DE2900136C2

DE2900136C2 - Analytisches Element zur Bestimmung eines vorgegebenen Analyten in einer wäßrigen Flüssigkeit

Info

Publication number: DE2900136C2
Application number: DE2900136A
Authority: DE
Inventors: Jon Nathan Eikenberry; Karl John Sanford; Richard Calvin Rochester N.Y. Sutton
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1978-01-03
Filing date: 1979-01-03
Publication date: 1985-03-21
Also published as: GB2011616B; GB2070770B; CH644454A5; GB2011616A; FR2413658A1; US4132528A; JPS5877664A; FR2413658B1; GB2070770A; DE2900136A1; JPS54101398A; JPS616340B2; CA1120832A

Description

dadurch gekennzeichnet, daß das Element ein stabiles, im wesentlichen Natriumionen-freies Alkalisierungsmittel enthält, das eine Mischung aus

(a) einer Menge an Base, die beim Gebrauch des Elements zur Erzielung eines pH-Wertes größer als

ungefähr 12,0 ausreicht, und
H (b) einem Alkalischutzpolymeren

S| umfaßt.

fo| Z Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Base um Lithiumhy-

¹S^ droxid, Calciumhydroxid oder deren Mischungen handelt.

'f\ 3. Analyt«ches Element nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich beii dem

ώ τι- Alkalischutsaolymeren um Agarose. Polyacrylamid oder Polymere mit wiederkehrenden Einheiten, die sich

?! von Vinylpyrrolidon ableiten, handelt

r.i 4. Analytisches Element nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem

& Alkalischutzpolymeren um ein Copolymer handelt, das aus einer Monomermischung aus 20 bis 80 Gew.-%

£ Vinylpyrrolidon und 80 bis 20 Gew.-% Acrylamid hergestellt ist.

£| 25 5. Analytisches Element nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkalisie-

': rungsmittel 2 bis 5 Gew.-Teile aes Polymeren auf einen Gewichlsteil Base entlv~.lt.

6. Analytisches Element nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es mehrere Zonen einschließlich eine Ausbreiuone und einer Reagenszone, die bei Gebrauch des Elements miteinander in fluidem Kontakt stehen, aufweist, wobei die Rcagenszusammensetzung ein aktives Mittel enthält, das bei

■ ■ 30 einempH-W?r* von größer als etwa 12,0 reaktiv ist.

ρ 7. Analytisches Element nach Anspurch 6. dadurch gekennzeichnet, daß

(1) die Ausbreitzone sti ah'.ungsdurchlässig ist;

^: (2) die Reagenszone ein Biuret -Reagens enthält, das praktisch frei von Natriumionen ist und in Mischung

ein wasserlösliches Kupfer-ll-Salz, einen Vorläufer eines Kupferchclatbildnc-rs und ein stabiles Alkalisierungsmittel enthält, wobei das Alkalisierungsmitiel

(a) eine Menge an Base, die beim Gebrauch des Elements zur Hervorrufung einer Reaktion zwischem dem Kupfer-ll-Salz mit dem Protein unter Bildung einer radiometrisch nachweisbaren Veränderung des Elements ausreicht, und
(b) ein Alkalischutzpolymer,

umfaßt, und

(3) die Ausbreitzone und die Reagenszone auf einem strahlungsdurchlässigen Schichtträger angeordnet sind.

8. Analytisches Element nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Vorläufer des Kupferchelatbildners aus Weinsäure und das Alkalisicrungsmittcl ans einer Mischung aus Lithiumhydroxid und einem Polymeren aus Agarose oder einem Polymer mil wiederkehrenden Einheiten, die sich von Vinylpyrrolidon ableiten, besteht.

9. Analytisches Element nach einem der Ansprüche I His 8. dadurch gekennzeichnet, daß die Zonen in Form integraler, übereinander angeordneter Schichten vorliegen.

10. Analytisches Element nach Anspruch 9. dadurch gekennzeichnet, daß die Ausbrcilschicht eine nichtfaserige Zusammensetzung aufweist.

11. Analytisches Element nach einem der Ansprüche I — 10 zur Analyse von Proteinen in einer wäßrigen Flüssigkeitsprobe, dadurch gekennzeichnet, daß es als Rcagenszusammensetzung eine Mischung aus einem wasserlöslichen Kupfer-ll-Salz. einem Vorläufer eines Kupfcrchelaibildncrs. einer Menge an Base, die beim Gebrauch des Elements zur Erzielung eines pH-Wertes größer als ungefähr 12.0 in der Zusammensetzung ausreicht, und einem Alkalischutzpolymercn umfaßt.

12. Analytisches Element nach Anspruch 1 !,dadurch gekennzeichnet.daß es eine Mischung aus Kupfcrsulfat, Weinsäure und Lithiumhydroxid umfaßt.

Die Erfindung betrifft ein analytisches F.lc-ment zur Bestimmung eines vorgegebenen Analyten in einer wäßrigen Flüssigkeit mit

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(a) einer Zone zum Verteilen des Analyten und

(b) einer mil der Zone in Verbindung siehenden Reagenszusammenselzung, die durch Reaktion des Elements mit einer Analyt enthaltenden Flüssigkeit eine nachweisbare Veränderung im Element ergibt.

Analytische Elemente dieses Typs, die zur Bestimmung bestimmter Substanzen in wäßrigen Flüssigkeiten. insbesondere biologischen Flüssigkeiten, wie z. B. Blut, Serum und Urin, eingesetzt werden können, sind als sog. »grifftrockene« Elemente bekanntgeworden. Zu typischen »grifftrockenen« analytischen Elementen gehören »Einlauch- und Ablcsew-Testsireifen und analytische Testelemente mit mehren Zonen, d. h. sog. mehrschichtige analytische Elemente. Ein besonders vorteilhafter Typ eines mehrschichtigen analytischen Testelementes ist z. B. aus der US-PS 39 92 158 bekannt. Testelementc dieses Typs dienen der Durchführung von »trockenchemischen« Analj'semethoden im Gegensatz zu den bekannten »naßchemischen« Analysemethoden, bei denen die zur Analyse benötigten Reagentien in einem flüssigen, wäßrigen Träger aufgelöst oder suspendiert werden.

Häufig ist es notwendig, eine bestimmte Analyse bei hohem pH, beispielsweise einem pH größer als ungefähr 12,0, durchzuführen, je nach dem zu analysierenden Analyten oder der jeweiligen Reagenszusammensetzung im Testelement. Beispielsweise läßf sich die Analyse wäßriger Flüssigkeiten, wie Serum und Urin auf ihren Proteingehalt mittels, einer Biurct-Reagenszusammensetzung durchführen. Ein Biuret-Reagens enthält bekanntlich zweiwertige Kupferionen in Gegenwart einer Base ausreichender Stärke, die einen pH von größer als ungefähr 12 ergibt. Reagiert in einer wäßrigen Flüssigkeit, beispielsweise Serum, das Protein mit dem Biuret-Reagens, so erfolgt eine Reaktion zwischen den Kupfer-ll-Ionen und dem Protein, wobei eine violette Färbung entsteht. Üblicherweise erfolgt die Bestimmung des Protcingehaltes einer wäßrigen Flüssigkeit, wie beispielsweise vorn Humanserum, unter Verwendungeines Biurr -Reagens mach einer »naßchemischen« Methode.

Vorteilhaft wäre es, wenn die naßchemische Methode so modifiziert werden könnte, daß sie ohne weiteres als »trockcnchemische« Methode durchgeführt werden kann, bei der man z. B. einen »Eintauch- und Ablese«-Te»tslreifen verwendet, wenn man qualitative oder halbquantitative Ergebnisse wünscht, oder ein analytisches Element mit mehreren Zonen, z. B. ein mehrschichtiges analytiscncs Element, wenn quantitative Ergebnisse erhalten werden sollen. Bei dem Versuch, stark basische Verbindungen in trockenchemische analytische Elemente einzuarbeiten, tritt jedoch das Problem auf, daß viele Verbindungen, die bei ihrem Einsatz zunächst zu einer stark alkalischen Reaktion führen, beispielsweise Natriumhydroxid, die Befähigung zur Hervorrufung eines hohen pH-Wertes schnell verlieren. Dies führt dazu, daß ein typisches trockenchemisches analytisches Element, das basische Verbindungen des erwähnten Typs enthält, nach einem relativ kurzen Zeitraum, beispielsweise nach 8 bis 10 Tagen, keinen hohen pH-Wert mehr liefert, wenn es mit einer wäßrigen Probe mit einem Analyten in Kontakt gebracht wird. Aus diesem Grunde kann die gewünschte Reaktion zwischen dem Analyten und der Reagenszusammensetzung, die eine stark alkalische Umgebung erfordert, entweder überhaupt nicht mehr erfolgen, oder sie wird stark gehemmt.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein analytisches Element zur Bestimmung eines vorgegebenen Analyten in einer wäßrigen Flüssigkeit anzugeben, das die Bestimmung des Analyten unter stark alkalischen Bedingungen, d. h. bei einem pH-Wert von größer als ungefähr 12,0 ermöglicht, ohne daß die geschilderten Nachteile auftreten.

