MX2013002867A - Anticuerpos monoclonales y metodos de deteccion de enzimas que confieren resistencia a acido 2, 4-diclorofenoxiacetico. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a anticuerpos monoclonales y métodos útiles para determinar y cuantificar la presencia de la enzima AAD-1 (dioxigenasa de ariloxi valcanoato). Estos anticuerpos monoclonales carácteres sorprendentemente son muy adecuados para detectar productos genéticos de eventos transgénicos de ADDI en una variedad de plantas y tejidos vegetales. La invención además proporciona inmunoensayos cuantitativos y cualitativos que usan las inmunoglobulinas de la invención.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES Y METODOS DE DETECCIÓN DE ENZIMAS QUE CONFIEREN RESISTENCIA A ÁCIDO 2,4-DICLOROFENOXIACÉTICO Referencia cruzada a solicitudes relacionadas Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional norteamericana no. de serie 61/383,015, presentada el 15 de septiembre 2010, cuya descripción se incorpora aquí por referencia en su totalidad, incluyendo todas las figuras, tablas y secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos.

Campo de la Invención La invención se refiere a anticuerpos monoclonales y métodos útiles para determinar y cuantificar la presencia de la enzima AAD-1 (dioxigenasa de ariloxi valcanoato). Estos anticuerpos monoclonales sorprendentemente son muy adecuados para detectar productos genéticos de eventos transgénicos de ADD1 en una variedad de plantas y tejidos vegetales. La invención además proporciona inmunoensayos cuantitativos y cualitativos que usan las inmunoglobulinas de la invención.

Antecedentes de la Invención El ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) pertenece a la clase de herbicidas de ácido fenoxi y se ha utilizado en muchos cultivos de monocotiledóneas tales como maíz, trigo, arroz y para el control selectivo de malezas de hoja ancha sin afectar seriamente las plantas de la cosecha deseada. 2,4-D es un derivado de auxina sintética que actúa para desregular la homeostasis de la hormona celular normal y para impedir el crecimiento equilibrado y controlado, sin embargo, el modo exacto de acción de esta clase de herbicidas todavía no ha sido entendido completamente, a pesar de más de 60 años de campo de aplicación. Triclopir y fluroxipir son herbicidas piridiloxiacéticos que también actúan como una auxina sintética.

Estos herbicidas tienen diferentes niveles de selectividad en algunas plantas (por ejemplo, las dicotiledóneas son más sensibles que las monocotiledóneas). El metabolismo diferencial por diferentes plantas es una explicación para diversos niveles de selectividad. En general, las plantas metabolizan lentamente 2,4-D, por lo la respuesta variable de la planta al 2,4-D puede ser explicada de forma más probable por la actividad diferente en los lugares de destino (WSSA, 2002; Herbicide Manual 8a edición, Weed Science Society of America; Lawrence, KS págs. 492). El metabolismo de 2,4-D en la planta se produce normalmente a través de un mecanismo de dos fases, típicamente hidroxilación seguida de conjugación con aminoácidos o glucosa (WSSA, 2002).

Con el tiempo, ciertas poblaciones microbianas atacadas con 2,4-D han desarrollado una vía alternativa para degradar este xenobiótico que da como resultado la completa mineralización de 2,4-D. Las sucesivas aplicaciones del herbicida seleccionan microbios que pueden utilizar el herbicida como una fuente de carbono y energía para el crecimiento, dándoles una ventaja competitiva en el suelo. Por esta razón, 2,4-D actualmente formulado tiene una vida media en el suelo relativamente corta y no hay efectos de arrastre significativos en cultivos subsiguientes.

Un organismo que ha sido ampliamente estudiado por su capacidad para degradar el 2,4-D es Ralslonia eutropha (Streber, et al, 1987, Análisis, clonación y expresión de alto nivel del gen monooxigenasa 2,4-diclorofenoxiacética tfdA de Alcaligenes eiitrophus JMP134. J. Bacteriol. 169:2950-2955). El gen que codifica la enzima en la etapa inicial de la vía de la mineralización es tfdA. Véase la patente norteamericana no. 6,153,401 y GENBANK No. de acceso M16730. El producto del gen tfdA cataliza la conversión de 2,4-D para diclorofenol (DCP) a través de una reacción de dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato (Smejkal; et al; 2001. La especificidad del sustrato de bacterias que degradan ácido clorofenoxialcanoico no depende de los tipos de genes de tfdA filogenéticamente relacionados. Biol. Fértil. Sois 33:507-513). DCP tiene una reducida actividad herbicida en comparación con 2,4-D. tfdA se ha utilizado en plantas transgénicas para conferir resistencia al 2,4-D en plantas dicotiledóneas tales como algodón y tabaco, que naturalmente son sensibles a 2,4-D (Streber; et al;. 1989; Plantas de tabaco transgénicas que expresan una enzima desintoxicante bacteriana resistentes a 2,4-D. Bio/Technology 7:81 1-816.), y la patente norteamericana no. 5,608,147).

Un gran número de genes tipo tfdA que codifican a enzimas capaces de degradar 2,4-D han sido aislados del suelo bacteriano y sus secuencias depositadas en la base de datos de Genbank. Muchos homólogos de tfdA (>85% de identidad de aminoácidos) tienen propiedades enzimáticas similares a tfdA. Sin embargo, hay una serie de homólogos que tienen una identidad significativamente menor a tfdA (25-50%), aún con los residuos característicos asociados con dioxigenasas de a-cetoglutarato dioxigenasa de Fe + 2. Así, no es obvio cuales son las especificidades de sustrato de estas dioxigenasas divergentes, entre otras propiedades bioquímicas.

