JPS5877664A - 蛋白質分析方法 - Google Patents

蛋白質分析方法

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JPS5877664A
JPS5877664A JP57181225A JP18122582A JPS5877664A JP S5877664 A JPS5877664 A JP S5877664A JP 57181225 A JP57181225 A JP 57181225A JP 18122582 A JP18122582 A JP 18122582A JP S5877664 A JPS5877664 A JP S5877664A
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reagent
layer
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analytical
test
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JP57181225A
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ジヨン・ナ−サン・アイケンベリイ
カ−ル・ジヨン・サンフオ−ド
リチヤ−ド・カルヴアン・ストン
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Eastman Kodak Co
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Eastman Kodak Co
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Publication date
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    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
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    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
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    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6827Total protein determination, e.g. albumin in urine
    • G01N33/683Total protein determination, e.g. albumin in urine involving metal ions
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  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 水性液体、詳しくは血液、血清及び尿のような生物学的
液体中のある物質の存在及び/又は濃度を測定すること
が所望であるか又は必要である場合が多い。このような
分析には、従来、様々ないわゆる湿式化学装置及び方法
が用いられていた。
かような湿式化学では臨床試薬を水性液体媒質に溶解又
は懸濁する。溶液分析と呼ばれることもあるこのような
湿式化学分析方法は有用であるけれども典型的には複雑
な溶液操作を行うことが可能であ〕かつ輸送性を備えた
高価で複雑な分析装置が必要である。
好都合でかつ低コストであシそして分析を迅速に行うこ
とが可能であるので、前記湿式化学分析方法に代わるも
のとしていわゆる乾式化学方法と呼ばれる種々の方法を
用いて水性液体の分析を行うことが望ましい場合が多い
ことが判明した。この明細書で用いられているように、
′乾式化学”分析又は1乾式化学”法という表現によシ
、たとえば、以下に相互作用性組成物と呼ばれることが
ある試薬組成物を用いて行う分析化学方法が意味される
。前記組成物は接触O際実質的に乾燥している種々の分
析素子中に組み入れられる。接触の際乾燥している代表
的な分析素子Ka多層分析をケのような多区域分析試験
素子や1浸漬及び解読(dip and r@ad)’
″試験ストリッグがある。
以下アナライト(analyt・)と呼ばれることもあ
る分析下の特定物質か又は所望の被検体の存在を測定す
る為に従来は試験素子中に含まれる特定の相互作用性組
成物に依存して、例えば、約12.0を超えるような高
−条件下で特定の分析を行うことが必要な場合が多かっ
た。血清及び尿のような水性液体の蛋白質含量はビウレ
ット試薬組成物を用いて分析するのが有用であることを
見い出した。
周知のごとく、ビウレット試薬組成物は、約12.0を
超える−とするのに十分な塩基の存在下で銅を第二銅の
形で含有する相互作用性組成物の使用を意味する。血清
のような水性流体中の蛋白質がビウレット試薬と相互作
用する場合、第二銅の形の銅と蛋白質との反応が前記高
声下で生じ、紫色を呈する。典型的にはビラ1/、)試
薬の使用による人間の血清のような水性流体の蛋白質含
量の測定もちろんのことであるが、かような有用な湿式
化学分析法を、以下のものを用いて行う乾式化学分析法
のような容易に実施しうる方法へ転換することは非常に
有利であろう、前記乾式化学分析法に用いるものは、た
とえば、定性又は半定量分析値が所望な場合は1浸漬及
び解読”試験ストリ。
グであシまた更に正確な定量値が所望な場合は多層分析
素子のような多区域分析素子である。しかしながら、塩
基性の非常に強い化合物を乾式化学分析素子に組み入れ
ようとする場合、水酸化ナトリウムのような強いアルカ
リ性条件を生成しうる多くの化合物はその最初の高−生
成能が急速に低下するという問題にぶつかる。従って、
前記塩基性化合物を含有する典型的な乾燥化学分析素子
は、最初高−条件を生成しうるけれど、も(所望の被検
体を含む水性試料と接触する場合)、8ないし10日の
ようなかなシ早い時期に最早高−雰囲気を生成しえなく
なる。それ故高アルカリ性雰囲気を必要とする試薬組成
物と被検体との所望の反応は最早生じえないか又は実質
的に阻止されてしまう。
本発明により、高アルカリ性条件下、即ち約12.0を
超える一条件下における水性液体中の所定の被検体を測
定する為の改善され九分析方法が提供される。本発明方
法に使用される素子には、分析下の水性液体を分布させ
る区域が含まれ、そして更にかような区域と協働して、
被検体含有液体と素子との相互作用の際素子内に検出可
能な変化を生ぜしめる試薬組成物が含まれる0本発明に
係る改善された素子を特徴とする特殊な性質は、安定な
アルカリ性生成組成物を素子に組み入れることによシ得
られる。前記組成物は実質的にナトリウムイオンを含ま
ず、そして素子の使用条件下で素子内に約12.0を超
える一条件を生成するのに十分な量の塩基とアルカリ保
換性ぼりマーとを混合状能で含む。
本発明の分析素子において特徴づけられる安定なアルカ
リ性生成組成物は次のような程々な分析素子に広く適用
可能である。即ち前記素子にれ前記 浸漬及び解読1試
験ストリ、プ羞ひに米国特許第3,992,158号;
同第4,042,335号;ドイツ国公開公報$2,8
01,455号及び同第2.801,476号に記載の
型の一体型多層素子のような前記多区域分析素子がある
更に、本明細書記載の安定なアルカリ性生成組成物と一
緒に分析素子に使用可能な種々の試薬組成物に関して同