Gelöst wird diese Aufgabe mit einem analytischen Element der eingangs genannten Art, das die im Kennzeichen des Anspruchs 1 aufgeführten Merkmale aufweist.

Kennzeichnend für ein erfindungsgemäßes analytisches Eiern .nt ist somit, daß es ein stabiles, im wesentlichen Natriumionen-freies Alkalisicrungsmittel emhält, das eine Mischung aus

(a) einer Base, die bei Gebrauch des Elements zur Erzielung eines pH-Wertes größer als ungefähr 12.0 ausreicht und

(b) einem Alkalischut/.polynieren u.nfaßt.

Die stabilen Alkalisierjngsmittel lassen sich zur Herstellung der verschiedensten analytischen Elemente verwenden, einschließlich der zuvor genannten »Eintauch- und Ablese«-Teststreifen und der zuvor genannten analytischen Elemente n;it mehreren Zonen, wie beispielsweise zur Herstellung der einstückigen Mehrschichtelemente der in den US-PS 39 92 158 und 40 42 335 sowie den DE-OS 28 01 455 und 28 01 476 beschriebenen Typen.

Zur Herstellung erfindungsgemäßer Elemente sind ferner die "'e^schiedensten Reagenszusammensetzungen geeignet.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform eines Elementes ;iach der Erfindung enthalt das analytische Element als Reagenszusammensetzung ein Biurct-Reagens, das den Nachweis von Proteinen ermög- 5b licht.

Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird zur Herstellung eines analytischen Elementes ein verbessertes Biuret-Reagens verwendet, das im wesentlichen frei von Natriumionen ist und enthält: ein wasserlösliches Kupfer-Il-Salz, beispielsweise Kupfersulfat, einen Vorlaufer eines Chelatbildner für das Kupfer-ll-Salz, sowie eine Menge an Base, die bei der Verwendung des Biuret-Reagenses zur Erzielung eines bo pH-Wertes von größer als ungefähr 12,0 ausreicht. Eine besondere vorteilhafte Verbindung zur Bildung eines Chelats für das Biuret-Reagens ist Weinsäure. In stark alkalischer Umgebung wird Weinsäure in die Tartratform überführt, wodurch ein Chelatbildner für das Kupfer-Il-Salz entsteht.

Die Zeichnung(i⁷ · g. 1) veranschaulicht die Eignung von bestimmten Polymeren als Alkiilischulzpolymere.

In vorteilhafter Weise hat ein crfirulungsgemäßes Element den Aufbau eines mehrzonigen analytischen Elementes des aus der DE-OS 28 01 476 bekannten Typs oder eines mehrschichtigen analytischen Elementes, wie sie beispielsweise aus der genannten Druckschrift, aus den US-PS 39 92 158 und 40 42 335, sowie der DE-OS 28 01 455 bekannt sind. Bei solchen mchrzonigen analytischen Elementen liegt üblicherweise eine Ausbreitzone

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vor, um die zu analysierende wäßrige Flüssigkeitsprobe zu trnnsporliercn und im analytischen Element zu verteilen. Diese Ausbreitzonc kann daher als Zone zur Verteilung des Analytcn dienen.

Die mehrzonigcn Elemente weisen einen solchen Aufbau auf, daß die Rcagenszone mit der Ausbreitzone in Verbindung stehi. Hierdurch kann die Au'.brcitzone die flüssige Tcsiprobe verteilen, wobei ein fluider Kontakt s mit der Reagenszonc gebildet wird.

Das stabile Alkalisierungsmittel kann bei einem mehrzonigen Element entweder in die Ausbreilzonc oder in die Reagenszone eingebracht werden. Alternativ kann es in einem derartigen mehrzonigen Element in einer getrennten Zone des Elements vorliegen, das wiederum beim Gebrauch des Clements in fluidem Kontakt mit der Ausbreitzone und der Reagenszone steht. Auf diese Weise kann eine aufgebrachte wäßrige Probe mit dem Alkalisierungsmittel in fluiden Kontakt gelangen und mit diesem reagieren, wodurch in einer oder mehreren Zonen des Elements die gewünschte alkalische Umgebung geschaffen wird.

Gemäß einer weiteren Ausgestaltung eines erfindungsgemäßen Elementes mit mehreren Zonen ist dieses als einstückiges Element ausgebildet, in dem die Ausbreitzone, die Reagenszone und ggf. vorgesehene andere Zonen im Element durch übereinandergelagerte Schichten gebildet werden, die von einem geeigneten Träger. beispielsweise einem »strahlungsdurchlässigen« Träger getragen werden.

Der hier verwendete Begriff »strahlungsdurchlässig« bedeutet, daß ein wirksamer Durchtritt elektromagnetischer Strahlung zur Bestimmung eines im Element gebildeten analytischen Ergebnisses erfolgt.

Di.T.^o5!ri!i lirnfäßt die Durch!äSS!^akelt bei dcn'Cni°Cn crfin^<LU¹P°^f*^:o?r^r^.[Jcⁿ analytkrhen !'!lementen, bei denen

das hervorgerufene analytische Ergebnis durch eine sichtbare Farbänderung im Element nnchwcisbar ist. einen Durchlaß elektromagnetischer Strahlung einer Wellenlänge oder von Wellenlängen im sichtbaren Bereich zwischen ungefähr 400 Nanometern und 700 Nanometern. Soll das hervorgerufene analytische Ergebnis durch elektromagnetische Strahlung außerhalb des Bereichs der sichtbaren Wellenlängen nachgewiesen werden, so ist eine »strahlungsdurchlässige« Zone, Schicht oder Träger für diese spezifische Strahlung durchlässig, gleichgültig ob es sich beispielsweise um ultraviolette Strahlung, Infraroistrahlung oder durch Radioaktivität hervorgerufene Strahlung handelt.

Wie zuvor erläutert, befinden sich die verschiedenen einzelnen Zonen eines erfindungsgemäßen analytischen Elements mit mehreren Zonen mindestens während der Vcrwendving des Elements miteinander in fluidem Kontakt. Der hier verwendete Begriff »fluider Kontakt« bedeutet, daß eine wäßrige Flüssigkeit im Falle übereinander gelagerter oder angrenzender Zonen eines analytischen Elements von einer Zone in die andere Zone übertreten kann. Miteinander in fluidem Kontakt stehende Zonen können unmittelbar benachbart sein, sie können jedoch auch durch dazwischenliegende Zonen getrennt sein unter der Voraussetzung, daß derartige, physikalisch trennende Zonen ebenfalls in einem derartigen fluiden Kontakt stehen und den Durchtritt von Fluiden nicht verhindern.

Ein fluider Kontakt zwischen Zonen der bevorzugten erfindungsgemäßen Elemente mit mehreren Zonen üäßt sich erzielen, indem man Elemente mit Zonen herstellt, die bereits von Anfang an benachbart sind oder effektiv hinsichtlich des Fluiddurchtritts aneinandcrgren/.eti. Alternativ kann es angezeigt sein, Elemente herzustellen, die anfänglich nicht aneinandergrenzende Zonen aufweisen, wobei die Zonen darüber hinaus beispielsweise durch Verwendung von Zwischenblättern oder von nachgiebigem, absorbierendem Material oder durch Verwendung eines verformbaren Trägers, im Abstand voneinander gehalten v/erden können. Falls das Element anfangs keine benachbarten Zonen aufweist, ist ersichtlich, daß man ggf. cin>en Preßdruck anwenden oder eine Vorrichtung vorsehen muß, um derartige nichtangrenzende Zonen des Elements bei seiner Verwendung in fluiden Kontakt zu bringen.

Die Erfindung läßt sich auch ohne weiteres auf weniger quantitative analytische Elemente, beispielsweise ;auf »Eintauch- und Ablesew-Teststreifen, anwenden. Obgleich diese Teststreifen im allgemeinen keine so große Präzision oder Genauigkeit bei ihrer Herstellung erfordern und obwohl sie in ihrer physikalischen Struktur weniger komplex sind, kann man sie doch beispielsweise in Situationen einsetzen, in denen qualitative oder halbquantitative Ergebnisse erhalten werden sollen.

Derartige Teststreifen können in ihrer einfachsten Form aus einer einzigen Schicht bestehen, die als Zone zur Verteilung der zu analysierenden wäßrigen Flüssigkeit dient. Üblicherweise besteht diese einzelne Schicht aus

so einem faserigen Material, z. B. einem Nylonnetz oder einem Filterpapiermaterial, das mit einem oder mehreren aktiven Materialien imprägniert oder durchtränkt ist. das oder die als Rcagenszusammensetzung(en) für das Element dient bzw. dienen. Die stabilen Alkalisierungsmiitcl können auch in diese einzelne Schicht des Teststreifens oder in eine benachbarte Schicht des Teststreifen, die beim Gebrauch des Teststreifens mit der Reagensizusammensetzung in fluidem Kontakt steht, eingebracht werden. Bei seiner Verwendung wird der Teststreifen mit einer wäßrigen Flüssigkeit behandelt, die den gewählten Analytcn enthält, beispielsweise durch Eintauchen des Teststreifens in die Flüssigkeit oder durch Inkontaktbringen des Streifens mit der Flüssigkeit, wodurch die Flüssigkeit in den Streifen eindringen kann. Die Folge ist, daß der Analyt unter stark alkalischen Bedingungen mit der Reagenszusammensetzung reagiert. Die stark alkalischen Bedingungen werden dadurch hervorgerufein, dsß die wäßrige Flüssigkeit das im Streifen enthaltene Alkalisierungsmittel aktiviert. Dies führt zur Bildung einer nachweisbaren Veränderung im Streifen.

