CN103209993A - 针对赋予对2,4-二氯苯氧乙酸的抗性的酶的单克隆抗体和检测方法 - Google Patents

Abstract

本文中描述了可用于测定并定量AAD-1(芳氧基链烷酸酯双加氧酶)酶的存在的单克隆抗体和方法。令人惊讶地，这些单克隆抗体完全适合于检测多种植物和植物组织中的AAD-1转基因事件基因产物。本发明进一步提供了使用本发明的免疫球蛋白的定量和定性免疫测定法。

Description

针对赋予对2,4-二氯苯氧乙酸的抗性的酶的单克隆抗体和检测方法

对相关申请的交叉引用

本申请要求2010年9月15日提交的美国临时申请流水号61/383,015的权益，其公开内容在此通过提述完整(包括所有图、表和氨基酸或核酸序列)并入。

发明背景

2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)属于苯氧酸类的除草剂，并且已经在许多单子叶植物作物诸如玉米、小麦、和稻中用于选择性控制阔叶杂草，而对期望的作物植物没有严重损害。2,4-D是一种合成生长素衍生物，其作用为使正常的细胞-激素体内稳态脱调节并阻碍平衡的、受控的生长；然而，尽管田间应用超过60年，这类除草剂的确切作用模式仍未得到完全了解。定草酯(triclopyr)和氟草烟(fluroxypyr)是吡啶基氧乙酸除草剂，它们也充当合成生长素。

这些除草剂对某些植物具有不同的选择性水平(例如双子叶植物比单子叶植物更敏感)。不同植物的差异代谢是对选择性水平变化的一种解释。一般地，植物缓慢代谢2,4-D，因此对2,4-D的植物响应变化可能更有可能通过靶位置处的不同活性解释(WSSA,2002;Herbicide Handbook第8版;WeedScience Society of America;Lawrence,KS第492页)。2,4-D的植物代谢通常经由两阶段机制(通常是羟基化，接着是与氨基酸或葡萄糖缀合)发生(WSSA,2002)。

随着时间推移，用2,4-D攻击的某些微生物群已经形成一种用于降解此异生素的替代途径，这导致2,4-D的完全矿化。除草剂的连续应用选择出能利用该除草剂作为碳源和能源进行生长的微生物，给予它们在土壤中的竞争优势。出于此原因，目前配制的2,4-D具有相对较短的土壤半衰期，并且对后续的作物没有显著的遗留影响。

一种已经对其降解2,4-D的能力进行过广泛研究的生物体是真养产碱杆菌(Ralstonia eutropha)(Streber等；1987;Analysis,cloning,and high-levelexpression of2,4-dichlorophenixyacetic monooxygenase gene tfdA ofAlcaligenes eutrophus JMP134.J.Bacteriol.169:2950-2955)。编码矿化途径起始步骤中的酶的基因是tfdA。参见美国专利No.6,153,401和GENBANK登录号M16730。TfdA基因产物经由α-酮戊二酸依赖性双加氧酶反应催化2,4-D到二氯苯酚(DCP)的转化(Smejkal等；2001.Substrate specificity ofchlorophenoxyalkanoic acid-degrading bacteria is not dependent uponphylogenetically related tfdA gene types.Biol.Fertil.Sols33:507-513)。DCP相比于2,4-D具有很少的除草剂活性。已经在转基因植物中使用TfdA来在对2,4-D天然敏感的双子叶植物诸如棉和烟草中赋予2,4-D抗性(Streber等；1989.Transgenic tobacco plants expressing a bacterial detoxifying enzyme are resistantto2,4-D.Bio/Technology7:811-816和美国专利No.5,608,147)。

已经从土壤细菌中分离出编码能够降解2,4-D的酶的大量tfdA型基因，并且将其序列存储于Genbank数据库中。许多tfdA同源物(大于85%氨基酸同一性)与tfdA具有类似的酶特性。然而，存在许多如下的同源物，其与tfdA具有显著较低的同一性(25-50%)，但具有与α-酮戊二酸双加氧酶Fe⁺²双加氧酶有关的特征性残基。因此，在其它生物化学特征外，这些趋异的双加氧酶的底物特异性是什么并不明显。

