CS214658B2 - Prostředek pro zjišťování přítomnosti složky ve zkoušeném vzorku - Google Patents

Description

Vynález ss týká analýzy složky ve zkoušeném vzorku, při níž reakční systém vytváří snímáte lnou odezvu při styku se složkou a přičemž vytváření zjistitelné odezvy přestává po uplynutí předem stanovené časové periody.

Pole fyzikální a chemické diagnostiky se rozšířilo význačnou měrou v posledních 25 letech tak, že zejména v oblasti lékařství může být provedena diagnóza parametrů systému s neuvěřitelnou snadností a rychlostí.

Jednou takovouto oblastí expanze je lékařská diagnostika, při níž lze studovat početné tělesné funkce pouze ponořením reagencií opatřeného proužku do vzorku tělesné tekutiny jako· je moč a zkoumání zjistitelné odezvy je objevení barvy nebo její změny nebo změny množství odraženého světla nebo světla absorbovaného proužkem.

Současně s těmito metodami typu „ponoř a čti“ vznikly různé chemické metody pro zjišťování složek tělesných tekutin. Většina z nich vytváří zjistitelnou odezvu, která je kvantitativní nebo alespoň semikvantitiativní. Takto, měřením odezvy po předem stanovené době, může analytik získat nejen kladné zjištění přítomnosti určité složky v tělesné tekutině, ale také odhadnout jaké množství této složky tekutiny je přítomno. Tudíž tyto proužky vybavují lékaře vhodným diagnostickým nástrojem, stejně jako schopností odhadnout míru nemoci nebo tělesné vadné funkce.

Zkušební prostředky obsahuj obvykle jeden nebo více nosných základů jako je absorpční papír s příslušně absorbovaným určitým reakčním systémem, které projeví změnu barvy nebo její objevení v přítomnosti určité složky zkušebního vzorku.

V závislosti na určitém reakčnún systému začleněném v určitém základě tyto prostředky mohou zjistit přítomnost glukosy, albuminu, ketonů, bilirubinu, skryté krve, dusitanu, urobilinogenu, koncentraci vodíkových iontů (pH) nebo podobně.

Objevení se určité barvy a její zjistitelná intenzita v určitém časovém rozmezí po styku pásku se vzorkem indikuje přítomnost určité složky a její koncentraci ve vzorku.

Některé z těchto zkušebních prostředků a jejich reakční systémy jsou uvedeny v US patentech 3 123 443 (CLINISTIX); 3 212 855 (KETOSTOX); 3 814 668, 3 164 534 a 2 981 606 (DIASTIX); a 3 092 465 3 298 739, 3 164534 a 2 931 606 (DEXTROSTIX).

Obvykle jsou diagnostické zkušební prostředky jako· jsou „ponoř a čti“ reagenční proužky vybaveny podrobnými natisknutými instrukcemi, které se musí pečlivě dodržovat, aby se zajistila přesnost. V případě,

146 5 8 kde zjistitelnou odezvou je změna barvy, vyžaduje se zvláštní péče. Je zajištěna tabulka různých barev pro porovnání s proužkem, protože ve většině případech je kvantitativnost prostředku závislá na určení stupně vytvoření barvy s ohledem na čas, je nutné, aby změna barvy byla porovnána s. tabulkou v předem určeném_ časovém rozmezí po ponoření do- vzorku. Čekací doby se musí přesně dodržet, protože příliš časné odečtení má za následek příliš slabé vytvoření barvy a příliš pozdní odečtení má za následek příliš intenzívní vytvoření barvy nebo dokonce výskyt vedlejší izávadné barvy.

Tudíž, jestliže se vytvořeni barvy porovná s barevnou tabulkou příliš brzy a příliš pozdě, může se zjistit a často se zjistí nepřesný výsledek.

V pokusu eliminovat kritičnost přesného Časování při odečítání, což je jak nepohodlné, tak potenciálně nepřesné, byl rozvinut rozsáhlý výzkumný program, aby se nalezl způsob vyloučení nutnosti časování dosud známých zkušebních prostředků.

Nejdříve byl sledován způsob, při němž by vytvoření zjistitelné odezvy bylo automaticky ukončeno po předem stanovené době a kde by odezva zůstala konstantní po· relativně dlouhou dobu uložení.

Tak by porovnání s barevnou tabulkou mohlo být provedeno podle libosti použivatele nebo v době vzdálené od skutečného styku prostředku se vzorkem. Po dlouhou dobu se souhlasilo s míněním diagnostické reagenční chemie, že takové zkušební prostředky by značně zvýšily stav techniky. Do současné doby však nebyl vytvořen ještě žádný návrh, který by přinesl dlouho očekávané řešení tohoto problému, dokud nebyl vypracován předložený vynález.