Bei dem erfindungsgemäß verwendeten Alkalisierungsmittel handelt es sich, um ein stabiles Alkalisierungsmiitel. Dies bewirkt, daß im Element, in das es eingebracht ist. stark alkalische Bedingungen geschaffen werden, und zwar selbst dann, wenn das Element über einen längeren Zeitraum bei Umgebungstemperatur und normaler relativer Luftfeuchtigkeit aufbewahrt wurde. Diese Stabilität hängt offensichtlich zum großen Teil davon ab, daß

to das Alkalisierungsmittel im wesentlichen frei von Natriumionen gehalten wird und davon, daß man in dais Alkalisierungsmittel ein Alkalischutzpolymercs einarbeitet. Insbesondere wird angenommen, daß — obgleich Natriumionen in vielen anorganischen Verbindungen vorliegen können, wenn es gilt, basische Verbindungen; zu schaffen, beispielsweise Natriumhydroxid, wasserfreies Natriumcarbonat und Nalriumorthophosphat — derar-

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(ige basische, Natrium enthaltende Verbindungen zu beträchtlicher Hygroskopizität neigen, selbst wenn sie mit einem Alkalischutzpolymcrcn vermischt undinanalytischc Elemente eingebracht sind. Die Folge hiervon ist, daß diese basische!:, Natrium enthaltenden Verbindungen die Tendenz aufweisen, der umgebenden Atmosphäre Wasserdampf zu entziehen, das sich wiederum mit ebenfalls in der umgebenden Atmosphäre vorhandenem Kohlendioxid vereinigen kann, was zur Bildung von Natriumhydrogencarbonat oder anderen Carbonaten im analytischen Element führen kann. Infolge der Pufferkapazität derartiger Carbonate verschlechtert sich die anf>igs starke Alkalinität, die mit basischen Natriumverbindungen, beispielsweise Natriumhydroxid, erzielbar ist, schnell. Die Folge hiervon ist, daß Rcagenszusammensetzungen, für die eine stark alkalische Umgebung benötigt wird, beispielsweise ein Biurct-Reagcns, das eine optimale Wirksamkeit unter alkalischen Bedingungen mit einem pH-Wert von größer als 12,0 l'at, lediglich eine wesentlich verminderte Wirksamkeit aufweisen oder sogar vollständig unwirksam werden.

Kin zweiter Hauptfaktor, der zur Stabilität des im erfindungsgemäßen Element enthaltenen Alkalisierungsmittels beiträgt, ist die Verwendung eines Alkalischutzpolymercn. Selbst bei stark basischen Verbindungen, die frei von Natriumionen sind, z. B. Lithiumhydroxid und Calciumhydroxid wurde festgestellt, daß die Fähigkeit zur Hervorrufung eines alkalischen pH-Wertes innerhalb eines relativ kurzen Zeitraumes, beispielsweise innerhalb von 8 bis 10 Tagen, abnehmen kann, wenn sie in ein analytisches Element eingearbeitet werden. Vereinigt man jedoch die Natrium-freien, basischen Verbindungen mit Polymeren, die hier als »Alkalischutzpolymerc« bezeichnet werden, so läßt sich die Reduzieren" des nlkäüschcn ^H-Weries v/irks«m verhindern.

Ein relativ einfach durchzuführender Test ermöglicht es festzustellen, ob ein bestimmtes Polymer ein geeignetes Alkalischutzpolymcr ist. DieserTesl laut sich wie folgt durchführen:

(1) Man verwendet als Träger einen Kunststoffilmträger, beispielsweise einen Polyäthylenterephthalatfilm mit einer Breite von mindestens 2,5 cm und einer Länge von mehr als ungefähr 100 cm. Auf den Träger wird gleichmäßig von Hand cine kontinuierliche Schicht eines Alkalisierungs-Testmittels aufgetragen, das aus der basischen Verbindung Lithiumhydroxid, einer oberflächenaktiven Verbindung und dem auf sein Alkalischutzvermögen zu testenden Polymeren besteht. Bei dem oberfächenaktiven Mittel handelt es sich um ein Salz eines Alkylarylpolyäthersulfonats (Triton® X-200). Die genannte oberflächenaktive Verbindung kann ggf. auch durch andere, ähnliche oberflächenaktive Substanzen ersetzt werden, ohne daß die Testergebnisse wesentlich beeinträchtigt werden. Das Lithiumhydroxid, die oberflächenaktive Verbindung und das zu untersuchende Polymer werden aus destilliertem Wasser aufgezogen und die Mengen an Lithiumhydroxid, oberflächenaktiver Verbindung und zu testendem Polymeren in der Schicht werden so ausgewählt, daß die

als nasser Überzug auf den Kunststoffilmträger aufgebrachte theoretische Menge an Lithiumhydroxid ungefähr 2,7 g/m² LiOH · H2O äquivalent ist, die Menge an aufgebrachtem Polymeren ungefähr 8,0 g/m² ausmacht und die Menge an aufgebrachter oberflächenaktiver Verbindung 0,54 g/m² beträgt. Die naß aufgebrachte Schicht wird an der Luft getrocknet. J5

(2) Aus dem beschichteten Träger schneidet man innerhalb von 3 Stunden nach der in Stufe ! beschriebenen Beschichtung einen Teststreifen in Form eines Quadrats mit 1,6 cm Kantenlänge, um die Menge der darin enthaltenen Base zu bestimmen. Diese Bestimmung wird folgendermaßen durchgeführt:

Man stellt eine Phenolphthalein-Indikatorlösung her, indem man 5 mg Phenolphthalein zu 10 ml destilliertem Wasser gibt. Der Indikator wird aufgelöst, indem man einen Tropfen konzentrierter NaOH (d. h. eine Lösung aus 50 Gcw.-% NaOH und 50 Gew.-% Wasser) zusetzt und die Lösung mit Im HCl auf pH 8,9 titriert. Dann gibt man den beschichteten Teststreifen mit der Überzugsseite nach oben in ein 25-ml-Scintillationsgläschcn. In das Gläschen gibt man dann 3 ml destilliertes Wasser und einen kleinen Magnetrührstab, worauf die Lösung 5 Minuten lang gerührt wird. Zur gerührten Lösung gibt man 40 μΙ der zuvor beschriebenen Phenolphthalein-Indikatorlösung und titriert die erhaltene Lösung mit 0,01 η HCl bis auf einen klaren Endpunkt. Man notiert das Volumen an Säure, das zur Erreichung des Endpunkts erforderlich ist
Falls während der Beschichtungs- und Trocknungsoperationen der obigen Stufe 1 kein Lithiumhydroxid verlorengegangen ist, beispielsweise durch Kohlendioxid-Absorption während dieser Arbeitsgänge, so ergibt sich, daß die theoretische Menge an Lithiumhydroxid im Teststreifen auf der Grundlage der zuvor beschriebenen Titration unter Verwendung von 0,01 nHCI 1,70 χ ΙΟ-² mÄq Lithiumhydroxid beträgt Der restliche beschichtete Träger wird bei einer Temperatur von etwa 21° C bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von ungefähr 50% mindestens 8 Tage lang bei Raumtemperatur aufbewahrt Während dieser 8tägigen Aufbewahrungszeit schneidet man jeweils am vierten und am achten Tag ein weiteres quadratisches Teststück mit einer Kantenlänge von 1,6 cm aus dem beschichteten Träger und untersucht auf eine Weise, die mit der zur Bestimmung der Basenmenge im ersten Teststreifen angewendeten Methode identisch ist.

(3) Die Menge an Base in jedem der drei Teststreifen wird nach der Arbeitsweise der Stufen 1 und 2 bestimmt j und verglichen. Falls die absolute Menge an in jedem der Teststreifen gemessener Base gleich oder größer ' ungefähr 0,8 χ 10-² mÄq Lithiumhydroxid ist, besitzt das jeweils getestete Polymer das erforderliche Alkalischutzvermögen, weshalb es für die Herstellung eines erfindungsgemäßen Elements geeignet ist

In den nachfolgenden Beispielen ist die Anwendung des beschriebenen Tests zur Bestimmung des Alkalischutzvermögens von erfindungsgernäß geeigneten Polymeren mehrfach beschrieben. Die Ergebnisse der Tests sind in dem Schaubild der Zeichnung dargestellt

Mit Hilfe des beschriebenen Tests ist die Ermittlung von verwendbaren Alkaüschutzpolymeren eine recht unkomplizierte Sache.

