CN104704003A - 针对赋予膦丝菌素-n-乙酰转移酶抗性的酶的单克隆抗体及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述了用于确定和定量膦丝菌素-N-乙酰转移酶(phosphinothricin-N-acetyl-transferase)存在的单克隆抗体和方法。权利要求的抗体和方法特别用于确定和定量在转基因植物中表达的膦丝菌素-N-乙酰转移酶的存在。

Description

针对赋予膦丝菌素-N-乙酰转移酶抗性的酶的单克隆抗体及检测方法
相关申请的交叉引用
本申请要求获得于2012年10月10日提交的美国专利申请系列号61/711,950的权益。
技术领域
本发明涉及的领域是应用于旨在检测由某些转基因植物事件表达的酶的ELISA(酶联免疫吸附测定法)的免疫学，这些酶可赋予对草铵膦，即L-膦丝菌素除草剂的抗性。
背景
编码膦丝菌素-N-乙酰转移酶(PAT)(EC 2.3.1.183)的基因常规地用作植物转基因事件的可选择标记，它们最初是从常见的好氧土壤放线菌——绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)中分离的。PAT酶催化膦丝菌素的乙酰化，将其脱毒为无活性的化合物，导致氨积累和细胞死亡(Murakami T.，Anzai H.，Imai S.，Satoh A.，Nagaoka K.，Thompson C.J.(1986).MolGen Genet205：42-50；Twell D.，Klein T.M.，Fromm M.E.，McCormick S.(1989).PlantPhysiol91：1270-1274.)。因此，表达PAT的转化植物细胞能够用草铵膦加以选择。
开发并销售用于播种用种子产品(planting seed products)的重组DNA性状(traits)的公司制订、执行并遵守严格的产品管理计划。这些管理计划要求对重组性状的各种组分使用经验证的定量和定性蛋白质检测方法，以跟踪性状渗入和种子产生活性，以及监测谷物收成。这些检测方法必须足够容易使用并且足够鲁棒，以供在GLP和非GLP条件下使用。此外，这些方法必须对用户足够友好，以使农民便于在田间、粮商便于在筒仓、海关官员便于在边境使用。因此，鲁棒、高质量、用户友好的蛋白质检测方法和商业试剂盒是有用的且必要的。
尽管ELISA在本领域众所周知，但是开发能够在实验室和田间设置下重复检测一系列植物组织中的特定转基因产物的鲁棒、高质量、经验证的(validated)ELISA方法既不是琐碎小事，亦非常规手段。更具有挑战性的是发现特别适合于开发用于检测功能性PAT转基因事件的侧向流试纸条(lateralflow strip)和/或ELISA的抗体对(antibody pairs)。
发明概要
本发明提供了一组单克隆抗体(mAbs)，155AD4，155E2.1.114，155Q3，155Q12，和155Q19.1，和产生这些mAbs的杂交瘤细胞系。这些mAbs令人惊讶地非常适用于检测多种植物和植物组织中表达PAT的转基因事件。本发明进一步提供了使用本发明免疫球蛋白的定量和定性免疫测定法，并且一般性地包括用于鉴定PAT酶存在的方法，其包括a)将第一种要求保护的mAb固定在测定表面上，然后清洗所述测定表面；b)使所述测定表面与怀疑含有PAT的液体接触足以容许结合的一段时间，然后清洗所述测定表面；c)使所述测定表面与和报告基团缀合的不同的要求保护的第二种抗体接触一段时间，该接触时间足以容许所述第二种缀合单克隆抗体结合，然后清洗所述测定表面；和d)检测所述报告基团的存在或不存在。本发明进一步一般性地包括用于定量测定PAT酶的方法，包括：a)将PAT特异性单克隆抗体固定在测定表面上；b)使所述测定表面与怀疑含有PAT的液体接触足以容许结合的一段时间，然后清洗所述测定表面；c)使所述测定表面与和报告基团缀合的不同的要求保护的第二抗体接触一段时间，该接触时间足以容许所述第二缀合单克隆抗体结合，然后清洗所述测定表面；和d)通过从比较到校准曲线插值来定量所述报告基团的存在。本发明还包括使用这些mAbs分离或检测PAT的方法，包括：a)将所述抗体固定化到表面上；b)使所述固定化的抗体与含有PAT的混合物接触；c)从所述混合物中分离与PAT结合的所述固定化抗体；和d)通过从所述固定化抗体中移出与抗体结合的PAT来回收PAT。
