JP2015533831A - ホスフィノスリシン−n−アセチル−トランスフェラーゼに対する抵抗性を付与する酵素に対するモノクローナル抗体および検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2012年10月10日に出願された米国特許出願第61/711,950号明細書の利益を主張する。
モノクローナル抗体の作製
精製された組換えPATタンパク質でマウスを免疫し、PEGによって媒介される標準的な融合法を用いることにより、抗PATモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマのパネルを調製した。使用済みの組織培養液のサンプルを、ハイブリドーマ培養物を含む各ウェルから無菌的に(aspetically)取り出し、以下の抗体捕捉ELISA法を用いて、PAT反応性についてアッセイした。マイクロタイターウェルを、1〜10μg/mLの精製された組換えPATタンパク質の溶液でコーティングした。それらのウェルを洗浄し、使用済みの組織培地のサンプルをそれらのウェルに入れ、インキュベートした。それらのウェルを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された抗マウス抗体を加え、インキュベートした。そのプレートを洗浄し、基質を加えることにより、呈色反応を起こし、光学密度(OD)についてそのプレートを読み出した。ハイブリドーマを含むウェルを培養するために、高いOD読み値を有するウェルをマップバックした(mapped back)。PAT抗体陽性培養物を、抗体産生について連続的にスクリーニングすることにより、それらの培養物が増加するときの増殖安定性および抗体産生を確実にした。数回の限界希釈によるクローン化を行うことにより、各培養物に対して真の単クローン性を確立した。抗体陽性クローンに対してさらなるアッセイを行うことにより、植物材料とともに圃場で使用するための現在特許請求されている定量的検出方法において使用するための各抗体の適格性を判定した。
イムノブロットアッセイの開発
トランスジェニック作物の組織サンプルからPATタンパク質を検出するためにPATモノクローナル抗体またはPATポリクローナル抗体を使用するためのウエスタンブロット条件を評価し、確立した。最終的なアッセイは、SDS−PAGEを使用してサンプルを分離し、膜へのブロッティング後にPATモノクローナル抗体またはPATポリクローナル抗体でプロービングした。
ELISAアッセイの形式および開発
最適な抗体対、抗体コーティング濃度、コーティング緩衝液およびブロッキング緩衝液の成分、コーティングの形式およびpH、ならびに抗体−HRPの結合体化の比率および濃度を決定するために、アッセイ条件を評価した。最終的なアッセイ形式は、ポリクローナルコーティング抗体およびモノクローナル抗体−HRP結合体によって構成される、順次または同時のサンドイッチ形式を使用した。
ELISAアッセイの特徴
A)標準的な較正曲線の性能:
上記のアッセイ形式を、植物材料から抽出されたPATタンパク質の定量的解析のために適用した。標準的な較正曲線の範囲を、0.25〜6.0ng/mLの範囲の7つの濃度によって確立し、対応するODの範囲および変動を評価した。異なる日に様々な分析者が行った5つの試験から、結果は、0.113〜1.773の範囲の全体的な検量線の吸光度を示した。プレート間および分析者間の試験の精度は、8.0%〜12.6%の範囲のパーセント変動係数(CV%)をもたらした(表1a)。確立された較正曲線を使用して逆算すると、予測された標準的な濃度は、0.4%〜3.5%の範囲の平均%誤差で正確な断定を示し、変動(CV%)は、5つの独立した試験から5%未満(less 5%)だった(表1b)。
ネガティブコントロール作物の組織を既知量の参照標準タンパク質で強化し、回収物を測定することによって、アッセイを精度について評価した。2つの独立した試験に基づいて、トウモロコシおよびダイズの葉サンプルに、0.25ng/mL(LODレベル)、0.60ng/mL(LOQレベル)、中レベル(2.40ng/mL)および高レベル(6.00ng/mL)の定量的範囲でスパイクした(spiked)。その定量的範囲(0.60〜6.00ng/mL)内の平均回収率は、トウモロコシおよびダイズの葉に対してそれぞれ88.5%および117%であり(表2)、これらは、アッセイ精度の評価のために業界で広く実施された70〜120%という許容可能な範囲内に入るものだった。2つの試験の変動は、トウモロコシおよびダイズに対してそれぞれ18.3%および2.5%のCV%をもたらした。ダイズとは異なり、トウモロコシ葉は、LODレベルにおいて70〜120%の範囲外だったが、正確な定量化は、このレベルにおいて適用できなかった。
上記アッセイを作物組織サンプルに適用することにより、PATタンパク質の発現を測定した。表3に示されるように、1つのネガティブコントロールダイズ葉サンプルおよび3つのPATトランスジェニックダイズ葉サンプルを、ELISAアッセイによって複数の希釈度で解析した。線形性および精度を、それぞれ複数の希釈度の間および複製サンプルの間の調整された結果からCV%を計算することによって、評価した。両方のCV%が、5%未満だったことから、このアッセイの良好な線形性および精度が示唆された。