Předmětem vynálezu, je zkušební prostředek pro zjišťováni přítomnosti složky, například glukosy, ketonu, skryté kr.ve, bilirubinu, urobilinogonu, cholesterolu, vodíkového iontu, proteinu nebo dusitanu ve zkoušeném vzorku, obsahující nosný základ se začleněným reakčním systémem k vytvoření zjistitelné odezvy při styku uvedené složky s reakčním systémem, jehož podstata spočívá v tom, že dále obsahuje inhibiční systém v množství 5 až 50 %' hmotnostních, vztaženo na celkovou hmotnost reakčního systému, k zábraně další reakce reakčního systému s uvedenou složkou po uplynutí předem stanovené doby, přičemž inhibiční systém obsahuje látku ze skupiny zahrnující látku schopnou vyťvrdnout nebo zgelovatět při styku se vzorkem, například 2-kyanakrylovou kyselinu nebo její estery, látku schopnou otrávit reakční systém, například hydroxid sodný NaOH, kyselinu chlorovodíkovou nebo rtuťnatou sůl, nebo látku schopnou produkovat teplo při styku se vzorkem, například hydroxid sodný NaOH, chlorid hlinitý AICk nebo chlorid titanitý TiCb.

Předložený vynález zasahuje do mnoha torem diagnostické chemie včetně známých reakčních systémů současně využívaných jako jsou pH indikátory a indikátory koncentrace jiných iontů a složitějších reakčních systémů jako jsou systémy pro určování složek tělesných tekutin.

Ty jsou ideálně vhodné pro představu a slučitelné s představami nyní uváděnými. Tudíž známé diagnostické zkušební prostředky pro skrytou krev, glukosu, bilirubin, bakterioureu, urobilinogen, cholesterol, protein a jiné, mohou být všechny modifikovány podle údajů zde uvedených.

Předložený vynález se týká výhodného využití známých nebo nových reakčních systémů jako je to, že vzájemná reakce mezi složkou vozrku a reakčním systémem přestává po předem stanoveném časovém intervalu. Takto je zřejmé, že kvantum zjistitelné odezvy je fixováno pro· jakýkoli daný reakční systém: barva vytvořená při vzájemné reakci ani nevzrůstá ani neklesá; množství citlivého produktu na ultrafialové světlo vytvořeného nebo využitého při vzájemné reakci, zůstává konstantní.

Právě popsané účinky se mohou dosáhnout mnohými způsoby. Výhodným způsobem je vytvoření inhibičního systému, který fyzikálně zabraňuje další vzájemné reakci tvorbou gelu, polymeru nebo ztvrdlého povrchu, čímž se vyloučí fyzikální styk mezi reakčním systémem a složkou po předem stanoveném časovém intervalu.

Jiný způsob spočívá ve vytvoření zkušební směsi s inhibičním systémem, který deaktivuje reakční systém. Takto v případě, kde je tepelně labilní enzym kritický k působení reakčního systému, inhibiční systém může převzít formu teplotvorného prostředku, který zvyšuje teplotu zkušební směsi k bodu, v němž se enzym deaktivuje po uplynutí předem stanovené doby. Ještě dalším způsobem je vytvoření inhibičního systému, který 0tráví nebo chemicky interferuje s jednou nebo více složkami reakčního systému, čímž se potlačí vzájemná reakce se složkou vzorku po předem stanovené době.

Tyto a jiné inhibiční systémy jsou v rozsahu předloženého vynálezu, přičemž kritickým faktorem, je schopnost inhibičního systému umožnit vzájemnou reakci mezi reakčním systémem a složkou v době styku mezi vzorkem a zkoušenou směsí, ale vyloučit takovou vzájemnou reakci poněkud později v předem stanoveném čase.

Tam, kde se požaduje inhibiční systém, který fyzikálně zabraňuje vzájemné reakci reakčního systému a složky, to je inhibiční systém, který tvrdne nebo gelovatí, je možno použít mnoho dostupných způsobů.

Mezi gelovatelné nebo vytvrditelné materiály, které jsou použitelné, patří ty, které rychle ragují při teplotě místnosti a které začínají reagovat nebo jsou iniciovány při styku se zkoušeným vzorkem.

Tyto Inhibiční směsi musí tvrdnout nebo gelovatět v dostatečné míře, aby se zabráni214658

Io vytvoření zjistitelné odezvy po relativně krátkém časovém intervalu. Zcela vhodné jsou ty, kde zgelovatělý nebo vytvrdlý inhibitor znemožňuje nebo zabraňuje dalším změnám barvy nebo jinak rozptýlí zjistitelnou odezvu.