附图简述
图1是ELISA标准曲线分析。纯化的重组PAT蛋白被稀释成7个浓度，范围是0.25-6.0ng/mL。使用450nm的光密度读数减去650nm的背景OD对浓度进行描点绘图。
发明详细说明
本发明包括特异性结合PAT的抗体和产生这些mAbs的杂交瘤。下表列出了要求保护的杂交瘤细胞系命名及其相应的保藏日期。
杂交瘤/mAb命名 ATCC保藏命名 ATTC保藏日期
155AD4 PTA-13188 2012年9月12日
155E2.1.114 PTA-13189 2012年9月12日
155Q3 PTA-13187 2012年9月12日
155Q12 PTA-13190 2012年9月12日
155Q19.1 PTA-13186 2012年9月12日
杂交瘤细胞系被保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，VA，20110，该机构将向公众无限制地发放这些细胞系，但受到专利权管制。要求保护的细胞系以Dow AgroSciences LLC的名义于2012年9月12日保藏。这些保藏物系根据布达佩斯条约中关于用于专利程序目的之细胞系的保藏的相关条款作出并保持。这些保藏物将在ATCC保藏机构，其是一处公共性保藏机构，无限制地保持30年，或者在最近一次请求后5年，或者专利的有效期，以较长者为准，并且如果它们在此期间失活，则将被更换。
本发明包括使用这些mAbs分离或检测PAT的方法，包括将所述抗体固定化到表面上，使所述固定化的抗体与含有PAT的混合物接触，从所述混合物中分离与PAT结合的所述固定化抗体，和通过从所述固定化抗体中移出与抗体结合的PAT来回收PAT。
本发明进一步包括使用要求保护的抗体鉴定生物样品中PAT之存在的方法，包括将所述抗体固定化在测定表面上，使所述测定表面与怀疑含有PAT的液体接触并用合适的溶液清洗所述测定表面，使所述测定表面与用报告基团标记的抗-PAT抗体接触并用合适的溶液清洗所述测定表面，和检测所述报告基团的存在。
本发明进一步包括用于定量确定在转基因植物，特别是玉米、大豆和棉花植物中表达的PAT酶的分析方法。使用磷酸盐缓冲盐水溶液从植物样品中提取PAT蛋白。将提取物离心，收集水性上清液并稀释。在抗-PAT多克隆或单克隆抗体包被的平板的孔中，以夹心ELISA模式，将等份的稀释样品与要求保护的发明的酶缀合抗-PAT单克隆抗体进行温育。夹心对中的两种抗体均捕捉样品中的PAT蛋白。在温育期结束时，通过用PBST清洗将未结合的试剂从平板上除去。通过将酶缀合物与酶底物温育，产生有颜色的产物，来检测PAT的存在。因为PAT被结合在抗体夹心中，所以显色水平与样品中PAT的浓度成正比(即，蛋白浓度越低，显色越低)。使用酶标仪测量450nm的吸光度，并减去参考波长(例如650nm)的吸光度。使用二次回归方程从7个标准浓度估算校准曲线。这种PAT ELISA的特异性和灵敏度足以用于定量植物组织样品提取物中的PAT。此外，本发明的抗体可用于使用标准western印迹程序确认PAT的存在。
针对感兴趣蛋白质的抗体的制备在本领域是众所周知的。参见Galfreand Milstein，Methods in Enzymology，73卷，Academic Press，New York(1981)；James W.Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，AcademicPress，Orlando，Florida(1986)；Current Protocols in Molecular Biolopy，F.M.Ausubel等人编辑，Wiley Interscience，New York，(1987)。
为了制备可与感兴趣蛋白质反应的抗体，首先必须富集或纯化蛋白质。蛋白质的相对较粗的抗原制备物可用于免疫目的。然而，要精确地确定杂交瘤是否产生所寻求的单克隆抗体或者要测定免疫血清的抗体滴度，则需要高度纯化的蛋白质。