PAT定量的ELISAプロトコル
装置および材料
分析用天秤,Model AE50,Mettler Instrument Corporation,Hightstown,NJ08520。
96ウェルプレートを保持することができる遠心分離機,Model GR422,カタログ番号11176916,Jouan,Inc.,Winchester,VA22602。
2mLのEppendorfチューブを保持することができる遠心分離機,Eppendorf−5417C,Brinkmann Instruments.Inc.,Westbury,NY11590。
−20℃を維持することができる冷凍庫,Model 75F,U−Line Corporation,Milwaukee,WI53223。
−80℃を維持することができる冷凍庫,Model ULT2586,カタログ番号13−989−233,Fisher Scientific,Pittsburgh,PA15205。
正確かつ経済的な恒温器,カタログ番号51221087,Jouan,Inc.。
磁器製品である乳鉢,Coors 60316,カタログ番号12−961A,Fisher Scientific。
磁器製品である乳棒,Coors 60317,カタログ番号12−961−5A,Fisher Scientific。
様々なサイズのピペッター,Rainin,Woburn,MA01888。
8または12チャネルのピペッター,Rainin,Woburn,MA01888。
携帯型のピペットエイド,カタログ番号13−681−19,Fisher Scientific。
450および650nmを読み出すことができるSOFTMAX PRO(登録商標)ソフトウェアを備えるMAXlINE(登録商標)Vmaxマイクロプレートリーダーであるプレートリーダー,カタログ番号0200−2018,Molecular Devices,Sunnyvale,CA94089。
4℃を維持することができる冷蔵庫,カタログ番号13−991−86,Fisher Scientific。
振盪機/粉砕機,Model Geno/Grinder,カタログ番号2000−115,Certiprep,Metuchen,New Jersey 08840。
撹拌プレート,Model 220T,カタログ番号14−493−220T,Fisher Scientific。
ボルテックス,Genie−2 Model,カタログ番号12−812,Fisher Scientific。
96ウェルマイクロプレートの洗浄機,Model Elx 405,Bio−Tek Instruments,Inc.,Winooski,VT05404。
水精製システム,Model Milli−Q UV Plus,Millipore Corporation,Milford,MA01757。
未滅菌の試薬容器,カタログ番号13−681−100,Fisher Scientific。
1/8”クロム鋼のビーズ,カタログ番号039347,Small Parts Inc.,Miami Lakes,FL33014−0650。
10mLの使い捨ての血清学的ピペット,カタログ番号13−678−11E,Fisher Scientific。
様々なサイズのピペットチップ,Fisher Scientific。
サンプル希釈用の、96ウェルで深ウェルのポリプロピレン非結合プレート,Fisher Scientific。
96ウェルプレートシーラー,カタログ番号07−200−375,Fisher Scientific。
1.2mLのポリプロピレンクラスターで96本/ラックのチューブ,カタログ番号7200320,Fisher Scientific。
2.0mLのポリプロピレン製、Eppendorfマイクロ遠心分離機用のコニカルチューブ,カタログ番号02−681−344,Fisher Scientific。
2.0mLコニカルチューブ用のキャップ,カタログ番号02−681−361,Fisher Scientific。
5mLのポリプロピレン遠心分離機用のキャップ付きチューブ,カタログ番号14−959−11A,Fisher Scientific。
15mLのポリプロピレン遠心分離機用のキャップ付きチューブ,カタログ番号05−538−59A,Fisher Scientific。
50mLのポリプロピレン遠心分離機用のキャップ付きチューブ,カタログ番号05−526B,Fisher Scientific。
小型の秤量皿,カタログ番号02−204A,Fisher Scientific。
PAT抗体がコーティングされた96ウェルマイクロタイタープレート、PAT抗体結合体溶液、発色基質溶液、停止液。
PBST,pH7.4,1L調製用のパケット,カタログ番号P−3563,Sigma.2〜8℃で保管する。
分子量40,000のポリビニルピロリドン(PVP),カタログ番号PVP−40,Sigma。
微生物の標準的なPATタンパク質。
洗浄緩衝液:0.05%Tween20を含むPBS,pH7.4(PBST)
アッセイ緩衝液:0.05%Tween20を含むリン酸緩衝食塩水,pH7.4+1%PVP(w/v)(PBST/PVP):
アッセイを行う少なくとも30分前に冷蔵庫から取り出すことによって、PAT ELISA試薬を20〜25℃に平衡化する。