Takovýmito typickými inhibičními systémy jsou polymerovatelné nebo zesíťovatelné, ve vodě rozpustné polymery, směsi epoxidu a polyaminu, s vodou reaktivní polyisokyanáty, hydroxylovým iontem polymerizovatelný akrylát a substituované estery kyseliny akrylové, směsi polyvinylalkoholu. s různými kovovými sloučeninami (například bo-ritany, vanadičnany, trojmocný chrom a čtyřmoený titan], sodná sůl karboxymothylcelulosy a trojmocný hliník, směsi polyvinylalkoholu s polyfenolickými sloučeninami (například resorcin, katechol, floroglucin a barviva a diasoniové soli], směs polyvinylalkoholu a dimethylolmočoviny s katalyzátorem chloridem amonným, směsi dimethylolmočoviny s hydroxyalkylcelulosou a kopolymery hydrolyzovaného maleinanhydridu nebo polyakrylové kyseliny, směsi polyvinylalkoholu a polyaldehydické sloučeniny, polyvinylpyrolidinové komplexy (to je s látkami jako jsou polykarboxylové kyseliny, kopolymer methylvinyletheru a maleinanhydridu dostupný od GAF Corporation nebo polyakrylová kyselina), směsi acidického kopolymeru a polyethylenglykolu a směsi polyvinylalkoholu se srážecími prostředky (například uhličitan sodný NaaCOs, síran sodný NazSO4 nebo síran draslný K2SO4).

Zpoždění při polymeraci nebo zesítění ve vodě rozpustného polymeru se může dosáhnout izolací iniciátorů z ve vodě rozpustného· polymeru dokud zkušební směs nepřijde do styku se sloučeným vzorkem. Jedním způsobem pro dosažení takovéto separace polymeru a iniciátoru je zapouzdření iniciátoru do ve vodě rozpustných mikroprouzder nebo do mikropouzder, která prasknou při smočení. Tudíž želatinová mikropouzdra obsahující iniciátor by se mohla rozpustit při styku s vodným zkoušeným vzorkem, čímž se uvolní iniciátor pro další polymeraci ve vodě rozpustného· polymeru.

Mikropouzdra, která prasknou při smáčení, obsahují osmoticky křehké polopropustné membránové stěny, které uzavírají vodnou fázi obsahující iniciátor. Vodná fáze má relativně vysokou specifickou hmotnost s ohledem na zkušební vzorek. Když se pouzdra dostanou do styku se zkušebním vzorkem, vytvoří se osmotický spád napříč membrány, který vyvolá vzrůst tlaku uvnitř pouzdra, který je dostatečný k protrhnutí jeho stěn, čímž se uvolní iniciátor.

Fyzikální inhibice oddělením reakčního systému od složky se může také dosáhnout inhibičním systémem obsahujícím epoxid a deaktivovaný polyaminový zdroj, který dává dostupné polyaminy při kontaktu s vodou. Takovými typickými polyamlnovými zdroji jsou ketiminy a molekulární síta impregnovaná polyaminem. V prvním případě ketimin reaguje s vodou, čímž se vytvoří polyamin a keton. V druhém případě je vcxda schopna vstoupit do mřížky molekulárního síta a nahradit polyamin.

V jiném případě může být zkušební směs začleněna do vodou zpěnitelného polyisokyanátu.

Z basických nebo hydroxylovým iontem katalyzovaných akrylátových inhibičních systémů jsou pro· předložený vynález zvláště vhodné dvě — kyanoakrylátestery. Tyto estery jsou podstatnými složkami v některých lepidlech a jsou rychle polymerovatelné v přítomnosti vody, čímž se získají tvrdé polymery. Methylestery a ethylestery jsou zvláště dostupné v některých adhesivních směsích, obsahujících stabilizátory a zahušťovadla přidaná k esterům.

Polyvinylalkohol, když se smíchá s kyselinou boritou, gelovatí rychle v přítomnosti alkáiií jako je hydroxid sodný a je tudíž vhodný jako inhibiční systém. Výhodným způsobem využití této alternativny je začlenit alkálii do zkušební směsi ve formě ve vodě rozpustných nebo osmoticky křehkých mikropouzder.

Takto·, když se uvede do styku se zkušebním vzorkem, všechny reagencle inhibičního systému se spojí a tvorba gelu zastaví analýzu.

Kromě gelovatění s boraxem (kyselina boritá a alkálie) polyvinylalkohol také gelovatí s různými jinými kovovými ionty a solemi mezi kterými jsou vanadičnany, trpjmocný chrom a čtyřmocný titan. Například titaničitodraselný šťovan ΤΐΟ(θ2θ·ιΚ]2 . 2ΗζΟ a jiné organické titaničitany rychle znerozpustňují polyvinylalkohol při teplotě místnosti při pH asi 7. Navíc polyvinylalkohol tvoří tepelně re.versibilní gely s polyfenolickými sloučeninami jako je resorcin, katechoi, floroglucin a některá barviva a diasoniové soli.

Polyvinylalkohol je navíc výhodný v předloženému vynálezu pro svou schopnost zesilovat přes vytvoření acetalu s 1,3-bíshydroxymethylmočovinou (dimethylolmočovina) a podobnými sloučeninami v přítomnosti chloridu amonného. Jako u mnoha předcházejících systémů se katalyzátor nebo iniciátor (NHdCl) může izolovat takovým prostředkem jako je mikrozapouzdrování.

