une polyamines Dans le premier cas, la cétimine réagit avec l'eau pour former une polyamine et une cétone. Dans l'autre cas, l'eau est capable de pénétrer dans le réseau du tamis moléculaire et d'en déplacer la polyamine.
A titre de variante, on peut incorporer à la composition analytique un polyisocyanate capable de mousser avec l'eau tel que le produit "Hypol", de la Dewey and Almy Chemical Division de
la firme W.R. Grace & Co.
Parmi les systèmes inhibiteurs acryliques catalysés
par l'ion basique ou hydroxyle, les esters 2-cyanacryliques s'appliquent particulièrement bien à la présente invention. Ces esters sont des composants essentiels d'adhésifs produits par la firme Eastman Kodak Company et ils se polymérisent rapidement en présence d'eau en donnant des polymères durs. Les esters méthyliques et éthyliques sont les principaux esters disponibles dans les formulations d'adhésifs du commerce, par exemple celles de la firme Kodak, les adhésifs contenant des agents stabilisants et des agents épaississants en plus des esters. Le 2-cyanacrylate de méthyle
est contenu dans le produit "Eastman 910" et le 2-cyanacrylate d'éthyle est le principal ester du produit "Eastman 910 EM".
L'alcool polyvinylique, en mélange avec l'acide borique, se gélifie rapidement en présence d'une base alcaline telle que l'hydroxyde de sodium et on peut donc l'utiliser avantageusement comme système inhibiteur. Un procédé avantageux d'utilisation
de cette variante consiste à incorporer la base alcaline dans la composition analytique sous la forme de microcapsules hydrosolu� bles ou fragiles du point de vue osmotique. Ainsi, au contact
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système inhibiteur sont combinés et la formation d'un gel interrompt l'analyse.
Outre le fait qu'on peut l'utiliser avec le borax
(acide borique et base alcaline), l'alcool polyvinylique se gélifie également avec divers autres ions et sels métalliques parmi lesquels on mentionne des vanadates, le chrome trivalent et le titane tétravalent. Par exemple, l'oxalate de potassium
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vinylique forme des gels thermiquement réversibles avec des composés polyphénoliques tels que le résorcinol, le catéchol, le phloroglucinol et certains colorants et sels de diazor.ium.
L'alcool polyvinylique est en outre intéressant à utiliser dans la présente invention du fait de son aptitude
à se réticuler en passant par le stade intermédiaire d'un acétal avec la 1,3-bishydroxyméthylurée (diméthylolurée) et les composés apparentés, en présence du chlorure d'ammonium. Comme dans beau-
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peut être isolé par exemple par formation de capsules microscopiques.
Des aldéhydes polyfonctionnels réagissent également avec l'alcool polyvinylique en formant des groupes acétal de réticulation. Dans cette technique, un catalyseur acide tel que l'acide oxalique ou un autre acide compatible avec le système réactif est incorporé à la composition analytique et ltaldéhyde est isolé de l'alcool polyvinylique, par exemple par formation de capsules microscopiques. Naturellement, on peut isoler l'acide au lieu de l'aldéhyde, à condition que ce dernier soit suffisamment inerte envers l'alcool polyvinylique en l'absence du catalyseur.
Des précipités polymères se sont montrés intéressants à utiliser dans la présente invention comme système inhibiteur. Ils sont illustrés par la précipitation de l'alcool polyvinylique dans sa solution, par des sels tels que Na2C03, Na2S04 et K2S04. En outre, les acides polymères tels que l'acide polyacrylique peuvent être précipités en solution ou gélifiés par des sels d'acide acétique de métaux lourds ou par d'autres sources hydrosolubles d'ions divalents, de même que par le polyéthylèneglycol.
L'hydroxypropylcellulose ("KLUCEL", de la firme Hercules, Inc.) est un autre polymère qui peut constituer le système inhibiteur de la composition analytique de la présente invention. Cette substance peut être réticulée avec des polymères acides
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diméthylolurée, de préférence à un pH faible.
Un autre système gélifiant intéressant à utiliser dans la composition analytique est le sel de sodium de la carboxyméthylcellulose et l'ion aluminium trivalent.
