JP5940538B2 - 2,4−ジクロロフェノキシ酢酸に対する抵抗性をもたらす酵素に対するモノクローナル抗体および検出方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2010年9月15日出願の米国特許仮出願第61/383,015号の利益を主張するものであり、すべての図面、表およびアミノ酸または核酸の配列を含むこの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は特許請求される抗体を使用する、生体試料中のAAD−1の存在を同定する方法であって、a)前記抗体をアッセイ表面に固定化するステップ、b)前記アッセイ表面とAAD−1を含有するとされる液体とを接触させ、前記アッセイ表面を適切な溶液で洗浄するステップ、c)前記アッセイ表面を、リポーティング基で標識された抗AAD−1抗体と接触させ、前記アッセイ表面を適切な溶液で洗浄するステップ、d)前記リポーティング基の存在を検出するステップを含む方法もまた含む。
AAD−1タンパク質を、安定剤を加えたPBST(0.05% Tween(登録商標)20、pH7.4を含むリン酸緩衝生理食塩水)ベースの緩衝液中のトランスジェニックトウモロコシから回収された、凍結乾燥された葉組織から抽出し、可溶性タンパク質を、遠心分離後の上清中に回収した。上清をろ過し、1M AmSO4に調整し、可溶性タンパク質をPhenyl Sepharose(商標)HIC(疎水性相互作用ビーズ)(GE Healthcare)に結合させる。1時間のインキュベーション後、HICビーズをPBSTで洗浄し、結合タンパク質をMilli−Q(商標)水で溶出した。塩化ナトリウムを加えて電導度を上げ、HICにより精製されたタンパク質を、AAD−1特異的ポリクローナル抗体とコンジュゲートされている抗AAD−1免疫親和性カラムに添加した。ポリクローナル抗体は、国際公開第2005/107437号に記載の蛍光菌(Pseudomonas fluorescens)において産生される組み換えAAD−1に対して産生された。未結合タンパク質をカラムから回収し、カラムを、あらかじめ冷却したPBS(リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4)で広範囲にわたって洗浄した。結合タンパク質を、3.5M NaSCN、50mM Tris(商標)、pH8.0 緩衝液で溶出した。微生物由来AAD−1およびトウモロコシ由来AAD−1を、SDS−PAGEおよびウエスタンブロッティングにより試験した。
マウスを精製されたAAD−1により免疫化し、標準的融合技術を使用し、抗AAD−1モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマのパネルを調製した。使用済みの組織培養培地の試料を、ハイブリドーマ培養液を含有する個々のウェルから無菌で取り出し、AAD−1の反応性を、下記の抗体捕捉ELISA法を使用してアッセイした。マイクロタイタ―ウェルを、1〜10μg/mLの精製AAD−1の溶液でコーティングした。ウェルを洗浄し、使用済みの組織培地の試料をウェルに配置し、インキュベートした。ウェルを洗浄し、ホースラッディシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス抗血清を加え、インキュベートさせた。プレートを洗浄し、基質を加え、呈色反応を生じさせ、プレートをOD(光学密度)に関して読み取った。OD測定値が高いウェルを、元のハイブリドーマを含有する培養液のウェルにマッピングした。AAD−1抗体陽性培養液を抗体産生に関して連続的にスクリーニングし、培養液が拡大した場合の成長安定性および抗体産生を確実にした。数ラウンドの限界希釈クローニングを実施し、各培養液の真の単一クローン性を確立した。抗体陽性クローンについてのさらなるアッセイを実施し、植物材料の現場使用のための、現在特許請求される定量的検出方法に使用する個々の抗体の適切性を決定した。
アッセイ条件を、最適コーティング濃度、コーティング緩衝液の構成要素、コーティングフォーマットおよびpHならびに抗体−ビオチン比および濃度に関して評価した。最終アッセイフォーマットは、連続または同時サンドイッチフォーマットを使用した。HRP(ホースラッディシュペルオキシダーゼ)およびAP(アルカリホスファターゼ)両方の標識系を開発した。mAb 473H274.2#36を、両方の系に関して反応ウェル表面にコーティングし、乾燥させた。
