KR20150065856A - 포스피노트리신-n-아세틸-트랜스퍼라제에 대한 저항성을 부여하는 효소에 대한 모노클로날 항체 및 검출 방법 - Google Patents

Abstract

포스피노트리신-N-아세틸-트랜스퍼라제 효소의 존재의 결정 및 정량화에 유용한 모노클로날 항체 및 방법이 본원에 기재된다. 본 발명의 항체 및 방법은 특히 트랜스제닉 식물에서 발현된 포스피노트리신-N-아세틸-트랜스퍼라제의 존재의 확인 및 정량화에 유용하다.

Description

포스피노트리신-N-아세틸-트랜스퍼라제에 대한 저항성을 부여하는 효소에 대한 모노클로날 항체 및 검출 방법 {MONOCLONAL ANTIBODIES AND DETECTION METHODS FOR ENZYMES THAT CONFER RESISTANCE TO PHOSPHINOTHRICIN-N-ACETYL-TRANSFERASE}

관련 출원에 대한 상호 참조

본원은 2012년 10월 10일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 61/711,950을 우선권 주장한다.

기술 분야

본 발명은 글루포시네이트, 즉 L-포스피노트리신 제초제에 대한 저항성을 부여하는 특정 트랜스제닉 식물 사례에 의해 발현되는 효소를 검출하도록 설계된 ELISA (효소 결합 면역흡착 검정)에 적용된 바와 같은 면역학 분야에 관한 것이다.

포스피노트리신-N-아세틸-트랜스퍼라제 (PAT), EC 2.3.1.183을 코딩하는 유전자는 일반적으로 식물에서의 트랜스제닉 사례에서 선택 마커로서 사용되고, 통상의 호기성 토양 방선균인 스트렙토미세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes)로부터 최초로 단리되었다. PAT 효소는 암모니아 축적 및 세포 사멸을 발생시키는 포스피노트리신의 아세틸화를 촉매하여, 이를 불활성 화합물로 해독시킨다 (Murakami T., Anzai H., Imai S., Satoh A., Nagaoka K., Thompson C. J. (1986). Mol Gen Genet 205:42-50; Twell D., Klein T. M., Fromm M. E., McCormick S. (1989). Plant Physiol 91:1270-1274.). 따라서, PAT를 발현하는 형질전환된 식물 세포는 글루포시네이트를 사용하여 선택될 수 있다.

종자 생성물의 재식을 위한 재조합 DNA 형질을 개발 및 판매하는 회사는 엄격한 제품 책임주의 계획을 수립, 이행 및 고수한다. 이러한 책임주의 계획은 형질 유전자이입 및 종자 생산 활성을 추적하기 위해 재조합 형질의 다양한 성분에 대해 유효한 정량적 및 정성적 단백질 검출 방법의 이용 뿐만 아니라 곡물 수확 모니터링을 필요로 한다. 이러한 검출 방법은 GLP 및 비-GLP 조건 하에서 사용하기에 충분할 정도로 용이하고 강건하여야 한다. 또한, 이 방법들은 재배지에서의 농부, 사일로에서의 곡물 거래업자, 및 국경지대에서의 세관원에 의해 용이하게 활용되기에 충분할 정도로 사용자-친화적이어야 한다. 따라서, 강건하고 고품질의 사용자 친화적 단백질 검출 방법 및 상업용 키트가 유용하며 요망되고 있다.

ELISA는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으나, 실험실 및 현장 설정 둘 다에서 식물 조직의 어레이 중 특정한 트랜스제닉 생성물을 재현가능하게 검출할 수 있는 강건하고 고품질의 유효한 ELISA 방법을 개발하는 것은 사소한 것도 일상적인 것도 아니다. 기능성 PAT 트랜스제닉 사례를 검출하기 위한 측방 유동 스트립 및/또는 ELISA의 개발에 특히 적합한 항체 쌍을 발견하는 것이 여전히 보다 더 요망되고 있다.

본 발명은 모노클로날 항체 (mAb), 155AD4, 155E2.1.114, 155Q3, 155Q12 및 155Q19.1, 및 이들 mAb를 생산하는 하이브리도마 세포주의 패널을 제공한다. 이들 mAb는 놀랍게도 다양한 식물 및 식물 조직에서 PAT 단백질을 발현하는 트랜스제닉 사례를 검출하는데 널리 적합하다. 본 발명은 또한 본 발명의 이뮤노글로불린을 사용하는 정량적 및 정성적 면역검정을 제공하며, 일반적으로 a) 제1 본 발명의 mAb를 검정 표면 상에 고정시킨 후에 상기 검정 표면을 세척하는 것; b) 상기 검정 표면을 PAT를 함유할 것으로 추정되는 액체와 결합을 허용하기에 충분한 기간 동안 접촉시킨 후에 상기 검정 표면을 세척하는 것; c) 상기 검정 표면을 리포팅 기에 접합된 상이한 본 발명의 제2 항체와 상기 제2 접합된 모노클로날 항체의 결합을 허용하기에 충분한 기간 동안 접촉시킨 후에 상기 검정 표면을 세척하는 것; 및 d) 상기 리포팅 기의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하는 PAT 효소의 존재를 확인하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 일반적으로 a) PAT-특이적 폴리클로날 항체를 검정 표면 상에 고정시키는 것; b) 상기 검정 표면을 PAT를 함유할 것으로 추정되는 액체와 결합을 허용하기에 충분한 기간 동안 접촉시킨 후에 상기 검정 표면을 세척하는 것; c) 상기 검정 표면을 리포팅 기에 접합된 상이한 본 발명의 제2 항체와 상기 제2 접합된 모노클로날 항체의 결합을 허용하기에 충분한 기간 동안 접촉시킨 후에 상기 검정 표면을 세척하는 것; 및 d) 보정 곡선에 대한 비교로부터의 보간에 의해 상기 리포팅 기의 존재를 정량화하는 것을 포함하는, PAT 효소의 정량적 결정 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 a) 상기 항체를 표면 상에 고정시키는 것; b) 상기 고정된 항체를 PAT를 함유하는 혼합물과 접촉시키는 것; c) PAT에 결합된 상기 고정화된 항체를 상기 혼합물로부터 분리하는 것; 및 d) 항체-결합된 PAT를 상기 고정된 항체로부터 제거함으로써 PAT를 회수하는 것을 포함하는, PAT의 단리 또는 검출을 위해 mAb를 사용하는 방법을 포함한다.