様に本発明を広く適用可能である。
本発明の特に好ましい態様では、本明細書記載の安定な
アルカリ性生成組成物を、試薬組成物としてビウレット
組成物を含む分析素子に紹み入れる。高アルカリ性雰囲
気においてビウレット試薬組成物は水性液体中の蛋白質
と相互作用し、そしてそれを検出する。
更に、本発明によ)改善されたビウレット試薬組成物及
びそれを用いた分析方法が提供される。
本発明方法において使用されるビウレット試薬組成物は
実質的にナトリウムイオンを含まず、そして硫酸鋼のよ
うな水溶性第二銅塩、その第二銅塩用のキレート化剤前
駆体及びビウレット組成物使用条件下で約12.0を超
える−とするのに十分な量の塩基を含む。前記ビウレッ
ト試薬組成物の殊に有用なキレート化剤前駆体鉱酒石酸
である。
高アルカリ性雰囲気下では酒石酸唸塩の形状に転化し、
かくして第二銅塩のキレート化剤が得られる。このビウ
レット試薬組成物は前記乾式化学分析!)及びそれを用
いる分析方法に特に有用である。しかしながら、これら
の試薬組成物は水性液体試料中の蛋白質の検出に一般に
有用であり、それ放水性液体の湿式化学分析及び乾式化
学分析の双方に有利に使用可能である。
ある好ましい態様では、本発明はドイツ国公開公報第2
,801,476号に記載の型の多区域分析を号、特に
前記明細書に記載されているような多層分析素子におい
て有利に具体化され、また米国特許第3,992,15
8号、同第4,042,335号及びドイツ国公開公報
第2,801,455号においても有利に具体化される
。かような多区域分析素子には、典型的には拡散区域が
存在して分析下の水性液体試料を輸送しそして分析素子
内に液体試料を分布させる。それ故、この拡散区域は、
本発明に従って分析下の液体試料を分布させる区域とし
て働くことができる。
これら各区域素子では、典型的には試薬組成物を含有す
る協働試薬区域も存在する。試薬区域が拡散区域と協働
し、よって拡散区域によシ液体試験試料が分布され試薬
区域と流体接触可能になるように各区域素子は構成され
ている。
本発明の本質的な特徴を構成する前記の安定なアルカリ
性生成組成物を、各区域素子の前記拡散区域又は試薬区
域のいずれかに組み入れてもよい。
別法としては前記組成物を、使用条件下で素子の拡散区
域及び試薬区域と順次流体接触するような、各区域素子
の単独区域に存在させてもよい。かくして適用された水
性試料はこのアルカリ性生成組成物と流体接触しうるよ
うになシ、そしてこの組成物と相互作用して素子の一つ
又はそれ以上の区域内を所望のアルカリ性雰囲気とする
本発明の各区域素子の別の態様では、これら叡ケを一体
型素子として構成する。この素子では拡散区域、試薬区
域及びその他の区域は素子内において放射線(もしくは
輻射線、以下同じ)透過支持体のような適切な支持体上
に支持される載置層によシ規定される。
この明細書で用いる“放射線透過性”という表現は広義
の1光透過性”なる語に対応し、素子中で生成する分析
結果検出に用いられる電磁放射線(もしくは輻射線)の
有効通過を許容することを意味する。従って生成した分
析結果が素子中で生成する可視の色変化によシ検出する
分析素子では、前記有効通過とは、約400ナノメータ
ーと約700ナノメーターとの間の可視範囲内の波長の
電磁放射線(Iv視光)の透過させることをいう。
また生成した分析結果を可視波長範囲以外の電磁放射線
、例えば紫外線、赤外線又は放射能によシ検出する場合
はこれらの電磁放射線を透過することをいう。
前述のごとく、本発明の多区域分析素子の糧々の個々の
区域は少なくとも使用条件下で互いに流体接触する。こ
の明細書で用いる1流体接触”という表現社、水性液体
が分析素子の載置又は隣接区域間を通過可能であること
を意味する。流体接触する区域は相接することができる
けれども、区域を介在させることによシ離すこともでき
る。但し、この場合はかような物理的に介在した区域も
流体接触しそしてそれらによシ区域間の流体の通過がさ
またげられないことが条件である。
本発明の好ましい各区域素子の区域間の流体接触は、流
体が通る為にもともと接触しているか又は有効に接触し
ている区域を有するような素子を製造することによシ可
能となる。別法としては、最初接触しておらず、そして
たとえば挿入物の使用によるか又は弾力性のある吸収性
材料もしくは非変形性支持体の使用によシ更に間隔をあ
け九区域を有する素子を製造することが適切な場合もあ
る。もちろんのことであるが、を奇が最初接触していな
い区域を有する場合は、有用な分析結果を得る為に素子
を用%Aゐ時に圧縮力を適用するか、さもなければ引)
のかような非接触区域を流体接触させる手段を提供する
ことが必要であろう。
本発明の更に別の態様に従って本発明を1浸漬及び解読
”試験ストリップのような定量性の低い分析素子におい
ても容易に具体化可能であることは轟然のことである。
これら試験ストリ、fは製造の際それ程精度を必要とせ
ず、そしてその物理的構造は、それ程複雑ではないけれ
ども、これらの素子はたとえば定性又は半定量的結果を
得ることが所望な場合にも有用である。かような試験ス
トリップは、最も単純な形状では、分析下の水性液体を
分布させる区域として働く単一層から成るものとするこ
とが出来る。典型的にはこの単一層は合成又は天然繊維
状材料(たとえばナイロンメッシ、又は1紙材料)のよ
うな繊維状材料から成シ、前記材料には素子の試薬組成
物として働く一つ又はそれ以上の活性物質が含浸又は吸
収されている。本発明に従ってこの明細書記載の安定な
アルカリ性生成組成物を、試験ストリップのこの単一層
にか又は試験ストリップの協働層に組み入れることも可
能である。前記協働層は試験ストリ。
グの使用条件下で試薬組成物と流体接触する。試験を実
施する場合は、たとえば得られた試験ストリップを液体
中へ浸すか又は液体と接触させてストリップ中へ液体を
しみ込ませることにより、試験ス)lJ、、7”をある
被検体含有水性液体で処理する。その結果水性液体がス
トリップに組み入れられたアルカリ性生成組成物を活性
化することにょシ生じた高アルカリ性条件下で被検体は
ストリ。
プと相互作用する。
前述のごとく、本発明方法における本質的な特徴はアル
カリ性生成組成物である。この組成物は二つの必要な成
分を含む。即ちこれら成分は、使用条件下において分析
素子の声を約12.0を超える声にするのに十分な量の
塩基とアルカリ保護性ポリマーである。
安定性とは、素子を周囲の温度及び相対湿度条件下に長
期間さらした後でさえも、これらアルカリ性生成組成物
を組み入れた素子内を高アルカリ性条件とする能力のこ
とである。この安定性は、    −これらアルカリ性
生成組成物を実質的にナトリウムイオン・が含まれない
状態に保持し、そしてこれら組成物に前記アルカリ性保
膜性、jF リマーを組み入れることにほとんど依存す
るように思われる・詳しくは、ナトリウムイオンは多く
の無機化合物中に用いて、例えば水酸化ナトリウム、無
水炭酸ナトリウム、オルトリン酸ナトリウム等の上うな
有効な塩基性化合物を提供しうるけれども、このような
塩基性ナトリウム含有化合物は、アルカリ保護性プリマ
ーと混合し、そして分析素子に組み入れた場合でさえも
、非常に吸湿性であるように思われる。その結果、これ
らナトリウム含有塩基性化合物は、周囲の雰囲気から水
蒸気を吸収しやすく、そして次にこれも大気中に存在す
る二数化炭素と結合し、それによって分析素子内に炭酸
水素塩及びその他の炭酸塩を生成する。このような炭酸
塩によシ示される緩衝能力の故に、水酸化ナトリウムの
ような塩基性ナトリウム化合物によって分析素子内に生
成可能な最初の高アルカリ性条件は実質的にpH12,
0未満のレベルまで急速に低下する。従って、高アルカ
リ性雰囲気を必要とする試薬組成物、即ち12.0を超