得られたAPフォーマットを、異なるロットの試薬で評価し、アッセイの感度および範囲を決定し、吸光度の変動性およびアッセイの正確性を確立した。これらの研究において、3人のオペレーターが、2つの標準曲線および単一ポイントの分析を行うことによって、2つのプレート/試薬のロットを試験した。アッセイの標準曲線の全体の吸光度は、0.1abs405から1.5abs405に及んだ。結果を、下記の表1に示す。
実施例3の免疫アッセイを、無秩序な市販の形質のタンパク質に対して実施し、任意の許容できない交差反応性が存在するかどうかを決定した。タンパク質Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F、Cry34Ab1、Cry35Ab1およびPAT(ホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼ)を含有する試験試料を、反応ウェルにおいてインキュベートし、免疫アッセイを実施例3に従って実施した。同様に、Cry1F(DAS TC1507)、Cry34Ab1/35Ab1(DAS−59122−7)、Cry3Bb(MON 863)、Cry2Ab/Cry1A(MON 89034)、Cry3Bb/CP4(MON 88017)、GA21(GA21)、Cry1Ab(MON 810およびBt11)、Cry3A(MIR604)およびCP4(NK603)を発現する、トランスジェニックコーン種子に免疫アッセイを実施し、陽性シグナルは発生しなかった。このアッセイは、AAD−1タンパク質に対して高度に選択性であることが見出された。試験において非標的タンパク質に対して、交差反応性または干渉効果は測定されなかった。したがって、特許請求されるアッセイAAD−1マイクロタイタープレートELISAは、コーンの市販のトランスジェニック品種中に見出される、他の組み換えタンパク質に対して交差反応性を有さないと結論付けた。
1.一般要求事項
A.材料
ビーズ、1/8インチ クロム鋼、カタログ番号BS−0125−C、Small Parts Inc.,Miami Lakes、FLまたは同等物。
キャップ、2.0mLの円錐管用、カタログ番号02−681−361、Fisher Scientificまたは同等物。
マルチチャネルピペッター、12チャネル、10〜300μL
ピペットチップ、さまざまなサイズ
プレートカバーまたは同等物
試薬貯蔵容器、非滅菌
さまざまなサイズの単一チャネルピペッター、10μL〜1.0mL
管、ポリプロピレン、5mL、カタログ番号14−956−1D、Fisher Scientific
管、キャップ付き15mLのポリプロピレン遠心管、カタログ番号05−539−12、Fisher Scientific
管、2.0mLの円錐の微小遠心用、カタログ番号02−681−344、Fisher Scientificまたは同等物。
U底プレート、非結合96ウェル、BD Falcon カタログ番号35−3918または同等物
B.機器
はかり、分析的、Model AB54−S、Mettler Instrument Corporationまたは同等物
遠心分離機、2mLエッペンドルフ管が保持可能なもの、エッペンドルフ−5417Cまたは同等物
フリーザー、−20℃を維持可能なもの、Model 75F、U−Line Corporation、Milwaukee、WIまたは同等物
プレートリーダー、405〜650nmで読み取り可能なもの、Molecular Devicesカタログ番号0200−2018または同等物
冷蔵庫、2〜8℃を維持可能なもの。
ボルテックス、Genie−2 Model、カタログ番号12−812、Fisher Scientificまたは同等物
シェーカー/グラインダー、Model Geno/Grinder、カタログ番号2000−115、Certiprep、Metuchen、New Jerseyまたは同等物
洗浄機、96ウェルマイクロプレート、Model Elx405、Bio−Tek Instruments,Inc.または同等物
2.試薬および試薬の調製
A.抗体によりコーティングされた96ウェルマイクロタイタ―プレート;AAD−1抗体コンジュゲート(120mL);呈色試薬(120mL);停止溶液(120mL)。
B.PBST、pH7.4、カタログ番号P−3563、Sigma。2〜8℃において保存。