Polyfunkční aldehydy také reagují s polyvinylalkoholem, čímž se vytvoří acetalové síťující skupiny. Při tomto způsobu se kyselý katalyzátor jako je kyselina šťavelová nebo jiná kyselina slučitelná s reakčním systémem začlení do zkušební směsi a aldehyd se izoluje od polyvinylalkoholu pomocí mikrozapouzdření. Může se ovšem izolovat kyselina místo aldehydu za předpokladu, že aldehyd je dostatečně nereaktivní s polivinylalkoholem za nepřítomnosti katalyzátoru.

Polymerní sraženiny byly zjištěny jako y

výhodné v předloženém vynálezu pro inhibiční systém. Lze je osvětlit pomocí příkladu srážením polyvinylalkoholu z roztoku solemi jako- je NazCOs, NažSOá a K2SO4.

Navíc polymerní kyseliny jako je kyselina polyakrylová se mohou srážet z roztoku nebo gelovatět octanovými solemi těžkých kovů nebo jinými ve vodě rozpustnými zdroji dvojmocných iontů stejně jako polyethylenglykolem.

Hydroxyfenylcelulosa je dalším polymerem, který se sám zavádí do inhibičního systému předložené zkušební směsi.

Tento materiál může být zesítěn kyselými polymery jako jsou hydrolyzované kopolymery maleinanhydridu nebo polyakrylové kyseliny při použití sloučenin jako je dirnethylolmočovina výhodně při nízkém pH.

Jinými želatinovými systémy výhodnými pro· zkušební směs je sodná sůl karboxyrnethylcelulosy a iont trojmocného hliníku.

Kopolymer methylvinyletheru a maleinanhydridu je použitelný do zkušebních směsí několika způsoby. Tvoří nerozpustný komplex s polyvinylpýrrolidonem při pH nižším než asi 5. Polyakrylová kyselina se chová podobně vůči kopolymeru methylvinyletheru a maleinanhydridu s polyvinylpyrrolidonem. Tento kopolymer také tvoří nerozpustný komplex s želatinou v kyselém roztoku.

Jinak je kopolymer methylvinyletheru a maleinanhydridu a jiné kyselé polymery a kopolyméry srážen sloučeninami jako jsou glykoly, polyvinylalkohol, hydroxyalkylcelulosa a diamlny.

Jak je- uvedeno výše, i jiné inhibiční systémy jsou zcela v rozsahu předloženého vynálezu. Tak se může využít inhibiční systém jiný než jsou ty systémy, které fyzikálně oddělují reakční systém a analyzovanou složku. Například enzym, který je tepelně labilní, nebude působit v reakčním. systému, jestliže se teplota stane dostatečně vysokou k jeho deaktivaci. V souhlase s tím zkušební směs obsahující takový enzym může být vyloučena z vytvoření zjistitelné odezvy o předem stanovené době použitím inhibičního systému vytvářejícího teplo·.

Podobně může reakční systém obsahovat jed roakčního systému. Například enzymy obsahující merkaptoskupiny (—SHJ jsou deakťvovány dvojmocnou rtutí a enzymy jsou obecně deaktivovány v přítomnosti silných kyselin a zásad jako je kyselina chlorovodíková HC1 a hydroxid sodný NaOH.

Příklady enzymů, které jsou inhibovány dvojmocnou rtutí, jsou glutamátdekarboxylasa, laktátdehydrogenása, malátdehydrogenasa, myokynasa, zásaditá fosfatása, kyselá fosfatása (pH 5,2*), aldehydoxidasa, diaminokyselá oxidasa, beta-amylasa, uhličitá anhydrasa, cholinesterasa, alfa-glukositasa, beta-glukuronidasa, homogentisáíoxidasa, 3-hydroxyanthranilátoxidasa a invertasa.

Takto· předložený vynález zahrnuje začlenění takovýchto inhibičmch systémů do zkušební směsi.

>

Tepelně labilní enzymy jako je salicylát-hydroxylasa jsou stejně v rozmezí předloženého vynálezu. Látky, které vytvářejí teplo při styku s vodným zkušebním vzorkem, zahrnují hydroxid sodný NaOH, chlorid hlinitý AICI3, chlorid titanitý TÍCI3, alkylhllník a jiné.

Způsob, jak zpomalit denaturaci .nebo 0trávení enzymu je izolace inhibičního systému vytvářejícího teplo nebo jed pomocí mikropouzder.

Ve vodě rozpustný zapouzdřovací materiál může být zvolen tak, že teplo vytvářející látky nejsou vystaveny vzorku dokud zapouzdřovací materiál není rozpuštěn. Ve vodě rozpustné látky jako je želatina, akrylamidy, kopolyméry styrenu a maleinové kyseliny a hydroxypropylcelulo-sa a směsi jako je koacervát želatiny a přírodních nebo syntetických polymerů jsou vhodné pro zapouzdření.

Jak je uvedeno výše, mikropouzdra různého druhu se sama o sobě zvláště dobře hodí pro předložený vynález, když složky musí být dočasně odděleny. Mohou se připravovat různými dobře známými způsoby. Jejich příkladem je způsob popsaný v Angswandte Chemie-International Edition (v angličitině) 14: 539 (1975) a reference tam citované.

