JP5292270B2 - 犬crp測定用乾式分析要素 - Google Patents
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Description
好ましくは、本発明の犬CRP測定用乾式分析要素は、犬由来のアミラーゼを阻害するアミラーゼ阻害剤を更に含む。
(a)免疫反応層から拡散・移行してきた酵素反応生成物を検出するための検出層;
(b)下記(c)に記載の酵素の基質を含む基質層;及び
(c)犬CRPを認識する第一のモノクローナル抗体の断片を酵素で標識化したモノクローナル抗体断片と、犬CRPを認識する第二のモノクローナル抗体とを含む免疫反応層;
を光透過性支持体側からこの順番で含む。
更に好ましくは、上記検出層は、免疫反応層から拡散・移行してきた酵素反応生成物(拡散性物質)を検出するための試薬組成物を含有する試薬層である。
好ましくは、本発明の犬CRP測定用免疫分析試薬又はキットは、犬由来のアミラーゼを阻害するアミラーゼ阻害剤を更に含む。
本発明においては、犬CRPを認識する第一のモノクローナル抗体の断片を酵素で標識化したモノクローナル抗体断片と、犬CRPを認識する第二のモノクローナル抗体を使用する。本発明で用いる上記2種類の抗体は、第一のモノクローナル抗体および第二のモノクローナル抗体の犬CRPに対する結合定数が107M-1〜109M-1であり、第一のモノクローナル抗体および第二のモノクローナル抗体のサブクラスがIgG1であり、第一のモノクローナル抗体と第二のモノクローナル抗体のモル比が0.1〜30であるという条件を満たす。なお、本発明で言う抗体とは、抗体分子全体を意味するのみならず、その断片(例えば、Fab、F(ab')2又はFab'断片)をも意味する。
特に、犬ではα―アミラーゼ活性値が2500U/L以上存在する検体が少なからず存在するため、少量で有効に阻害する阻害剤が好ましい。
(1) 支持体上に試薬層、その上に免疫反応層を有するもの。
(2) 支持体上に試薬層、基質層、免疫反応層をこの順に有するもの。
(3) 支持体上に試薬層、接着層、免疫反応層をこの順に有するもの。
(4) 支持体上に試薬層、接着層、基質層、免疫反応層をこの順に有するもの。
(5) 支持体上に検出層、試薬層、免疫反応層をこの順に有するもの。
(6) 支持体上に検出層、試薬層、基質層、免疫反応層をこの順に有するもの。
(7) 支持体上に試薬層、光反射層、免疫反応層をこの順に有するもの。
(8) 支持体上に試薬層、光反射層、基質層、免疫反応層をこの順に有するもの。
(9) 支持体上に検出層、試薬層、光反射層、免疫反応層をこの順に有するもの。
(10)支持体上に検出層、試薬層、光反射層、基質層、免疫反応層をこの順に有するもの。
(11)支持体上に検出層、光反射層、試薬層、免疫反応層をこの順に有するもの。
(12)支持体上に検出層、光反射層、試薬層、基質層、免疫反応層をこの順に有するもの。
(13)支持体上に第2試薬層、光反射層、第1試薬層、免疫反応層をこの順に有するもの。
(14)支持体上に第2試薬層、光反射層、第1試薬層、基質層、免疫反応層をこの順に有するもの。
(15)支持体上に検出層、第2試薬層、光反射層、第1試薬層、免疫反応層をこの順に有するもの。
(16)支持体上に検出層、第2試薬層、光反射層、第1試薬層、基質層、免疫反応層をこの順に有するもの。
(1)抗体産生用融合細胞(ハイブリドーマ)の調製:
ビーグル犬の新鮮な血清からアフィニティーカラムを用いて分離、精製した犬CRPを抗原として、マウス(BALBc)に免疫し、犬CRPに対する抗体価の上昇を確認後、脾細胞を採取してミエローマ(P3U1)とPEG法で細胞融合させた。HAT培地による選択培養し、増殖したハイブリドーマを多数得た。
上記(1)で得たハイブリドーマの培養上澄について、犬CRPの蛋白抗原を1 μg/mLとなるようPBS(-)で希釈し固相を行い、2次抗体として抗マウスIgG HRP標識ヤギ抗体(Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugated secondary antibody:No.AP308P フナコシ(株))を用いてマイクロプレートを用いた ELISA法により、抗原に対する反応性を確認し、犬CRPの抗原に反応する抗体を産生するハイブリドーマを数種選別できた。また、これらのハイブリドーマについて、培養上澄中の抗体のアイソタイプ及びサブクラスは、市販の同定キット試薬を用いて同定した。
犬CRPに対する反応性が確認された培養上澄の内、産生抗体がIgGであるものについて、Biacore社の装置(Biacore3000)を用いて、その結合定数を測定した。センサーチップに抗マウスIgGのウサギIgGを固定化し、これと培養上澄とを一定条件で接触させ、培養上澄中のマウスIgGを固定する。次いで、目標とする結合定数109M-1に対し、4μg/mL(3.5×10-8M)の各抗原蛋白質を接触させる。培養上澄を接触させた時のシグナル増加(抗体シグナル:培養上澄中のIgG量に相当)を基準にして、抗原蛋白質を接触させた時のシグナル増加(抗原シグナル:抗体の抗原捕捉力に相当)の比を取ると培養上澄中の抗体の結合定数の序列が推定できる。培養上澄の測定結果を表1に示す。三種類のハイブリドーマ3A6、11C6、16H4を用いて、マウス腹水法で調製後、プロテインAカラムで精製した抗体での同条件下のシグナル比は、培養上澄と良く一致しており、培養上澄での結果が抗体選別に有効であることを示している。この方法により、犬CRPに対して充分な結合定数107M-1〜109M-1を有し、且つ、サブクラスがIgG1である抗体産生ハイブリドーマとしてハイブリドーマ16H4を選別することができた。さらに、ハイブリドーマとして3A6、11C6を得た。