도 1은 ELISA 표준 곡선 분석이다. 정제된 재조합 PAT 단백질은 0.25 내지 6.0 ng/mL 범위의 7개의 농도로 희석되었다. 농도는 650nm에서의 배경 OD를 뺀 후에 450nm에서의 광학 밀도 판독을 이용하여 플롯팅하였다.

본 발명은 PAT에 특이적으로 결합하는 항체 및 이 mAb를 생산하는 하이브리도마를 포괄한다. 하기 표는 본 발명의 하이브리도마 세포주 명칭 및 그의 해당하는 기탁일을 열거한다.

하이브리도마 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC) (버지니아주 20110 마나사스 유니버시티 불러바드 10801)에 기탁하였으며, 이는 제한없이 대중에게 이용가능하게 될 것이나, 특허 권리에 따를 것이다. 본 발명의 세포주를 2012년 9월 12일에 다우 아그로사이언시스 엘엘씨(Dow AgroSciences LLC)를 대리하여 기탁하였다. 이들 기탁은 특허 절차의 목적을 위한 세포주 기탁에 관한 부다페스트 조약에 따라 그의 조항 하에 이루어졌으며 유지될 것이다. 이들 기탁물은 공공 기탁기관인 ATCC 기탁기관에 30년의 기간 동안, 또는 가장 최근의 요청 이후 5년 동안, 또는 특허의 유효 기간 동안 중 가장 긴 기간 동안 제한 없이 유지될 것이며, 그 기간 동안 생존할 수 없게 되면 교체될 것이다.

본 발명은 항체를 표면 상에 고정시키는 것, 상기 고정된 항체를 PAT를 함유하는 혼합물과 접촉시키는 것, PAT에 결합된 상기 고정된 항체를 상기 혼합물로부터 분리하는 것, 및 항체-결합된 PAT를 상기 고정된 항체로부터 제거함으로써 PAT를 회수하는 것을 포함하는, PAT를 단리하거나 또는 검출하기 위해 mAb를 사용하는 방법을 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체를 검정 표면 상에 고정시키는 것, 상기 검정 표면을 PAT를 함유할 것으로 추정되는 액체와 접촉시키고 상기 검정 표면을 적합한 용액으로 세척하는 것, 상기 검정 표면을 리포팅 기로 표지된 항-PAT 항체와 접촉시키고 상기 검정 표면을 적합한 용액으로 세척하는 것, 및 상기 리포팅 기의 존재를 검출하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플에서 PAT의 존재를 확인하기 위해 본 발명의 항체를 사용하는 방법을 포함한다.

본 발명은 또한 트랜스제닉 식물, 특히 옥수수, 대두 및 목화 식물에서 발현된 PAT 효소의 정량적 결정을 위한 분석 방법을 포함한다. PAT 단백질은 포스페이트 완충 염수 용액을 사용하여 식물 샘플로부터 추출된다. 추출물을 원심분리하고, 수성 상청액을 수집하고 희석한다. 희석된 샘플의 분취액을 샌드위치 ELISA 포맷에서 항-PAT 폴리클로날 또는 모노클로날 항체-코팅된 플레이트의 웰 중에서 본 발명의 발명의 효소-접합된 항-PAT 모노클로날 항체와 인큐베이션한다. 샌드위치 쌍에서의 두 항체는 샘플에서 PAT 단백질을 포획한다. 인큐베이션 기간 종료시에, 미결합 시약은 PBST로 세척하여 플레이트로부터 제거한다. PAT의 존재는 효소 접합체를 효소 기질과 인큐베이션하여, 유색 생성물이 생성됨으로써 검출된다. PAT가 항체 샌드위치에서 결합하므로, 발색의 수준은 샘플 중의 PAT의 농도에 비례한다 (즉, 보다 낮은 단백질 농도는 보다 낮은 발색을 일으킴). 450 nm에서의 흡광도에서 참조 파장 (예컨대, 650 nm)에서의 흡광도를 뺀 값은 플레이트 판독기를 이용하여 측정한다. 7개의 표준물 농도로부터 이차 회귀 방정식을 이용하여 보정 곡선을 추정한다. 이 PAT ELISA는 식물 조직 샘플 추출물에서 PAT를 정량화하는데 충분히 특이적이고 민감하다. 또한, 본 발명의 항체는 표준 웨스턴 블롯팅 절차를 이용하여 PAT의 존재를 확인하는데 사용될 수 있다.

관심 단백질에 대한 항체의 제조는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 문헌 [Galfre and Milstein, Methods in Enzymology, Vol. 73, Academic Press, New York (1981); James W. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, Orlando, Florida (1986); Current Protocols in Molecular Biolopy, F. M. Ausubel, et al. ed., Wiley Interscience, New York, (1987)]을 참조한다.

관심 단백질과 반응성인 항체를 제조하기 위해, 단백질을 먼저 풍부화시키거나 또는 정제하여야 한다. 단백질의 상대적으로 조질인 항원 제제가 면역화 목적을 위해 사용될 수 있다. 그러나, 하이브리도마가 필요로 하는 모노클로날 항체를 생성하는지를 정확하게 측정하거나 또는 면역 혈청의 항체 역가를 검정하기 위해서는 고도로 정제된 단백질이 요구된다.