Zu den Polymeren, von denen festgestellt wurde, daß sie sich aufgrund ihres Alkalischutzvermögens, bestimmt nach dem beschriebenen Test, besonders zur Herstellung erfindungsgemäßer Elemente eignen, gehören Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylamid, Agarose, und insbesondere die aus copolymerisierten Monomermischungen von

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Vinylpyrrolidon und Acrylamid hergestellten Copolymcren. Die zuletzt genannten Copolymeren haben sich als besonders geeignet erwiesen, da sie nicht nur ein Alkalischtit/.vcrmögen aufweisen, sondern auch zusätzlich gute filmbildende Eigenschaften und (in Gegenwart großer Mengen von Basen) gute Adhäsionseigenschaften bei üblichen Kunststoffilmträgern zeigen, die beispielsweise aus Polyalkylenterephthalat oder Polyäthylenterepht-5 halat, deren Oberflächen wie nachstehend beschrieben behandelt wurden, um ihre Adhäsion an darObcrlicgende Schichten zu verbessern, bestehen. Darüber hinaus können diese Copolymeren ohne weiteres als Schichten aufgebracht u;.ei getrocknet werden, ohne daß man Hochtcmpcratur-Beschichtungsbedingungen, d. h. Temperaturen von höher als ungefähr 50°C anwenden muß. Bevorzugt verwendete Copolymere sind solche, die aus Monomermischungen hergestellt wurden, die ungefähr 20 bis ungefähr 80 Gew.-% Vinylpyrrolidon und ungc-IO fähr 80 bis ungefähr 20 Gew.-% Acrylamid enthalten. Besonders bevorzugt sind Copolymere, die aus einer Monomermischung hergestellt wurden, welche aus gleichen Gewichtsmengen Acrylamid und Vinylpyrrolidon besteht.

Zu den Basen, die sich in den erfindungsgemäß verwendeten Alkalisicrungsmitteln bewährt haben, gehören stark basische Verbindungen, die im wesentlichen frei von Natriumionen sind, z. B. Lithiumhydroxid, Calciumhy-15 droxid und deren Mischungen. Als besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung von Lithiumhydroxid erwiesen,, das aus wäßrigen Beschichtungsmassen leicht aufgebracht werden kann und in Mischung mit einem geeigneten Alkalischutzpolymeren sich als besonders stabil erwiesen hat und einen hohen Alkalinitälsgrad bewahrt. Es sind aber auch, andere im wesnnt liehen natriumfreie, stark basische Verbindungen einsetzbar.

Die Menge an eingesetzter Base soll ausreichen, um im Element unter normalen Anwendungsbedingungen 20 einen pH-Wert von größer als ungefähr 12,0 zu ergeben. Die tatsächliche Menge an Base, die in einem erfindungsgemäßen vorgegebenen Element eingesetzt werden soll, ist abhängig von beispielsweise dem jeweiligen Alkalinitätsgrad, der im Element oder einem Teil des Elements während des Gebrauchs aufrechterhalten [ werden soll und der Menge an wäßriger Flüssigkeit, die beim Gebrauch in das Element eindringt. Dies bedeutet,

daß bei der Auswahl einer bestimmten Reagenszusamnicnselzung. die mit dem gewählten Analyten nur bei 25 außergewöhnlich hohen pH-Werten in der Größenordnung von ungefähr 13,5 bis 14 reagiert, größere Mengen an Base erforderlich sind als in dem Fall, in dem die Reagenszusammensetzung mit dem gewählten Analyten bei einem pH im Bereich von ungefähr 12,5 bis 13,5 reagiert.

!m allgemeinen hängt die Menge an Alkalischutzpolymcren im Alkalisierungsmitlcl, das im erfindungsgemäßen Element verwendet wird, von der Menge an Base ab, die im Alkalisierungsmittcl gebraucht wird. Brauchba-30 re Ergebnisse werden im allgemeinen erzielt, wenn man auf einen Gew.-Teil Base angenähert 2 bis ungefähr 5 Gew.-Teile Alkalischutzpolymer einsetzt. Brauchbare Ergebnisse lassen sich jedoch auch dann erzielen, wenn man Anteile an Alkalischutzpolymerem verwendet, die außerhalb des genannten Bereichs liegen.

Die in die erfindungsgemäßen analytischen Elemente eingearbeiteten Reagenszusammensetzungen können

verschiedene aktive Stoffe enthalten. Diese Stoffe reagieren chemisch oder physikalisch und führen bei der

:': 35 Behandlung des Elements mit einer Analyt enthaltenden wäßrigen Flüssigkeit zu einer nachweisbaren Verände-

.i rung im Element. In einer bestimmten Reagenszusammensetzung können ggf. mehrere, verschiedene aktive

*! Stoffe enthalten sein, die bei der Behandlung eines analytischen Elements, das diese Rcagenszusammensetzung

enthält, mit der den Analyten enthaltenden wäßrigen Flüssigkeit mehrere einzelne physikalische oder chemische

: Reaktionen eingehen können. Da eine gegebene Reagenszusammensetzung mehr als einen aktiven Stoff enthal-

;.' 40 ten kann, können die einzelnen aktiven Stoffe an mehr als einem Ort verteilt sein, d. h. in mehr als einer Zone

¹ eines erfindungsgemäßen analytischen Elements. Demgemäß ist es bei einem erfindungsgemäßen analytischen

Element mit mehreren Zonen nicht erforderlich, daß sämtliche aktiven Stoffe der im Element verwendeten

iX Reagenszusammensetzung allein in der Rcagenszone des Elements vorliegen.

i;: Beispielsweise kann ein oder können mehrere der aktiven Stoffe einer gegebenen Reagenszusammensclzung

$ 45 in einem einstückigen, mehrschichtigen erfindungsgemäßen analytischen Element in die Ausbreitschicht cingefi arbeitet sein, oder in eine der anderen im Element ggf. vorliegenden Schichten, beispielsweise eine Strahlungs-

j\ blockierungsschicht. eine Aufzeichnungsschicht, eine Filterschicht, oder andere Zwischenschichten des EIe-

'; ments, so wie dies nachstehend beschrieben wird. Jedoch ist mindestens einer der aktiven Stoffe und häufig sind

^ sämtliche aktiven Stoffe, die in einer gegebenen Reagenszusammensetzung enthalten sind, in die Reagenszone

^:?s 50 des analytischen Elements eingearbeitet. Im übrigen kann ein erfindungsgemäßes analytisches Element mehr als % nur eine Reagenszone aufweisen.

i Die Zusammensetzung der im erfindungsgemäßen Element vorliegenden Reagenszusammensetzung kann

β sehr verschieden sein, je nach dem jeweiligen Analyten und der jeweiligen Nachweisvorrichtung, die zur Analyse

Ci der Anwesenheit einer nachweisbaren Veränderung im Element angewendet wird.

% 55 Die erfindungsgemäß eingesetzten Reagenszusammensetzungen enthalten im allgemeinen ein oder mehrere p aktive Stoffe, die in ihrer Eigenschaft als solche direkt nachweisbar sind oder miteinander, mit dem Analyten

,rj oder einem Analytzersetzungs- oder Reaktionsprodukt unter Bildung eines Stoffes reagieren können, der

H nachgewiesen werden kann.

'*i Die aktiven Stoffe der Reagenszusammensetzungen können colorimetrisch nachweisbare Farbstoffe und

Κ 60 Pigmente, fluorometrisch nachweisbare Farbstoffe und Pigmente, radioaktive Markierungen, markierte Anli- ; gen-Antikörper-Komplexe, Enzyme und Präkursoren und Reaktionsprodukte dieser Materialien sein. Weitere

f _s ' diesbezügliche Einzelheiten finden sich in der US-PS 39 92 158 und der DE-OS 28 01 455.

K Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung enthält das analytische Element eine

,-fi Biuret-Reagenszusammensetzung. Biuret-Reagentien regieren bekanntlich mit Proteinen, die in wäßrigen

§ 65 Fluiden, beispielsweise im Serum oder Plasma enthalten sind, in stark alkalischer Umgebung, beispielsweise bei fei pH-Werten von 12,0 und vorzugsweise 12,5 oder darüber. Als Folge dieser Reaktion ergibt sich beim Biuret-

Is Reagens eine leicht nachweisbare Farbänderung, die in Gegenwart von Protein zu einer violetten Färbung führt.

la Übliche Biuret-Reagenszusammensetzungen enthalten ein K.upfer-11-Salz, insbesondere ein wasserlösliches

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Kupfer-Il-Salz, sowie ggf. einen Chelatbildner, um die Ausfällung von unlöslichem Kupferhydroxid zu vermindern bzw. zu verhindern. Gegebenenfalls können auch verschiedene oberflächenaktive Verbindungen in eine Biurct-Rcagenszusammensetzung eingebracht werden. In den Biuret-Reagenszusammensetzungen des Standes der Technik werden verschiedene Kupfer-Il-Salze und Chelatbildner verwendet. Typische Kupfer-Il-Salze sind:

Kupfcr-ll-Perchlorat, Kupfer-Il-Sulfat, Kupfer-H-Aceuit,

Kupfer-Il-Butyrat, Kupfer-Il-Bromat, Kupfcr-Il-Chlorat,

Kupfer-!l-Bromid, Kupfer-II-Chlorid, Kupfcr-Il-Fluorid,

Kupfer-Il-Dichromat, Kupfer-Il-Formiat, Kupfer-Il-Iodat, Kupfer-II-Lactat, Kupfer-II-Orthophosphat, Kupfer-Il-Laurat,

Kupfer-Il-Salicylat, Kupfer-Il-Nitrat, Kupfer-Il-Tartrat und

Kupfer-ll-Oxalat.