一旦PAT酶被纯化，便可通过本领域众所周知的传统方法激发PAT特异的抗体。历时数周或数月反复注射选定的动物宿主将引发免疫响应，并导致显著的抗-PAT血清滴度。优选的宿主是哺乳动物物种，更高度优选的物种是兔、山羊、绵羊和小鼠。从这些被免疫的动物中抽取的血液可以通过确立的方法加工，从而获得可与PAT反应的抗血清(多克隆抗体)。然后，可以根据本领域已知的技术通过与PAT吸附对抗血清进行亲和纯化。亲和纯化的抗血清可以使用本领域已知的程序通过分离抗血清中的免疫球蛋白组分来进一步纯化。所得的材料将是能够与PAT反应的异质性的免疫球蛋白群体。
抗-PAT mAb可以使用纯化的PAT容易地加以制备。用于产生mAb的方法已经被实践了数十年，并且对于本领域普通技术人员而言是众所周知的。反复腹腔或皮下注射置于佐剂中的PAT将在大多数动物，特别是小鼠中引发免疫响应。从动物中移出超免疫化的B淋巴细胞，并与能够无限培养的合适融合伴侣(partner)细胞系融合。多种哺乳动物细胞系可作为产生杂交瘤用的合适融合伴侣。许多这样的细胞系可以从ATCC和供应商商购获得。
一旦融合完成，将所得杂交瘤在选择性生长培养基中培养1-2周。有两种熟知的选择系统可供用于从混合的杂交瘤培养物中清除未融合的骨髓瘤细胞或骨髓瘤细胞之间的融合物。选择系统的选择取决于被免疫的小鼠的品系和所用的骨髓瘤融合伴侣。可以使用如Taggart and Samloff，Science 219，1228(1982)所述的AAT选择系统；然而，如Littlefield，Science145，709(1964)所述的HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸苷)选择系统是优选的，因为它与上述的小鼠细胞和融合伴侣兼容。
然后对用过的生长培养基(Spent growth medium)筛选是否有免疫特异性mAb的分泌。酶联免疫测定程序最适合该目的；尽管适合大体积筛选的放射免疫测定也可以接受。必须实施多次旨在连续削减大量无关或不甚合意的培养物的筛选，以分离只占小部分的本发明单克隆抗体。对于分泌与PAT反应的mAb的培养物，可以使用市售的测定法鉴定同种型。
分泌寻求的抗-PAT mAb的杂交瘤培养物可以亚克隆数次，以确立单克隆性和稳定性。公知的真核生物非粘附细胞培养物亚克隆方法包括有限稀释、软琼脂糖和荧光激活细胞分选技术。每次亚克隆之后，必须重新测定所得培养物的抗体分泌并鉴定同种型，以确保稳定的抗体分泌杂交瘤细胞系已建立。
要求保护的抗-PAT抗体可以固定化在表面上，从而使一些抗体结合位点仍然暴露，并能够结合PAT。在过去的几十年里，已经开发了出各式各样的用于固定化抗体的方案。固定化可以通过将抗体直接共价偶联到期望的表面上而实现，或者通过将抗体桥连到该表面上而实现。
将抗体用CNBr和碳二亚胺偶联到基于多糖的球珠，例如(Pharmacia，Piscataway，NJ)上，是符合本发明的直接偶联方案的实例。直接偶联一般不会以特定的方式定向抗体；然而，某些类型的直接偶联能够可重复地将抗体定向在固定化基质上。
优选的偶联方案定向抗体使其抗体结合区保持暴露。其中一种这样的方案利用在抗体重链上发现的天然糖类。通过首先将糖部分氧化成相应的醛，然后使醛与表面上的伯氨基反应，有可能沿着有利的朝向连接抗体。
可能有多种类型的桥，包括小的有机接头，其将抗体共价结合到固定化表面上。这样的间隔臂(spacer arms)是可以接受的，并且优选地一旦当桥联已经形成不应与蛋白质相互作用。
上面的讨论没有任何限制本发明范围的涵义。其它大量熟知的用于将抗体连接到固定化基质上的方案也符合本发明。
众所周知，用报告基团标记的抗体能够用于在各种环境下鉴定抗原的存在。用放射性同位素标记的抗体已经在放射免疫测定中使用了数十年，以很高的精确度和灵敏度鉴定各种生物流体中存在的抗原。新近，酶标记的抗体已经在流行的ELISA中用作放射性标记抗体的替代物。