일단 PAT 효소가 정제되면, PAT에 특이적인 항체가 관련 기술분야에 널리 공지된 통상의 방법에 의해 생성될 수 있다. 수주 또는 수개월의 기간에 걸쳐 선택된 동물 숙주에 반복하여 주사하면 면역반응이 도출되고, 유의한 항-PAT 혈청 역가를 나타낼 것이다. 바람직한 숙주는 포유동물 종이고, 보다 크게 바람직한 종은 토끼, 염소, 양 및 마우스이다. 이러한 면역화 동물로부터 채취한 혈액을 확립된 방법에 의해 처리하여 PAT와 반응성인 항혈청 (폴리클로날 항체)을 수득할 수 있다. 이어서 항혈청은 관련 기술분야에 공지된 기술에 따라 PAT에의 흡착에 의해 친화성 정제될 수 있다. 친화성 정제된 항혈청은 또한 관련 기술분야에 공지된 절차를 이용하여 항혈청내의 이뮤노글로불린 분획을 단리함으로써 정제될 수 있다. 생성된 물질은 PAT와 반응성인 이뮤노글로불린의 불균질 집단일 것이다.

항-PAT mAb는 정제된 PAT를 사용하여 용이하게 제조된다. mAb를 생산하는 방법은 수십년 동안 실시되어 왔으며, 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 아주반트 중의 PAT의 반복적인 복강내 또는 피하 주사는 대부분의 동물, 특히 마우스에서 면역 반응을 도출할 것이다. 과면역화된 B-림프구를 동물로부터 제거하고, 영구 배양될 수 있는 적합한 융합 파트너 세포주와 융합시킨다. 다수의 포유동물 세포주가 하이브리도마의 생산을 위한 적합한 융합 파트너이다. 다수의 이러한 계통은 ATCC 및 상업적 공급업체로부터 상업적으로 입수가능하다.

일단 융합되면, 생성된 하이브리도마를 선택 성장 배지에서 1 내지 2주 동안 배양한다. 비융합된 골수종 세포 또는 골수종 세포 사이의 융합체를 혼합된 하이브리도마 배양물로부터 제거하는데 2종의 널리-공지된 선택 시스템이 이용가능하다. 선택 시스템의 선택은 면역화된 마우스 계통 및 사용된 골수종 융합 파트너에 따라 달라진다. 문헌 [Taggart and Samloff, Science 219, 1228 (1982)]에 의해 기재된 AAT 선택 시스템이 이용될 수 있지만; 문헌 [Littlefield, Science 145, 709 (1964)]에 의해 기재된 HAT (하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘) 선택 시스템이 바람직하며, 이는 상기 언급된 마우스 세포 및 융합 파트너와의 그의 호환성 때문이다.

이어서 소비된 성장 배지를 면역특이성 mAb 분비에 대해 스크리닝한다. 효소 결합 면역흡착 검정 절차가 이러한 목적에 가장 적합할지라도; 대용량 스크리닝에 적합한 방사성면역 검정이 또한 허용된다. 작은 비율의 본 발명의 mAb를 단리하기 위해 상당수의 관계없는 또는 덜 바람직한 배양물을 연속적으로 감소시키도록 설계된 다중 스크린이 수행되어야 한다. PAT와 반응성인 mAb를 분비하는 배양물은 상업적으로 입수가능한 검정을 이용하여 이소형결정될 수 있다.

목적하는 항-PAT mAb를 분비하는 하이브리도마 배양물은 모노클로날성 및 안정성을 확립하기 위하여 수회 서브클로닝될 수 있다. 진핵생물 비-접착성 세포 배양물을 서브클로닝하는 널리 공지된 방법은 한계 희석, 연질 아가로스 및 형광 활성화 세포 분류 기술을 포함한다. 각각의 서브클로닝 후에, 생성된 배양물은 항체 분비에 대해 재검정되고, 안정한 항체-분비 하이브리도마 세포주의 확립을 보장하기 위해 이소형결정되어야 한다.

본 발명의 항-PAT 항체는 항체 결합 부위의 일부가 노출된 상태로 남아있고 PAT에 결합할 수 있도록 표면에 고정될 수 있다. 광범위한 항체 고정 방식이 지난 수십년에 걸쳐 개발되어 왔다. 고정화는 항체를 목적하는 표면에 직접 공유 결합시키거나 또는 항체를 표면에 가교시킴으로써 달성될 수 있다.

폴리사카라이드 기반 비드, 예컨대 세파로스(SEPHAROSE)® (파마시아(Pharmacia), 뉴저지주 피스카타웨이)에 대한 항체의 CNBr 및 카르보디이미드 커플링은 본 발명에 부합하는 직접적 커플링 방식의 예이다. 직접적 커플링은 일반적으로 임의의 특정한 방식으로 항체를 배향시키지 않지만; 일부 유형의 직접적 커플링은 고정 물질 상에 항체를 재현가능하게 배향시킬 수 있다.

바람직한 커플링 방식은 항체를 그의 항원 결합 영역이 노출된 상태로 남아있도록 배향시킨다. 하나의 이러한 전략은 항체의 중쇄 상에서 발견되는 천연 탄수화물을 이용한다. 우선 탄수화물 모이어티를 상응하는 알데히드로 산화시킨 후에 알데히드를 표면 상에서 1급 아미노 기와 반응시킴으로써, 항체를 유리한 배향으로 연결시키는 것이 가능하다.

다수의 유형의 가교가 가능하고, 항체를 고정 물질에 공유 결합시키는 소형 유기 링커를 포함한다. 이러한 스페이서 아암이 허용되며, 바람직하게는 일단 가교가 형성되면 단백질과 상호작용하지 않아야 한다.

상기 논의는 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하지 않도록 의도된다. 항체를 고정 물질에 연결시키는 다수의 다른 널리-공지된 방식이 본 발명에 부합한다.

리포팅 기로 표지된 항체가 다양한 환경에서 항원의 존재를 확인하는데 사용될 수 있다는 것이 널리 공지되어 있다. 방사성동위원소로 표지된 항체는 다양한 생물학적 유체 중의 항원의 존재를 큰 정밀도 및 감수성으로 확인하기 위한 방사성면역 검정에 수십년간 사용되어 왔다. 보다 최근에, 효소 표지된 항체가 대중적인 ELISA에서 방사성-표지된 항체에 대한 대용물로 사용되고 있다.