EZin besonders bevorzugt verwendetes Kupferll-Salz ist Kupfer-Il-Sulfat.

Typische Chelatbildner (die bisweilen auch als Stabilisierungsmittel bezeichnet werden) sind Tartrate, Citrate und A.thylendiamin.

Die zur Herstellung von Aufzeichnungsmaterialien verwendeten Alkalisicrungsmitte! eignen sich in besonders vorteilhafter Weise in Kombination mit den zuvor beschriebenen Biuret-Reagentien, weil diese eine stark alkalische Umgebung erfordern. Wenn die Alkiilisicrungsniitie! in einem erfindungsgemäßen analytischen EIement zusammen mit einer Biuret-Reagenszusainmensctzung gebraucht werden, können sie in einer Zone des Elements angeordnet sein, die von der Zone, in der das Biurei-Reagcns eingearbeitet ist, getrennt ist, sich jedoch mit dieser in fluidem Kontakt befindet. Vorzugsweise befindet sich jedoch das Alkalisierungsmittel in derselben Zone wie das Biuret-Reagens und die basische Verbindung des Aikalisicrungsmittels ist ein integraler Bestandteil der Biuret-Reagenszusammcnsetzung.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein verbessertes Biuret-Reagens verwendet. Bei dieser Ausführungsform ist das ganze Biuret-Reagens im wesentlichen frei von Natriumionen. Es umfaßt ein wasserlösliches Kupfer-Il-Salz, einen Vorläufer eines Kupferchelatbildners und eine solche Menge an Base, die bei der Anwendung der Biuret-Reagenszusammensetzung einen pH-Wert von größer als ungefähr 12,0 ergibt. Der Vorläufer des Kupferchelatbildners besteht aus einer Verbindung, die unier den stark alkalisehen Anwendungsbedingungen der Biuret-Reagenszusammenseizung in einen Kupferchelatbildner überführt wird, beispielsweise im Falle von Weinsäure in ein Tartratsalz. Eine besonders bevorzugte Biuret-Reagenszusammensetzung besteht im wesentlichen aus einer Natrium-freien Mischung aus Kupfer-Il-Sulfat, Weinsäure und Lithiumhydroxid.

Die Mengenanteile der verschiedenen Komponenten des Biuret-Reagens können verschieden sein in Abhängigkeit vom Konzentrationsbcrcich des Proteinanalyten, innerhalb dessen eine spezifische Biuret-Reagenszusammensetzung wirksam sein soii. im allgemeinen sollten ungefähr 0,5 g bis ungefähr 10 g wasserlösliches Kupfcr-II-Salz auf jedes Gramm zu analysierendes Protein vorliegen. Die Menge an Kupfcrchelatbildner-Vorläufer hängt im allgemeinen von der Menge an Kupfer-Il-Salze ab. das in der Zusammensetzung vorliegt, wobei typischerweise ungefähr 0,5 bis ungefähr 2 Mol Chelatbildner auf ein Mol Kupfer-Il-Salz entfallen.

Werden die Biurct-Rcagentien in ein trockenchemisches analytisches Element, so wie es hier beschrieben ist. eingearbeitet, so bringt man sie in vorteilhafter Weise in eine Reagenszone des Elements ein. und zwar zusammen mit einem wie zuvor beschriebenen Alkalischutzpolymeren. In diese Reagenszonen lassen sichl<_.ner zusammen mit der Biuret-Rcagcnszusammensetzung und dem Alkalischutzpolymeren auch andere, störungsfreie Zusätze, wie oberflächenaktive Mittel, zusätzliche Polymere als Bindemittel und dergleichen einbringen.

Die »trockenchemischcn« analytischen Elemente gemäß der Erfindung können verschiedene strukturelle Konfigurationen aufweisen. So können sie aus relativ unkomplizierten »Eintauch- und Ablese«-Teststreifen bestehen, aus mehrzonigen analytischen Elementen mit einem Träger, auf dem eine Ausbreitzone aufgebracht ist, die an eine angrenzend angeordnete Reagenszone anliegt, wie dies beispielsweise in Fig. 2 der zuvor erwähnten DE-OS 28 01 476 beschrieben ist oder aus einstückigen, mehrschichtigen analytischen Elementen mit einem strahlungsdurchlässigen Träger, auf dem zwei oder mehrere übereinander gelagerte, angrenzende Schichten, einschließlich Reagensschichten, Ausbreitschichten, Aufzeichnungsschichten, Strahlungsblockierungsschichten, Filterschiohten und Zwischenschichten, aufgebracht sind, wie beispielsweise in den US-PS 39 92 158 und 40 42 335, sowie in der DE-OS 28 01 455 beschrieben. Aus Gründen der Einfachheit und zur Erläuterung der besten Ausführungsform der Erfindung wird diese nachstehend in der Ausgestaltung als einstückiges, mehrschichtiges analytisches Element beschrieben.

Ein einstückiges erfindungsgemäßes, mehrschichtiges analytisches Element umfaßt eine Ausbreitschicht und eine Reagensschicht, die beide vorzugsweise strahlungsdurchlässig sind. Bei diesen Elementen können die Schichten auf einem Träger aufgebracht sein, vorzugsweise einem strahlungsdurchlässigen Träger. Falls die Schichten jedoch eine ausreichende Haltbarkeit und Zusammenhaftvermögen aufweisen, ist ein Träger nicht erforderlich.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein erfindungsgemäßes einstückiges analytisches Element einen strahlungsdurchlässigen Träger auf dem sich (1) eine Reagensschicht befindet, die für Wasser und aufgelöste aktive Materialien einer Reagenszusammensetzung, beispielsweise einer Biuret-Reagenszusammensetzung, die darin enthalten ist, permeabel ist, sowie (2) eine Ausbreitschicht, die für Wasser permeabel ist. Die Reagensschicht ist zwischen Träger und Ausbreitschicht angeordnet. Die Ausbreitschicht weist vorzugsweise eine im wesentlichen gleichmäßige Permeabilität für aufgelöste Komponenten einer aufgebrachten, wäßrigen Flüssigkeitsprobe auf. Bei den Ausführungsformen, in denen das Element in der Reagensschicht eine Biuret-Reagenszu-

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sammensetzung aufweist, weist die Ausbreitschicht ebenfalls vorzugsweise eine im wesentlichen gleichmäßige Permeabilität für die aufgelösten aktiven Materialien der Biurct-Rcagenszusammcnsetzung der Reagensschicht auf, wodurch die aufgelösten Materialien in die Ausbreilschicht wandern können. Bei diesen Ausführungsformen ist die Reagensschicht vorzugsweise im wesentlichen impermeabel für Proleine, beispielsweise für Albumin oder s andere Proteine mit einem Molekulargewicht im Bereich von 60 000 (Daltön-Einheitcn) oder höher. Als Folge reagieren die aufgelösten Materialien des Biuret-Reagcnses mit dem in der Ausbreitschicht des Elements festgehaltenen Protein.

Es wird auch ein einstückiges, analytisches Element mit einem Träger geschaffen, auf dem eine Reagensschicht

und eine Ausbreitschicht angeordnet sind, weiche wie zuvor in Verbindung mit der bevorzugten Ausführungs form beschrieben gestaltet sind. In den Elementen nach dieser bevorzugten Ausführungsform ist jedoch noch zusätzlich eine nichtfaserige Ausbrettschicht enthalten, die günstigerweise isotrop porös gestaltet sein kann. In einem Fall dieser Ausführungsform sind sämtliche Schichten vorzugsweise nichtfaserig, um die Brauchbarkeit des Elements zur quantitativen Analyse zu verbessern. Der Begriff »nichtfaserig« wird hier unter Bezugnahme auf Schichten und/oder Materialien verwendet, um zu bedeuten, daß solche Schichten oder Materialien frei oder im wesentlichen frei von faserigen Materialien sind, d. tu daß sie keine faserigen Komponenten in einem Ausmaß enthalten, das zur Störung der Probeausbreitung oder zur Störung des Nachweises des analytischen Ergebnisses durch rcdiometrische Vorrichtungen führen würde.

Bevorzugte Ausbreitschichten können hergestellt werden, indem man verschiedene Komponenten verwendet, die in der zuvor genannten US-PS 39 92 158 ausführlicher beschrieben sind. So kann man teilchenförmiges Material zur Bildung solcher Schichten gebrauchen, wobei die isotrope Porosität dieser Schichten durch miteinsnder verbundene Zwischenräume zwischen den Teilchen geschaffer! wird. Verschiedene .Arten von teilchenförmigen Materialien sind brauchbar, die wünschenswerterweise sämtlich gegenüber den Komponenten der zu analysierenden Probe chemisch inert sind. Hiei zu gehören Pigmente, beispielsweise Titandioxid, Teilchen auch Diatomeenerde, Glasperlen oder -kugelchen, Kunststoffperlcn oder -kügelchen, sowie mikrokristalline kolloida-Ie Materialien, die sich von natürlichen oder synthetischen Polymeren ableiten, beispielsweise mikrokristalline Cellulose.