える−のアルカリ性条件下で最適活性を示すビウレット
試薬のような試薬組成物紘活性が実質的に低下するか、
又は完全に活性を失うようになる。
本発明方法に用いる%欺的なアルカリ性生成組成物の安
定性に貢献する第二の主な因子は、これら組成物に前記
アルカリ保護性ポリマーを用いることである。高塩基性
化合物のアルカリ性声生成物は、たとえこれらの化合物
が水酸化リチウム、水酸化カルシウム等のようなナトリ
ウムイオンを含まぬ塩基性化合物であっても、分析素子
に組み入れた場合8〜lO日のような比較的短期間で実
質的に減少する傾向があることが見い出された。
しかしながらナトリウムを含まぬ塩基性化合物とあるポ
リマー(この明細書では”アルカリ保護性ポリマー”と
呼ぶ)とを組み合せることにょシ、前述のような塩基性
化合物のアルカリ性癖生成性の低下を防ぐか又は少なく
とも減少させる有効な手段が提供される。
特定ポリマーが本発明で必要とされるような有用な”ア
ルカリ保I!’″性を示すかどうか確認する為に、比較
的簡単で安価なオフ−ライン(off −11ns)試
験が開発された。このテストは次の通シである: (1)幅が2.5 cIIL以上で、長さが約1001
2を超えるぼり(エチレンテレフタレート)フィルムの
ようなグラスチックフィルム支持体を支持体として用い
る、塩基性化合物(水酸化リチウム)、界面活性剤及び
アルカリ保膜性を試験すべき特定ポリマーから成るアル
カリ性生成試験組成物の連続層を支持体上に均一に手法
被覆する。この試験に用いる特定の界面活性剤はトライ
トン@X−200(ロームアンドハース社によシ販売さ
れているアルキルアリールポリエーテルスルホネートの
塩)である。トライトン”X−200に代えて、その他
の同様な界面活性剤を、試験結果に明きらかな影響を与
えることなくこの試験に使用可能であると思われる。水
酸化リチウム、界面活性剤及び試験すべきポリマーは蒸
留水を用いて被覆しそして被覆ドーグに含まれる水酸化
リチウム、界面活性剤及び試験下のポリマーの量を、グ
ラスチックフィルム支持体上に湿潤塗布して被覆される
水酸化リチウムの理論量がLloH−H20約2.7f
/m2に等しく、被覆されるポリマーの量が約8.0 
f / m2、そして被覆される界面活性剤の量が0.
54t/yn2となるように調節する。この湿潤被覆層
を次いで空気乾燥する。轟然のことであるが特定被覆及
び温度、相対湿度郷のような空気乾燥条件は試験下のポ
リマーの物理的性質に依存して可変である。
たとえば典型的には、均一なフィルム形成性のような実
質的に均一な被覆をポIJ w−が呈する温度のような
被覆温度を選ぶ。
(2)前記ステラflに記載の最初の被覆操作の3時間
の内に前述のととく被覆したプラスチ、り支持体から1
.6 cmの正方形の試験パッチを切多出し、そこに含
まれる塩基の量を測定する。この測定は次の通シ実施す
る。
K留水10 mAにフェノールフタレイ75 mW 全
添加することにより、フェノールフタレイン指示薬溶液
を製造する。濃NaQH(即ちNaOH50重量%と水
50重量−とから成る溶液)−滴を添加しそして溶液を
i MHClでpH8,9にすることによシ指示薬を溶
解させる。次いで被覆された試験ノ4ツチを25mt容
のシンチレーションパイアルに装入する。バイアルへ蒸
留水3rntを添加し、小型の磁性撹拌棒をバイアルに
装入しそして溶液を5分間攪拌する。攪拌した溶液へ、
前記フェノールフタレイン指示薬溶液401Ltを添加
しそして得られた溶液を0.01 NHClで明きらか
な終点まで滴定する。
終点に達するまでに要した酸の体積を記録する。
前記ステップ(1)の被覆及び乾燥操作の際、たとえば
二酸化炭素吸着等による水酸化リチウムの損失が全くな
い場合、試験ツク、チに存在する水酸化リチウムの理論
量は、o、 o i NHctを用いた前記滴定操作で
表わして水酸化リチウム1.70 X 10−2mKq
である。残シの被覆されたプラスチ、り支持体を温度約
21℃、相対温度約50%の室内雰囲気で8日以上貯蔵
する。この8日の貯蔵期間のそれぞれ4日目及び8日目
に更に1.6cmの正方形の試験パッチを前記被嶺グラ
スチ、り支持体から切シ出しそして最初の試験/中、チ
に用いた方法と同じ方法で試験しパッチに含まれる塩基
の量を測定する。
(3)ステ、fl及び2で測定した各三つの試験・譬ツ
チそれぞれに存在する塩基の量を評価し、そして比較す
る。各試験/4ツチで測定する塩基の絶対量が水酸化リ
チウム約0.8X10  mEqに等しいかX線この値
を越える場合、試験下の特定ポリマーは必要なアルカリ
保護能を示し、本発明に有用である。
本発明に有用なポリマーのアルカリ保獲性を評価する前
記試験の使用を示すいくつかの例を以下の例に掲げる。
かような試験の結果は第1図に示すグラフに掲げる。
前記試験によって、本発明に用いる特殊なアルカリ保躾
性ぼりマーの選択は比較的簡単な作業になるのはもちろ
んである。かくして所定のポリマーをルーチン作業によ
り評価し、アルカリ保鰻性であるかないか、そしてそれ
故本発明に有用であるかどうかを決定することが出来る
。従って本明細書で用いる”アルカリ保膜性”という表
現は前記試験によシ定義される。
前記試験によシ評価するアルカリ保護性に基づき、本発
明に用いるに有効であることがわかっているIリマーの
特殊な一部の代表例には、/す(ビニルピロリドン)、
テリ(アクリルアミド)、アガロース及び特にビニルピ
ロリドンとアクリルアミドとの共重合モノマーブレンド
から製造したコ/ 9−t−がある。前記コIリマーは
アルカリ保護性を示すばかりでなく、更に、良好なフィ
ルム、形成性及び(大量の塩基の存在下で)慣用のグラ
スチックフィルム支持体に対する良好な接着性を示すも
ので%に有用であることが判明した。前記支持体はたと
えばポリ(エチレンテレフタレート)か又は載置層への
接着性を改善する為に以下に記載のような表面処理を施
したIす(エチレンテレフタレート)から成る。更に、
これらコーリマーは容易に被扱可能であルそして高温被
覆条件(即ち約50℃を超える温度)を用いなくても容
易に乾燥可能であり、そして乾燥時間に対し過度の感受
性を示さない。好ましいコ4すi−はビニルピロリドン
約20ないし約80重量−とアクリルアミド約80ない
し約20重量%とを含むモノマーブレンドから製造した
コーリマーである。等重量のアクリルアミドとビニルピ
ロリドンとから成るモノマーブレンドから製造したコポ
リマーが特に好ましい。
本発明に用いるアルカリ性生成組成物に組み入れられる
塩基として有用であることが見い出された塩基性化合物
には、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、それらの混
合物等のような実質的にナトリウムイオンを含まぬ強塩
基性化合物がある。
特に水酸化リチウムが好ましく、水酸化リチウムは水性
被覆ドーグから容易に被後可能であシ、そしてこれは適
切なアルカリ保股性ポリマーと混合する場合、非常に安
定でihりそして高度のアルカリ性を保持することがわ
かった。当然のことながら専質的にナトリウムを含まな
いその他の強塩基性化合物も本発明の範囲内で使用可能
である。
前述のごとく、用いる塩基の量は使用の通常の条件下で
素子の声を約12.0を超える−にするのに十分な量で
なければガらない。本発明に用いる塩基の実際の量はた
とえば使用条件下で素子又はその一部内で保持されるこ
とが所望な特定のアルカリ度及び使用条件下で素子内へ
浸透する水性液体の量に依存して可変である。即ち選定
し九特定の試薬組成物が約13.5ないし14のオーダ
ーの非常に高い−でのみある被検体と相互作用する組成
物である場合は、選定した特定の試薬組成物が約12.