Un ejemplo único con baja homología a tfdA (28% de identidad de aminoácidos) es rdpA de Sphingobiiim herbicidovorans (Kohler, 1999 HPE Sphingobium herbicidovorans MH: un versátil degradante herbicida de ácido fenoxialcanóico J. Ind Microbiol and Biotech 23:336-340, Westendorf A., D. Benndorf, R. Muller, W. Babel. 2002. Las dos diclorprop/a-dioxigenasas de cetoglutarato específicas a los enantiómeros de la proteína MC-1 de Delftia acidovorans y datos de secuencia de RdpA y SdpA., Microbiol. Res. 157:317-22.). Se ha mostrado que esta enzima cataliza el primer paso en la mineralización de (R)-diclorprop (y otros ácidos (R)-fenoxipropiónicos), así como 2,4-D (un ácido fenoxiacético) (Westendorf, A., RH Muller, y W. Babel 2003 Purificación y caracterización de las dioxigenasas enantioespecíficas de Delftia acidovorans MC1 que inician la degradación de fenoxipropionatos y herbicidas de fenoxiacetato. Acta Biotechnol. 23:3-17). Aunque los microorganismos que degradan el ácido fenoxipropiónico fueron descritos hace algún tiempo, poco progreso se había hecho en la caracterización de esta vía (Horvath, M., G. Ditzelmuller, Lodl ., y F. Streichsbier 1990). Aislamiento y caracterización de bacterias del suelo degradantes del ácido 2-(2,4-diclorofenoxi)-propiónico. Appl. Microbiol. Biotechnol. 33:213-216.). Una complicación adicional a la degradación de dicloroprop es la estereoespecificidad (R vs S) implicada tanto en la absorción (Kohler, 1999) y la oxidación inicial de dicloroprop (Weslendorf ef al., 2003). La expresión heteróloga de rdpA en otros microbios, o la transformación de este gen en las plantas, hasta ahora no han sido reportadas. La literatura se ha centrado principalmente en los homólogos cercanos de tfdA que degradan principalmente ácidos fenoxiacéticos quirales (por ejemplo, 2,4-D).

Un gen de dioxigenasa de ariloxialcanoato optimizado con codón vegetal, AAD-1, que codifica a la enzima aislada originalmente de Delflia acidovorans se describen en primer lugar para el uso como un carácter de resistencia a herbicidas en el documento WO2005/107437 , incorporado aquí como referencia. El carácter confiere tolerancia a 2,4-D y a los herbicidas de piridiloiacetato. El primer reporte de maíz transformado que porta el gen AAD-1 fue en la solicitud de patente norteamericana provisional no. 61/235248, incorporada aquí como referencia.

Las empresas que desarrollan y comercializan los caracteres de ADN recombinante para formulaciones de productos de semillas de siembra, implementan y cumplen con los estrictos planes de control de los productos. Estos planes de control requieren el uso de métodos de detección proteína validados cuantitativos y cualitativos para el carácter recombinante para rastrear la introgresión del carácter y actividades de producción de semillas, así como vigilar el carácter en la cosecha de cereales. Estos métodos de detección deben ser lo suficientemente fáciles y robustos para usarse en condiciones GLP (buenas prácticas de laboratorio) y no GLP. Además, los métodos deben ser suficientemente fáciles de usar y no presentar problemas para ser fácilmente utilizados por los agricultores en el campo, los comerciantes de granos en el silo, y los funcionarios de aduanas en las fronteras. Por lo tanto, métodos de detección de proteínas y kits comerciales robustos, de alta calidad y fáciles de usar son fundamentales y esenciales para el lanzamiento de un producto de carácter vegetal recombi nante .

Si bien los inmunoensayos son bien conocidos en la técnica, el desarrollo de métodos ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay-Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) sólidos y validados que sean reproducibles y suficientemente sensibles para detectar un producto transgénico concreto de una matriz de tejidos vegetales tanto en entornos de laboratorio y de campo no son ni triviales ni rutinarios. Todavía más difícil es encontrar pares de anticuerpos complementarios que son adecuados para el desarrollo de métodos ELISA de tira de flujo lateral para detectar el producto de un evento transgénico AAD-1.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona un panel de anticuerpos monoclonales (mAbs) y las líneas celulares de hibridoma que producen los anticuerpos en cuestión. Los hibridomas se depositaron en la American Type Culture Collection, de conformidad con los términos del Tratado de Budapest.

Los mAbs en cuestión son sorprendentemente bien apropiados para la detección de un producto genético de evento transgénico específico AAD-1 en una variedad de plantas y tejidos vegetales. La invención proporciona además inmunoensayos cuantitativos y cualitativos utilizando las ¡nmunoglobulinas de la invención.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención abarca anticuerpos reactivos con AAD-1 y los hibridomas que producen los mAb reivindicados. La tabla siguiente muestra las designaciones de líneas de hibridoma y sus designaciones correspondientes al depósito ATCC.

La invención también incluye métodos de uso de los mAbs para el aislamiento o la detección de AAD-1 que comprende: a) inmovilizar dicho anticuerpo sobre una superficie, b) poner en contacto dicho anticuerpo inmovilizado con una mezcla que contiene AAD-1, c) separar dicho anticuerpo inmovilizado unido a AAD-1 a partir de dicha mezcla, y d) recuperar AAD-1 mediante la eliminación del anticuerpo enlazado a AAD-1 de dicho anticuerpo inmovilizado.

La invención también incluye un método de uso de los anticuerpos reivindicados para identificar la presencia de AAD-1 en una muestra biológica, que comprende: a) inmovilizar dicho anticuerpo sobre una superficie de ensayo; b) poner en contacto dicha superficie con un líquido de ensayo sospechoso de contener AAD-1 y lavar dicha superficie de ensayo con una solución apropiada, c) poner en contacto dicha superficie de ensayo con un anticuerpo anti-AAD-1 marcado con un grupo de reporte y lavar dicha superficie de ensayo con una solución apropiada; d) detectar la presencia de dicho grupo de reporte.