本发明的抗体能够被结合到固定化物质或测定表面，例如聚苯乙烯孔或颗粒，并在免疫测定中用于确定测试样品中是否存在PAT。在本发明的这个实施方案中，使样品与免疫亲和表面接触并温育。在清洗步骤之后，通过使表面与标记有报告基团的另一种本发明的抗体接触，对任何结合到免疫亲和表面上的PAT进行检测。
使用具有要求保护的抗体和测定方法的侧向流试纸条(lateral flow strip)或免疫色谱试纸条(immunochromatographic strips)也符合本发明。侧向流测定法是本领域熟知的。参见例如美国专利6,485,982。在这种模式下，侧向流试验(test)可用于定性或半定量地单独检测PAT或者一起检测PAT与其它分析物。侧向流试验是本文所述的所有试验模式中最简单易用的一种，特别适用于田间环境，其中植物材料快速提取成溶液，并在侧向流试纸条上进行测试。在这种模式下，仅需要将侧向流试纸条放置到液体样品中或者将液体样品施加到侧向流试纸条上，并在预定的时间后读出结果。所有侧向流试验均应当包括一条用于验证测试结果的流程对照线(control line)或样品对照线。因此，出现两条线表示阳性结果，而有效的阴性测试仅产生对照线。如果仅出现测试线，或者如果没有出现线，则是无效的。
典型的侧向流试纸条包括4个主要部分：样品垫(pad)，在上面施加测试样品，缀合物垫，含有与有色颗粒(典型的胶体金颗粒，或乳胶微球)缀合的本发明抗体；反应膜，例如疏水硝酸纤维素或醋酸纤维素膜，在上面沿着横跨膜的线固定化本发明的不同抗体，作为捕获区或测试线；物种特异性第二抗体，用于捕获未结合的PATAb-金缀合物，以形成对照线；和废物储存器，设计用于通过毛细作用吸引样品穿过反应膜。
侧向流试纸条的各个部分通常被固定在惰性背衬材料上，并可能以简单的浸渍条(dipstick)形式存在，或者位于塑料外壳内，塑料外壳具有样品口(port)和显示捕获区和对照区的反应窗口。在测定实施方案的另一个模式中，使怀疑含有PAT的测试样品干固(dried onto)到表面上，形成固定化的测试样品。然后，使本发明的标记抗体与固定化的测试样品接触并温育。如果样品中含有PAT，则标记的抗体将结合到固定化的PAT上。这种方法也可以这样实现，使用非标记的本发明抗体，随后添加带标记的第二抗体，其与已经和PAT结合的本发明抗体结合。在清洗之后，对固定化的测试样品进行测量，以检测任何报告基团的存在。
报告基团通常是酶，例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或β-D-半乳糖苷酶。合适的底物在与酶反应时会产生颜色变化。在这样做的时候，颜色强度的测量可以使用分光光度计加以量化。如果报告基团是放射性同位素，则可以使用合适的γ或β射线检测仪器对报告基团进行定量。报告基团的强度与测试样品中PAT的量直接相关。
下面的实施例将帮助描述如何实践本发明，并将例示对要求保护的抗-PAT抗体和测试方法的特征。
实施例1
产生单克隆抗体
用纯化的重组PAT蛋白对小鼠进行免疫，并使用标准PEG-介导的融合技术制备一组表达抗-PAT单克隆抗体的杂交瘤。从每个含有杂交瘤培养物的孔中无菌移出用过的组织培养基的样品，并用如下的抗体捕获ELISA方法对PAT反应性进行测定。用1-10μg/mL纯化重组PAT蛋白溶液包被微滴定孔。清洗孔，并将用过的组织培养基的样品置于孔中并温育。清洗孔，并添加辣根过氧化物酶标记的抗小鼠抗体并温育。清洗平板，添加底物进行显色反应，并阅读平板的光密度(OD)。将具有高OD读数的孔对映回含有杂交瘤的培养孔。在培养扩大的同时，对PAT抗体阳性培养物持续进行筛选抗体产生，以保证生长稳定性和抗体产生。进行数轮有限稀释克隆，从而为每一个培养物建立真正的单克隆性。对抗体阳性克隆进行进一步的测定，以确定每种抗体是否适用于使用要求保护的定量检测方法对植物材料进行田间测量。
实施例2
开发免疫印迹测定方法
评估并建立Western印迹条件，用于使用PAT单克隆或多克隆抗体检测转基因作物组织样品中的PAT蛋白。最终的测定法使用SDS-PAGE分离样品，并在印迹到膜上之后用PAT单克隆或多克隆抗体进行探测。