Le produit "GANTREZ" AN, copolymère d'éther de méthyle et vinyle et d'anhydride maléique de la firme GAF, peut être utili-
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invention. Ce produit forme un complexe insoluble avec la polyvinylpyrrolidone à un pH inférieur à environ 5. L'acide polyacrylique se comporte de la même manière que le produit "GANTREZ" AN avec la polyvinylpyrrolidone. Le produit "GANTREZ" AN forme également un complexe insoluble avec la gélatine, en solution acide. De même, le produit "GANTREZ"AN et d'autres polymères et copolymères acides sont précipités par des composés tels que des glycols, l'alcool polyvinylique, une hydroxyalkylcellulose et des diamines.
Comme indiqué ci-dessus, d'autres systèmes inhibiteurs peuvent être intéressants à utiliser dans le cadre de la présente invention. Ainsi, on peut utiliser un système inhibiteur différent de ceux qui séparent physiquement le système réactif du composant à analyser. Par exemple, un enzyme qui est thermolabile n'agit pas dans un système réactif si la température du système s'élève suffisamment pour le désactiver. En conséquence, une composition analytique contenant un tel enzyme peut être
rendu incapable de produire une réponse décelable après un intervalle prédéterminé de temps par l'utilisation d'un système inhibiteur engendrant de la chaleur.
De même, le système inhibiteur peut constituer un poison pour le système réactif. Par exemple, des enzymes contenant des groupes mercapto (-SH) sont désactivés par le mercure divalent et des enzymes en général sont désactivés en présence d'acides forts et de bases fortes, par exemple l'acide chlorhydrique et l'hydroxyde de sodium. Des exemples d'enzymes qui sont inhibés
par Hg(II) comprennent la glutamate-décarboxylase, la lactatedéshydrogénase, la malate-déshydrogénase, la myokinase, la phosphatase alcaline, la phosphatase acide (pH 5,2), l'aldéhydeoxydase, la diaminoacide-oxydase, la bêta-amylase, l'anhydrase carbonique, la cholinestérase, l'alpha-glucosidase, la bêtaglucuronidase, l'homogentisate-oxydase, la 3-hydroxyanthranilate-oxydase et l'invertase. Ainsi, la présente invention couvre l'incorporation de ces systèmes inhibiteurs à la composition analytique.
Des enzymes thermolabiles tels que la salicylate-hydroxylase entrent également dans le cadre de la présente invention. Les substances qui produisent de la chaleur par contact avec un
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les aluminium-alkyles, etc.
On parvient à retarder la dénaturation ou ltempoisonnement d'un enzyme en isolant le système inhibiteur thermogène ou contaminant à l'aide de microcapsules. Ainsi, on peut choisir
des matières hydrosolubles d'encapsulage de telle sorte que les substances thermogènes ne soient pas exposées à l'échantillon avant que la matière d'encapsulage n'ait été dissoute. On peut utiliser avantageusement pour l'encapsulage des matières hydrosolubles telles que la gélatine, des acrylamides, des copolymères de styrène et d'acide maléique, l'hydroxypropylcellulose et
des mélanges tels qu'un coacervat de gélatine et de polymères naturels ou synthétiques.
Comme on l'a indiqué ci-dessus, des microcapsules de diamètre variable conviennent très bien pour la présente invention lorsque des ingrédients doivent être séparés temporairement. On peut les préparer par divers procédés bien connus. On mentionne,
à titre d'exemple, le procédé décrit dans "Angew. Chem. Internat. Edit.", 14:539 (1975) et dans les références bibliographiques
qui y.sont citées. Des techniques telles qu'une polycondensation interfaciale, une coacervation, etc., produisent des microcapsules. D'autres techniques telles que la centrifugation, le séchage par pulvérisation, ainsi que d'autres techniques physicomécaniques peuvent être utilisées de même dans la préparation des microcapsules.
La polycondensation interfaciale est un procédé avantageux pour la préparation des microcapsules, à cause de sa relative facilité. Dans cette technique, deux substances réactives différentes (comonomères ou oligomères) sont amenées à réagir à l'interface d'un système formé de plusieurs phases.
Il s'y produit une polycondensation, avec formation d'une mince pellicule de polymère, qui est insoluble dans les milieux contenant les monomères. Des microcapsules convenables, douées de fragilité osmotique ont été préparées par dissolution d'un premier composant comonomère, tel qu'une amine polyfonctionnelle, dans une phase aqueuse contenant la substance à isoler. Cette phase aqueuse est de préférence douée d'une grande densité ou d'une grande osmolalité par rapport à la gamme présumée d'osmolalité de l'échantillon à analyser. Elle est ensuite dispersée ou émulsifiée dans une phase non miscible à l'eau telle qu'une huile minérale. Un second comonomère, tel qu'un halogénure acylique polyfonctionnel, est ensuite ajouté à la suspension ou à l'émulsion.