La invención incluye además un método analítico para la determinación cuantitativa de la enzima de AAD-1 expresada en plantas transgénicas, especialmente maíz y plantas de algodón. La proteína AAA-1 se extrae de muestras de maíz con una solución PBST (solución salina tamponada con fosfato con 0.05% de Tween*-20). El extracto se centrifugó y el sobrenadante acuosa se recolecto se diluyó. Una alícuota de la muestra diluida se incuba con el anticuerpo monoclonal anti-AAD-1 conjugada con enzima en los pocilios de una placa recubierta con anticuerpo policlonal o monoclonal anti-AAD-1 en un formato de ELISA tipo sándwich. Ambos anticuerpos en el par del sándwich capturan la proteína AAD-1 en la muestra. Al final del periodo de incubación, los reactivos no unidos se eliminan de la placa por lavado con PBST. La presencia de AAD-1 se detecta mediante la incubación de la enzima conjugada con un sustrato de enzima, que genera un producto coloreado. Ya que el AAD-1 está ligado en el sándwich de anticuerpos, el nivel de desarrollo de color es proporcional a la concentración de AAD-1 en la muestra (es decir, concentraciones menores de proteína dan como resultado un menor desarrollo de color). La absorbencia a 450 nm (o 405 nm en función de la etiqueta) menos la absorbencia a una longitud de onda de referencia (por ejemplo, 650 nm) se mide usando un lector de placas. Una curva de calibración se calcula a partir de siete concentraciones estándar, usando una ecuación de regresión cuadrática. Este ELISA AAD-1 es suficientemente específico y sensible para cuantificar AAD-1 en extractos la muestra de tejido vegetal. Además los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para confirmar la presencia de AAD-1 utilizando técnicas conocidas de Western blot.

La preparación de anticuerpos monoclonales contra proteínas de interés es bien conocida en la técnica. Ver Galfre y Milstein, Methods in Enzymology, vol. 73, Academic Press, Nueva York (1981), James W. Goding, Anticuerpos monoclonales: Principios y Práctica, Academic Press, Orlando, Florida (1986), Protocolos Actuales en Biología Molecular, F.M. Ausubel, et al. ed., Wiley Interscience, Nueva York, (1987). Si bien puede ser rutinario generar puntuaciones de reactivos mAbs con un inmunógeno dado, es difícil clasificar a través de ellos para encontrar los muy pocos mAbs que son adecuados para una aplicación en particular y para asegurar los hibridomas que los secretan son estables y susceptibles de cultivo continuo.

Para preparar anticuerpos reactivos con una proteína de interés, la proteína primero debe ser enriquecida o purificada. Preparaciones antigénicas relativamente cruda de la proteína pueden ser utilizada para fines de inmunización. Sin embargo, se requiere proteínas altamente purificadas para determinar con precisión si las hibridomas están produciendo los anticuerpos monocionales o para ensayar las concentraciones de anticuerpos de sueros específicos.

Una vez que el AAD-1 ha sido aislado, los anticuerpos específicos para AAD-1 pueden ser mejorados por métodos convencionales que son bien conocidos en la técnica. Las inyecciones repetidas en un huésped de elección durante un período de semanas o meses provocarán una respuesta inmune y dan como resultado concentraciones significativas de anti-AAD-1 en el suero. Los hospederos preferidos son especies de mamíferos y las especies más preferidas son conejos, cabras, ovejas y ratones. La sangre extraída de esos animales inmunizados puede ser tratada por los métodos establecidos para obtener de antisuero reactivo (anticuerpos policlonales) con AAD-1. El antisuero puede ser entonces purificado por afinidad mediante adsorción a AAD-1 de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica. El antisuero purificado por afinidad se puede purificar adicionalmente mediante el aislamiento de la fracción de inmunoglobulina dentro de los procedimientos que usan antisuero conocidos en la técnica. El material resultante será una población heterogénea de inmunoglobulinas reactivas con AAD-1.

Los mAbs anti-AAD-1 se preparan fácilmente usando AAD-1 purificado. Los métodos para producir mAbs se han practicado durante varias décadas y son bien conocidos por los expertos en la técnica. Las inyecciones intraperitoneales o subcutáneas repetidas de AAD-1 en adyuvante provocará una respuesta inmunitaria en la mayoría de los animales, especialmente los ratones. Los linfocitos B hiperinmunizados se retiran del animal y se fusionan con una línea celular del compañero de fusión adecuado capaz de ser cultivada indefinidamente. Numerosas líneas celulares de mamífero son compañeros de fusión adecuados para la producción de hibridomas. Muchas de tales líneas están disponibles comercialmente de ATCC y de los proveedores comercial.

Una vez fusionados, los hibridomas resultantes se cultivan en un medio de crecimiento selectivo durante una o dos semanas. Dos sistemas de selección bien conocidos están disponibles para la eliminación de las células no fusionadas de mieloma o para las fusiones entre las células de mieloma del cultivo de hibridoma mixto. La elección del sistema de selección depende de la cepa de ratón inmunizado y del compañero de fusión de mieloma usado. El sistema de selección AAT, descrito por Taggart y Samloff, Science 219, 1228 (1982), se puede utilizar, sin embargo, el sistema de selección HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina), descrito por Littlef ield , Science I45, 709 (1964), se prefiere debido a su compatibilidad con las células de ratón y los compañeros de fusión mencionados anteriormente.

El medio de cultivo consumido se examina con respecto a la secreción de mAb inmunoespecífica. Los procedimientos de ensayo inmunoabsorbentes ligados a enzimas son los más adecuados para este propósito, aunque también son aceptables los ensayos radioinmunes adaptados para los exámenes de gran volumen. Múltiples selecciones diseñadas para reducir consecutivamente el número considerable de cultivos irrelevantes o menos deseados, deben ser realizadas para aislar el pequeño porcentaje de los mAb de la presente invención. Los cultivos que secretan mAbs reactivos con AAD-1 se isotipificaron usando los kits disponibles comercialmente.