对于来自表达PAT的转基因大豆的叶片组织样品，首先在PBST缓冲液中或者直接在Laemmli缓冲液中进行提取。然后，对加热处理的样品进行SDS-PAGE。将蛋白质转移到PVDF或硝酸纤维素膜上之后，用封闭缓冲液封闭膜，然后用PAT单克隆或多克隆抗体在室温下温育大约1小时。清洗步骤之后，用HRP(辣根过氧化物酶)缀合的物种特异性第二抗体(例如，对于PAT单克隆抗体，第二抗体是山羊抗小鼠IgG抗体)对膜进行温育。温育之后，洗去未结合的抗体，将已结合的抗体与化学发光底物温育。通过以各种时间间隔对膜进行曝光而捕获化学发光信号，获得产生的条带。单克隆和多克隆抗体均能够检测来自转基因作物组织样品的PAT蛋白。
实施例3
ELISA测定模式和开发
对测定条件进行评估，以确定最佳抗体对、抗体包被浓度、包被和封闭缓冲液的组分、包被模式和pH，和抗体-HRP缀合比及浓度。最终的测试模式使用顺次或同时夹心模式，包括单克隆包被抗体和单克隆抗体-HRP缀合物。
在这一系统中，从抗血清批号(lot)D2976纯化的PAT多克隆抗体用包被缓冲液稀释，并添加到微量滴定板中。温育后，用封闭缓冲液封闭孔，并清洗。将纯化的重组PAT蛋白样品加入到经过包被的反应孔中，与HRP缀合的单克隆抗体155Q12温育大约1小时。清洗步骤之后，向反应孔中添加比色底物。在PAT蛋白存在下，PAT特异性单克隆抗体被结合在反应孔中，并且缀合的HRP与HRP反应，随后在孔中产生颜色变化。与底物温育合适的时间之后，通过添加终止溶液终止反应。用96孔酶标仪在底物特异性波长(即450nm)读取显色的光密度，并减去参考波长(即650nm)的读数。对所得数据进行作图，并计算标准校准曲线，如图1所示。
实施例4
ELISA测定特征
A)标准校准曲线性能：
该测定模式被应用于定量分析从植物材料中提取的PAT蛋白。用范围为0.25-6.0ng/mL的7个浓度建立标准校准曲线，并评估相应的OD范围和变异。来自在不同日期由不同的分析者进行的五次测试的结果显示，总体标准曲线吸光度范围是0.113-1.773。板间和分析者间测试精密度导致的百分比变异系数(CV％)范围是8.0％-12.6％(表1a)。使用所建立的校准曲线进行倒推测算，预测的标准浓度显示了精确的预测，来自5个独立试验的平均值％误差范围是0.4％-3.5％，变异性(CV％)小于5％(表1b)。
表1a
PAT校准曲线性能——OD范围和精密度
样品 浓度 平均预测浓度 平均％误差 CV％ (n＝)
Std01 6.00 5.98 0.4 0.5 5
Std02 4.80 4.85 1.1 1.2 5
Std03 3.60 3.55 1.4 0.7 5
Std04 2.40 2.41 1.2 1.5 5
Std05 1.20 1.21 1.4 2.1 5
Std06 0.60 0.60 1.6 2.0 5
Std07 0.25 0.25 3.5 4.8 5
B)测定法准确度：
通过用已知量的参考标准蛋白强化(fortifying)阴性对照作物组织，并测量回收率，来评估该测定法的准确度。基于两个独立的试验，在玉米和大豆叶样品中掺杂0.25ng/mL(LOD水平)，0.60ng/mL(LOQ水平)，中(2.40ng/mL)和定量范围上限水平(upper level)(6.00ng/mL)。玉米和大豆叶在定量范围(0.60-6.00ng/mL)内的平均回收率分别为88.5％和117％(表2)，处于行业内在测定准确度评估中普遍使用的70-120％的可接受范围内。两个试验的变异导致的玉米和大豆的CV％分别为18.3％和2.5％。与大豆不同，玉米叶在LOD水平上超出了70-120％的范围，但是准确定量在这个水平上不适用。
表2
玉米和大豆PAT蛋白定量的准确度评估
C)来自作物组织样品的转基因PAT蛋白定量：
将该测定法用于作物组织样品以测量PAT蛋白的表达。如表3所示，对一个阴性对照大豆叶样品和三个PAT转基因大豆叶样品在多个稀释度下通过ELISA测定法进行分析。线性和精密度分别通过计算多个稀释度和重复样品之间的调整结果的CV％进行评估。两者的CV％均小于5％，表明测定具有良好的线性和精密度。
表3
大豆叶样品PAT蛋白的ELISA定量分析
经调整结果、平均值结果来自重复确定值乘以稀释因子；N.D.，不可检测，如果平均OD小于校准曲线上LOD水平的OD；N.A.，不适用。