본 발명의 항체는 고정 물질 또는 검정 표면, 예컨대 폴리스티렌 웰 또는 입자에 결합시킬 수 있고, PAT가 시험 샘플에 존재하는지 여부를 측정하기 위한 면역검정에 사용될 수 있다. 본 발명의 이러한 실시양태에서, 샘플을 면역친화성 표면과 접촉시키고, 인큐베이션한다. 세척 단계 후에, 면역친화성 표면에 결합된 임의의 PAT는 표면을 리포팅 기로 표지된 본 발명의 또 다른 항체와 접촉시킴으로써 검출된다.

측방 유동 스트립 또는 면역크로마토그래피 스트립을 본 발명의 항체 및 검정 방법에 사용하는 것은 본 발명에 부합한다. 측방 유동 검정은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 6,485,982를 참조한다. 이 방식에서, 측방 유동 시험은 PAT 단독의 또는 동시에 다른 분석물과의 정성적 또는 반-정량적 검출에 사용될 수 있다. 측방 유동 시험은 본원에 기재된 모든 시험 포맷의 활용에 가장 간단하고, 식물 물질이 용액으로 빠르게 추출되고 측방 유동 스트립 상에서 시험되는 현장 설정에 특히 유용하다. 이 방식에서, 오직 측방 유동 스트립을 액체 샘플에 넣거나 또는 액체 샘플을 측방 유동 스트립에 적용하고, 예정된 시간 후에 결과를 판독하는 것만이 요구된다. 모든 측방 유동 시험은 시험 결과를 검증하는데 사용되는 절차 상의 대조 라인 또는 샘플 대조 라인을 포함하여야 한다. 따라서 2개 라인이 나타나는 것은 양성 결과를 나타내는 반면, 유효 음성 시험은 오직 대조 라인만을 생성한다. 오직 시험 라인만이 나타나거나, 또는 어떤 라인도 나타나지 않은 경우에, 이는 무효이다.

전형적인 측방 유동 시험 스트립은 하기 4종의 주요 성분으로 이루어진다: 시험 샘플이 적용되는 샘플 패드; 유색 입자 (전형적으로 콜로이드성 금 입자, 또는 라텍스 마이크로구체)에 접합된 본 발명의 항체를 함유하는 접합체 패드; 본 발명의 상이한 항체가 포획 구역 또는 시험 라인으로서 막을 가로질러 라인에 고정되는 반응 막, 예컨대 소수성 니트로셀룰로스 또는 셀룰로스 아세테이트 막; 비결합된 PAT Ab-금 접합체를 포획하여 대조 라인을 형성하는 종-특이적 이차 항체; 및 모세관 작용에 의해 반응 막을 가로질러 샘플을 가져오도록 설계된 폐기물 저장소.

측방 유동 스트립의 성분은 보통 불활성 백킹 재료에 고정되며, 단순 딥스틱 포맷으로 제시되거나 또는 샘플 포트와 포획 및 제어 구역을 보여주는 반응 윈도우를 갖는 플라스틱 케이싱 내에 제시될 수 있다. 검정 실시양태의 또 다른 방식에서, PAT를 함유할 것으로 추정되는 시험 샘플을 표면 상에 건조시켜 고정된 시험 샘플을 형성한다. 이어서 본 발명의 표지된 항체를 고정된 시험 샘플과 접촉시키고, 인큐베이션한다. 샘플이 PAT를 함유하는 경우에, 표지된 항체는 고정된 PAT에 결합할 것이다. 이 방법은 또한 본 발명의 비표지된 항체, 이어서 PAT에 이미 결합된 본 발명의 항체에 결합하는 표지된 이차 항체를 사용하여 수행될 수 있다. 세척 후에, 고정된 시험 샘플을 측정하여 임의의 리포팅 기의 존재를 검출한다.

리포팅 기는 전형적으로 효소, 예컨대 알칼리성 포스파타제, 양고추냉이 퍼옥시다제 또는 베타-D-갈락토시다제이다. 적합한 기질은 효소와 반응하였을 때 색 변화를 일으킨다. 그 때, 색 강도의 측정은 분광광도계를 이용하여 정량화될 수 있다. 리포팅 기가 방사성동위원소인 경우에, 적절한 감마선 또는 베타선 검출 기기를 이용하여 리포팅 기를 정량화할 수 있다. 리포팅 기의 강도는 시험 샘플 중의 PAT의 양과 직접 상관된다.

하기 실시예는 본 발명을 실시하는 방법을 설명하는 것을 도울 것이며, 본 발명의 항-PAT 항체 및 검정의 특징을 예시할 것이다.

실시예 1

모노클로날 항체 생성

마우스를 정제된 재조합 PAT 단백질로 면역화시키고, 표준 PEG-매개 융합 기술을 이용하여 항-PAT 모노클로날 항체를 발현하는 하이브리도마의 패널을 제조하였다. 소비된 조직 배양 배지의 샘플을 하이브리도마 배양물을 함유하는 각각의 웰로부터 멸균 제거하고, 하기 항체 포획 ELISA 방법을 이용하여 PAT 반응성에 대해 검정하였다. 마이크로타이터 웰을 1-10 μg/mL의 정제된 재조합 PAT 단백질의 용액으로 코팅하였다. 웰을 세척하고, 소비된 조직 배지의 샘플을 웰에 넣고 인큐베이션하였다. 웰을 세척하고, 양고추냉이 퍼옥시다제-표지된 항-마우스 혈청을 첨가하고 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 기질을 첨가하여 발색 반응을 발생시키고, 플레이트를 광학 밀도 (OD)에 대해 판독하였다. 높은 OD 판독치를 갖는 웰을 하이브리도마를 함유하는 배양 웰에 대해 다시 맵핑하였다. PAT 항체 양성 배양물을, 배양물이 팽창함에 따라, 항체 생산에 대해 연속적으로 스크리닝하여 성장 안정성 및 항체 생산을 확인하였다. 수회의 한계 희석 클로닝을 수행하여 각각의 배양물에 대한 진정한 모노클로날성을 확립하였다. 항체 양성 클론에 대한 추가 검정을 수행하여 식물 물질과의 현장 사용을 위한 본 발명의 정량적 검출 방법에 사용하기 위한 각각의 항체의 적합성을 결정하였다.