Los cultivos de hibridoma que secretan el codiciado mAb anti-AAD-1 debe ser sub-clonado varias veces para establecer la monoclonalidad y la estabilidad. Los métodos bien conocidos para la sub-clonación de cultivos de células eucariotas no adherentes incluyen dilución limitante, agarosa blanda y las técnicas de clasificación de células activadas por fluorescencia. Después de cada subclonación, los cultivos resultantes deben volver a ensayarse para la secreción de anticuerpos y se isotipificaron de nuevo para garantizar que se ha establecido un cultivo secretor de anticuerpos estable.

Los anticuerpos anti-AAD-1 en cuestión pueden inmovilizarse en una superficie de manera que algunos de los sitios de unión del anticuerpo permanecen expuestos y capaces de unirse a AAD-1. Una amplia gama de sistemas de inmovilización de los anticuerpos se ha desarrollado durante las últimas décadas. La inmovilización se puede lograr mediante acoplamiento covalente del anticuerpo directamente a la superficie deseada o puenteando el anticuerpo a la superficie.

El acoplamiento con CNBr y carbodiimida de los anticuerpos a perlas a base de polisacáridos tales como Sepharose© (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.; Pistcataway, NJ) son ilustrativos de los sistemas de acoplamiento directo que son consistentes con la invención. Los acoplamientos directos generalmente no orientan los anticuerpos en cualquier forma particular, sin embargo, algunos tipos de acoplamientos directos son capaces de orientar el anticuerpo reproducible sobre la sustancia de inmovilización.

Los esquemas de acoplamiento preferidos orientan el anticuerpo de tal manera que sus regiones de unión al antígeno permanecen expuestas. Un sistema de este tipo utiliza el carbohidrato natural que se encuentra en las cadenas pesadas del anticuerpo. Al primero oxidar los restos de carbohidratos a los correspondientes aldehidos, los aldehidos reactivos interactúan adicionalmente con un grupo amino primario en la superficie de la matriz, es posible vincular el anticuerpo en una orientación ventajosa.

Muchos tipos de puentes son posibles e incluyen pequeños ligantes orgánicos que se enlazan covalentemente al anticuerpo a la sustancia de inmovilización. Tales brazos espaciadores son aceptables y preferentemente no debe interactuar con las proteínas una vez que el puente se ha formado.

La discusión anterior de ninguna manera pretende limitar el alcance de la invención. Muchos otros sistemas bien conocidos por enlazar los anticuerpos a las sustancias inmovilizadoras son consistentes con la invención.

Es bien conocido que los anticuerpos marcados con un grupo de reporte se pueden utilizar para identificar la presencia de antígenos en una variedad de entornos. Anticuerpos marcados con radioisótopos se han utilizado durante décadas en ensayos radioinmunes para identificar, con gran precisión y sensibilidad, la presencia de antígenos en una variedad de fluidos biológicos. Más recientemente, los anticuerpos marcados con enzimas se han utilizado como un sustituto para los anticuerpos marcados radioactivamente en la popular ELISA.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden enlazar a una sustancia de inmovilización tal como un pocilio o partículas de poliestireno y usarse en inmunoensayos para determinar si AAD-1 está presente en una muestra de ensayo. En esta forma de realización de la invención, una muestra se pone en contacto con la superficie de inmunoafinidad y se dejó incubar. Después de una etapa de lavado, cualquier AAD-1 que se ha unido a la superficie de inmunoafinidad se detecta poniendo en contacto la superficie con otro anticuerpo de la invención marcado con un grupo de reporte.

El uso de tiras de flujo lateral o tiras de inmunocromatografía con los anticuerpos y métodos de ensayo reivindicados concuerda con la invención. Los ensayos de flujo lateral son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo el documento US 6,485,982. De esta manera las pruebas de flujo lateral se pueden utilizar para la detección cualitativa o semi-cuantitativa de AAD-I solo o simultáneamente con otros analitos. Las pruebas de flujo lateral son las más sencillas de utilizar de todos los formatos de ensayo descritos aquí y son particularmente útiles en la configuración del campo del cual se extraen rápidamente el material vegetal en una solución y se analiza en una tira de flujo lateral. En este modo sólo es necesario colocar la tira de flujo lateral en una muestra líquida o aplicar el líquido de muestra a la tira de flujo lateral y leer los resultados después de un tiempo predeterminado. Todas las pruebas de flujo lateral deben incorporar ya sea una línea de control de procedimiento o una línea de control de muestra que se utiliza para validar el resultado de la prueba.

La aparición de dos líneas, por lo tanto, indica un resultado positivo, mientras que un resultado negativo válido produce sólo la línea de control. Es válido si sólo aparece la línea de prueba, o si no aparecen líneas.

Una tira de prueba de flujo lateral típica se compone de cuatro componentes principales: una almohadilla de muestra sobre la cual se aplica la muestra de prueba; una almohadilla de conjugado que contiene anticuerpos de la presente invención conjugados con partículas de color (típicamente partículas de oro coloidales o microesferas de látex); una membrana de reacción tal como una membrana hidrófoba de nitrocelulosa o acetato de celulosa sobre el que se inmoviliza un diferente anticuerpo de la invención en una línea a través de la membrana como una zona de captura o de línea de prueba y, por último, un depósito de residuos diseñado para extraer la muestra a través de la membrana de reacción mediante la acción capilar.

Los componentes de la tira de flujo lateral normalmente se fijan a un material de soporte inerte y pueden ser presentadas en un formato de varilla de nivel simple o dentro de una carcasa de plástico con un orificio de muestra y la ventana de reacción que muestra las zonas de captura y control. En otro modo de realización del ensayo, una muestra de ensayo sospechosa de contener AAD-I se seca sobre una superficie, formando una muestra de ensayo inmovilizada. Un anticuerpo marcado de la invención se pone en contacto con la muestra de ensayo inmovilizado y se deja incubar. Si la muestra contiene AAD-I, el anticuerpo marcado se unirá al AAD-I inmovilizado. Este método también se puede hacer usando un anticuerpo no marcado de la invención seguido por un anticuerpo secundario marcado que se une a un anticuerpo de la invención que ya se ha unido a AAD-I. Después del lavado, la muestra inmovilizada de prueba se mide para detectar la presencia de cualquier grupo de reporte.