ハイブリドーマ16H4をRPMI 1640 + 10 % FBSで融解し培養し、増殖させた細胞をマウス20匹にそれぞれ0.5 mL(5 × 106 cells/匹)移植する。一定期間の後に、腹腔から腹水を採取して遠心分離後、上澄を以下に示すプロテイン A−アフィニティクロマト法で精製する。1.5 Mグリシン-NaOH (pH 8.9)-3 M NaClで平衡化したプロテインAカラムに、同じ緩衝液で希釈した腹水の上澄を流しIgGを吸着させる。溶出バッファ(100 mM クエン酸バッファ 、pH 3.0) で溶出し、直ちに、中和液(2 M Tris − HCl、pH 9.0)を添加 して pH 7.0〜7.5に調整後、PBSに透析して精製抗体を得た。
表2に犬CRP抗体の犬CRPに対する結合定数を示す。比較例として人CRP抗体の人CRPに対する結合定数を示す。標識化抗体は、特許第3151080号に記載の方法と同様の方法に従って、枯草菌αアミラーゼと表1に記載の犬CRP抗体を用いて酵素で標識化した抗犬CRP・IgGFab’を調製した。比較例として、人CRP抗体を用いて酵素で標識化した抗人CRP・IgGFab’も調製した。これら表2に示す材料を用いて、犬CRP測定用分析要素を作製した。比較例として人CRP抗体を用いたCRP測定用分析要素を作製した。第二抗体は、表2に示すイヌCRP抗体を用いた。
ゼラチン下塗りされている180μmのポリエチレンテレフタレ−ト無色透明平滑フィルムに下記組成の水溶液を、乾燥後の厚さが14μmになるように塗布し乾燥した。
ゼラチン 14.1g/m2
ペルオキシダーゼ 12.0KU/m2
グルコースオキシダーゼ 6.0KU/m2
グルコアミラーゼ 5.0KU/m2
ロイコ色素 0.5g/m2
界面活性剤 1.0g/m2
ゼラチン 10.2g/m2
界面活性剤 0.5g/m2
ヒドロキシプロピルセルロース 4.7 g/m2
カルボキシメチルスターチ 3.5g/m2
PIPES 0.9 g/m2
マンニトール 2.3 g/m2
界面活性剤 1.2 g/m2
アミラーゼ阻害剤 1020KU/ m2
上記布地上に、エタノールを200g/m2となるように塗布し(=OC1塗布)乾燥後、下記組成のエタノール溶液を各々の成分が下記の量となるように、そして乾燥後の厚さが5μmになるように、塗布し(=OC2塗布)、乾燥させ、一体型多層分析要素を作製した。
アミラーゼ標識化抗犬CRP抗体LA 19.0 KU/m2 (1.2mg/m2、分子量30 KDa)
抗犬CRP抗体A 5.4 mg/m2 (分子量15 KDa)
ポリビニルピロリドン 5.6 g/m2
界面活性剤 0.2 g/m2
アミラーゼ阻害剤 2080 KU/ m2
(抗体のモル比の計算)
抗体LA 1.2 mg/m2 ÷ 分子量30 KDa = 0.04 x10-3 mmol/m2
抗体A 5.4 mg/m2 ÷ 分子量15 KDa = 0.36 x10-3 mmol/m2
モル比 = 0.36 ÷ 0.04 = 9
下記組成(*)の希釈液と免疫比濁法にて検定されたCRP濃度0、1.1、3.0、7.1、10mg/dLの犬血清を希釈液にて21倍希釈した液を上記実施例で作製したCRP分析用乾式スライドに10μL点着した。
MES(*1) 5mg
カゼイン水溶液(*2) 100mg
アジ化ナトリウム 0.2mg
精製水 1.0ml
*1 MES:2−(N−モルホリノ)エタンスルフォン酸モノハイドレート
*2 例えば 商品名:ブロックエース
免疫比濁法にて検定された犬CRP濃度0.5mg/dLと12mg/dLの犬血清を相互に希釈して所望のCRP濃度にした検体を、実施例5と同様の希釈液で21倍希釈した液を実施例4で作製したCRP分析用乾式スライドに10μL点着した。
Claims (5)
- 犬CRPを認識する第一のモノクローナル抗体の断片を酵素で標識化したモノクローナル抗体断片と、犬CRPを認識する第二のモノクローナル抗体とを含む免疫反応層を光透過性支持体の上に含む犬CRP測定用乾式分析要素であって、第一のモノクローナル抗体および第二のモノクローナル抗体の犬CRPに対する結合定数が107M-1〜109M-1であり、第一のモノクローナル抗体および第二のモノクローナル抗体のサブクラスがIgG1であり、第一のモノクローナル抗体と第二のモノクローナル抗体のモル比が5〜15である、犬CRP測定用乾式分析要素。
- 酵素が枯草菌αアミラーゼである、請求項1に記載の犬CRP測定用乾式分析要素。
- 犬由来のアミラーゼを阻害するアミラーゼ阻害剤を更に含む、請求項1又は2に記載の犬CRP測定用乾式分析要素。
- 第一のモノクローナル抗体と第二のモノクローナル抗体のモル比が9〜11である、請求項1から3の何れか1項に記載の犬CRP測定用乾式分析要素。
- 請求項1から4の何れかに記載の犬CRP測定用乾式分析要素を用いる、犬CRPの測定方法。
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