实施例5
PAT定量ELISA方案
设备和材料
天平，分析用，AE50型，Mettler Instrument Corporation，Hightstown，NJ08520
离心机，能够容纳96孔板，GR422型，目录号11176916，Jouan，Inc.，Winchester，VA 22602
离心机，能够容纳2mL Eppendorf管，Eppendorf-5417C，BrinkmannInstruments.Inc.，Westbury，NY 11590
冰箱，能够保持-20℃，75F型，U-Line Corporation，Milwaukee，WI 53223
冰箱，能够保持-80℃，ULT2586型，目录号13-989-233，Fisher Scientific，Pittsburgh，PA 15205
温育箱，精密型(Precision)，经济型(Economy)，目录号51221087，Jouan，Inc
研钵(Mortar)，陶瓷，Coors 60316，目录号12-961A，Fisher Scientific
杵(Pestle)，陶瓷，Coors 60317，目录号12-961-5A，Fisher Scientific
移液器，各种尺寸，Rainin，Woburn，MA 01888
移液器，8或12通道，Rainin，Woburn，MA 01888
电动移液器(Pipet Aid)，手提式，目录号13-681-19，Fisher Scientific
酶标仪，Vmax微板酶标仪，带SOFTMAX软件，能够读取450和650nm，目录号0200-2018，Molecular Devices，Sunnyvale，CA94089
冰箱，能够保持4℃，目录号13-991-86，Fisher Scientific
振荡器/研磨器，Geno/Grinder型，目录号2000-115，Certiprep，Metuchen，New Jersey 08840
搅拌盘(Stir plate)，220T型，目录号14-493-220T，Fisher Scientific
漩涡振荡器，Genie-2型，目录号12-812，Fisher Scientific
洗板机，96孔微板，Elx 405型，Bio-Tek Instruments，Inc.，Winooski，VT05404
水纯化系统，Milli-Q UV Plus型，Millipore Corporation，Milford，MA01757
盆(Basin)，试剂，非无菌，目录号13-681-100，Fisher Scientific
球珠，1/8″铬钢，目录号039347，Small Parts Inc.，Miami Lakes，FL33014-0650
移液管，10-mL一次性血清级，目录号13-678-11E，Fisher Scientific
移液管吸头，各种尺寸，Fisher Scientific
平板，96孔，深孔聚丙烯非结合性，用于样品稀释，Fisher Scientific
平板封盖(Plate sealer)，96孔，目录号07-200-375，Fisher Scientific
管，1.2-mL聚丙烯集群(cluster)，每架96管，目录号7200320，FisherScientific
管，2.0-mL圆锥形聚丙烯Eppendorf微离心，目录号02-681-344，FisherScientific
帽，用于2.0-mL圆锥形管，目录号02-681-361，Fisher Scientific
管，具有帽的5-mL聚丙烯离心管，目录号14-959-11A，Fisher Scientific
管，具有帽的15-mL聚丙烯离心管，目录号05-538-59A，Fisher Scientific
管，具有帽的50-mL聚丙烯离心管，目录号05-526B，Fisher Scientific
称重盘(Weigh dish)，小型，目录号02-204A，Fisher Scientific。
试剂和标准品
PAT抗体包被的96孔微滴定板，PAT抗体缀合溶液，比色底物溶液，终止溶液。