실시예 2

이뮤노블롯 검정 개발

트랜스제닉 작물 조직 샘플로부터 PAT 단백질을 검출하기 위해 PAT 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 사용하기 위한 웨스턴 블롯 조건을 평가하고 확립하였다. 최종 검정은 SDS-PAGE를 이용하여 샘플을 분리하였고, 막에 블롯팅한 후에 PAT 모노클로날 또는 폴리클로날 항체로 프로빙하였다.

PAT를 발현하는 트랜스제닉 대두로부터의 잎 조직 샘플을 먼저 PBST 완충제에서 또는 직접적으로 라에믈리(Laemmli) 완충제에서 추출하였다. 이어서, 열-처리된 샘플을 SDS-PAGE에 적용하였다. 단백질을 PVDF 또는 니트로셀룰로스 막에 전달한 후에, 막을 차단 완충제에서 차단하고, 이어서 대략 1시간 동안 실온에서 PAT 모노클로날 또는 폴리클로날 항체와 인큐베이션하였다. 세척 단계 후에, 막을 HRP (양고추냉이 퍼옥시다제) 접합된, 종-특이적 이차 항체 (예를 들어, PAT 모노클로날 항체의 경우에, 이차 항체는 염소 항-마우스 IgG 항체임)와 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 결합되지 않은 항체를 세척하여 제거하고, 결합된 항체를 화학발광 기질과 인큐베이션하였다. 화학발광 신호를 다양한 시간 간격으로 필름에 노출시켜 포획함으로써 생성된 밴드를 달성하였다. 모노클로날 및 폴리클로날 항체는 둘 다 트랜스제닉 작물 조직 샘플로부터 PAT 단백질을 검출할 수 있었다.

실시예 3

ELISA 검정 포맷 및 개발

최적의 항체 쌍, 항체 코팅 농도, 코팅 및 차단 완충제 구성성분, 코팅 포맷 및 pH, 및 항체-HRP 접합 비 및 농도를 결정하기 위한 검정 조건을 평가하였다. 최종 검정 포맷은 순차적 또는 동시 샌드위치 포맷을 이용하여 폴리클로날 코팅 항체 및 모노클로날 항체-HRP 접합체를 구성하였다.

이 시스템에서, 항혈청 lot D2976으로부터 정제된 PAT 폴리클로날 항체를 코팅 완충제에서 희석하고, 마이크로타이터 플레이트에 첨가하였다. 인큐베이션 후에, 웰을 차단 완충제로 차단하고 세척하였다. 정제된 재조합 PAT 단백질 샘플을 코팅된 반응 웰에 첨가하고, 대략 1시간 동안 HRP-접합된 모노클로날 항체 155Q12와 인큐베이션하였다. 세척 단계 후에, 비색 기질을 반응 웰에 첨가하였다. PAT 단백질의 존재 하에, PAT-특이적 모노클로날 항체를 반응 웰에서 결합시키고, 접합된 HRP를 HRP와 반응시키고, 이후에 웰에서 색 변화가 발생하였다. 적합한 시간 동안 기질과 인큐베이션한 후에, 정지 용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 발색의 광학 밀도를 96-웰 플레이트 판독기에서 참조 파장 (즉, 650nm)에서의 판독치를 뺀 후에 기질-특이적 파장 (즉, 450nm)에서 판독하였다. 생성된 데이터를 플롯팅하고, 표준 보정 곡선을 도 1에 나타낸 바와 같이 계산하였다.

실시예 4

ELISA 검정 특성

A) 표준 보정 곡선 성능:

검정 포맷을 식물 물질로부터 추출된 PAT 단백질의 정량 분석에 적용하였다. 표준 보정 곡선 범위를 0.25 내지 6.0 ng/mL 범위의 7개의 농도에서 확립하고, 해당하는 OD 범위 및 변동을 평가하였다. 상이한 날짜에 다양한 분석가에 의해 수 행된 5가지 시험으로부터, 결과는 0.113 내지 1.773 범위의 전체 표준 곡선 흡광도를 보여주었다. 플레이트간의 정밀도 및 분석가 시험간의 정밀도는 8.0% 내지 12.6% 범위의 변동 계수 퍼센트 (CV%)를 결과하였다 (표 1a). 확립된 보정 곡선을 이용해 역계산하여, 예측된 표준물 농도는 0.4% 내지 3.5% 범위의 평균 % 오차를 갖는 정확한 예측을 보여주었으며, 변동 (CV%)은 5가지 독립적 시험으로부터 5% 더 적었다 (표 1b).

<표 1a>

<표 1b>

B) 검정 정확도:

검정은 음성 대조군 작물 조직을 기지의 양의 참조 표준 단백질로 강화시키고 회수율을 측정함으로써 정확도에 대해 평가하였다. 2가지 독립적 시험에 기초하여, 옥수수 및 대두 잎 샘플을 0.25ng/mL (LOD 수준), 0.60ng/mL (LOQ 수준), 중간 (2.40ng/mL) 및 상위 수준 (6.00ng/mL)의 정량적 범위로 첨가하였다. 정량적 범위 (0.60-6.00ng/mL) 내에서의 평균 회수율은 각각 옥수수 및 대두 잎의 경우에 88.5% 및 117%였으며 (표 2), 이는 검정 정확도 평가를 위한 산업상 광범위하게 실시되는 70-120% 허용되는 범위 내에 포함된다. 2가지 시험으로부터의 변동은 각각 옥수수 및 대두의 경우에 18.3% 및 2.5%의 CV%를 결과하였다. 대두와 상이하게, 옥수수 잎은 LOD 수준에서 70-120% 범위 밖에 있었으나, 정확한 정량화는 이 수준에서 적용가능하지 않았다.