Los grupos de reporte típicamente son enzimas tales como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante o beta-galactosidasa. Los sustratos adecuados producen un cambio de color cuando se hacen reaccionar con la enzima. Al hacerlo, las mediciones de la intensidad del color pueden cuantif icarse utilizando un espectrofotómetro. Si el grupo de reporte es un radioisótopo, puede utilizarse un instrumento de detección de rayos gamma o beta para cuantificar el grupo de reporte. La intensidad del grupo de reporte se correlaciona directamente con la cantidad de AAD-1 en la muestra de ensayo.

Los siguientes ejemplos ayudarán a describir como se pone en práctica la invención y ilustrarán las características de los anticuerpos y ensayos anti-AAD-1 de la invención.

EJEMPLO 1 Preparación de Inmunógeno La proteína AAD-1 de se extrajo de tejido de hoja liofilizado obtenido de maíz transgénico en un tampón a base de PBST (PBS con 0.05% de Tween 20*, pH 7.4) en base con estabilizadores añadidos, y las proteínas solubles se recolectaron en el sobrenadante después de la centrifugación. El sobrenadante se filtró, se ajustó a AMS04 1 M y las proteínas solubles se deja enlazar a Sepharose™ de fenilo HIC (perlas de interacción hidrófoba) (GE Healthcare). Después de una hora de incubación, las perlas de HIC se lavaron con PBST y las proteínas ligadas se eluyeron con agua Milli-Q™. Se añadió cloruro de sodio para aumentar la conductividad y las proteínas purificadas de HIC se cargaron en una columna de inmunoafinidad anti-AAD-1 que había sido conjugada con un anticuerpo policlonal específico AAD-1. El anticuerpo policlonal se cultivó contra AAD-1 recombinante producido en Pseudomonas fluorescens , como se describe en WO2005/107437. Las proteínas no ligadas se obtienen de la columna y la columna se lavó extensamente con PBS pre-refrigerada (solución salina tamponada con fosfato, pH 7.4).

Las proteínas ligadas se eluyeron de la columna con NaSCN 3.5M, Tris™ 50 mM, tampón pH 8.0. AAD-1 derivada de microbios y AAD-1 derivada de maíz se examinaron mediante SDS-PAGE y Western Blot.

En el microbio derivado de AAD-1, la banda de proteína mayor, tal como se visualiza en el gel SDS-PAGE teñido con Coomassie, fue de aproximadamente 32 kDa. La proteína AAD-1 correspondiente de origen vegetal de era idéntica en tamaño a la proteína derivado de microbios. Además, la muestra de AAD-1 derivado de planta contenía una pequeña cantidad de impurezas, que no era inmunorreactiva al antisuero de AAD-1. Las proteínas co-purif ¡cadas fueron probablemente retenidas en la columna mediante las interacciones débiles con la matriz de la columna.

El AAD-1 derivado de microbios y la muestra de origen vegetal mostraron una señal positiva del tamaño esperado en el Western blot utilizando antisuero anti-AAD-1. En el análisis Western blot de AAD-1, no se observaron proteínas inmunorreactivas en el extracto de control negativo (maíz nativo), ni proteínas de tamaño alternativo (en forma de agregados o productos de degradación) se observaron en las muestras de la planta transgénica.

EJEMPLO 2 Preparación del hibridoma Se inmunizaron ratones con AAD-1 purificado, y se utilizaron técnicas estándar de fusión para preparar un panel de hibridomas que expresan los anticuerpos monoclonales anti-AAD-1.

Las muestras de medio de cultivo de tejidos consumidas se retiraron asépticamente de cada pocilio que contenía un cultivo de hibridoma y se ensayó la reactividad AAD-1 utilizando el siguiente método de captura de anticuerpos ELISA. Los pocilios de microtitulación se recubrieron con una solución de 1-10 g/mL de AAD-1 purificado. Los pocilios se lavaron y las muestras de medios de tejido consumidos se colocaron en los pocilios y se deja incubar. Los pocilios se lavaron y se añadió antisuero anti-ratón de cabra etiquetada con peroxidasa de rábano picante y se dejó incubar. Las placas se lavaron, se añadió sustrato para desarrollar una reacción de color y se leyó la OD (densidad óptica) de las placas. Los pocilios con altas lecturas de OD fueron asignadas a los pocilios de cultivo que contenían los hibridomas. Los cultivos AAD-1 de anticuerpos positivos se examinaron continuamente para verificar la producción de anticuerpos para asegurar la estabilidad y el crecimiento de la producción de anticuerpos a medida que los cultivos se expandieron. Se realizaron varias rondas de clonación de dilución limitante para establecer la monoclonalidad verdadera para cada cultivo. Se realizaron ensayos adicionales sobre los clones positivos de anticuerpos para determinar la idoneidad de cada anticuerpo para usarse en los métodos cuantitativos de detección actualmente reivindicados para usarse en el campo con material vegetal.

EJEMPLO 3 Desarrollo de los Ensayos Las condiciones de ensayo fueron evaluadas para la concentración de recubrimiento óptimo, los constituyentes del revestimiento tampón, el formato de recubrimiento y el pH, y la relación y las concentraciones anticuerpo-biotina. El formato de ensayo final usó un formato sándwich secuencial o simultáneo. Se desarrollaron sistemas etiquetados tanto de HRP (peroxidasa de rábano picante) como de AP (fosfatasa alcalina). mAb 473H274.2 # 36 fue recubierto y secado en la superficie de los pocilios de reacción para ambos sistemas.