5ないし13.5の範囲の−である被検体と相互作用す
る組成物である場合よシ大量の塩基が必要とされる。
一般に本発明に用いるアルカリ生成組成物内のアルカリ
保護性/ +77−の量は、組成物に用いる塩基量に依
存する。一般に存在する塩基量1重量部に対し、約2な
いし約5重量部のアルカリ保饅性Iリマーが有用な結果
を与えることが見い出された。当然、考察中の特定のア
ルカリ保膜性?リマー、それと混合する特定の塩基性化
合物及びアルカリ性生成組成物を組み入れる分析素子の
構造に依存して、前記範囲外の量のアルカリ保鏝性4リ
マーを用いて本発明の範囲内で有用な結果を得ることが
できる。
本発明方法において使用する試薬組成物には種雅の活性
物質が含むことができる。これらの物質は化学的か又は
物理的に相互作用し、そして被検体含有水性液体で分析
素子を処理する際素子内に検出可能表変化を生成する。
特定試薬組成物がいくつかの異なる活性物質を含むこと
は異例なことではなく、これらの物質は、前記試薬組成
物含有分析素子を被検体含有水性液体で処理の際個々の
物理的又は化学的相互作用を多数受けることがある。所
定の試薬組成物に一種よシ多い活性物質を含ませること
ができるので、個々の活性物質を本発明の分析素子の一
つを超える場所、たとえば一つを超える区域に分布させ
ることができる。従って本発明の多区域分析素子では、
そこに用いる試薬組成物の各活性物質を素子の試薬区域
にのみ組み入れる必要は々い。たとえば一体型多層分析
素子に用いる所定の試薬組成物の一つ又はそれ以上の活
性物質を拡散層に組み入れてもよいし、また放射線グロ
、キング層、レジストレージ、ン層、−退場もしくは以
下に記載するような素子のその他の中間層のような素子
のその他の任意の層の一つに組み入れてもよい。当然ど
の場合も所定の試薬組成物に含まれる各活性物質が分析
素子の試薬区試に少なくとも一つそしていくつも組み入
れられる場合が多い。更にもちろんのことであるが、本
発明方法に使用する分析素子が一つを超える試薬区域を
含む場合がある。
本発明方法に用いる試薬組成物の特定組成は、素子へ適
用する特定の被検体及び素子内における検出可能な変化
の存在を分析するに用いる特定の分析手段°にかなシ依
存して可変である。一般に本発明は、高アルカリ性雰囲
気下で相互作用する一つ又はそれ以上の活性物質を含む
試薬組成物と両立可能であシそしてこれら組成物に特に
有用であることはもちろんのことである。更にもちろん
のことであるが所定の被検体に対し、使用可能ないくつ
かの異なる種類の相互作用性組成物が存在可能である。
一般に本発明に用いる試薬組成物には、一つ又はそれ以
上の活性物質が含まれ、それはそのままで直接検出可能
であるか又は被検体、又は被検体分解物若しくは反応生
成物と互いに相互作用して検出可能な物質を生成可能で
ある。このようにして試薬組成物中に必要な活性物質を
提供して本発明に所望の被検体含有水性試料適用の際検
出可能な変化を生成する。
本発明に有用な試薬組成物の活性物質として広範囲の種
々表物質を使用することができる。これら活性物質には
比色測定によシ検出可能な染料及び顔料、螢光測定によ
シ検出可能な染料及び顔料、放射性ラベル物、ラベル付
きの、抗原−抗体コンブレックス、酵素並びにこれら物
質の前駆体及び反応生成物がある。これら物質に関する
詳細は前記米国特許第3.992,158及びドイツ国
公開公報第2,801,455号に記載されている。
前述のごとく本発明方法はビウレット試薬組成物を用い
る。ビウレット試薬組成物は、12.0の一しベル好ま
しくは12.5又はそれ以上の一レベルのような高アル
カリ性雰囲気下で血清又は血漿のような水性液体に含ま
れる蛋白質と相互作用する。この相互作用の結果ビウレ
ット試薬は、蛋白質の存在下で検出可能表色変化(紫色
を生成)を容易に生成する。周知のごとく慣用のビウレ
ット試薬組成物の成分には、第二銅塩、特に水溶性第二
銅塩、そして所望なら不溶性水酸化銅の沈澱を減少又は
防止するキレート化剤がある。種々の界面活性剤も場合
によってはビウレット試薬組成物に組み入れてもよい。
&々の第二銅塩及びキレート化剤が先行技術のビウレッ
ト試薬組成物に用いられてきた。それらの代表例の一部
には、過塩素酸第二銅、硫酸第二銅、酢酸第二銅、酪酸
第二飢臭素酸第二銅、塩素酸第二銅、臭化第二銅、塩化
第二銅、弗化第二銅、重クロム酸第二銅、ギ酸第二銅、
沃素酸第二銅、乳酸第二銅、オルトリン酸第二銅、ラウ
リン酸第二銅、サリチル酸第二銅、硝酸第二銅、酒石酸
第二銅及びシ、つ酸第二銅がある。特に好ましい第二銅
塩は硫酸第二銅である。
代表的なキレート化剤(又は安定化剤と呼ばれることも
ある)には酒石酸塩、クエン酸塩、エチレンジアミン等
がある。
前記ビウレット試薬組成物は高アルカリ性雰囲気を必要
とするので本発明に用いるアルカリ性生成組成物は、そ
れらに特に有用である。アルカリ性生成組成物を本発明
に用いる分析素子内でビウレット試薬組成物と共に用い
る場合、前記アルカリ性生成組成物紘、ビウレット試薬
組成物が組み入れられている区域とは離れているが、流
体接触している素子の区域に位置させてもよい。しかし
ながらアルカリ性生成組成物がビウレット試薬組成物と
同じ区域に位置しそしてアルカリ性生成組成物の塩基性
化合物がビウレット試薬組成物の構成?+、を成すよう
することが好ましい。
本発明の特に好ましい態様では、改善されたビウレット
試薬組成物が提供される。この態様ではビウレット試薬
組成物には実質的にナトリウムイオンが含まれず、そし
て水溶性第二銅塩、銅キレート化剤前駆体及びピウレ、
ト組琲物使用条件下で約12.0を超える−にするのに
十分な量の塩基が含まれる。銅キレート化剤前駆体はピ
ウレ、ト試薬組成物使用の高アルカリ性条件下で銅キレ
ート化剤へ転化する物質のことであり、たとえば酒石酸
の場合は酒石酸塩へ転化する。本発明のこの態様では特
に好ましいピウレ、ト試薬組成物社実質的にす) IJ
ウムを含まぬ、硫酸第二銅、酒石酸及び水酸化リチウム
の混合物である。
本発明の改善されたビウレット試薬組成物に用いる種々
な成分の量は、特定のビウレット試薬組成物が有効であ
る蛋白質被検体の濃度範囲に幾分依存して可変である。
一般に分析すべき蛋白質1グラムに対し水溶性第二銅塩