C.リン酸緩衝生理食塩水+0.05% Tween−20(PBST)、pH7.4。6ヶ月まで2〜8℃において保存。PBST粉末を使用して緩衝液を調製できる、カタログ番号P−3563、Sigma。
D.30%ウシ血清アルブミン(BSA)溶液、免疫血液学グレード(Serologicals Corporation,Inc.1−800−431−4505カタログ番号81−070または同等物。2〜8℃において保存。
E.AAD−1標準タンパク質。
F.アッセイ衝液:PBST+0.5% BSA(w/v)(PBST/BSA)。PBST粉末を使用して緩衝液を調製できる、カタログ番号P−3563、Sigma。
1mLの30% BSAを、容器中の30mLのPBSTに加えた。
ウェルを混合し、これを1日使用できる。実験後、残りを廃棄する。
G.洗浄緩衝液:PBST+0.05% Tween−20(w/v)。PBST粉末を使用して緩衝液を調製できる、カタログ番号P−3563、Sigma。
0.5mLのTween−20を、容器中の1LのPBSTに加える。
ウェルを混合し、室温において保存する。任意の目に見える混入が観察された場合、溶液を廃棄する。
H.AAD−1ストック溶液、1000ng/mL。
PBST/BSA中液体標準濃度に基づく1000ng/mLストック溶液を調製する。氷中に保ち、2時間以内に使用する。任意の目に見える混入が観察された場合、廃棄する。AAD−1ストックの残りを廃棄し、再使用のための再凍結はしない。
3.手順
A.アッセイの実施30分前に冷蔵庫から取り出すことによって、ELISA試薬を20〜25℃にする。
B.下記のように、5mLのポリスチレン管中にアッセイ緩衝液中AAD−1標準を調製する。次の希釈に移る前に数秒ボルテックスにかける。管を氷上に保存し、試料をプレートに加える直前に個々のアッセイ用の新しい標準を調製する。(注:ストック参照抗原を移す場合、分注後、ピペットチップを目的溶液中で一度すすがれたい)。
C.試験試料の調製:
葉の試料に関して、4つの葉のパンチを作り、2mLのポリプロピレン管に配置する。2または3つの金属ビーズを各管に加える。その後0.80mLのアッセイ緩衝液を加える。すべての管にキャップをする。
試料を、Geno/Grinder自動シェーカー/グラインダーを使用して、ダイアルを350、トグルスイッチを1×設定値(およそ1500ストローク/分)、1サイクル5分にセットし、抽出する。代替の同等の粉砕または抽出方法も使用できる。
試料を、14,000(またはそれより早く)rpmにおいて5分間または分離される(上清に目に見える粒子がなくなる)まで遠心分離機にかける。上清を、別個の管に移すか、または分析用アリコートをとる。溶液を氷上に保ち、2時間以内にアッセイする。
D.AAD−1試料を、下記のようにELISAプレート(複数可)に加える。
ELISA標準希釈液を、非結合96ウェルU底マイクロタイタ―プレート(およそ130μl/ウェル)のカラム1〜3に移す。個々の被験プレートに関して、標準溶液を3連に流す。
必要に応じ試料の希釈液を調製し、希釈された試料を、標準較正溶液を含有する非結合96ウェルマイクロタイタ―プレート(130μL/ウェル)に移し、96ウェルアッセイテンプレートシートの位置を記録する。
E.あらかじめコーティングされたプレートに蓋をし、混合のためにおよそ5秒、ベンチトップまたはプレートシェーカーにおいて穏やかに回転させる。周囲温度において1時間(±5))インキュベートさせる。
F.あらかじめコーティングされたプレートを、個々のウェルをPBSTで満たすことによって3〜5回洗浄する。ペーパータオルの上で過剰の液体をたたいて落とす。プレートウォッシャーにより洗浄してもよい。
G.100μLのAAD−1抗体コンジュゲートを、抗体によりコーティングされた96ウェルマイクロタイタ―プレートの個々のウェルにピペットで加える。その後、100μLのELISA標準溶液およびU底マイクロタイタープレートからの試料を、あらかじめコーティングされたプレートに移し、あらかじめコーティングされたプレートに移された試料と同じ配向を保つ。列ごとにピペットチップを変える。
H.プレートに蓋をし、それをシェーカーに配置し、周囲温度で30分間(±5分)インキュベートする。
I.プレートを、個々のウェルを洗浄緩衝液で満たすことによって3〜5回洗浄する。ペーパータオルの上で過剰の液体をたたいて落とす。プレートウォッシャーにより洗浄してもよい。
J.100μLのTMB基質を、反応プレートの個々のウェルに加える。蓋をし、穏やかに混合する。周囲温度において、暗所で20±2分間インキュベートさせる。