Technologie jako· je mezifázová polykondenzace, koacervace, a podobně, mohou vytvářet mikropouzdra. Jiné technologie jako je odstřeďování, sušení rozstřikováním a jiné fyzikálně-mechanické technologie jsou podobně užitečné při přípravě mikropouzder.

Mezifázová polykondenzace je výhodnou metodou pro výrobu mikropouzder vzhledem k jejímu relativně snadnému provádění. Při této technologii se dvě reaktivní látky (komonomery nebo oligomeryj nechají reagovat na rozhraní vlcefázového systému. Tam nastává polykondenzace, přičemž se vytváří tenký polymerní film, který je nerozpustný v prostředí obsahujícím monomery.

Vhodná mikropouzdra osmotlcky křehkého typu se mohou připravit rozpuštěním první komonomerní složky jako je polyfunkční amin ve vodné fázi obsahující látku, která se má izolovat. Tato vodná fáze je výhodně fáze s vysokou specifickou hmotností nebo osmolalitou ve vztahu k očekávanému osmotickému rozmezí vzorku, který se má analyzovat. Tato· vodná fáze se pak rozptýlí nebo emulguje ve fázi, která je s vodou nemísitelná jako je minerální olej.

Druhý komonomer jako je polyfunkční ,acylhalogenid se pak přidá do suspenze nebo emulze. Když jsou komonomery polyfunkční aminy a acylhalogenidy, vytvoří se polyamidová pouzdra, z nichž každé obsahuje část vodné fáze, to je izolované látky.

Vhodným polymerním materiálem výhodným pro vytvoření osmoticky křehké polopropustné membránové stěny mikropouzder zahrnuje mimo polyamid, plyester, polyuretan, polymočovinu apod.

Jiným způsobem oddělování složek inhibičního systému, kde Jedna ze složek je rozpustná ve vodě a druhá je organickým rozpouštědlem, je použití „dvounamáčecího“ postupu. Takto nosný základ zkušebního prostředku je nejdříve zanesen vodným roztokem jedné složky, vysušen a pak je zanesen druhým roztokem druhé složky v organickém rozpouštědle.

U některých inhibičních systémů popsaných výše, které nevyžadují izolaci složek jako jsou ty, které využívají 2-kyanoak.rylátů, vodou zpcnitelných isokyanátů a epoxidovaných reagenčních složek, musí se pečlivě vyloučit vlhkost jak během přípravy zkušební směsi a prostředku a při uskladnění před konečným použitím. Tak je polymerace inhlbičního systému vyloučena až do styku so zkušebním vzorkem.

Zelatinující nebo tvrdnoucí inhibiční systémy představené některými ze systémů výše uvedených spolu s požadovaným reakčním systémem se mohou začlenit do nosného základu jakýmkoli vhodným prostředkem, čímž se vytvoří zkušební prostředek předloženého vynálezu. Tak se nosný základ může ponořit do jednoho roztoku všech složek reakčního a inhibičního systému. V jiném případě, kde se vyžaduje způsob dvojího máčení vzhledem k nutnosti izolace složek, se základ střídavě ponoří, vysuší a znovu ponoří, jak je výše popsáno.

V případě, kdy se po-užijí mikropouzdra, mohou se tato· upevnit k základu pomocí pojiv. Mezi pojivý, která jsou zvláště vhodná, jsou acetát celulosy, acetátbutyrát celulosy, hydroxypropylcelulosa a polyvinylpyrrolidon. Pojivá by měla být nemísitelná se zkoušeným vzorkem a měla by umožnit vzorku, aby se absorboval do· nosného základu.

Vhodné materiály, které se mohou použít jako nosný základ testovacího· prostředku zahrnují papír, celulosu, dřevo, syntetická pryskyřičná rouna, skleněná vlákna a jiné syntetické papíry, polypropylenovou plsť, netkané a tkané textilie apod. Základ je výhodně upevněn jakýmkoli vhodným prostředkem ke konvenčnímu nosnému členu jako je proužek polymeru k usnadnění použití.

Při způsobu použití zkušebního prostředku se základ se začleněným reakčním, a inhibičním systémem ponoří do zkoušeného vzorku. Předem stanovený časový interval příslušný pro prostředek se nechá uplynout a prostředek se pak analyzuje na zjistitelnou odezvu. Tam, kdej e odezvou vytvoření nebo změna barvy, se může prostředek porovnat se standardní tabulkou barev.

Kdyby měla odezva obsahovat změnu odrazivosti světla, prostředek se zkouší v příslušném měřicím zařízení jako jsou zařízení, která jsou dobře známa.

Následující příklady jsou určeny pro další objasnění předloženého· vynálezu. Slouží pouze pro· vysvětlení výhodných provedení a nijak neomezují rozsah vynálezu.

Příklad 1

10% roztok (hmotnostní °/o J adhesiva obsahujícího methyl-2-kyanoakrylát v chloroformu bylo připraveno a uloženo v těsně přikryté skleněné nádobě.