<표 2>

C) 작물 조직 샘플로부터의 트랜스제닉 PAT 단백질 정량화:

검정을 작물 조직 샘플에 적용하여 PAT 단백질 발현을 측정하였다. 표 3에 나타난 바와 같이, 하나의 음성 대조군 대두 잎 샘플 및 3개의 PAT 트랜스제닉 대두 잎 샘플을 ELISA 검정에 의해 여러 희석배율에서 분석하였다. 선형성 및 정밀도는 각각 여러 희석배율 및 반복 샘플에 걸쳐 조정된 결과로부터 CV%를 계산하여 평가하였다. CV%는 둘 다 5% 미만이였으며, 이는 검정의 우수한 선형성 및 정밀도를 나타낸다.

<표 3>

실시예 5

PAT 정량적 ELISA 프로토콜

장비 및 물질

밸런스(Balance), 분석용, 모델 AE50, 메틀러 인스트루먼트 코포레이션(Mettler Instrument Corporation), 뉴저지주 08520 하이츠타운.

원심분리기, 96-웰 플레이트 보유 가능, 모델 GR422, 카탈로그 번호 11176916, 조우안, 인크.(Jouan, Inc.), 버지니아주 22602 윈체스터.

원심분리기, 2 mL 에펜도르프(Eppendorf) 튜브 보유 가능, 에펜도르프-5417C, 브링크만 인스트루먼츠. 인크.((Brinkmann Instruments. Inc.), 뉴욕주 11590 웨스트베리.

동결기, -20℃ 유지 가능, 모델 75F, 유-라인 코포레이션(U-Line Corporation), 위스콘신주 53223 밀워키.

동결기, -80℃ 유지 가능, 모델 ULT2586, 카탈로그 번호 13-989-233, 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific), 펜실베니아주 15205 피츠버그.

인큐베이터, 정밀도, 경제성, 카탈로그 번호 51221087, 조우안, 인크.

막자사발, 자기, 쿠어스(Coors) 60316, 카탈로그 번호 12-961A, 피셔 사이언티픽.

막자, 자기, 쿠어스 60317, 카탈로그 번호 12-961-5A, 피셔 사이언티픽.

피펫터, 다양한 크기, 라이닌(Rainin), 매사추세츠주 01888 워번.

피펫터, 8- 또는 12-채널, 라이닌, 매사추세츠주 01888 워번.

피펫 에이드, 휴대용, 카탈로그 번호 13-681-19, 피셔 사이언티픽.

플레이트 판독기, 소프트맥스 프로(SOFTMAX PRO)® 소프트웨어를 이용하는 맥스라인(MAXline)® Vmax 마이크로플레이트 판독기, 450 및 650 nm 판독 가능, 카탈로그 번호 0200-2018, 몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices), 캘리포니아주 94089 서니베일.

냉장고, 4℃ 유지 가능, 카탈로그 번호 13-991-86, 피셔 사이언티픽.

진탕기/분쇄기, 모델 게노(Geno)/그라인더(Grinder), 카탈로그 번호 2000-115, 세르티프렙(Certiprep), 뉴저지주 08840 메투첸.

교반 플레이트, 모델 220T, 카탈로그 번호 14-493-220T, 피셔 사이언티픽.

볼텍스, 지니-2(Genie-2) 모델, 카탈로그 번호 12-812, 피셔 사이언티픽.

세척기, 96-웰 마이크로플레이트, 모델 Elx 405, 바이오-텍 인스트루먼츠, 인크.(Bio-Tek Instruments, Inc.), 버몬트주 05404 위누스키.

물 정제 시스템, 모델 밀리-Q UV 플러스(Milli-Q UV Plus), 밀리포어 코포레이션(Millipore Corporation), 매사추세츠주 01757 밀포드.

용기, 시약, 비-멸균, 카탈로그 번호 13-681-100, 피셔 사이언티픽.

비드, 1/8" 크로뮴 강, 카탈로그 번호 039347, 스몰 파츠 인크.(Small Parts Inc.), 플로리다주 33014-0650 마이애미 레이크스.

피펫, 10-mL 일회용 혈청 피펫, 카탈로그 번호 13-678-11E, 피셔 사이언티픽.

피펫 팁, 다양한 크기, 피셔 사이언티픽.

플레이트, 96-웰, 깊은-웰 폴리프로필렌 샘플 - 희석액에 대해 비-결합, 피셔 사이언티픽.

플레이트 실러, 96-웰, 카탈로그 번호 07-200-375, 피셔 사이언티픽.

튜브, 1.2-mL 폴리프로필렌 클러스터, 랙당 96개 튜브, 카탈로그 번호 7200320, 피셔 사이언티픽.

튜브, 2.0-mL 원추형 폴리프로필렌 에펜도르프 마이크로-원심분리기, 카탈로그 번호 02-681-344, 피셔 사이언티픽.

캡, 2.0-mL 원추형 튜브용, 카탈로그 번호 02-681-361, 피셔 사이언티픽.

튜브, 캡이 있는 5-mL 폴리프로필렌 원심분리기, 카탈로그 번호 14-959-11A, 피셔 사이언티픽.

튜브, 캡이 있는 15-mL 폴리프로필렌 원심분리기, 카탈로그 번호 05-538-59A, 피셔 사이언티픽.

튜브, 캡이 있는 50-mL 폴리프로필렌 원심분리기, 카탈로그 번호 05-526B, 피셔 사이언티픽.

칭량 접시, 소형, 카탈로그 번호 02-204A, 피셔 사이언티픽.

시약 및 표준물

PAT 항체-코팅된 96-웰 마이크로타이터 플레이트, PAT 항체 접합체 용액, 비색 기질 용액, 정지 용액.