一个与tfdA具有低同源性(28%氨基酸同一性)的独特例子是来自Sphingobium herbicidovorans的rdpA(Kohler,H.P.E.1999;Sphingobiumherbicidovorans MH:a versatile phenoxyalkanoic acid herbicide degrader.J.IndMicrobiol and Biotech.23:336-340.Westendorf A.,D.Benndorf,R.Muller,W.Babel.2002.The two enantiospecific dichlorprop/α-ketoglutarate-dioxygenasesfrom Delftia acidovorans MC1-protein and sequence data of RdpA and SdpA.,Microbiol.Res.157:317-22.)。已经显示了此酶催化(R)-滴丙酸(dichlorprop)(和其它(R)-苯氧丙酸)以及2,4-D(一种苯氧乙酸)矿化中的第一步(Westendorf,A.,R.H.Muller,and W.Babel.2003.Purification and characterization of theenantiospecific dioxygenases from Delftia acidovorans MC1initiating thedegradation of phenoxypropionates and phenoxyacetate herbicides.ActaBiotechnol.23:3-17)。虽然以前有时描述降解苯氧基丙酸的生物体，但是在表征此途径上很少做出进展(Horvath,M.,G.Ditzelmuller,M.Lodl和F.Streichsbier1990).Isolation and characterization of a2-(2,4-dichlorophenoxy)propionic acid-degrading soil bacterium.Appl.Microbiol.Biotechnol.33:213-216.)。牵涉滴丙酸的摄取(Kohler,1999)和初始氧化(Westendorf等,2003)两者的立体专一性(R对S)使滴丙酸降解更为复杂化。至今尚未报告rdpA在其它微生物中的异源表达，或此基因对植物的转化。文献主要聚焦于紧密的tfdA同源物，其主要降解非手性苯氧基乙酸(例如，2,4-D)。

经植物密码子优化的芳氧基链烷酸酯双加氧酶基因AAD-1(其编码最初从食酸代尔夫特菌分离的酶)在WO2005/107437(其通过提述并入本文)中在作为除草剂抗性性状使用方面第一次描述。该性状赋予对2,4-D及对吡啶基氧乙酸除草剂的耐受性。携带AAD-1基因的经转化玉米第一次报告于美国临时专利申请号61/235248，其通过提述并入本文。

为种植种子产品开发并销售重组DNA性状的公司制定、执行并遵守严格的产品管理计划。这些管理计划需要对重组性状使用证实的定量和定性蛋白质检测方法来追踪性状基因渗入(introgression)和种子生产活动，以及对谷粒收获监测该性状。这些检测方法必须是容易且强力的，使得足以在GLP和非GLP条件下使用。此外，方法必须是对用户友好且不麻烦的，使得足以田间的农民、粮仓的粮商和边境的海关行政人员容易地采用。因此，强力的、高质量、用户友好的蛋白质检测方法和商业试剂盒对于推出重组植物性状产品是至关重要的且必要的。

尽管免疫测定法是本领域公知的，开发可再现且灵敏得足以在实验室和田间背景两者中检测一批植物组织中特定转基因产物的强力的且证实的ELISA(酶联免疫吸附测定法)方法既不是不重要的，也不是常规的。更具挑战的是，寻找适用于开发用于检测AAD-1转基因事件产物的侧向流动条ELISA方法的互补抗体对。

发明概述

本发明提供了一组单克隆抗体(单抗)和生成要求保护的抗体的杂交瘤细胞系。杂交瘤按照布达佩斯条约的条款保藏于美国典型培养物保藏中心。令人惊讶地，要求保护的单抗完全适用于在多种植物和植物组织中检测特定AAD-1转基因事件基因产物。本发明进一步提供了使用要求保护的免疫球蛋白的定量和定性免疫测定法。