K.100μLの停止溶液を個々のウェルに加え、反応を停止させる。プレートを穏やかに混合し、デュアル波長モジュール450nm〜650nmでMAXline Vmaxプレートリーダーを使用して吸光度を読み取る。
L.未加工のデータファイルをセーブし、4項に記載のようにデータ分析を実施する。
4.データ分析および計算
A.較正曲線:
参照標準由来の吸光度値を使用し、較正曲線を作製しなければならない。SOFTmax PRO(商標)ソフトウェアまたはMicrosoft Excelを使用して、必要な分析および計算を提供する。AAD−1 ELISAのための較正曲線を、標準およびそれらの続く吸光度(光学密度)の期待される濃度の二次回帰を使用して構築する。
B.この方程式を、下記の方程式に基づく標準曲線にもっともよい放物線に適合させる:
y=A+Bx+Cx2
式中:
y=平均吸光度値(OD)
x=参照標準濃度
C.試験試料中のAAD−1の計算:
SOFTmax PRO(商標)またはMicrosoft Excelを使用して、個々の試験試料のAAD−1濃度を計算できる。予測濃度を、二次方程式における曲線の係数および光学密度(OD)測定値を使用して決定できる。回帰方程式は下記のように適合される:
試験試料の決定されたAAD−1濃度(すなわち、単一希釈液の個別の再現)を、予測濃度×使用する希釈係数により得る。
5.分析バッチの受容基準
個々の分析バッチは、下記の有効な手順において受容基準を満たさなければならない。データがこれらの実施基準を満たせなかった場合、分析者は、結果を評価し、変動の潜在源を決定し、必要であれば分析を繰り返さなければならない。
[1]
PTA−11251(473F185.2#18)、PTA−11252(473F225.2#7)、PTA−11253(473F274.2#36)、PTA−11254(473H46.2)およびPTA−11255(473H172.3)からなる群から選択される受託番号のもと、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection)(ATCC)に寄託されたハイブリドーマにより産生され、アリールオキシアルカノエート・ジオキシゲナーゼ酵素(AAD−1)と特異的に結合するモノクローナル抗体。
[2]
受託番号PTA−11251(473F185.2#18)を有する前記ハイブリドーマにより産生される、前記[1]に記載のモノクローナル抗体。
[3]
受託番号PTA−11252(473F225.2#7)を有する前記ハイブリドーマにより産生される、前記[1]に記載のモノクローナル抗体。
[4]
受託番号PTA−11253(473F274.2#36)を有する前記ハイブリドーマにより産生される、前記[1]に記載のモノクローナル抗体。
[5]
受託番号PTA−11254(473H46.2)を有する前記ハイブリドーマにより産生される、前記[1]に記載のモノクローナル抗体。
[6]
受託番号PTA−11255(473H172.3)を有する前記ハイブリドーマにより産生される、前記[1]に記載のモノクローナル抗体。
[7]
前記[1]に記載のモノクローナル抗体を産生し、PTA−11251(473F185.2#18)、PTA−11252(473F225.2#7)、PTA−11253(473F274.2#36)、PTA−11254(473H46.2)およびPTA−11255(473H172.3)からなる群から選択される受託番号のもと、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection)(ATCC)に寄託されたハイブリドーマ細胞系。
[8]
ATCC受託番号PTA−11251(473F185.2#18)のもと寄託された、前記[7]に記載のハイブリドーマ。
[9]
ATCC受託番号PTA−11252(473F225.2#7)のもと寄託された、前記[7]に記載のハイブリドーマ。
[10]
ATCC受託番号PTA−11253(473F274.2#36)のもと寄託された、前記[7]に記載のハイブリドーマ。
[11]
ATCC受託番号PTA−11254(473H46.2)のもと寄託された、前記[7]に記載のハイブリドーマ。
[12]
ATCC受託番号PTA−11255(473H172.3)のもと寄託された、前記[7]に記載のハイブリドーマ。
[13]
AAD−1酵素の存在を同定する方法であって、
a)前記[1]に記載の一次モノクローナル抗体をアッセイ表面に固定化し、その後前記アッセイ表面を洗浄するステップ、