Alternativ oder zusätzlich zur Verwendung der teilchenförmigen Materialien kann die Aiisbreitschicht hergestellt werden, indem man isotrop poröse Polymerenzusammensetzungen verwendet- Solche Polymerenzusammensetzungen können hergestellt werden, indem man Techniken anwendet, die zur Bildung von »Blush«-Polymeren (blushed polymers) gebraucht werden, so wie sie beispielsweise in der US-PS 35 55 129 und der zuvor erwähnten US-PS 39 92 158 beschrieben sind. Zu anderen Arbeitsweisen, die zur Herstellung isotrop poröser Polymerzusammensetzungen brauchbar sind, gehören solche, bei denen Gas oder andere bläh- oder schwellbare Bestandteile verwendet werden, um Poren zu bilden. Diebe sind beispielsweise in den US-PS 29 60 728 oder 2946 095 beschrieben. Man kann auch Arbeitsweisen anwenden, bei denen innerhalb der Polymerenphase ein auflösbarer Feststoff gebraucht wird, der zur Bildung von Poren aufgelöst wird, so wie dies beispielsweise in der US-PS 38 16 575 diskutiert wird. Man kann viele verschiedene Polymere einzeln oder in Kombination verwenden, um isotrop poröse »Biushw-Polymere-Ausbreitschichten zur Anwendung bei der vorliegenden Erfindung herzustellen. Als typische Beispiele kann man Polycarbonate, Polyamide, Polyurethane und Celluloseester, wie Celluloseacetat, nennen.

Die Dicke der Ausbreitschicht und deren Porengröße sind variabel und hängen teilweise von der vorgesehenen Analytgröße, dem vorgesehenen Probevolumen, das die Ausbreitschicht aus Gründen der Einfachheit und Sauberkeit absorbieren sollte, und vom Leervolumen der Schicht, das ebenfalls die Menge an Probe, die in die Schicht absorbiert werden kann, beeinflußt, ab. Ausbreitschichten mit einer Trockendicke von ungefähr 50 Mikron bis ungefähr 300 Mikron haben sich als besonders brauchbar erwiesen, lccloch sind auch größere Variationen der Dicke annehmbar und können für bestimmte Elemente sogar wünschenswert sein. Porengrößen der Ausbreitschicht von ungefähr 1 bis ungefähr 30 Mikron haben sich als brauchbar erwiesen.

Die Reagensschichten in den erfindungsgemäßen Elementen sind günstigerweise gleichmäßig für Wasser und darin enthaltene, aufgelöste Substanzen permeabel, jedoch für Proteinmatcrialien mit höherem Molekulargewicht im wesentlichen impermeabel und nichtporös. Der hier verwendete Begriff »Permeabilität« umfaßt so Permeabilität, die von Porosität, von der Fähigkeit zum Anschwellen oder irgendeinem anderen kennzeichnenden Merkmal herrührt. Reagensschichten können beispielsweise eine Matrix enthalten, beispielsweise ein filmbildendes Polymer«, in dem die Reagenszusammensetzung verteilt, d. h. aufgelöst oder dispergiert ist. Da jedoch bei der Erfindung häufig der Fall vorliegt, daß die Reagensschicht das stabile Alkalisicrungsmittel enthält, das wiederum das zuvor beschriebene Alkalischutzpolymerc enthält, kann sich ein getrenntes Matrixmaterial für die Reagensschicht als unnötig erweisen, vorausgesetzt, daß das AlkalischutzpoNmerc in einer ausreichenden Menge vorliegt.

Die Auswahl eines Matrixmaterials kann selbstverständlich variieren und ist abhängig von den Komponenten der Reagenszusammensetzung und anderen darin verteilten Komponenten. In jedem Falle sollte das Matrixmaterial gegenüber der Reagenszusammensetzung keine Störung verursachen, d. h. das Matrixmaterial sollte nicht befähigt sein, eine Bindung oder Wechselwirkung mit den aktiven Materialien der Kcagcnszusammensct/ung einzugehen. Bevorzugte Matrixmaterialien für Reagensschichten.die mit Ausbreitschichten verbunden sind, sind nichtfaserig. Hierzu gehören störungsfreie hydrophile Materialien, einschließlich Gelatine, hydrophile Cellulosederivate, Polysaccharide, wie Dextran, Gummiarabicum und dergleichen, sowie synthetische Substanzen, wie wasserlösliche Polyvinylverbindungen, beispielsweise Polyvinylalkohol und dergleichen. Störungsfreie Matcrialien, wie Celluloseester und dergleichen, können sich ebenfalls als brauchbar erweisen. Falls die Reagcnsschichl nicht porös ist, kann man zur Erhöhung ihrer Permeabilität ein Matrixmaterial verwenden, das im Lösungsmittel oder Dispersionsmedium einer zu analysierenden Flüssigkeit quellbar ist. Es kann auch erforderlich sein, ein Material zu wählen, bei dem die Aufbringung einer angrenzenden Schicht, beispielsweise durch eine Bcschich-

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lungsvorrichtung während der Herstellung des Elements, möglich ist. Wenn beispielsweise die Bildung einzelner, aneinandergrenzender Schichten gewünscht ist und die vorgesehene Analyse bei wäßrigen Flüssigkeiten erfolgen soll, kann es angezeigt sein, für die Reagensschicht eine im wesentlichen wasserlösliche Matrix zu wählen und für eine angrenzende Schicht, beispielsweise eine Ausbreitschicht, Bestandteile zu wählen, die im wesentlichen in organischen Lösungsmitteln lösbar oder dispergierbar sind. Auf diese Weise wird eine gegenseitige Auflösungswirkung minimiert, und es kann eine genau festgelegte Schichtenstruktur gebildet werden. In vielen hallen kann es zur Vermeidung einer Diffusion von Proteinen mit hohem Molekulargewicht in die Reagensschicht wünschenswert sein, daß die Reagensschicht eine geringere Permeabilität als die Ausbreitschicht aufweist. Dies läßt sich ohne weiteres dadurch erreichen, daß man die effektive Porengröße der Reagensschicht verringert Die relative Permeabilität bzw. Porosität können nach bekannten Arbeitsweisen bestimmt werden.

In der Reagensschicht sind ein oder mehrere Komponenten der Reagenszusammensetzung verteilt, die im jeweiligen, herzustellenden analytischen Element eingesetzt werden sollen. Die Verteilung der Reagenskomponente(n) läßt sich dadurch bewirken, daß man sie in dem Fall, daß ein Matrixmaterial verwendet wird, darin auflöst oder dispergiert Obgleich häufig gleichmäßige Verteilungen bevorzugt sind, muß dies jedoch nicht erforderlich sein. Wie zuvor bemerkt, können die in den erfindungsgemäßen Elementen verwendeten Alkalisierungsmittel zusätzlich auch in die Reagensschicht eingearbeitet sein.

Die Dicke einer Reagensschicht und ihr Permeabilitätsgrad können in weitem Umfang schwanken, sie sengen vom tatsächlichen Gebrauch ab. Eine Trockendicke von ungefähr 10 Mikron bis ungefähr 100 Mikron hat sich als günstig erwiesen, obgleich Dicken außerhalb dieses Bereichs unter bestimmten Umständen bevorzugt sein können. Man kann faserige Reagensschichten herstellen, indem man eine faserige Matrix nach bekannten Arbeitsweisen imprägniert.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen einstückigen analytischen Elemente können die Schichten als getrennte Schichten vorgeformt und anschließend vor dem Gebrauch laminiert oder als getrennte Schichten aufgehoben werden, bis sie in fluiden Kontakt gebracht werden, wenn das Element im Gebrauch ist Wenn es möglich ist, als getrennte Elemente vorgebildete Schichten durch Beschichtungsverfahren herzustellen, so erfolgt die Herstellung der Schicht üblicherweise aus einer Lösung oder Dispersion auf einer Oberfläche, von der die Schicht nach dem Trocknen physikalisch abgenommen werden kann. Wenn die Herstellung aneinandergrenzender Schichten gewünscht ist, besteht eine günstige Arbeitsweise, bei der man Probleme bei den mehrfachen Abnehme- und Laminierungsstufen vermeiden kann, darin, daß man zuerst, wie gewünscht eine Anfangsschicht auf eine Abnehme-Oberfläche oder einen Träger aufträgt und anschließend nachfolgende Schichten auf die zuvor aufgetragenen Schichten direkt aufbringt Diese Beschichtung kann nach verschiedenen bekannten Beschichtungstechniken erfolgen, wie sie ausführlich in der zuvor genannten US-PS 39 92 158 beschrieben sind, .irgendwelche Zwischenschicht-Adhäsionsprobleme können ohne schädliche Wirkung dadurch gelöst werden, daß man Oberflächenbehandlungen durchführt. Hierzu gehört eine extrem dünne Anwendung von Zwischenschichtmaterialien, so wie sie in fotografischen Filmen verwendet werden.

Wie zuvor erwähnt, können die analytischen Elemente selbsttragend sein oder auf einem Träger aufgebracht sein. Zu geeigneten Trägermateralien gehören verschiedene polymere Materialien, wie Celluloseacetat, PoIyäthylenterephthalat. Polycarbonate und Polyvinylverbindungen, wie beispielsweise Polystyrole, und dergleichen. Ein Träger der Wahl für ein bestimmtes Element ist mit der vorgesehenen Art der Bestimmung des Ergebnisses verträglich. Zu bevorzugten Trägern gehören strahlungsdurchlässige Trägermaterialien, welche die elektromagnetische Strahlung einer Wellenlänge oder von Wellenlängen im Bereich zwischen ungefähr 300 nm und ungefähr 700 nm durchlassen.