PBST，pH 7.4，用于制作1L的包，目录号P-3563，Sigma。2-8℃保存。
聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，分子量40000，目录号PVP-40，Sigma
PAT微生物标准蛋白质。
清洗缓冲液：PBS，pH 7.4，含0.05％吐温20(PBST)
测定缓冲液：磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4，含0.05％吐温20加1％PVP(w/v)(PBST/PVP)
测定程序
将PAT ELISA试剂在实施测定前至少30分钟从冰箱取出，平衡到20-25℃。
准备PAT工作储液，100ng/mL
起始的PAT标准品可以是冻干粉或分为等份的液体储液。例如，一种储液是0.3mg/mL溶液。
涡旋储液，然后将最少10μL的0.3-mg/mL PAT储液添加到990μLPBST/PVP中，充分混合制成3000-ng/mL储液。类似地，将40μL 1000-ng/mL储液添加到1160μL PBST/PVP中，充分混合制成100-ng/mL储液。将它们保持在冰上，并在2小时内使用。如果观察到任何可见的污染，则抛弃。
按照表4准备PAT校准曲线溶液。
表4
样品制备
A)作物组织样品在-80℃冷冻保存，直至冻干。冻干后，研磨样品，然后保存于-80℃冰箱，直至称量用于分析。
B)一般地，称量每份15-mg的制备好的组织样品，分装到2-mL聚丙烯管中。每个管中放入2或3个金属球珠和1.5mL PBST/PVP测定缓冲液。每个样品系列应当按照方法实施一个试剂空白和一个对照。试剂空白含有1.5mL PBST/PVP测定缓冲液。
C)所有的管封盖。使用Geno/Grinder自动振荡器/研磨器提取样品，标度盘设置(dial setting)为500，切换开关设定为1X(每分钟大约1500个行程)，一个周期为3分钟。
D)以3,000(或者更多)rpm离心样品5分钟或直至分离(上清液中没有可见颗粒)。上清液可以转移到别的管中，或者可以用测定缓冲液进一步稀释，用来按照如下所述的步骤进行分析。将提取物保持在冰上，并在4小时内对其进行测定。
每个测试在一个单独的微滴定板上执行。对一个样品或标准品的重复分析的平均值构成单个结果。每个板内必须包含校准曲线和合适的对照。
将ELISA标准校准溶液转移到非结合性的96孔稀释平板内，并将位置记录在96孔测定模板页(template sheet)上。
根据需要制备样品稀释液，将稀释的样品转移到含有标准校准溶液的非结合性96孔稀释板中，并将位置记录在96孔测定模板页上。
向试剂盆中分加大约每板6mL的PAT抗体缀合物。
从试剂盆向抗体包被的96孔微滴定板的每个孔中移入50μL所述PAT抗体缀合物。丢弃任何未使用的PAT抗体缀合溶液。
从非结合性的96孔稀释平板取100μL ELISA标准溶液和稀释样品加入抗体包被的96孔微滴定板，保持与96孔测定模板相同的方向。为每个样品更换移液器吸头。
用粘性板封盖覆盖平板。在台式或平板摇床上轻轻摇动ELISA平板大约10秒钟，以将参考标准品和稀释样品与PAT抗体缀合物混合。
在平板摇床上室温(20-30℃)下震荡微量滴定板大约60分钟。
使用自动洗板机用350μL//孔的PBST清洗平板5次。在纸巾上吸干多余的液体。
向试剂盆中分加大约每板12mL显色剂(底物溶液)。
从试剂盆向抗体包被的96孔微滴定板的每个孔中移入100μL显色剂。覆盖板，并轻轻混匀。丢弃任何未使用的显色剂溶液。
在平板摇床上在室温(20-30℃)下震荡微量滴定板大约30分钟。
向试剂盆中分加大约每板12mL终止溶液。
向每个孔添加100μL终止溶液终止反应。轻轻混合平板。终止溶液的添加应当没有中断。使微滴定板避阳光；否则颜色强度会受到影响。
使用96孔微滴定板酶标仪读出450nm减去650nm的吸光度。所有读数应当在添加终止溶液后的30分钟内完成。
数据分析和计算：校准曲线
应当使用已知浓度的标准校准溶液及其随后的吸光度(光密度)进行校准曲线回归。使用SOFTMAX软件的二次回归模型建立回归曲线并进行随后的计算。