100ng/mLのPAT使用原液(Working Stock Solution)を調製する。
開始時のPAT標準物質は、凍結乾燥粉末または等分された液体原液であり得る。例えば、1つの原液は、0.3mg/mLの溶液である。
その原液をボルテックスし、次いで、最低10μLの0.3mg/mL PAT原液を990μLのPBST/PVPに加え、十分に混合することにより、3000ng/mL原液を調製する。同様に、40μLの1000ng/mL原液を1160μLのPBST/PVPに加え、十分に混合することにより、100ng/mL原液を調製する。それらを氷上で維持し、2時間以内に使用する。目に見える混入が観察される場合、廃棄する。
表4に従って、PAT較正曲線用の溶液を調製する。
A)作物組織サンプルを、凍結乾燥するまで−80℃で凍結保存する。凍結乾燥後、サンプルを粉砕し、次いで、解析のために秤量するまで−80℃の冷凍庫で保存する。
B)通常、調製された組織サンプルの15mgの部分を秤量し、2mLのポリプロピレンチューブに分配する。各チューブに2つまたは3つの金属ビーズ、および1.5mLのPBST/PVPアッセイ緩衝液を加える。各サンプルセットを用いる方法を通じて、試薬ブランクおよびコントロールを伴うべきである。その試薬ブランクは、1.5mLのPBST/PVPアッセイ緩衝液を含む。
C)上記のチューブすべてに蓋をする。1サイクルとして3分間、Geno/Grinder自動振盪機/粉砕機を500というダイアル設定でおよびトグルスイッチを1×設定(およそ1500ストローク/分)で使用して、サンプルを抽出する。
D)3,000(またはそれ以上の)rpmで5分間または分離するまで(上清中に粒子が見えなくなるまで)サンプルを遠心分離する。その上清を分離用チューブに移し得るか、または以下の工程に記載されるような、解析のためにアッセイ緩衝液によるさらなる希釈に供し得る。その抽出物を氷上で維持し、それを4時間以内にアッセイする。
各試験を1枚の個別のマイクロタイタープレートにおいて行う。サンプルまたは標準物質の2つ組の解析の平均値が、単一の結果を構成する。較正曲線および適切な条件が、各プレートに含められていなければならない。
ELISAの標準的な較正溶液を非結合96ウェル希釈プレートに移し、その96ウェルアッセイテンプレートシート上に位置を記録する。
必要に応じてサンプル希釈物を調製し、希釈されたサンプルを、標準的な較正溶液を含む非結合96ウェル希釈プレートに移し、96ウェルアッセイテンプレートシート上に位置を記録する。
プレート1枚あたりおよそ6mLのPAT抗体結合体を試薬容器に分注する。
抗体がコーティングされた96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルにその試薬容器から50μLのPAT抗体結合体をピペットで移す。使用されないPAT抗体結合体溶液がある場合はこれを廃棄する。
100μLのELISA標準液および未結合96ウェル希釈プレートからの希釈されたサンプルを、96ウェルアッセイテンプレートと同じ配向を維持しながら、抗体がコーティングされた96ウェルマイクロタイタープレートに加える。サンプルごとにピペットチップを交換する。
接着性のプレートシーラーを用いてプレートを覆う。ELISAプレートを卓上でまたはプレートシェーカー上でおよそ10秒間静かに回すことにより、対照標準および希釈されたサンプルをPAT抗体結合体と混合する。
そのマイクロタイタープレートを室温(20〜30℃)においておよそ60分間プレートシェーカー上で振盪する。
自動プレート洗浄機を使用して、そのプレートを350μL/ウェルのPBSTで5回洗浄する。過剰な液体をペーパータオルの上にたたいて落とす。
プレート1枚あたりおよそ12mLの呈色試薬(基質溶液)を試薬容器に分注する。
その試薬容器から、抗体がコーティングされた96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに100μLの呈色試薬をピペットで移す。そのプレートを覆い、静かに混合する。使用されなかった呈色試薬溶液がある場合はこれを廃棄する。
そのマイクロタイタープレートを室温(20〜30℃)においておよそ30分間プレートシェーカー上で振盪する。
プレート1枚あたりおよそ12mLの停止液を試薬容器に分注する。
100μLの停止液を各ウェルに加えることにより、反応を停止させる。プレートを静かに混合する。停止液の添加は、中断されることなく完了されるべきである。マイクロタイタープレートを太陽光から保護する;さもないと、色の強度に影響する。
96ウェルマイクロタイタープレートリーダーを使用して、450nmにおける吸光度−(マイナス)650nmにおける吸光度を読み出す。すべての読み出しは、停止液を加えた30分以内に完了されるべきである。
既知濃度の標準的な較正溶液およびそれらのその後の吸光度(光学密度)が、較正曲線回帰のために使用されるべきである。二次回帰モデルをSOFTMAX PRO(登録商標)ソフトウェアにおいて使用することにより、回帰曲線を作成し、その後の計算を行った。その方程式は、方程式:y=A+Bx+Cx2
(式中:y=平均吸光度値(OD)およびx=対照基準濃度)に基づいて、最良の放物線を検量線に当てはめる。