PBST, pH 7.4, 1L을 만들기 위한 패킷, 카탈로그 번호 P-3563, 시그마(Sigma). 2-8℃에 저장.

폴리비닐피롤리돈 (PVP), 분자량 40,000, 카탈로그 번호 PVP-40, 시그마.

PAT 미생물 표준 단백질.

세척 완충제: PBS, pH 7.4, 0.05% 트윈 20 포함 (PBST)

검정 완충제: 포스페이트 완충 염수, pH 7.4, 0.05% 트윈 20 플러스 1% PVP (w/v) 포함 (PBST/PVP):

검정 절차

검정을 수행하기 적어도 30분 전에 냉장고로부터 꺼내어 PAT ELISA 시약을 20-25℃로 평형화시킨다.

PAT 작업 원액, 100 ng/mL를 제조한다.

출발 PAT 표준물은 동결건조 분말 또는 분취된 액체 원액일 수 있다. 예를 들어, 하나의 원액은 0.3mg/mL 용액이다.

원액을 볼텍싱하고, 이어서 최소 10 μL의 0.3-mg/mL PAT 원액을 990 μL의 PBST/PVP에 첨가하고, 잘 혼합하여 3000-ng/mL 원액을 만든다. 유사하게, 40 μL의 1000-ng/mL 원액을 1160 μL의 PBST/PVP에 첨가하고, 잘 혼합하여 100-ng/mL 원액을 만든다. 이들을 얼음 상에서 유지하고, 2시간 내에 사용한다. 임의의 가시적 오염이 관찰되는 경우에 폐기한다.

표 4에 따라 PAT 보정 곡선 용액을 제조한다.

<표 4>

샘플 제조

A) 작물 조직 샘플을 동결건조될 때까지 -80℃에 냉동 저장한다. 동결건조 후에, 샘플을 분쇄하고, 이어서 분석을 위해 칭량될 때까지 -80℃ 동결기에 저장한다.

B) 일반적으로, 제조된 조직 샘플의 15-mg 분량을 칭량하고, 2-mL 폴리프로필렌 튜브에 분배한다. 각각의 튜브에 2 또는 3개의 금속 비드를 첨가하고, 1.5 mL의 PBST/PVP 검정 완충제를 첨가한다. 시약 블랭크 및 대조군이 각각의 샘플 세트와 함께 이 방법 전체에 포함되어야 한다. 시약 블랭크는 1.5 mL의 PBST/PVP 검정 완충제를 함유한다.

C) 모든 튜브의 뚜껑을 닫는다. 1 사이클로서 3분 동안 500의 다이얼 설정에서의 게노/그라인더 자동 진탕기/분쇄기 및 1X 설정 (분당 대략 1500 스트로크)에서의 토글 스위치를 이용하여 샘플을 추출한다.

D) 샘플을 3,000 (또는 그 초과) rpm에서 5분 동안 또는 분리될 때까지 (상청액 중에 가시적 입자가 없음) 원심분리한다. 상청액을 개별 튜브에 전달하거나 또는 하기 단계에 기재된 바와 같은 분석을 위해 검정 완충제 중에서 추가로 희석할 수 있다. 추출물을 얼음 상에서 유지하고, 이를 4시간 내에 검정한다.

각각의 시험을 하나의 개별 마이크로타이터 플레이트 상에서 수행한다. 샘플 또는 표준물의 이중 분석의 평균이 단일 결과를 구성한다. 보정 곡선 및 적절한 대조군이 각각의 플레이트에 포함되어야 한다.

ELISA 표준 보정 용액을 비-결합 96-웰 희석 플레이트로 전달하고, 96-웰 검정 템플릿 시트 상의 그 위치를 기록한다.

필요에 따라 샘플 희석액을 제조하고, 표준 보정 용액을 함유하는 비-결합 96-웰 희석 플레이트에 희석된 샘플을 전달하고, 96-웰 검정 템플릿 시트 상의 그 위치를 기록한다.

플레이트당 대략 6 mL의 PAT 항체 접합체를 시약 용기에 분배한다.

시약 용기로부터 50 μL의 PAT 항체 접합체를 항체 코팅된 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각각의 웰로 피펫팅한다. 임의의 미사용 PAT 항체 접합 용액은 폐기한다.

100 μL의 ELISA 표준 용액 및 비-결합 96-웰 희석 플레이트로부터의 희석된 샘플을 96-웰 검정 템플릿과 동일한 배향을 유지하면서 항체 코팅된 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 첨가한다. 각각의 샘플마다 피펫 팁을 교체한다.

플레이트를 접착성 플레이트 실러로 덮는다. ELISA 플레이트를 벤치탑 또는 플레이트 진탕기 상에서 대략 10초 동안 부드럽게 회전시켜 참조 표준물 및 희석된 샘플을 PAT 항체 접합체와 혼합한다.

마이크로타이터 플레이트를 실온 (20-30℃)에서 대략 60분 동안 플레이트 진탕기 상에서 진탕시킨다.

플레이트를 자동 플레이트 세척기를 이용하여 350 μL/웰 PBST로 5회 세척한다. 잉여량의 액체를 종이 수건 상에서 가볍게 두드려 제거한다.

플레이트당 대략 12 mL의 발색 시약 (기질 용액)을 시약 용기에 분배한다.

시약 용기로부터 100 μL의 발색 시약을 항체 코팅된 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각각의 웰로 피펫팅한다. 플레이트를 덮고, 부드럽게 혼합한다. 임의의 미사용 발색 시약 용액을 폐기한다.

마이크로타이터 플레이트를 실온 (20-30℃)에서 대략 30분 동안 플레이트 진탕기 상에서 진탕시킨다.

플레이트당 대략 12 mL의 정지 용액을 시약 용기에 분배한다.

100 μL의 정지 용액을 각각의 웰에 첨가하여 반응을 정지시킨다. 플레이트를 부드럽게 혼합한다. 정지 용액의 첨가는 끊김없이 완료되어야 한다. 마이크로타이터 플레이트는 일광으로부터 보호되며; 그렇지 않으면 색 강도가 영향을 받는다.