En el sistema de HRP, el mAb 473F185.2#18 fue conjugado con HRP. La muestra de AAD-1 se añadió a los pocilios de reacción y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de una etapa de lavado, el conjugado 473F185.2#18-HRP se añadió a los pocilios de reacción y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los pocilios de reacción se lavaron a continuación y se añadió sustrato para reaccionar con el HRP. En presencia de proteína de AAD-1, el conjugado HRP ligado a los pocilios de reacción y, posteriormente, generó un cambio de color con el sustrato en los pocilios. Después de un período de incubación del sustrato de 30 minutos, se añadió una solución de detención y los pocilios de reacción se leyeron en un lector de placas de 96 pocilios a una longitud de onda de 450 nm menos 650 nm.

En el sistema de AP, el mAb 473F185.2#18 fue conjugado con biotina. Una muestra y el mAb biotinilado se añadieron a los pocilios de reacción y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de una etapa de lavado, se añadió conjugado de estreptavidina-AP a los pocilios de reacción y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación los pocilios de reacción se lavaron y se añadió sustrato para reaccionar con el AP. En presencia de de proteína de AAD-1, el AP conjugado ligado a los pocilios de reacción y, posteriormente generó un cambio de color con el sustrato en el pozo. Después de un período de incubación del sustrato de 30 minutos, la reacción se leyó en un lector de placas de 96 pocilios a una longitud de onda de 405 nm, los resultados se trazaron y se calculó una curva estándar como se muestra en la figura 1.

Durante las pruebas del ensayo basado en HRP se observó una señal no específica con muestras de tejido de maíz. En contraste, el sistema de AP no demostró ninguna señal no específica significativa al utilizar tejidos de maíz. Por lo tanto, el ensayo basado en AP es el formato más preferido; sin embargo, el ensayo basado en HPR es no obstante un sistema viable.

EJEMPLO 4 Características del ensayo El formato de AP resultante se evaluó con diferentes lotes de reactivos para determinar la sensibilidad y el rango del ensayo, así como para establecer la variabilidad de la absorbencia y la exactitud del ensayo, en estos estudios, tres operadores probaron dos lotes de placas/reactivo realizando dos curvas estándar y el análisis de un solo punto. La absorbencia total de la curva estándar del ensayo osciló entre 0.1 abs405 a 1.5 abs405- Los resultados se muestran en la Tabla 1 a continuación.

Tabla 1 El rango cuantitativo efectivo del ensayo varió de 1 ng/mL a 32 ng/mL con un % de error y un coeficiente porcentual de variación (% CV) promedio entre placas y entre analistas de 3.40% y 2.62%, respectivamente (tabla 2). No hubo efecto significativo del operador, lote de placas, lote de conjugado o días en las determinaciones de CV%. El % de error y la precisión del lote entre placas fueron muy similares a los resultados del lote entre placas (Tablas 3 y 4).

Tabla 2 Tabla 3 Tabla 4 AAD-1 OD media Stdev %CV ng/mL 0 0 093 0 005 5.4 1 0 141 0 006 4.3 2 0 186 0 010 5.4 4 0 261 0 007 2.7 8 0 440 0 018 4.1 16 0 735 0 048 6.5 24 1 109 0 037 3.3 EJEMPLO 5 Ensayo de especificidad El inmunoensayo del ejemplo 3 se realizó contra las proteínas de caracteres comerciales desreguladas para determinar si había alguna reactividad cruzada inaceptable. Las muestras de ensayo que contenían proteínas CryIAb, CryIAc, CryIF, Cry34Abl, Cry35Abl, y PAT (fosfinotricina acetiltransferasa) se incubaron en los pocilios de reacción y el inmunoensayo se ejecutó de acuerdo con el ejemplo 3. Del mismo modo, las semillas de maíz transgénico que expresa CryIF (DAS TCI 507), Cry34Abl/35Abl (DAS-59122-7), Cry3Bb (MON 863), Cry2Ab/CrylA (MON 89034), Cry3Bb/CP4 (MON 88017), GA21 (GA21) , Cryl Ab (MON 810 y Btl 1), Cry3A (MIR604), y CP4 (NK603) se llevaron a cabo en el inmunoensayo y no generar una señal positiva. El ensayo se encontró que era altamente selectivo para la proteína AAD-1 No se midieron reactividad cruzada o efectos de interferencia para las proteínas no objetivo en las pruebas. Por lo tanto, se concluyó que el ensayo ELISA para placas de microtitulacion de AAD-1 no tenía reactividad cruzada con otras proteínas recombinantes que se encuentran en las variedades transgénicas de maíz disponibles en el mercado.

EJEMPLO 6 Protocolo ELISA cuantitativo para AAD-1 1. REQUISITOS GENERALES A. Materiales • perlas, acero cromado de 1/8", número de catálogo BS-0125-C, Small Parts Inc., iami Lakes, FL o equivalente.

• Tapa, para tubo cónico de 2.0 mL, número de catálogo 02-681-361, Fisher Scientific o equivalente • Pipeta multi-canal de 12 canales, 10-300 µ?_ • Puntas de pipeta, varios tamaños • Cubiertas de placas o su equivalente • Depósitos para reactivos, no estériles • Pipetas monocanal de diversos tamaños, 10 pL-I.O µ?_ • Tubos de polipropileno, 5 mL, número de catálogo 14-956-ID, Fisher Scientific • Tubo, 15-ml, centrífuga de polipropileno con tapón, número de catálogo 05-539-12, Fisher Scientific • Tubo, micro-centrífuga cónica de 2.0 mi, número de catálogo 02-681-344, Fisher Scientific • Placas con fondo de U, de 96 pocilios no indispensables, catálogo BD Falcon no. 35-3918 o equivalente B. Equipo • Báscula, analítica, Modelo AB54-S, Mettler Instrument Corporation o equivalente • Centrífuga, capaz de recibir tubos Eppendorf de 2 mi, Eppendorf 5417C o equivalente • Congelador, capaz de mantener -20°C, Modelo 75F, U-Line Corporation, Milwaukee, Wl o equivalente • Lector de placas, capaz de leer 405-650 nm. catálogo Molecular Devices no. 0200-2018 o equivalente • refrigerador, capaz de mantener una temperatura de 2- 8°C • Vórtice, Modelo Genie-2, número de catálogo 12-812, Fisher Scientific o equivalente • Agitador/molino, Modelo Geno/Grinder, número de catálogo 2000-1 15, Certiprep, Metuchen, Nueva Jersey o eqivalente • Lavadora, microplaca de 96 pocilios, Modelo Elx 405, Bio-Tek Instruments, Inc. o equivalente REACTIVOS Y PREPARACIÓN DE REACTIVOS Placas de 96 pocilios de microtitulación recubiertas con anticuerpo A.; conjugado de anticuerpo AAD-1 (120 mi); reactivo de color (120 mi), solución de detención (120 mi).