Lorsque les comonomères sont des amines et des halogénures acyliques polyfonctionnels, il est formé des microcapsules polyamidiques, contenant chacune une portion de -La phase aqueuse, c'est-à-dire la substance isolée.
Une matière polymère convenable intéressante à utiliser pour former la membrane semi-perméable douée de fragilité osmotique des micro-capsules peut aussi être un polyester, un polyuréthanne, une polyurée, etc., en plus d'un polyamide.
Une autre façon de séparer des ingrédients du système inhibiteur, lorsque l'un des ingrédients est soluble dans l'eau et l'autre dans des solvants organiques, consiste à utiliser
un procédé de "double immersion". Ainsi, le support d'un détecteur analytique est tout d'abord imprégné d'une solution aqueuse d'un ingrédient, séché puis imprégné d'une seconde solution de l'autre ingrédient dans un solvant organique.
Dans certaines des systèmes inhibiteurs décrits cidessus, ne nécessitant pas la séparation des ingrédients, par exemple dans les systèmes qui utilisent des 2-cyanacrylates, des isocyanates capables de mousser en présence d'eau et des réactifs du type époxyde, on doit soigneusement exclure l'humidité, tant pendant la préparation de la composition et du détecteur d'essai que pendant la conservation, avant l'application finale. Ainsi, la polymérisation du système inhibiteur est rendue impossible
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Des systèmes inhibiteurs gélifiables ou durcissants, par exemple certains de ceux qui ont été mentionnés ci-dessus,
en association avec un système réactionnel désiré, peuvent être incorporés au support par tout moyen convenable pour produire
le détecteur analytique de la présente invention. Ainsi, un support peut être plongé dans une solution unique de tous les ingrédients du système réactionnel et du système inhibiteur. A titre de variante, lorsqu'une méthode de "double immersion" est requise par suite de la nécessité d'isoler des ingrédients, le support est alternativement plongé, séché et plongé de nouveau comme décrit ci-dessus. Lorsqu'on utilise des microcapsules, on peut
les fixer au support en utilisant des liants. Parmi les liants qui se sont montrés particulièrement avantageux à utiliser, on mentionne l'acétate de cellulose, l'acétobutyrate de cellulose, l'hydroxypropylcellulose et la polyvinylpyrrolidone. Les liants ne doivent pas être miscibles à l'échantillon à analyser et l'échantillon doit pouvoir être fixé par absorption dans le support.
Des matières que l'on peut utiliser avantageusement pour former le support du détecteur analytique comprennent le papier, la cellulose, le bois, des voiles de résine synthétique, la fibre de verre et d'autres papiers synthétiques, un feutre
de polypropylène, des étoffes tissées et non tissées, etc.
Le support est avantageusement fixé par tous moyen convenables
à un substrat classique tel qu'une bande en matière polymère, pour en faciliter l'utilisation.
Pour utiliser le détecteur analytique, on plonge dans l'échantillon à analyser le support auquel le système réactionnel et le système inhibiteur ont été incorporés. On laisse s'écouler l'intervalle prédéterminé de temps qui convient pour
le détecteur, puis on analyse la réponse de ce dernier. Lorsque la réponse est une coloration ou un changement de couleur, on peut comparer le détecteur à une gamme colorée de référence.
Si la réponse se traduit par une variation de réflexion de la lumière, le détecteur est examiné dans un instrument photométrique convenable du type bien connu dans la pratique.
D'autres détails de la présente invention sont donnés dans les exemples suivants. Il y a lieu de remarquer toutefois que ces exemples ne correspondent qu'à des formes avantageuses de
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sens qui limiterait le cadre ou la portée de l'invention.