Es kann sich als vorteilhaft erweisen, in den Schichten des Elements ein oder mehrere oberflächenaktive Mittel einzuarbeiten, beispielsweise ionische oder nichtionische oberflächenaktive Substanzen. Sie können beispielsweise die Beschichtbarkeil der Schichtformulierungen verbessern und das Ausmaß und die Geschwindigkeit der Verteilung in Ausbreitschichten verbessern, die ohne Hilfe eines solchen oberflächenaktiven Mittels durch flüssige Proben nicht leicht benetzt werden können.

Die erfindungsgemäßen analytischen Elemente lassen sich nicht nur zum Gebrauch auf dem Gebiet der klinischen Chemie ausbilden, sondern auch zur Anwendung bei der chemischen Forschung und bei der chemischen Prozeßsteuerung. Sie sind zur klinischen Untersuchung von Körperfluiden, wie Blut, Serum und Urin, sehr gut geeignet, weil auf diesem Arbeitsgebiet eine große Zahl sicf. wiederholender Tests häufig durchgeführt wird und die Testergebnissc oftmals sehr kurze Zeit nach der Probeentnahme benütigt werden.

Wb zuvor erwähnt, können die erfindungsgemäßen Elemente auch eine Strahlungsblockierungsschicht enthalten. Strahlungsblockierungsschichten disnen dazu, den Druchtritt elektromagnetischer Strahlung, beispielsweise bei der Wellenlänge oder den Wellenlängen, die zum Nachweis eingesetzt werden, zu hemmen. Derartige Schichten enthalten ein Opakisierungsmittel, das aufgrund seiner Absorption, Reflexion oder dergleichen eine strahlungshemmende Wirkung ergibt, wenn es in die Schicht eingearbeitet wurde. Zur Strahlungsblockierenden Schicht kann eine Matrix gehören, die ein Opakisierungsmittel enthält, beispielsweise ein Pigment, wie Ruß oder ein anderes anorganisches Pigment, beispielsweise ein Metallsalz, wie Titandioxid, Zinkoxid, Bariumsulfat, und dergleichen, Blush-Polymcre, die ihrer Art nach im allgemeinen reflektierend wirken, können das Opakisierungs· so mittel enthalten, und Schichten aus derartigen Blush-Polymeren, die in Ausbreitschichten brauchbar sind, können auch als Strahlungsblockierungsschichten gebraucht werden.

Zusätzlich zur gegebenenfalls im erfindungsgemäßen, einstückigen analytischen Element enthaltenen Strahlungsblockierungsschicht können gewünschtenfalls auch andere Zwischenschichten enthalten sein. Beispielsweise können Aufzeichnungsschichten vorgesehen sein, um nachweisbare Materialien aufzunehmen, beispielsweise Farbstoffe, die im Element gebildet oder freigesetzt wurden, wie dies in den US-PS 39 92 158 und 40 42 335 beschrieben ist, Filterschichten, sowie Zwischenschichten, die verschiedene aktive Materialien einer Reagenszusammensetzung enthalten, die mit irgendwelchen gegebenenfalls enthaltenen Störungen der jeweils durchzufüh-

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renden Analyse reagieren und sie so wirksam entfernen können.

Man kann eine Vielzahl verschiedener Elemente herstellen. Die Elemente können in den verschiedensten Formen vorliegen. Hierzu gehören längliche Bänder oder Streifen jeglicher gewünschter Breite, Plättchen oder Platten oder kleinere Abschnitte oder Chips.

Die bevorzugten einstückigen Elsmente werden in der Weise angewendet, daß man eine Probe der zu analysierenden Flüssigkeit auf das Element aufgibt Üblicherweise ist ein Element so ausgebildet, daß eine aufgebrachte Probe vor der Reagensschicht mit einer Ausbreitschicht in Kontakt gelangt, wobei zuerst die Ausbreitschicht auf der Oberfläche berührt wird, die von der Reagensschicht am weitesten entfernt ist. Da die analytische Genauigkeit der erfindungsgemäßen Elemente durch Volumenschwankungen der aufgebrachten

lö Proben nicht wesentlich verringert wird, kann man die Proben mit einer Maschine, aber auch von Hand aufbringen. Aus Gründen der Einfachheit bei der Bestimmung des analytischen Ergebnisses ist jedoch eine vernünftige Übereinstimmung bei den Probenvolumina wünschenswert.

Bei einer typischen analytischen Arbeitsweise zur entweder manuellen oder automatisierten Anwendung der erfindungsgemäßen einstückigen Elemente wird das Element von einer Vorratsrolle, einer Packung von Abis schnitten oder einer anderen Quelle entnommen und in Position gebracht, um einen freien Tropfen, einen Kontaktspot oder eine andere Form von flüssiger Probe, beispielsweise aus einer geeigneten Abgabevorrichtung, aufzunehmen. Nach dem Aufbringen der Probe, günstigerweise nachdem die Plüssigprobe von der Ausbreitschicht aufgenommen wurde, wird das Element auf irgendeine Weise konditioniert, beispielsweise durch Erhitzen, Befeuchten oder dergleichen, um die Erzielung eines Testergebnisses zu beschleunigen oder zu erleichtern.

Nachdem <«an das analytische Ergebnis als nachweisbare Veränderung erhalten hat, wird es gemessen. Dies erfolgt üblicherweise dadurch, daß man das Element durch eine Zone durchschiebt, in der eine geeignete Vorrichtung für Reflexions- oder Transmissionsspektrofotometrie angeordnet ist. Eine derartige Vorrichtung dient dazu, einen Energiestrahl, beispielsweise Licht, durch den Träger und die Reagensschicht durchzustrahlen.

Das Licht wird dann beispielsweise von einem Opakisierungsmiltcl in der Ausbreitschicht oder einer Strahlungsblockierungsschicht im Element zur Meßvorrichtung reflektiert, oder es tritt durch das Element hindurch und trifft im Falle einer Transmissionsbestimmung auf einen Detektor. Bei einer bevorzugten Arbeitsweise wird das analytische Ergebnis an einer Stelle des Elements bestimmt, die vollständig in dem Gebiet liegt, in welchem das Ergebnis hervorgerufen wurde. Im allgemeinen hat sich eine elektromagnetische Strahlung im Bereich von ungefähr 400 bis ungefähr 700 nm für derartige Messungen als brauchbar erwiesen, obgleich jegliche Strahlung, für die das Element durchlässig ist, und die zu einer Quantifizierung der im Element hervorgerufenen, nachweisbaren Veränderung geeignet ist, angewendet werden kann. Es lassen sich verschiedene Kalibrierungstechniken anwenden, um einen Kcitrollstindard für die Analyse zu schaffen. Beispielsweise kann man eine Probe einer Analytstandardlösung neb«;n der Stelle aufbringen, auf die der Probetropfen gegeben wird. Hierdurch wird die

Anwendung differentieller Messungen zur Analyse ermöglicht.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung. Im ersten Beispiel ist die Synthese eines der in der vorliegenden Erfindung bevorzugt verwendeten Alkalischut/polyineren offenbart. Im zweiten Beispiel sind die durch Anwendung der zuvor beschriebenen Off-Line-Tests zur Bestimmung der Brauchbarkeit einer Reihe von Polymeren zur Verwendung als Alkalischuizpolymcrc nach d?r vorliegenden

Erfindung erzielten Ergebnisse enthalten. Beispiel I

Synthese von Poly(acrylamid-co-N-vinyl-2-pyrrolidon) mit einem Gcwichtsvcrhältnis der Monomeren von
50 :50

Man gibt 900 g denaturierten Alkohol, 200 g Acrylamid und 200 g Vinylpyrrolidon zu 2700 ml destilliertem Wasser. Die Lösung wird mit Stickstoffgas begast und in einem mit N2-Einraß, Rückflußkühler und Rührer versehenen Rundkolben auf 60⁰C erwärmt. Dann gibt man zu der zuvor genannten Monomerlösung eine Lösung aus 6 g des Polymerisationsinitiators 2,2'-Azo-bis-(2-melhylpropionitril), gelöst in 60 ml Aceton. Nach 16 Stunden bei 60° C weist die erhaltene klare, viskose Lösung hei 10,8% Feststoffen cine Viskosität der gesamten Masse (bulk viscosity) von 125 eps auf. Die in 1 nNaCI beim isolierten Polymeren gemessene inhärente Viskosität beträgt 0,94.