約0.5fないし約1ofとしなければならない。銅キ
レート化剤前駆体の量は一般に組成物に存在する第二銅
塩の量に依存し、典型的には第二銅塩1モルに対し約0
.5ないし約2モルのキレート化剤となるように存在す
る。
前記の改善されたビウレット試薬組成物は1乾式化学”
分析素子に用いるに%に適する。しかしながらこの組成
物はま九、水性液体試料に含まれる蛋白質の1湿式化学
”分析においてビウレット試薬組成物として用いること
もできる。ビウレット試薬を用いたかような湿式化学分
析を実施する方法及び操作は周知であシ、そしてそれ故
これら′操作に関する広範な記載は本明細書では不必要
であると考える。
本発明の改善されたビウレット試薬組成物を乾式化学分
析素子に組み入れる場合、これら組成物を前記アルカリ
保膜性4リマーと共に前記素子の試薬区域に組み入れる
ことが有利である。界面活性剤、別のIリマ−(たとえ
ばバインダ)等のようなその他の妨害作用のない添加物
も、改善されたビウレット試薬組成物及びアルカリ保腹
性ポリマーと共に試薬区域に組み入れてもよい。
前記のごとく、適切なアルカリ性生成組成物並びに改善
されたビウレット試薬組成物を広範囲のスペクトルを有
する1乾式化学”分析素子に使用可能である。前記素子
は様々な構造形態をとり、そして種々の物質を含む、た
とえばこれら組成物を次のような分析素子構造物に組み
入れ可能である。即ち前記構造物には、比較的簡単な”
浸漬及び解読”試験ストリッグ;前記ドイツ国公開公報
第2,801,476号の第2図に記載のような、協働
する試薬区域に接する拡散区域を支える支持体を有する
多区域分析費素;並びに前記米国特許第3.992,1
58号、同第4,042,335号及びドイツ国公開公
報第2,801,455号に記載のような、試薬層、拡
散層、レジストレージ、ン層、放射線プロ、キング層、
r退場及び下塗層を含む二つ又はそれ以上の載置連続層
を支える放射線透過支持体を有する一体型多層分析素子
がある。現時点で本発明の最善の様式を好都合に示す為
に、以下本発明を前記一体型多層分析素子において具体
化したごとく記載する。しかしながら株々の、その他の
素子構造物によシ、本明細書で幅広く記載する本発明を
具体化してもよいことはいうまで4ない。
本発明の一体型多層分析素子は典型的にL拡散層及び試
薬層を含み、そしてそれらは両方とも放射線透過性であ
るのが好ましい。かような素子は、支持体上に、好まし
くは放射線透過支持体上に層を有することが出来る。し
かしながら層が適切な耐久性及び保全性を示す場合は支
持体は不用である。
ある好ましい態様では、この一体型分析素子は(1)水
に浸透性で自身に含有するビウレット試薬組成物のよう
な試薬組成物の活性物質を溶解する試薬層及びQ)水に
浸透性である拡散層を支持する放射線透過性支持体を含
む。試薬層は支持体と拡散層との間に介在する。拡散層
は適用する水性液体試料の溶解成分へ実質的に均一な浸
透性を有することが好ましい、素子が試薬層にビウレッ
ト試薬組成物を含むこれら態様では、拡散層は試薬層の
ビウレット組成物の溶解した活性物質に対しても実質的
に均一な浸透性をン、・することが好ましい。
これら態様で社試薬層は蛋白質、たとえばアルブミンや
分子量範囲60,000 (ダルトン単位)又はそれ以
上の蛋白質に対し実質的に不浸透性であるのが好まい〜
その結果ビウレット試薬組成物の溶解物質は素子の拡散
層に保持される蛋白質と相夏作用する。
本発明に従って、前記好ましい態様に関して前述したよ
うな試薬層及び拡散層を支持する支持体を有する一体型
分析素子が提供される。しかしながらこの好ましい態様
に従って、望ましくは等方的に多孔性の非繊維性拡散層
を更に素子に含める。
この態様の一面ではすべての層は好ましくは非繊維性で
あり、それによって素子の定量分析性が増強される。こ
の明細書において層及び/又は物質に関して用いる1非
繊維性”という表現によシ、かような層及び物質に繊維
性物質が含まれないか又は実質的に含まれないことが示
される。即ち前記層及び物質に1試料拡散を妨害するか
又紘ラジオメトリーによる分析結果の測定を妨害する程
度までの繊維性成分しか含まれないことが示される。
前記米国特許第3,992,158号に更に詳しく記載
されているよう表種々の成分を用いて好ましい拡散層を
製造することが出来る。本発明において粒状物質を用い
てかような層を構成することが出来る。これらの層の等
方的多孔性は粒子間の相互連絡空間によシつくられる。
分析下の試料成分に対しすべてが望ましく鉱化学的に不
活性の様々な型の粒状物質が有用であ)、これらKは、
二酸化チタンのような顔料、ケイソウ土粒子、ガラスピ
ーズ、!ラスチックビーズ及び天然X線合成ポリマーか
ら誘導した微結晶性コロイド物質(たとえば微結晶性セ
ルロース)がある・ このような粒状物質に代わるものとして、又はそれに加
えて等方的に多孔性のポリマー組成物を用いて拡散層を
製造することが出来る。米国特許第3,555,129
号及び前記米国特許第3.992.158号に記載のよ
うなデラ、シュ(blush )されたポリマーの形成
に有用な方法を用いて前記テリマー組成物を製造するこ
とが出来る。等方的に多孔性のIリマー組成物を製造す
るに有用なその他の方法には、米国特許第2,960,
728号及び同第2.946,095号に記載のような
孔を創シ出す気体又はその他の膨張性成分の使用に関す
る方法又は米国特許第3,816,575号に記載のよ
うな溶解して孔を形成する溶解性成分の重合相内におけ
る使用に関する方法がある。本発明に用いる等方的多孔
性のプラ、シ、されたポリマー拡散層製造に多くの種々
のポリマーを単独で又は組み合せて使用することが出来
る。典型的な前記−リマーには4リカーゲネート、4リ
アミド、4リウレタン及び酢酸セルロースのよう々セル
ロースエステルがある。
拡散層の厚き及びその孔サイズ祉可変であ)、それらは
目的とする被検体のサイズ、目的とする試料の容&(こ
れは好都合に行う為及び清潔さの観点から拡散層が吸収
することができなければならない容積である)及び層の
空隙率(−イド−リーム)に幾分依存する。前記空隙率
は層中へ吸収されうる試料量にも影醤する。乾燥厚が約
50ミクロンないし約300ミクロンの拡散層が特に有