Exemple 1
On prépare et on conserve dans un récipient en verre, bouché de façon étanche, une solution à 10 % en poids dans le chloroforme d.'adhésif "Eastman 910" contenant du 2-cyanacrylate de méthyle (Eastman Chemical Products, Inc.", Kingsport, Tennessee,
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nière indiquée ci-après un détecteur analytique permettant de déterminer la quantité de glucose dans lturine (d'un type ressemblant au détecteur de marque déposée "CLINISTIX"). Des papiers-
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renferme en particulier les ingrédients suivants :
Formulation de "CLINISTRIX" (marque déposée)
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Des portions de ce papier imprégné sont ensuite imprégnées de nouveau avec les solutions décrites ci-dessus. D'autres sont traitées avec du chloroforme seulement, à titre de témoin. Le récipient d'imprégnation est réalisé de manière que le papier puisse y être introduit et en être extrait, mais il est couvert pour réduire l'évaporation du chloroforme, tandis que la solution d'imprégnation en excès peut s'égoutter du papier dans une atmosphère riche en solvant, à l'intérieur de ce récipient. Lorsque le papier a été retiré du bain, on laisse le solvant s'évaporer pendant
10 à 30 minutes à la température ambiante, dans une atmosphère dont l'humidité est limitée (moins de 10 % d'humidité relative).
Le papier imprégné de monomère est conservé à l'obscurité, en atmosphère sèche, puis monté sur un substrat de matière plastique et découpé au format usuel d'un ruban à réactif. Les rubans prêts à l'emploi
sont ensuite conservés dans des bocaux en verre foncé, en présence de gel de silice qui adsorbe l'humidité. On éprouve les rubans ainsi produits en les plongeant individuellement pendant trois secondes dans des échantillons d'urine de concentration connue en glucose (0, 50, 100, 200 et 500 mg/dl), en éliminant l'échantillon en excès puis en les introduisant dans un appareil réflectométrique. Les mesures réflectométriques à 680 nm sont enregistrées en fonction du temps à partir du temps t=15 secondes, y compris le temps d'immersion, pendant 3,5 minutes. Le tableau I reproduit les variations des valeurs de réflectance mesurées par intervalles et les valeurs finales de réflectance pour le papier spécifique du glucose, imprégné avec 10 % de "Eastman 910", aux diverses concentrations en glucose.
La variation de réflectance, après 15 secondes,est la différence par rapport à la valeur de réflectance lorsqu'il n'y
a pas de glucose. On note qu'il n'y a aucune variation de la valeur de réflectance au bout de 2 minutes. Ces couleurs finales peuvent être différenciées nettement à l'oeil nu et leur stabilité persiste pendant des périodes allant de plusieurs jours à plusieurs semaines selon les conditions de conservation.
Les rubans détecteurs qui n'ont été imprégnés que de chloroforme (témoins) développent des couleurs très intenses
dix secondes après l'immersion, mais le développement de couleur se poursuit rapidement et au bout de deux minutes, les rubans sont noirs et aucune différenciation ne peut être faite.
TABLEAU I
Variation de la réflectance en fonction du temps après le contact avec un échantillon
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Exemple 2
Un papier à réactif sensible au glucose, préparé au préalable, est imprégné comme dans l'exemple 1 d'une solution chloroformique contenant 10 % en poids de "Eastman 910 EM" (2cyanacrylate d'éthyle), 1:% (en poids/volume)de détergent solide non ionogène et 0,01 %(en poids/volume) d'acide dicarboxylique solide. Des rubans préparés à partir de ce papier imprégné ont des caractéristiques identiques à celles qui ont été indiquées dans l'exemple 1 et -les rubans, après réaction colorée, on un aspect uniforme particulièrement homogène.
Exemple 3
On prépare un papier à réactif sensible aux cétones,
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en plongeant du papier-filtre "Whatman 3MM" dans le premier mélange d'immersion indiqué ci-après, en le faisant sécher puis en l'immergeant dans le second bain.
1er bain
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Second bain
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Des rubans ainsi préparés sont ensuite imprégnés d'une solution chloroformique contenant 10 % en poids de "Eastman
910 EM" , comme dans l'exemple 1. Des rubans préparés à partir
de ce papier imprégné et testés avec des échantillons d'urine contenant diverses concentrations en acide acétylacétique ont d'excellentes caractéristiques en ce qui concerne le développement de couleur et les intensités de couleur indiquant la concentration en acide acétylacétique de l'urine analysée restent stables.
Exemple 4
Un papier à réactif sensible au glucose est imprégné avec une solution benzénique à 10 % de "Eastman 910", contenant du 2-cyanacrylate de méthyle. Dans la mise à l'essai,
des rubans de ce papier on les excellentes propriétés qui ont
été mentionnées dans les exemples précédents.