Zkušební prostředek pro zjišťování glukosy v moči byl připraven následujícím způsobem.

Whatmanovy 3MM filtrační pápíry byly impregnovány zkušebním reagenčním roztokem, jak je uvedeno v US patentech číslo 2 981 606 a 3 154 534 a pak byly vysušeny. Předpis byl následující:

Destilovaná voda 758,1 ml

Ethanol — 95% 205,0 ml

Carageenan Viscarin, (zhušťovadlo z mořských řas) 2,5 g

Polyvinylpyrrolidon 25,0 g barviva (FDaC červeň 3 a 4) (Colour index č. 45430 a 14700) 0,29 g o-tolidin . 2HC1 5,0 g kyselina citrónová (bezvodá) 15,42 g cltran sodný 67,92 g kopolymer maleinanhydridu a methylvinyletheru v molárním poměru 1 ku 1 7,5 g povrchově aktivní činidlo 2,5 g glukosoxidasa 76,0 ml peroxidasa 0,5 g

Části tohoto impregnovaného papíru byly pak dále impregnovány výše popsaným roztokem methyl-2-ky.anakrylátu. Jiné byly upraveny pouze chloroformem jako· kontrola. Papír se mohl vsunout a vysunout z impregnační nádoby, ale jinak byla nádoba přikryta aby se snížilo odpařování chloroformu, zatímco se ponechá možnost odvedení impregnačního roztoku do papíru v atmosféře bohaté na rozpouštědlo uvnitř nádoby. Po· vyjmutí papíru z lázně bylo rozpouštědlo ponecháno odpařit po dobu 10 až 30 minut při teplotě místnosti v atmosféře s řízenou nízkou vlhkostí, (menší než 10% relativní vlhkost).

Monomerem impregnovaný papír byl uložen v tmavé suché atmosféře a pak upevněn na plastickou podložku a rozřezán na formát obvyklých reagenčních proužků. Připravené proužky pak byly uloženy v tmavých skleněných lahvích v přítomnosti adsorbentu silikagelu.

Takto vyrobené proužky pak byly vyhodnoceny jejich ponořením jednotlivě po· dobu 3 s do vzorků moči o· známé koncentraci glukosy (0, 50, 100, 200 a 500 mg/dl), odstranil se přebytek vzorku a zavedly se do měřicího zařízení pro měření odrazivosti. Hodnota odrazivosti při 680 nm byla zaznamenána jako funkce času od t = 15 s včetně času ponoření až po 3,5 min.

V tabulce jsou zaznamenány hodnoty odrazivosti v jednotlivých intervalech a konečné hodnoty odrazivosti pro papír citlivý £2 na glukosu, impregnovaný 10%roztokem mefhyl-Z-kyanakryláTu v chloroformu, při rážných' koncentracích giuki>3ý.^: Změna odrazivošti při 15 s- je rozdílná bd hodnoty odrazivosti, když nebyla přítomna žádná glukosa. Je zjevné, že žádná - zrněna v hodnotě ódřažlvostí - se nezjistí po 2o minutách.· Tyto konečné barvy mohou být jasně rozlišený vizuálně a zůstávají stabilní po dobu několika dňíúáž hěkoííKáiTýdnůííy^ůávisrtostinna podmínkách uskladnění.

Zkušební proužky, které hýly pouze impregnovány chloroformem (kontrolní}, vyvinuly velmi intenzívní barvy 10 s po ponoření, ale vývoj barvy rychle pokračoval a po 2 minutách byly proužky černé a nemohla být provedená žádná diferenciace.

Změna obrazivosti v závislosti na časé po styku se vzorkem

Končen- 15 s % trnce Rx glukosy (mj %)	40 s % R+	65 s % R +	90 s R +	% 115 s % 140 s %	165 s %R+;	215 s % R+ ...	koiheČ. úprava % R
R +	R +
50 6,8	8,5	,:3,5- .	0,1	0	0	0 -,	0	. 59 ..
100 13,8	13,8	5,0	2,0	0,1.	·· 0	0	0	43
200 22,6	15,3 .	0,2	2,7	/ 0,7 ;	o	0 ..	0	31 -
500 : 30,8 ,.	15,7 :	.6,5	2,7	0,7	0 ...	0 ,,	0 .	; 22
Λ %?R V Čase t ;%R· .	UuH,	, r-. τ., ·; —	-%R :		-
’ i ' ' ’ :	(0 mg% glukosy)	(n mg% glukosy)			'
+ %R v čase t - t s %R ..			%R			'X.	s . ... Γ
7 A v	: tpře	idchozí	t). /	(t)
ůJ',V Příikilad 2				chloroform «.·			350 ml
				ethanol,	bezvodý,,,			200 ml
Předem «připravené	reagenční	papíry	cit-			ί Ί'
livé na glukosu byly	iinpregnov	ány jako v	Takto	připravené proužky byly ·,	pak fm-