用であった。しかしながらこの厚さは幅広く変化させる
ことができ、そして特定素子にとっては望ましい場合が
ある。約1ないし約30ミクロンの拡散層の孔サイズが
有用であることを見い出した。
前記素子の試薬層は氷及びそれに含まれる溶解物質に対
し均一に浸透可能であることが望ましいが高分子量蛋白
質に対し実質的に不浸透性かつ非有孔性であるのが望ま
しい。この明細書において、”浸透性”という表現は、
多孔性から生じる浸透性、膨潤性又はその他の特性を意
味する。試薬組成物が分布(即ち溶解X線分散)するフ
ィルム形成性4リマーのようなマトリ、クスを試薬層に
含ませることができる。しかしながら、本発明によくあ
るように、自身に前記アルカリ保睦性Iリマーを含む安
定なアルカリ性生成組成物を試薬層に組み入れる場合は
、十分な量のアルカリ保―性Iリマーが存在するという
条件で試薬層にマトリックス材料を用いなくてもよい。
マトリ、クス材料の選択は当然可変であり、そして試薬
組成物の成分やマトリ、クスに分布するその他の成分に
依存する4゜どの場合も、−r ) IJ 。
クス材料社試薬組成物に関し1非妨害性”でなけれにな
らない。即ちマトリックス材料はそれ自体が試薬組成物
の活性物質と結合することができないか、又紘相互作用
することができないものでなければならない。拡散層と
協働する試薬層にとって好ましいマトリ、クス材料祉非
緻維性であ〕、そしてこの材料には非妨害性の親水性物
質が含まれていてもよい。前記親水性物質Kaゼラチン
、親水性セルロース誘導体;ゼラチン、アラビアジム等
のような多糖類;及び水溶性ポリビニル化合物(たとえ
ば−リ(ビニルアルコール) 等)O!うな合成物質が
ある。セルロースエステル等のような非妨害性の物質も
有用である場合がある。多孔性でない場合は試薬層の浸
透性を強化する為に、分析下の液体の溶媒又は分散媒質
に膨潤性であるマトリ、クス材料を使用することが出来
る。また素子製造の際、たとえば被覆手段によるrs接
層の適用と相反さない材料を選ぶことが必要である場合
もある。たとえば個別的な連続層の形成が所望であシ、
そして目的とする分析が水性液体に関する場合、試薬層
に対し本質的に水溶性のマトリックスを選ぶことそして
拡散層のような婁接層に関しては、本質的に有機溶媒可
溶性であるか又は有機溶媒分散性の成分を選ぶことが適
切である場合がある。このような様式では溶媒の相互作
用が最小と々シ、そして輪郭のはつきシした層構造を形
成することが出来る。多くの場合に、高分子量の蛋白質
の試薬層中への拡散を防止する為に、拡散層自体よ)蝙
浸透性の低い試薬層とすることが望ましい場合がある。
このことは試薬層の有効孔サイズを減少させることによ
シ容易に行うことが出来る。相対的浸透性又は多孔性は
周知方法によシ測定可能である。
試薬層内に試薬組成物の一つ又はそれ以上の成分を分布
させて特定分析素子製造に用いる。マトリックス材料を
用いる場合はそれに試薬成分を溶解又は分散させるとと
Kよル試薬成分を分布させることが出来る。均一分布が
好ましい場合が多いけれどもそうで表〈てもよい場合も
ある。更に、前述のごとく素子に用いるアルカリ性生成
組成物を素子の試薬層に組み入れてもよい。
試薬層の厚さ及び浸透度は広く可変であシ、そしてそれ
は実際の用途に依存する。約10ミクロンな−し約10
0ミクロン以外の乾燥厚もある還境下では好ましいこと
もあるけれども、前記範囲の厚さが好都合であった。周
知方法に従って繊維性マトリ、クスを含浸させることに
より繊維性試薬層を形成することが出来る。
前記一体型分析素子製造の際、層を、使用する前に積層
することが可能な単独層として予備形成可能であるか又
は素子使用時に流体接触するようKなるまで単独層とし
て保持可能である。単独部材として予備形成した層を被
覆可能であるならば、典型的には層表面を溶液又状分散
液から被覆する。
前記表面か、ら層を乾燥時に物理的に除去可能である。
しかしながら連続層が所望な場合、何回もの除去及び積
層工程問題を回避可能な好都合な方法は、所望のように
最初の層の除去面又は支持体を被覆しそしてその後火の
層を前もって被覆した面上へ直接被覆する方法である。
このような被覆は種々の周知の被覆方法によシ実施可能
である。前記周知方法は前記米国特許第3,992,1
58号に詳しく記載されている。写真フィルムに用いら
れるような、下塗物質を非常に薄く適用するような表面
処理手段によシ、有害効果を及はすことなく中間層接着
問題を克服することが出来る。
本明細書において前述したごとく、前記分析素子は自己
支持性であるか又は支持体上に支持可能である。有用な
支持体物質には酢酸セルロース、ぼり(エチレンテレフ
タレート)、4リカー〆ネート及びIリビニル化合物(
たとえば?リスチレン勢)のような種々な重合体物質が
ある。特定素子に対する支持体は、結果を検出する様式
と相反さないように選定する。好ましい支持体には、約
300 am ないし約700 amの範囲内の波長の
電磁放射線を透過する放射線透過支持体がある。
素子の層にイオン性又は非イオン性界面活性剤のような
一つ文社それ以上の界面活性剤を組み入れることが有利
な場合がある。界面活性剤によシ、たとえば層の被覆性
が強化され、そして界面活性。
剤のような助剤の不存在下では液体試料によって容易に
ぬれない拡散層における拡散の程度が促進され、そして
拡散速度が速くなる。
前記分析素子を臨床化学の分野ばかシで用いるのでなく
化学的研究や化学プロセスコントロール分析においても
使用可能である。本発明の分析素子は血液、血清及び尿
のような体液の臨床試験に用いるに好適である。という
のは前記臨床試験では多数の反復試験を行う場合が多く
、そして試料採取後非常に短時間のうちに試験結果を必
要とする場合が多いからである。
前述のごとく、前記素子に放射線プロ、キング層が含ま
れていてもよい。放射線プロ、キング層はたとえば検出
に用いる波長の電磁放射線の通過を妨害する働きをする
。かような層には乳白剤が含まれ、これは自身の吸収性
、反射性等によプ層に組み入れられた場合に放射線妨害
効果をもたらす。本発明に従って、放射IwIfロ、キ
ング層には乳白剤含有マ) IJフックス含まれていて
もよく、前記乳白剤には炭素のような顔料か、又は金属