96-웰 마이크로타이터 플레이트 판독기를 이용하여 450 nm에서의 흡광도에서 650 nm에서의 흡광도를 뺀 흡광도를 판독한다. 모든 판독은 정지 용액을 첨가하고 30분 이내에 완료되어야 한다.

데이터 분석 및 계산; 보정 곡선

표준 보정 용액의 기지의 농도 및 그의 이후의 흡광도 (광학 밀도)가 보정 곡선 회귀에 사용될 것이다. 이차 회귀 모델을 소프트맥스 프로® 소프트웨어에서 이용하여 회귀 곡선 및 이후의 계산을 전개하였다.

하기 방정식은 최적 포물선을 하기 방정식에 기초하여 표준 곡선에 핏팅한다: y = A + Bx + Cx²

여기서: y = 평균 흡광도 값 (OD) 및 x = 참조 표준물 농도

미지의 샘플 중 PAT의 계산

소프트맥스 프로® 소프트웨어 또는 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel)을 이용하여 각각의 샘플 중 PAT의 농도를 계산할 수 있다. 각각의 웰로부터의 흡광도 값을 이용하여 보정 곡선 회귀로부터 농도를 보간하고 (하기 방정식 참조), 이어서 반복 웰의 결과로부터 평균 샘플 결과, 표준 편차 및 변동 계수 퍼센트를 계산하였다.

보간된 농도 (ng/mL) =

각 샘플로부터의 최종 PAT 농도를 샘플 중량, 추출에 사용된 검정 완충제 부피 및 적용된 희석 배율에 기초하여 ng/mg으로 계산하였다.

PAT 농도 (ng/mg) =

분석 배치의 수용을 위한 기준

각각의 실행은 하기 열거된 바와 같이 유효한 절차에서 수용 기준을 만족시켜야 한다. 데이터가 이들 성능 기준을 만족시키지 못한다면, 분석자는 결과를 평가하고, 변동의 잠재적 공급원을 결정하고, 필요한 경우에 분석을 반복하여야 한다.

<표 5>

본 발명이 명세서 및 실시예와 관련되어 기재되었으나, 본 발명은 본 개시내용의 취지 및 범위 내에서 추가로 변형될 수 있다. 또한, 본원은 본 발명이 속하는 관련 기술분야에서 공지된 또는 통상의 실시 내에 포함되는 바와 같이 본 개시내용으로부터의 이러한 변화를 포함하도록 의도된다.

Claims (17)

155AD4, 155E2.1.114, 155Q3, 155Q12 및 155Q19.1로 이루어진 모노클로날 항체의 군으로부터 선택된, 포스피노트리신-N-아세틸-트랜스퍼라제 효소 (PAT)에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체.

제1항에 있어서, 155AD4의 명칭을 갖는 하이브리도마에 의해 생산된 모노클로날 항체.

제1항에 있어서, 155E2.1.114의 명칭을 갖는 하이브리도마에 의해 생산된 모노클로날 항체.

제1항에 있어서, 155Q3의 명칭을 갖는 하이브리도마에 의해 생산된 모노클로날 항체.

제1항에 있어서, 155Q12의 명칭을 갖는 하이브리도마에 의해 생산된 모노클로날 항체.

제1항에 있어서, 155Q19.1의 명칭을 갖는 하이브리도마에 의해 생산된 모노클로날 항체.

PTA-13186, PTA-13187, PTA-13188, PTA-13189, 및 PTA-13190으로 이루어진 군으로부터 선택된 등록 번호 하에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁된, 제1항의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주.

제7항에 있어서, ATCC 등록 번호 PTA-13186 하에 기탁된 하이브리도마.

제7항에 있어서, ATCC 등록 번호 PTA-13187 하에 기탁된 하이브리도마.

제7항에 있어서, ATCC 등록 번호 PTA-13188 하에 기탁된 하이브리도마.

제7항에 있어서, ATCC 등록 번호 PTA-13189 하에 기탁된 하이브리도마.

제7항에 있어서, ATCC 등록 번호 PTA-13190 하에 기탁된 하이브리도마.

a) 제1항의 제1 모노클로날 항체를 검정 표면 상에 고정시킨 후에 상기 검정 표면을 세척하는 것;
b) 상기 검정 표면을 PAT를 함유할 것으로 추정되는 액체와 결합을 허용하기에 충분한 기간 동안 접촉시킨 후에 상기 검정 표면을 세척하는 것;
c) 상기 검정 표면을 리포팅 기에 접합된 제1항의 상이한 제2 항체와 상기 제2 접합된 모노클로날 항체의 결합을 허용하기에 충분한 기간 동안 접촉시킨 후에 상기 검정 표면을 세척하는 것; 및
d) 상기 리포팅 기의 존재 또는 부재를 검출하는 것
을 포함하는, PAT 효소의 존재를 확인하는 방법.

a) PAT 폴리클로날 항체를 검정 표면 상에 고정시키는 것;
b) 상기 검정 표면을 PAT를 함유할 것으로 추정되는 액체와 결합을 허용하기에 충분한 기간 동안 접촉시킨 후에 상기 검정 표면을 세척하는 것;
c) 상기 검정 표면을 리포팅 기에 접합된 제1항의 상이한 제2 항체와 상기 제2 접합된 모노클로날 항체의 결합을 허용하기에 충분한 기간 동안 접촉시킨 후에 상기 검정 표면을 세척하는 것; 및
d) 보정 곡선으로부터의 보간에 의해 상기 리포팅 기의 존재를 정량화하는 것
을 포함하는, PAT 효소의 정량적 결정 방법.

제14항에 있어서, 접합된 모노클로날 항체가 155Q12 및 155Q19.1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.

제14항에 있어서, 접합된 모노클로날 항체가 155Q12인 방법.

제14항에 있어서, 접합된 모노클로날 항체가 155Q19.1인 방법.

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