.příkladu 1 chloroformovým roztokem obsahujícím 10 % hmot. (ethyl-2-kyanakrylátu) 1% (h hior.zo h j.) pevného > ne iontového detergontu ;a 0,01 % . (hni ol. · ob j) pevné dikarho xylové'kyseliny.; .Proužky' připravené z. Takto impregnovaného.;', .papíru; vykazovaly vlastnosti pod c-bné vlastnostem, proužků: z příkladů l Λ< zbarvené ;zrengcvané -proužky měly zvláštěnstejnpměrný-vízhled; ,··.' ;

pregn o vány. chloroformovým . roztokem obsahujícím ; 10 % ' hmot, ethyl-2-kyanakrylátu jako- v příkladu 1. Proužky připravené z takto impregnovaného papíru a vyhodnocené močí obsahující různé koncentrace acetoctové kyseliny ukazovaly výtečné; vlastnosti vývinu barvy a barevné intenzity indikující koncentraci acetoctové kyseliny ve zkoušené moči zůstávaly stabilní. .

Pří klad 3 Byl připraven reagenční papír citlivýhna! ketony podle tJS patentu č. 3 202 855 ponořením Whatmanova 3MM filtračního papíru do, následující, první i máčecí směsi, pak byl vysušen, a pak ponořen do druhé máčecí směsi.

První máčecí směs

HzO ,,γ ,	,: 722 inl
Fosforečnan sodný, , · ;í··.'	202,2 g
sek·, fosforečnan: sodný -
(bezvodý,),, ,	86,7 g
amtaaootová kyselina -	.·< 180,6 g,
Druhá máčecí směs ,i
oktyísulfOísukcinát dvojsodný	: ' 1.64 g
polyvinylpyr rolidon vinyacetát
kopplymom,;-, rnc: gí-ovA:.?;’; no y ,0	67 ml,
nltroferirikyanid sodný	8,24 g
dimethylsulfoxid	401 ml

P ř í k 1 a d 4 .· ,γ,.:-:--; Reagenční papír, citlivý, na glukosu byl impregnován benzenovým roztokem 10% Eastman 910. obsahujícího methyl-2-kyanakrylát. Při vyhodnocování proužky tohoto papíru vykazovaly výborné vlastnosti jak v předešlých příkladech. .

P ř í k I a d 5 „Jednoponorný“ systém byl připraven podle následujícího předpisu.

Reagencie A fosforečnan sodný 2,02 g sek. fosforečnan sodný (bezvedý) 0,87 g glycin (aminooctová kyselina) 1,81 g nitroferrikyanid sodný (rozmělněný a vysušený) 82,4 mg

Koágeneh: B dioktylsulfosu-kcinát sodný 8,4 mg

GAFAC povrchově aktivní činidlo RE-610 obsahující volnou kyselinu komplexního organického fosforečnanového esteru 8,0 mg chloroform 16,7 ml

Hypol 2000 (hydrofilní polyuretanový předpolymer) míchat dokud není v roztoku 0,9 g

Všechny složky v reagencii A byly rozetřeny v třecí misce na jemný prášek a suspendovány do· reagencie B. Suchý Whatmanův 3MM filtrační papír byl impregnován touto suspenzí a proužky připravené z takto· impregnovaného papíru byly vyhodnoceny močemi, obsahujícími několik rozdílných koncentrací kyseliny acetoctové.

Intenzity barev zreagovaných proužků byly stabilní a byly funkcí koncentrace kyseliny acetoctové ve zkoušené moči.

Příklade

Glukosová indikační reagenční složka a enzymový roztok byly připraveny v následujícím složení.

Glukosová indikační reagenční složka destilovaná voda 16,6 mí póly vinyl pyrrolidon (PVP) 9,5 ml jodid draselný 1,5 g

FDaC modr č. 1 (Color index

č. 52015) 5,3 mg kyselina citrónová 0,497 g citran trojsodný 2,182 g sodná sůl (ethylendinitrilo)tetraoctové kyseliny 1,67 g (10% roztok kopolymeru methylvinyletheru a maleinanhydridu ] 5 ml enzymový roztok 16,7 ml

Enzymový roztok

225 ml glukosoxidasa

0,842 g peroxidasa

Všechny předcházející reagencie byly míchány dokud nepřešly do roztoku. Stejné objemy tohoto reagenčního indikačního roztoku moči obsahující glukosu a Hypolu 2000, což je vodou zpěnitelný urethanový předpolymer, byly přidány na desku pro kapkové reakce a míchány stěrkou, dokud nezačalo pěnění (asi 1 minutu). Předpolymer vytvořil zbarvenou pevnou pěnu v době od 3 do 5 minut.

Když byl systém vyhodnocen močí, obsahující 0, 100, 250, 500, 1000 a 2000 mg glukosy na dl, vyvinula se stabilní barva v krátké době a barevné intenzity určovaly koncentraci glukosy. Výsledné barvy přecházely od modré do zelené až do hnědé, v závislosti na koncentraci glukosy a byly porovnány s barevnými standardy.