B. PBST, pH 7.4, número de catálogo P-3563, Sigma. Almacenar a 2-8°C.

C. Solución salina tamponada con fosfato + 0.05% de Tween-20 (PBST), pH 7.4. Almacenar a 2-8°C durante un máximo de 6 meses. PBST en polvo puede ser utilizado para preparar el tampón, número de catálogo P-3563, Sigma.

D. 30% albúmina de suero bovino (BSA), calidad inmunohematología (Serologicals Corporation, Inc. 1-800-431-4505 Catálogo no. 81-070 o equivalente. Almacenar a 2-8°C.

E. Proteína estándar de AAD-1.

F. Tampón de Ensayo: PBST más 0.5% de BSA (w/v) (PBST/BSA). PBST en polvo puede ser utilizado para preparar el tampón, número de catálogo P-3563, Sigma.

• Añadir 1 mi de 30% de BSA a la PBST 30 mi en el recipiente; • Mezclar bien y se puede utilizarse ese día. Desechar el restante después del experimento.

G. Tampón de lavado: PBST más 0,05% de Tween-20 (w/v). PBST polvo puede ser utilizado para preparar el tampón, número de catálogo P-3563, Sigma.

• Añadir 0.5 mi de Tween-20 a 1L PBST en el recipiente; • Mezclar bien y almacenar a temperatura ambiente. Desechar la solución si se observa cualquier contaminación visible.

H. Solución madre de AAD-1, 1000 ng/mL.

• Preparar una solución madre 1000-ng/mL en base en la concentración de líquido estándar en PBST/BSA. Mantener en hielo para ser usado dentro de las 2 horas siguientes. Desechar si se observa cualquier contaminación visible. Desechar la solución restante de AAD-1, no volver a congelar para su reutilización. 3. PROCEDIMIENTO A. Templar los reactivos ELTSA a 20-25°C al sacarlos del refrigerador al menos 30 minutos antes de realizar el ensayo.

B. Preparar los estándares de AAD-1 en tampón de ensayo en tubos de poliestireno de 5 mi de la siguiente manera. Someter a vórtice unos segundos antes de transferir a la dilución siguiente. Guardar los tubos en hielo; preparar nuevos estándares para cada ensayo inmediatamente antes de la adición de las muestras a la placa. (Nota: al transferir la solución madre de antígeno de referencia, favor de enjuagar la punta de la pipeta una vez en la solución destino después de usar). aEI volumen de la solución final es el volumen que queda en el recipiente después de que ha servido como la solución madre para la siguiente concentración estándar y se transfiere la cantidad correspondiente de solución.

C. Preparar muestras: Para las muestras de hojas frescas, hacer 4 perforaciones a la hoja y colocar en tubos de polipropileno de 2 mL. Añadir dos o tres perlas de metal a cada tubo. A continuación, añadir 0.80 mi de tampón del ensayo. Tapar todos los tubos.

• Extraer las muestras usando el agitador/molino Geno/Grinder ajusfando el regulador a 350 y el interruptor de palanca en IX (aproximadamente 1500 golpes por minuto) durante 5 minutos como un ciclo. Puede utilizarse un método alternativo equivalente de trituración o extracción.

• Centrifugar las muestras a 14,000 (o más) rpm durante 5 minutos o hasta que se separe (sin partículas visibles en el sobrenadante). El sobrenadante se puede transferir a un tubo separado o se pueden tomar alícuotas para su análisis. Mantener la solución en hielo y utilizar en el ensayo en el transcurso de 2 horas.

D. Añadir las muestras de AAD-1 a la(s) placa(s) ELISA de la siguiente manera: Transferir las diluciones estándar ELISA a las columnas 1-3 en una placa de microtitulación de 96 pocilios no enlazante con fondo en U (aproximadamente 130 µ l/poci I lo) . Para cada placa de prueba, ejecutar soluciones estándar por triplicado.

• Preparar diluciones de muestras según sea necesario y transferir las muestras diluidas a la placa de microtitulación de 96 pocilios no enlazante con fondo en U (aproximadamente 130 µ l/poci I lo) que contiene las soluciones de calibración estándar y registrar la ubicación en la plantilla de ensayo de 96 pocilios.

E. Cubrir la placa previamente recubierta, y agitar suavemente sobre la mesa de trabajo o un agitador de placas durante aproximadamente cinco segundos para mezclar. Dejar incubar a temperatura ambiente durante 1 hora (± 5 min).

F. Lavar la placa previamente recubierta 3-5 veces al llenar cada pocilio con PBST. Eliminar el exceso de líquido en una toalla de papel. Se puede lavar en un lavador de placas.

G. Pipetear 100 µ?_ del conjugado de anticuerpo AAD-1 a cada pocilio recubierto con anticuerpo de la placa de microtitulación de 96 pocilios. Luego, transferir 100 pL de las soluciones estándar de ELISA y las muestras diluidas de la placa de microtitulación con fondo en U de una placa previamente recubierta, manteniendo la misma orientación a medida que las muestras se transfieren a la placa previamente recubierto. Cambiar las puntas de pipeta para cada hilera.