塩のようなその他の無機顔料がある。前記金属塩には二
酸化チタン、酸化亜鉛、磁酸バリウム等がある。一般に
本来反射性である!ラック、された4リマーに乳白剤を
含ませることは可能であシ、そして拡散層に有用である
ようなプラッシ、、連れたポリマーの層を放射線ブロッ
キング層として使用することもできる。
前記一体型分析素子に任意の放射線プロ、キング層を用
いることに加えて、所望ならその他の任意の中間層を組
み入れてもよい。たとえば米国特許第3,992,15
8号及び同第4.042,335号に記載のよう表素子
中で生成するか又はその素子中に放出される染料のよう
な検出可能な物質を受容するレジストレージ、ン層:P
濾過層;及び試薬組成物の様々な活性物質を含み、実施
する特定分析に関する潜在的訪害愉質と相互作用してそ
れらを有効に除く中間層を用いることが可能である。
もちろんのことであるが、種々な異なる素子を本発明に
従って製造可能でおる。素子を所望の幅の鷺伸テープ、
シート又は小チップのような様々な形に形成可能である
好ましい一体型素子は、分析下の液体試料を素子へ適用
することによシ使用に供せられる。典型的Ku適用試料
が試薬層より以前に拡散層と接触し、そして試料をこの
試薬層から最も離れ丸面でこのよう邊拡散層と最初KI
I!触するように素子を構成する。前記素子の分析精度
は、適用試料の体積変化によシ実質的な低下をきたさな
いので、手又は機械によって試料を適用することが可能
である。しかしながら分析結果の検出が好都合に行える
ので、適度に一貫性のある試料体積が所望である場合が
ある。
手を用いて行ってもよいし、また自動化4可能である。
前記一体型素子を用いた典淑的な分析操作では、素子を
供給ロール、チップパケット又はその他のソースから取
シ、そして液体試料を適切な分配器などのような手段に
よ)遊離滴、接触スポット又はその他の形態で受容する
ように位置させる。試料適用後、そして望ましくは液体
試料が拡散層によシ採取された後、素子に加熱、湿分付
与等のような調湿を行う。前記調湿は試験結果を得る速
度を速めたυまたさもなけれd試験結果を得やすくする
のに望ましい場合がある。
検出可能な変化として分析結果が得られた後、通常反射
又は透過スベクトロフォトメ) IJ−の適切な装置が
備えられている区域に素子を通すことによシ前記変化を
測定する。このような装置では、光のようなエネルギー
のビームが支持体及び試薬層を通して導かれる。・次い
で光は、たとえば素子の拡散層もしくは放射線ブロッキ
ング層の乳白剤から検出手段へ反射されるか又は透過検
出の場合には素子を通過して検出手段まで導かれる。好
ましい様式では、素子の領域内で(かような結果が生成
する領域内)分析結果を検出する。素子が透過可能であ
シ、そして素子内で生成する検出可能な変化を定量しう
るいかなる放射線も使用可能であるけれども、一般に約
400ないし約700ntnの範囲内の電磁放射線がか
ような測定に有用であることが見い出された。分析の対
照とする為に種々な較正方法が使用可能である。たとえ
ば分析において示差測定の使用を可能にする為に試料筒
を適用し九エリアKl!!Iして被検体の標準溶液試料
を適用することが出来る。
以下の例により本発明を東に詳細に説明する。
最初の例により本発明で用いる一つの好ましいアルカリ
保睡性ポリマーの合成を開示する。第二の例により、前
記オフ−ライン試験を用いることKよシ得られた結果を
開示する。前記試験は本発明に従りたアルカリ保護性ポ
リマーとして一連のポリマーを使用する場合のそれらの
適性を評価するものである。
例1:モノマー重量比50:50のポリ(アクリルアミ
ド−ツーN−ビニル−2−ピロリドンの合成 変性アルコール900 Ji’、アクリルアミド200
g及びビニルピロリドン200j’を蒸留水2700d
に添加した。この溶液を窒素ガスでパージしそして窒素
導入口、還流冷却器及び攪拌器を備えた丸底フラスコ内
で60℃とした。次いで、重合開始剤、2,2−アゾビ
ス(2−メチルプロピオニトリル)61をアセトン60
−に溶かした溶液を前記溶液へ添加した。60℃で16
時間経過後、得られた透明粘稠溶液の体積粘性率は固形
分1O88チにおいて12 S ep−であった。単離
したポリャOI N NaC1中で測定し九固有粘度は
0.94であり友。
例2:アルカリ保護性能に関するポリマーのオフ−ライ
ン試験 この例′では6種類の別々のポリマーのアルカリ保護性
能を前記オフ−ライン試験によシ評価した。
この例で試験し九6個のポリマーは次の通シである。
ポリマー4に2例1に記載したようなポリ(アクリルア
ミド−ツーN−ビニル−2−ピロリドン) ポリマー42:ポリ(アクリルアミド−ツー2−ヒドロ
キシエチルアクリレート)(モノマー重量比50:50
) ポリマー43:ポリ(2−ヒドロキシエチルアクリレー
ト) ポリマーI64:ボリ(アクリルアミド)ポリマーI6
5:ボリ(ビニルピロリドン)(GAF社からに一90
ポリマーとして販売)ポリff−A6:シープラークア
ガロース(剖÷SglrJaquPagarose )
これら6個のポリマーのオフ−ライン試験測定の結果を
第1図のグラフによプ示し良。第1図に示すようにポリ
マ−41a8日の試験期間全体に亘ってすぐれたアルカ
リ保護性能を示したが、ポリマーA2及び/I63は非
常に劣ったアルカリ保護性能しか示さなかった。第1図
から明らかなように、ポリマー&2とA3とを含む組成
物は、被覆直稜低い塩基含量を示した。これらポリマー
のエステル基に塩基によシ加水分解されうる加水分解位
置が存在するのでこれら組成物の前記ポリマーのアルカ
リ保護性能は劣っていると思われる。第1図から明らか
なようにポリマー&4及び4548日の試験期間に亘っ
て許容しうるアルカリ保護性能を示した。第1図のプロ
ットに示されるようにポリマーA1〜A5の試験を8日
間の試験期間を超えて更に継続した。
この継続試験では6番目のポリマー即ちマリーンコロイ
ド社により販売されているシープラークアガロースを用
いた以外は前記ポリff−Al〜ム5を評価する為に使
用した組成物と同じ被扱組成物を用いた。前記アガロー
スを前記オアーライン試験と非常に@似した方法で試験
し、そしてこの物質も非宵にすぐれ九アルカリ保護性能
を示すことを見■出した。ポリマーA6に関する第1図