Protože jedna kapka Hypolu 2000 vytvoří dost pěny, aby se vyplnila prohlubeň kapkovací desky, zkouška se může provádět s jednou kapkou vzorku moči a stále bude vizuálně vyhodnotitelná.

Příklad 7

Reagenční papír citlivý na ketony připravený podle US patentu č. 3 212 855 byl impregnován 10% chloroformovým roztokem Hypolu 2000, což je vodou zpěnitelný urethanový předpolymer.

Tento roztok může obsahovat navíc jakýkoli jeden nebo několik iontových detergentů v koncentraci kolísající mezi 1 až 5 procenty hmotnostními předpolymeru. Proužky připravené z takto impregnovaného papíru byly vyhodnoceny močemi obsahujícími rozdílná množství acetoctové kyseliny a konečné intenzity barev se dosáhly během 2 až 4 minut. Tyto barevné intenzity byly stabilní a byly jasně vizuálně rozlišitelné jako funkce koncentrace kyseliny acetoctové.

Z předcházejícího je jasné, že zavedení koncepce předloženého vynálezu je možné nejen pro výrobu zkušebních proužků nebo prostředků typu „ponoř a čti“ ale stejně i pro jiné formy zkoušek včetně těch, které se provádějí ve formě kapalných systémů.

Příklad 8

Zkušební prostředek pro určování urobilinogenů v moči byl připraven nejprve impregnací Whatman 3MM filtračního papíru následující směsí.

destilovaná voda 70,5 g

GANTREZ AN-139 (kopolymer maleinanhydridu a methylvinyletheru) 5,6 g sulfosalicylová kyselina 9,16 g kofein 7,05 g sulfamová kyselina 1,41 g p-dimethylaminobenzaldehyd 0,53 g čtyřsodná sůl (ethylendinitrilojtetraoctové kyseliny 0,14 g kyselina askorbová 3,52 g laurylsíran sodný 0,70 g

Papír byl pak vysušen a dále impregnován čtyřprocentním (% hmot.) roztokem polyvlnylpyrrolidonu v chloroformu. Výsledný papír pak byl vysušen a upevněn na polystyrénové proužky pro zkoušení. Reagenční proužky byly vyhodnoceny, jejich ponořením po dobu 3 s do vzorků moči se známými koncentracemi urobilinogenu (0, 4, 8 a 12 jednotek dle Ehrlicha).

Barvy se vyvinuly během 2 minut a byly zjištěny, že odpovídají koncentracím urobilinogenu. Tento časový účinek byl dosažen rychlou tvorbou komplexu kopolymerů hydrolyzovaného methylvinyletheru a maleinanhydridu s polyvinylpyrrolidonem při nízkém pH.

Příklad 9

Proužek použitý pro zjištěni skryté krve v moči byl připraven impregnací Whatmanova. 3MM filtračního papíru následujícím roztokem:

laurylsíran sodný 0,84 g kumsnhydroperoxid 1,67 g

6-msíhoxych‘nolin 0,39 g citran sodný . 2I-í?,0 1,79 g kyselina citrónová 2,32 g

3,3‘,5,5s-teíram.ethylbenzidin	0,45	g
triethanolaminboritan	5,58	g
čtyřsodná sůl (ethylendinitrilo)-
tetraoctové kyseliny	0,06	g
dimethylsulfon	5,53	g
voěa	40,67	g
dtmethylformid	40,67	g

Po vysušení byl papír dále impregnován 1% ('% hmot.) roztokem ethyl-2-kyanakrylátu v chloroformu. Připravené proužky z tohoto papíru při vyhodnocení vzorky moče obsahující známá množství hemoglobinu (0, 0,016, 0,064, 0,16, 0,80 mg/dl) vykázaly během dvou minut značně stabilní barvy, jejichž intenzita byla funkcí koncentrace hemoglobinu.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT

   Prostředek pro zjištování přítomnosti složky, například glukosy, ketonu, skryté krve, bilirubinu, urobilinogenu, cholesterolu, vodíkového· iontu, proteinu nebo dusitanu ve zkoušeném vzorku obsahující nosný základ se začleněným realtčním systémem k vytvoření zjistitelné odezvy při styku uvedené složky s re akčním systémem, vyznačený tím, že obsahuje inhibiční systém v množství 5 až 50 hmotnostních %' vztaženo· na celkovou hmotnost reakčního systému k zábraně další reakce reakčního systému s uvedenou

   VYNALEZU složkou po· uplynutí předem stanovené doby, přičemž inhibiční systém obsahuje látku ze skupiny zahrnující látku schopnou vytvrdnout nebo zgelovatět při styku se vzorkem, například 2-kyanakrylovou kyselinu něho její estery, látku schopnou otrávit reakční systém, např. hydroxid sodný NaOH, kyselinu chlorovodíkovou nebo rtuťnatou sůl, anebo látku schopnou produkovat teplo při styku se vzorkem, například hydroxid sodný NaOH, chlorid hlinitý AICI3 nebo chlorid titanitý TiCls.

   Severografia, n. p závod /, Most