根据如下的方程使最佳抛物线与标准曲线拟合：y＝A+Bx+Cx2
其中：y＝平均吸光度值(OD)，x＝参考标准浓度
计算未知样品中的PAT
SOFTMAX软件或Microsoft Excel可用于计算每个样品中的PAT浓度。使用每个孔的吸光度值从校准曲线回归插值计算浓度(见下面的方程)，然后，从重复孔的结果计算平均样品结果、标准偏差和百分比变异系数。
根据样品重量、用于提取的测定缓冲液体积、和所采用的稀释因子来计算每个样品的最终PAT浓度，单位是ng/mg。
分析批次的接受标准
每次测试必须满足如下所列的程序中可接受标准方可有效。如果数据不能满足这些性能标准，则分析者应当对结果进行评估；确定变异的潜在来源，并且如果有必要的话，重复进行分析。
表5
测定缓冲液空白(0ng/mL标准品) 吸光度(450nm-650nm)＜0.120
6ng/mL标准品 吸光度(450nm-650nm)≥1.000
校准曲线 r2(确定的相关性)≥0.990
所有阳性参考标准品，OD 三次重复的CV(OD)≤15％
未知或QC样品，溶液 重复的CV(OD)≤20％*
*只适用于高于LOD水平(0.25ng/mL)OD的样品OD值。
虽然本发明已经关于本说明书和实施例进行了描述，但是本发明还可以在本公开的精神和范围内进行进一步的修改。此外，本申请意图涵盖这些背离，它们虽然偏离本公开的内容但仍在本发明所属领域的已知或习惯做法之内。

Claims (17)

1.一种特异性结合膦丝菌素-N-乙酰转移酶(PAT)的单克隆抗体，其选自下列单克隆抗体的组：155AD4,155E2.1.114,155Q3,155Q12,和155Q19.1。
2.权利要求1的单克隆抗体，由命名为155AD4的杂交瘤产生。
3.权利要求1的单克隆抗体，由命名为155E2.1.114的杂交瘤产生。
4.权利要求1的单克隆抗体，由命名为155Q3的杂交瘤产生。
5.权利要求1的单克隆抗体，由命名为155Q12的杂交瘤产生。
6.权利要求1的单克隆抗体，由命名为155Q19.1的杂交瘤产生。
7.一种产生权利要求1的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其以选自下组的登录号保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)：PTA-13186,PTA-13187,PTA-13188,PTA-13189,和PTA-13190。
8.权利要求7的杂交瘤，其以ATCC登录号PTA-13186保藏。
9.权利要求7的杂交瘤，其以ATCC登录号PTA-13187保藏。
10.权利要求7的杂交瘤，其以ATCC登录号PTA-13188保藏。
11.权利要求7的杂交瘤，其以ATCC登录号PTA-13189保藏。
12.权利要求7的杂交瘤，其以ATCC登录号PTA-13190保藏。
13.一种用于鉴定PAT酶的存在的方法，包括：
a)将第一种权利要求1的单克隆抗体固定到测定表面上，然后清洗所述测定表面；
b)使所述测定表面与怀疑含有PAT的液体接触足以容许结合的一段时间，然后清洗所述测定表面；
c)使所述测定表面与和报告基团缀合的不同的第二种权利要求1的抗体接触足以容许所述第二种缀合单克隆抗体结合的一段时间，然后清洗所述测定表面；和
d)检测所述报告基团的存在或不存在。
14.一种用于定量测定PAT酶的方法，包括：
a)将PAT多克隆抗体固定到测定表面上；
b)使所述测定表面与怀疑含有PAT的液体接触足以容许结合的一段时间，然后清洗所述测定表面；
c)使所述测定表面与和报告基团缀合的不同的第二种权利要求1的抗体接触足以容许所述第二种缀合单克隆抗体结合的一段时间，然后清洗所述测定表面；和
d)通过从校准曲线插值来定量所述报告基团的存在。
15.权利要求14的方法，其中所述缀合单克隆抗体选自155Q12和155Q19.1。
16.权利要求14的方法，其中所述缀合单克隆抗体是155Q12。
17.权利要求14的方法，其中所述缀合单克隆抗体是155Q19.1。
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