Exemple 5
On prépare un système à "immersion unique" à partir de la formulation suivante :
Réactif A
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Réactif B
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Tous les composants du "réactif A" sont broyés dans un mortier à pilon en une poudre fine qui est mise en suspensior dans le "réactif B". Du papier filtre sec, de marque "Whatman" 3MM (de la firme 3M Co., St. Paul, Minn.) est imprégné avec cette suspension et des rubans préparés à partir de ces rubans imprégnés sont expérimentés avec des échantillons d'urine comprenant plusieurs concentrations différentes d'acide acétylacétique. Les intensités de couleur des rubans après réaction
sont stables et sont fonctions de la concentration en acide acétylacétique de l'urine analysée.
Exemple 6
On prépare un réactif indicateur de glucose et une solution d'enzyme, ayant les compositions suivantes :
Réactif indicateur de glucose
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Solution d'enzyme
225 ml de glucose-oxydase
0,842 g de peroxydase
Tous les réactifs indiqués ci-dessus sont mélangés jusqu'à dissolution. Des volumes égaux de cette solution de réactif indicateur, d'urine contenant du glucose et de "Hypol"
2000. sont introduits dans la dépression d'une plaque d'analyse par la méthode des taches et mélangés avec une spatule jusqu'à ce qu'un moussage commence à se produire (environ une minute). Le prépolymère forme une mousse solide colorée en trois à cinq minutes.
Lorsque le système est expérimenté avec de l'urine contenant 0, 100, 250, 500, 1000 et 2000 mg de glucose/dl,
il développe rapidement une coloration stable, et les intensités de couleur correspondent à la concentration du glucose.
Les couleurs finales vont du bleu au vert et au brun selon
la concentration en glucose, et on les compare à des étalons colorés.
Attendu qu'une goutte de "Hypol" 2000 forme assez
de mousse pour remplir la dépression de la plaque d'analyse par la méthode des taches, l'essai peut être effectué sur une goutte d'échantillon d'urine, tout en permettant encore la lecture visuelle.
Exemple 7
Un papier à réactif spécifique des cétones, préparé comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique
<EMI ID=23.1>
10 % de "Hypol" 2000, prépolymère d'uréthanne moussant à l'eau, de la Dewey and Almy Chemical Division de la firme W.R. Grace Co. Cette solution peut contenir, en outre, l'un quelconque
de divers détergents ionogènes à une concentration qui varie entre 1 et 5 % du poids du prépolymère. Des rubans préparés avec ce papier imprégné ont été mis à l'essai avec des urines contenant différentes quantités d'acide acétylacétique et les <EMI ID=24.1>
tes. Ces intensités de couleur sont stables et sont une fonction, facile à apprécier visuellement, de la concentration en acide acétylacétique.
Il ressort de ce qui précède que les concepts de la présente invention peuvent être appliqués, non seulement à
la production de rubans ou de détecteurs analytiques du type
à immersion et lecture, mais tout aussi bien à d'autres formes de réactifs, y compris ceux qui consistent en systèmes liquides.
Exemple 8
On prépare un détecteur pour le dosage de l'urobilinogène dans l'urine en imprégnant tout d'abord du papier-filtre Whatman 3MM avec le mélange suivant :
<EMI ID=25.1>
Le papier est ensuite séché puis imprégné avec une solution à 4 % en poids de polyvinylpyrrolidone dans le chloroforme. Le papier résultant est ensuite séché et monté sur des rubans de polystyrène en vue de l'analyse. On éprouve les rubans à réactif en les plongeant pendant 3 secondes dans des échantillons d'urine de concentrations connues en urobilino-
<EMI ID=26.1>
en deux minutes et on constate qutelles indiquent la concentration en urobilinogène. Cet effet qui se développe dans le temps est réalisé par la formation rapide d'un complexe de copolymère d'éther méthylvinylique/anhydride maléique hydrolysé avec la polyvinylpyrrolidone à un faible pH.
Exemple 9
On prépare un ruban destiné à être utilisé pour dé-celer le sang occulte dans l'urine en imprégnant du papier-filtre "Whatman 3MM" avec la solution suivante :
<EMI ID=27.1>
Après avoir séché le papier, on l'imprègne encore avec une solution à 1 % en poids de "Eastman" 910EM dans le chloroforme. Les rubans préparés à partir de ce papier, dans un essai portant sur des échantillons d'urine contenant des quantités connues d'hémoglobine (0, 0,016, 0,064, 0,16, 0,80 mg/dl) développent en deux minutes des couleurs remarquablement stables, dont l'intensité est une fonction de la concentration en hémoglobine.