のグラフの破線部分は単にこのポリマーのアルカリ性保
論性能を破線によシ示された期間試験しなかつたことを
示す。ポリマーA6に関する試験もこの8日のオフ−ラ
イン試験期間を超えて実施した。
例3:I!蛋白質測定用多層分析素子 この例で、は本発明に従ったアルカリ保護性ポリマー組
成物と改豐されたビウレット試薬組成物とを組み入れた
多層分析素子を製造した。この例では多層素子構造を次
のようにして製造した。
ポリ(エチレンテレフタレート)フィルム支持体を試薬
層及び拡散層で被板した。前記試薬層はアルカリ保護性
ポリマーとしてアガロース(16,01/m’  ) 
、 Cocoa ・5120 (10,8j’/m2)
 、 Li0H(5,4jl/m”) 、 11石11
 (8,O91m2) を含量、ソシて前記拡散層は微
結晶性セルロース粒子(即ちrnc社Hよシ販売されて
いるアビセル■)(64,5#/m )及びポリ(ビニ
ルピロリドン)(1,61/m )を含んだ。
前記構造を有する一連の素子に比色測定を行った。前記
測定は、540I1m、干渉フィルターを、次いで素子
のフィルム支持体を透過し、そしてフィルム支持体を通
って拡散層によシ反射される光線の反射濃度、D、の変
化を追跡することによ)行った。2〜129N、/V、
 (重量/単位体積)の範囲内の既知量の蛋白質(アル
ブミンを蛋白質として用いた)を含む水溶液を素子上に
スボ、トシながら、37℃において各素子のDII指示
値の変化を追跡した。素子の自身にスボ、トされた特定
のアルブミン含有試料に対する応答即ち各素子のDl 
を0−7分間観察した。素子でおこるビウレット反応か
ら生じる、素子の拡散層における発色は非常に迅速に生
成することがわかった。即ち2−71!(W、/V、 
)蛋白質含有試料の反応は1分未満で終了し、7%(W
/V)を超える蛋白質では反応時間は約7分まで長くか
かりた。試験し丸缶試料の7分におけるD1値を第1表
に掲けた。
第  1  表 2   0.10 4   0.20 6   0.37 7   0.42 8   0.58 10   0.64 12   0.68 例4:ナトリウムを含まないアルカリ性生成組成物の安
定性 本発明の幾つかの改曳点及び長所を示す為に、この例で
は多層分析素子を製造した。素子の一つ即ち対照を水酸
化リチウムよシもむしろ塩基として水酸化す) IJt
ムを用い″c製造し穴以外は各素子を前記例3に記載の
方法と同じ方法で製造した。
次いで一連の各素子を、2−1Oチ(W/V ”)の範
囲内のレベルの蛋白質を含む水fl!rtfLを用いて
例3と同様にして測定した。各素子を製造直後に測定し
そして室温(21℃)、50嗟R,H,で18日間貯貯
蔵後再測定した。各測定のDIll値を記11LAその
結果を下記第2表に掃けた。第2表の結果かられかるよ
うに、水酸化リチウムを含みそしてナトリウムイオンを
含まない本発明の分析素子社18日間の貯蔵期間全体に
亘って非常に安定な  ID、値を示した。対照的に水
酸化す) IJりムを含む対照素子は18日間の貯蔵の
後感度のかなシの低下を示した。
以下;コミ白 例5;総総蛋白質測定用層分析素子 例3で用いたアルカリ保鰻性ポリマー、アガロースのか
わりに例1に記載のごとくして製造したポリ(アクリル
アミド−ツーN−ビニル−2−ピロリドン)を用いた以
外は、この絡では総蛋白質測定用の多層分析素子を例3
に記載の方法と同一の方法で製造した。4ないし12%
(W/V)の範囲内のレベルの蛋白質を含む血清溶液に
対する素子の応答を、前記例3に記載方法と同じ方法で
測定した。素子において良好な応答が得られた。
素子応答の直線性が改善されたので、この素子の全体的
な性能は、例3の素子の性能よシもまさしくすぐれてい
ると思われた。更に前記コーリマーを含む素子の試薬層
の接着性及び被覆性は、アガロースを含んだ例3の素子
の試薬層のそれらと比べてすぐれていた。
【図面の簡単な説明】
第1図は本発明に有用なアルカリ保農性ポリi−として
のポリマーの適切性を示すグラフ図である・ ポリマーA1:ポリ(アクリルアミド−ツーN−ビニル
−2−ピロリドン) ポリマーム2:ポリ(アクリルアミド−クー2−ヒドロ
キシエチルアクリレート) ポリ!−43:/す(2−ヒドロキシエチルアクリレー
ト) ポリマーA4:ポリ(アクリルアミド)ポリマー扁5:
ポリ(ビニルピロリドン)ポリマーA6:シーグラーク
アガロース特許出動人 イーストマン コメ、り カンノニー 特許出願代理人 弁理士青水 朗 弁理士西舘和之 弁理士 石 1)  敬 弁理士 山 口 昭 之 図面の浄′:(内容に変更なし) 第1図 Li011手法被覆の安定性 貯蔵日数 手続補正書(方式) %式% 1、事件の表示 昭和57年 特許願  第181225号2、発明の名
称 蛋白質分析方法 3、補正をする者 事件との関係  特許出願人 名称  イーストマン コメック カンパニー4、代理
人 (外 3 名) & 補正命令の日付 自発補正 6、補正の対象 図   面 7、補正の内容 図面の浄書(内容に変更なし) 8、添付書類の目録 浄書図面     1通

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、水性液体試料中の蛋白質分析方法において、(1)
    前記試料をビウレット試薬で処理して前記蛋白質と前記
    ビウレット試薬との相互作用に際し放射線もしくは輻射
    線測定によシ検出可能な色変化を生成し、そして(2)
    前記色変化を検出する方法であって、前記ビウレット試
    薬が、実質的にナトリウムイオンを含まずそして、水溶
    性第二銅塩、銅キレート化剤前駆体及び前記試料を処理
    する間約12.0を超えるーとするのに十分な量の塩基
    を混合状態で含む組成物から成ることを特徴とする蛋白
    質分析方法。 2、前記ビウレット試薬が硫駿銅、酒石酸及び水酸化リ
    チウムを含む特許請求の範囲第1項記載の蛋白質分析方
    法。
JP57181225A 1978-01-03 1982-10-15 蛋白質分析方法 Pending JPS5877664A (ja)

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