H. Cubrir la placa y colocarla en un agitador e incubar a temperatura ambiente durante 30 min (± 5 min).

I. Lavar la placa 3-5 veces al llenar cada pocilio con tampón de lavado. Eliminar el exceso de líquido con una toalla de papel. Se puede lavar en un lavador de placas.

J. Añadir 100 pL del sustrato TMB a cada pocilio de la placa de reacción. Tapar y mezclar suavemente. Dejar incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 20 ± 2 minutos.

K. Añadir 100 de solución de detención a cada pocilio para detener la reacción. Mezclar suavemente la placa y leer la absorbencia en el módulo dual de longitud de onda 450 nm-650 nm utilizando el lector de placas MAXLINE Vmax.

L. Guardar el archivo de datos en bruto y hacer el análisis de los datos tal como se describe en la sección 4.

Análisis y cálculo de datos A. Curva de calibración: Los valores de absorbencia de los patrones de referencia deben ser utilizado para desarrollar una curva de calibración. Se utilizó el software SOFTmaxPRO™ o Microsoft Excel para proporcionar los análisis y cálculos necesarios. La curva de calibración para el ELISA de AAD-1s e construye utilizando una regresión cuadrática de las concentraciones previstas de las normas y su subsecuente absorbencia (densidad óptica).

B. La ecuación se ajusta la mejor parábola a la curva estándar en basada a la ecuación: y = A + Bx + Cx2 Donde: y = valor de absorbencia media (OD) x = concentración del estándar de referencia C. Cálculo del AAD-1 en muestras de prueba: Puede utilizarse SOFTmax PRO™ o Microsoft Excel para calcular la concentración de AAD-1 en cada muestra de prueba. La concentración pronosticada se determina utilizando los coeficientes de la curva y las lecturas de densidad óptica (OD) en la ecuación de segundo grado. La ecuación de regresión se aplica de la siguiente manera: Concentración pronosticada La concentración de AAD-1 determinada de una muestra de prueba (es decir, repeticiones individuales de una sola dilución) se obtiene multiplicando la concentración pronosticada por el factor de dilución utilizado. 5. Criterios para la aceptación de un lote analítico Cada lote analítico deberá cumplir con los criterios de aceptación en el procedimiento para que sea válido tal como se enumera a continuación. Si los datos no cumplen con estos criterios de desempeño, el analista debe evaluar los resultados, determinar la posible fuente de la variación, y repetir el análisis si fuera necesario.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a una enzima dioxigenasa de ariloxialcanoato (AAD-1) producido por un hibridoma depositado en la American Type Culture Collection (colección de cultivos tipo americano (ATCC)) bajo el número de acceso seleccionado del grupo que consiste de PTA-11251 (473F185.2#18), PTA-11252 (473F225.2#7), PTA-11253 (73F274.2#36), PTA-11254 (473H46.2) y PTA 11255 (473H172.3).

2. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 producido por el hibridoma que tiene el número de acceso PTA-11251 (473F185.2#18).

3. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 producido por el hibridoma que tiene el número de acceso PTA-11252 (473F225.2#7).

4. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 producido por el hibridoma que tiene el número de acceso PTA-11253 (73F274.2#36).

5. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 producido por el hibridoma que tiene el número de acceso PTA-11254 (473H46.2).

6. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 producida por el hibridoma que tiene el número de acceso PTA-11255 (473H172.3).

7. Una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 y se encuentra depositado en la American Type Culture Collection (ATCC) bajo el número de acceso seleccionado del grupo que consiste de PTA-11251 (473F185.2 # 18), PTA-11252 (473F225.2#7), PTA-11253 (73F274.2#36), PTA-11254 (473H46.2) y PTA-11255 (473H172.3).

8. El hibridoma de la reivindicación 7 depositado bajo el número de acceso ATCC PTA-11251 (473F185.2#18).

9. El hibridoma de la reivindicación 7 depositado bajo el número de acceso ATCC PTA-11252 (473F225.2#7).

10. El hibridoma de la reivindicación 7 depositado bajo el número de acceso ATCC PTA-11253 (73F274.2 # 36).

11. El hibridoma de la reivindicación 7 depositado bajo el número de acceso ATCC PTA-11254 (473H46.2).

12. El hibridoma de la reivindicación 7 depositado bajo el número de acceso ATCC PTA-11255 (473H172.3).

13. Un método para identificar la presencia de una enzima AAD-1 que comprende: a) inmovilizar un primer anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 sobre una superficie de ensayo después lavar dicha superficie de ensayo; b) poner en contacto dicha superficie con un líquido de ensayo sospechoso de contener AAD-1 durante un periodo de tiempo suficiente para permitir el enlace y luego lavar dicha superficie de ensayo; c) poner en contacto dicha superficie de ensayo con un segundo anticuerpo diferente de la reivindicación 1 conjugado con un grupo de reporte durante un período de tiempo suficiente para permitir el enlace de dicho segundo anticuerpo monoclonal conjugado y a continuación lavar dicha superficie de ensayo, y, d) detectar la presencia o ausencia de dicho grupo de reporte.

14. Un método para la determinación cuantitativa de una enzima AAD-1 que comprende: a) inmovilizar un antisuero AAD-1 sobre una superficie de ensayo; b) poner en contacto la superficie con un líquido de ensayo sospechoso de contener AAD-1 durante un periodo de tiempo suficiente para permitir el enlace y luego lavar dicha superficie de ensayo; c) poner en contacto la superficie de ensayo con un segundo anticuerpo diferente de la reivindicación 1 conjugado con un grupo de reporte durante un período de tiempo suficiente para permitir el enlace del segundo anticuerpo monoclonal conjugado y a continuación lavar dicha superficie de ensayo, y, d) cuantificar la presencia del grupo de reporte mediante comparación con una curva de calibración.

15. El método de la reivindicación 14 en el que el anticuerpo monoclonal conjugado es 473F185.2#18 (PTA-11251).