IO

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Beispiel 2
Off-Line-Test mit den Polymeren zur Feststellung des Alkalischutzvermögens

Bei diesem Beispiel wurde das Alkalischui/.vermögen von sechs einzelnen Polymeren unter Anwendung des zuvor beschriebenen Off-Une-Tests bestimmt. Die in diesem Beispiel untersuchten Polymeren sind folgende:

Polymeres Nr. 1

Poly(acrylamid-co-N-vinyl-2-pyrroüdon) gemäß Beispiel 1
Polymeres Nr. 2 Poly(acrylamid-co-2-hydroxyälhylacrylat)

(50 :50 Gewichtsteile der Monomeren)
Polymeres Nr. 3

Poly(2-hydroxyäthylacrylat)
Polymeres Nr. 4 !5

Polyacrylamid
Polymeres Nr. 5

Polyvinylpyrrolidon
Polymeres Nr. 6

Sea Plaque Agarose

Die Ergebnisse der Bewertung dieser sechs Polymeren nach dem Off-Line-Test sind in Fig. 1 grafisch dargestellt. Der F i g. 1 ist zu entnehmen, daß das Polymere Nr. 1 während der gesamten 8tägigen Testdauer ein ausgezeichnetes Alkalischutzvermögen zeigte, wogegen die Polymeren Nr. 2 und 3 nur ein sehr geringes Alkalischutzvermögen aufwiesen. Wie in Fig. 1 dargestellt, erhält man mit Zusammensetzungen, weiche die Polymeren Nr. 2 und Nr. 3 enthalten, unmittelbar nach dem Beschichten einen nur geringen Basengehalt. Es wird angenommen, daß die Polymeren dieser Zusammensetzungen ein geringes Alkalischutzvermögen aufwiesen, weil in den Estergruppen dieser Polymeren Hydrolyscstellen vorlagen, bei denen durch die Base eine Hydrolyse erfolgen konnte. Wie der F i g. 1 zu entnehmen ist, besitzen die Polymeren Nr. 4 und Nr. 5 während der 8tägigen Testdauer ein annehmbares Alkalischutzvermögen. Wie den McBpunkten der Fi g. 1 zu entnehmen ist, wurden die Polymeren Nr. 1 bis 5 zusätzlich noch über die 8tägige Testdauer hinaus untersucht.

In einer getrennten Untersuchung wurde eine Beschichtungszusammensetzung hergestellt, die mit der zur Bewertung der Polymeren Nr. 1 bis 5 verwendeten Zusammensetzung identisch war, mit der Ausnahme, daß man ein sechstes Polymeres, nämlich Sea Plaque Agarose verwendete. Dieses Material wurde auf sehr ähnliche Weise wie der zuvor beschriebene Off-Line-Test untersucht. Es wurde festgestellt, daß es ein sehr gutes Alkalischutzvermögen besitzt Der gestrichelte Teil der Kurve für das Polymere Nr. 6 in der Fig. 1 zeigt lediglich an, daß das Alkalischutzvermögen dieses Polymeren während der durch die unterbrochene Linie überstrichenen Zeit nicht untersucht wurde. Die Untersuchung des Polymeren Nr. 6 wurde ebenfaüs über die 8tägige Off-Line-Testdauer fortgesetzt.

Betspiel J
Mehrschichtiges analytisches Element zur Bestimmung von Gesamtprotein

In diesem Beispiel ist die Herstellung eines mehrschichtigen analytischen Elements beschrieben, in dem eine Alkaliscmiizpolymer-Zusammenst-i/tiiig und eine verbesserte Biurcl-Reagcnszusammensetzung eingearbeitet sind. Die Struktur des Mchrschichlelemenis wird wie folgt hergestellt:

Man beschichtet einen Polyäthylenterephthalatfilmträgcr mil einer Reagensschicht aus Agarose als Alkalischutzpolymeremi 16,0 g/m²), CuSO₄ ■ 5 H₂O (10,8 g/m²), LiOH (5,4 g/m²), Weinsäure (8,0 g/m²), sowie mit einer Ausbreitschicht aus mikrokristallinen Celluloseleilchen (64,5 g/m²) und Polyvinylpyrrolidon (1,6 g/m²).

Eine Reihe von Elementen der zuvor beschriebenen Struktur wurde colorimetrisch bewertet, indem man die Änderung der Reflexionsdichte Dr eines Lichtstrahls verfolgte. Der Lichtstrahl trat durch ein 540-nm-lnterferenzlilter, dann durch den Filmträger der Elemente und wurde dirn durch die Ausbreitschicht zurück durch den Filmträger reflektiert. Die Änderungen der Ablesungen Dr wurden für jedes Element bei 37°C beobachtet, während eine wäßrige Lösung mit einer bekannten Menge Protein (man verwendete Albumin als Protein) im Bereich von 2 bis 12% w/v(Gewicht/Einheitsvolumen) auf das Element aufgetüpfelt wurde. Der Wert Dr eines jeden Elements als Funktion des Ansprechens auf die jeweils aufgetüpfelte, spezielle, Albumin-enthaltende Probe wurde während des Zeitraums von 0 bis 7 Minuten beobachtet. Die Farbentwicklung in der Ausbreitschicht des Elements, die von der im Element auftretenden Biuret-Reaktion herrührte, wurde als sehr schnell erfolgend bemerkt. Die Reaktion der 2 bis 7% (w/v) Protein enthaltenden Probe war in weniger als 1 Minute beendet. Bei einem Gehalt von mehr als 7% (w/v) Protein verlängerten sich die Reaktionszeiten auf ungefähr 7 Minuten. Die nach 7 Minuten für jede untersuchte Probe erhaltenen Werte Du sind in der nachfolgenden Tabelle I aufgeführt.

	29 00	136	Pu (540 mn)
Tabelle I			0,10
% Protein in der I	'robe	0,20
2		0,37
4		0,42
fa		0.58
7		0,64
8		0.68
IO
12

12

Beispiel 4 Stabilität der natriumfreien Alkalisicrungsmittcl

In diesem Beispiel ist die Herstellung von zwei mehrschichtigen analytischen Elementen beschrieben. Jedes Element wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, daß eines der Elemente, nämlich die Kontrolle, anstelle von I .ilhiumhyclroxid mit Natriumhydroxid als Base hergestellt wurde.

Dann wurde eine Reihe der Elemente wie in Beispiel 3 beschrieben bewertet, wobei man wäßrige Lösungen mit Proteinspiegeln im Bereich von 2 bis 10% (w/v) verwendete. Jedes Element wurde unmittelbar nach seiner Herstellung untersucht und nach Lagerung unter Umgebungsbedingungen, 21 "C und 50% relativer Luftfeuchtigkeit während 18 Tagen nochmals bewertet. Die für jede Bewertung aufgezeichneten Du·Werte sind in der nachfolgenden Tabelle 11 aufgeführt. Den Ergebnissen der Tabelle 11 läßt sich entnehmen, daß das erfindungsge mäße analytische Element, das Lithiumhydroxid enthielt und frei von Natriumionen war. zu Dr-Werten führte, die während der gesamten 18tägigen Lagerzeit recht stabil waren. Im Gegensatz hierzu erhielt man beim Kontrollelement, das Natriumhydroxid enthielt, nach I8tägigcr Lagerung eine ganz beträchtliche Abnahme der Empfindlichkeit.

μ Tabelle II

Element Protcingehalt Dh Ο;·

(%) (unmittelbar nach der Herstellung (nach I8tägiger

des Rlemcnis gemessen) Lagerung gemessen)

Element mit LiOH 2.5 0,19 0.16 Element mit LiOH 5.0 0.32 0,27 Element mit LiOH 7,5 0.58 0,55 Element mit LiOH 10.0 0.85 0,74

Kontrollelement mit NaOH 23 0,13 0.13

Kontrollelement mit NaOH 5,0 032 0,18

Kontrollelement mit NaOH 73 031 0.22

Kontrollelement mit NaOH 10.0 0.70 0,26

B e i s ρ i c I 5

Mehrschichtiges analytisches Element zur Bestimmung von Gesamiprotein

In diesem Beispiel wurde ein mehrschichtiges analytisches Element zur Bestimmung von Gesamtprotein auf die gleiche Weise wie in Beispiel 3 beschrieben, hergestellt, mit der Ausnahme, daß die in Beispiel 3 als Alkalischutzpolymeres verwendete Agarose durch Poly(acrylamid-eo-N-vinyI-2-pyrrolidon) ersetzt wurde, oas wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt war. Das Element wurde hinsichtlich seines Ansprechens auf Serumlösungen mit Proteinspiegeln im Bereich von 4 bis 12% (w/v) unter Anwendung derselben wie in Beispiel 3 beschriebenen Arbeitsweise bewertet. Man erhielt ein gutes Ansprechen des Elements. Aufgrund der verbesserten Linearität des Ansprechens des Elements wurde das Gcsamtvcrhalten des Elements sogar noch als besser eingestuft als das beim Element des Beispiels 3 erzielte Ansprechen. Zusätzlich erhielt man eine bessere Adhäsion und verbesserte Auftragbarkeit der Reagensschicht bei diesem Element, welches das zuvor genannte Copolymere erhielt, und zwar im Vergleich zu der Adhäsion und Auftragbarkeit der Reagensschicht des Elements des Beispiels 3. in der Agarose enthalten war.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

!2

Claims

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Patentansprüche:
1. Analytisches Element zur Bestimmung eines vorgegebenen Analyten in einer wäßrigen Flüssigkeit mit

(a) einer Zone zum Verteilen des Analyten und

(b) einer mit der Zone in Verbindung stehenden Rcagcnxzusammensetzung, die durch Reaktion des Elements mit einer Analyt enthaltenden Flüssigkeit eine nachweisbare Veränderung im Element ergibt,