b)前記アッセイ表面と、AAD−1を含有することが疑われる液体とを、結合に十分な期間接触させ、その後前記アッセイ表面を洗浄するステップ、
c)前記アッセイ表面と、リポーティング基にコンジュゲートされた前記[1]に記載の異なる二次抗体とを、前記コンジュゲートされた二次モノクローナル抗体との結合に十分な期間接触させ、その後前記アッセイ表面を洗浄するステップ、および
d)前記リポーティング基の存在または不在を検出するステップを含む方法。
[14]
AAD−1酵素の定量的決定のための方法であって、
a)AAD−1抗血清をアッセイ表面に固定化するステップ、
b)前記アッセイ表面と、AAD−1を含有することが疑われる液体とを、結合に十分な期間接触させ、その後前記アッセイ表面を洗浄するステップ、
c)前記アッセイ表面と、リポーティング基にコンジュゲートされた前記[1]に記載の異なる二次抗体とを、前記コンジュゲートされた二次モノクローナル抗体との結合に十分な期間接触させ、その後前記アッセイ表面を洗浄するステップ、および
d)前記リポーティング基の存在を、較正曲線との比較によって定量化するステップを含む方法。
[15]
前記コンジュゲートされたモノクローナル抗体が473F185.2#18(PTA−11251)である、前記[14]に記載の方法。
Claims (12)
- PTA−11251(473F185.2#18)、PTA−11252(473F225.2#7)、PTA−11253(473F274.2#36)、PTA−11254(473H46.2)およびPTA−11255(473H172.3)からなる群から選択される受託番号のもと、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection)(ATCC)に寄託されたハイブリドーマにより産生され、アリールオキシアルカノエート・ジオキシゲナーゼ酵素(AAD−1)と特異的に結合するモノクローナル抗体。
- 受託番号PTA−11251(473F185.2#18)を有する前記ハイブリドーマにより産生される、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- 受託番号PTA−11252(473F225.2#7)を有する前記ハイブリドーマにより産生される、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- 受託番号PTA−11253(473F274.2#36)を有する前記ハイブリドーマにより産生される、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- 受託番号PTA−11254(473H46.2)を有する前記ハイブリドーマにより産生される、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- 受託番号PTA−11255(473H172.3)を有する前記ハイブリドーマにより産生される、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- 請求項1に記載のモノクローナル抗体を産生し、PTA−11251(473F185.2#18)、PTA−11252(473F225.2#7)、PTA−11253(473F274.2#36)、PTA−11254(473H46.2)およびPTA−11255(473H172.3)からなる群から選択される受託番号のもと、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection)(ATCC)に寄託されたハイブリドーマ細胞系。
- ATCC受託番号PTA−11251(473F185.2#18)のもと寄託された、請求項7に記載のハイブリドーマ。
- ATCC受託番号PTA−11252(473F225.2#7)のもと寄託された、請求項7に記載のハイブリドーマ。
- ATCC受託番号PTA−11253(473F274.2#36)のもと寄託された、請求項7に記載のハイブリドーマ。
- ATCC受託番号PTA−11254(473H46.2)のもと寄託された、請求項7に記載のハイブリドーマ。
- ATCC受託番号PTA−11255(473H172.3)のもと寄託された、請求項7に記載のハイブリドーマ。
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