SOFTMAX PRO(登録商標)ソフトウェアまたはMicrosoft Excelを使用することにより、各サンプル中のPATの濃度を計算することができる。各ウェルの吸光度値を使用することにより、較正曲線回帰から濃度を内挿し(下記の方程式を参照のこと)、次いで、平均サンプル結果、標準偏差およびパーセント変動係数を、複製ウェルの結果から計算した。
各サンプルからのPATの最終濃度を、サンプル重量、抽出のために使用したアッセイ緩衝液の体積および適用した希釈係数に基づいて、ng/mgとして計算した。
各ランは、下記に列挙されるように妥当であるために、その手順において一般に認められた基準を満たさなければならない。データが、これらの性能基準を満たさない場合、分析者が、結果を評価すべきであり;変動の潜在的な起源を特定すべきであり、必要であれば解析を反復すべきである。
本発明は、明細書および実施例に関連して記載されてきたが、本発明は、本開示の精神および範囲内でさらに改変され得る。さらに、本願は、本発明が属する分野の公知または通例の慣例の範囲内に入る本開示からのそのような逸脱を包含すると意図されている。
Claims (17)
- 155AD4、155E2.1.114、155Q3、155Q12および155Q19.1からなるモノクローナル抗体の群より選択されるホスフィノスリシン−N−アセチル−トランスフェラーゼ酵素(PAT)に特異的に結合するモノクローナル抗体。
- 155AD4の名称を有するハイブリドーマによって産生される、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- 155E2.1.114の名称を有するハイブリドーマによって産生される、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- 155Q3の名称を有するハイブリドーマによって産生される、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- 155Q12の名称を有するハイブリドーマによって産生される、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- 155Q19.1の名称を有するハイブリドーマによって産生される、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- PTA−13186、PTA−13187、PTA−13188、PTA−13189およびPTA−13190からなる群より選択されるアクセッション番号としてAmerican Type Culture Collection(ATCC)に寄託されている請求項1に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株。
- ATCCアクセッション番号PTA−13186として寄託されている請求項7に記載のハイブリドーマ。
- ATCCアクセッション番号PTA−13187として寄託されている請求項7に記載のハイブリドーマ。
- ATCCアクセッション番号PTA−13188として寄託されている請求項7に記載のハイブリドーマ。
- ATCCアクセッション番号PTA−13189として寄託されている請求項7に記載のハイブリドーマ。
- ATCCアクセッション番号PTA−13190として寄託されている請求項7に記載のハイブリドーマ。
- PAT酵素の存在を識別するための方法であって、
a)請求項1に記載の第1のモノクローナル抗体をアッセイ表面上に固定化し、次いで、前記アッセイ表面を洗浄する工程;
b)PATを含むと疑われる液体と前記アッセイ表面を、結合させるのに十分な時間にわたって接触させ、次いで、前記アッセイ表面を洗浄する工程;
c)レポーティング基に結合体化された請求項1に記載の異なる第2の抗体と前記アッセイ表面を、前記第2の結合体化されたモノクローナル抗体を結合させるのに十分な時間にわたって接触させ、次いで、前記アッセイ表面を洗浄する工程;および
d)前記レポーティング基の有無を検出する工程
を含む、方法。 - PAT酵素を定量的に測定するための方法であって、
a)PATポリクローナル抗体をアッセイ表面上に固定化する工程;
b)PATを含むと疑われる液体と前記アッセイ表面を、結合させるのに十分な時間にわたって接触させ、次いで、前記アッセイ表面を洗浄する工程;
c)レポーティング基に結合体化された請求項1に記載の異なる第2の抗体と前記アッセイ表面を、前記第2の結合体化されたモノクローナル抗体を結合させるのに十分な時間にわたって接触させ、次いで、前記アッセイ表面を洗浄する工程;および
d)較正曲線から内挿することによって、前記レポーティング基の存在を定量化する工程
を含む、方法。 - 前記結合体化されたモノクローナル抗体が、155Q12および155Q19.1からなる群より選択される、請求項14に記載の方法。
- 前記結合体化されたモノクローナル抗体が、155Q12である、請求項14に記載の方法。
- 前記結合体化されたモノクローナル抗体が、155Q19.1である、請求項14に記載の方法。
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