发明详述

本发明涵盖与AAD-1反应性的抗体和生成要求保护的单抗的杂交瘤。下表列出了杂交瘤系名称及其相应的ATCC保藏名称。

杂交瘤/单抗名称	ATCC保藏名称	ATCC保藏日期
			473F185.2#18	PTA-11251	2010年8月10日
473F225.2#7	PTA-11252	2010年8月10日
			473F274.2#36	PTA-11253	2010年8月10日
473H46.2	PTA-11254	2010年8月10日
			473H172.3	PTA-11255	2010年8月10日

本发明还包括使用所述单抗分离或检测AAD-1的方法，包括：a)将所述抗体固定化到表面上；b)使所述固定化抗体与含有AAD-1的混合物接触；c)自所述混合物分离与AAD-1结合的所述固定化抗体；并d)通过自所述固定化抗体取出抗体结合的AAD-1来回收AAD-1。

本发明还包括使用要求保护的抗体鉴定生物学样品中AAD-1存在的方法，包括：a)将所述抗体固定化到测定表面上；b)使所述测定表面与怀疑含有AAD-1的液体接触，并用合适的溶液清洗所述测定表面；c)使所述测定表面与用报告基团标记的抗-AAD-1抗体接触，并用合适的溶液清洗所述测定表面；d)检测所述报告基团的存在。

本发明进一步包括用于定量测定在转基因植物，特别是玉米和棉植物中表达的AAD-1酶的分析方法。用PBST(含0.05%

-20的磷酸盐缓冲盐水)溶液从玉米样品提取AAD-1蛋白。将提取物离心，并收集水性上清液并稀释。在经抗AAD-1多克隆或单克隆抗体包被的板的孔中，将稀释样品的等分试样与缀合有酶的抗AAD-1单克隆抗体以夹心/三明治式ELISA形式一起温育。夹心对中的这两种抗体都捕捉样品中的AAD-1蛋白。在温育期结束时，通过用PBST清洗将未结合的试剂自板除去。通过将酶缀合物与酶底物一起温育，生成有色产物来检测AAD-1的存在。由于AAD-1在抗体夹心物中结合，颜色显现水平与样品中AAD-1的浓度成比例(即较低的蛋白质浓度导致较低的颜色显现)。使用读板仪测量450nm(或405nm，取决于标记物)处吸光度减去参照波长(诸如650nm)处吸光度。使用二次回归方程从7个标准浓度估计校正曲线。此AAD-1ELISA是特异性的且灵敏得足以定量植物组织样品提取物中AAD-1。另外，使用已知的Western印迹技术，可以使用本发明的抗体来确认AAD-1的存在。

针对感兴趣的蛋白质的单克隆抗体的制备是本领域中公知的。参见Galfre和Milstein,Methods in Enzymology，第73卷，Academic Press,New York(1981);James W.Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,Orlando,Florida(1986);Current Protocols in MolecularBiolopy,F.M.Ausubel等编,Wiley Interscience,New York,(1987)。虽然产生与给定免疫原反应性的单抗的评分可以是常规的，但是有挑战的是经由它们分选以寻找适合于特定应用的非常少的单抗，以及确保分泌它们的杂交瘤是稳定的且适合于连续培养。

为了制备与感兴趣的蛋白质反应性的抗体，首先必须富集或纯化蛋白质。出于免疫目的，可以使用相对粗制的抗原性蛋白质制备物。然而，需要高度纯化的蛋白质来精确测定杂交瘤是否生成寻求的单克隆抗体或者测定特定血清的抗体滴度。

一旦分离出AAD-1，可以通过本领域中公知的常规方法生成对AAD-1特异性的抗体。在数周或数月的时段里对选择的宿主重复注射会引发免疫应答，并且产生显著的抗AAD-1血清滴度。优选的宿主是哺乳动物物种，并且更高度优选的物种是家兔、山羊、绵羊和小鼠。可以通过确立的方法加工从这类经免疫的动物中抽出的血液以获得与AAD-1反应性的抗血清(多克隆抗体)。然后，可以依照本领域中已知的技术通过吸附至AAD-1来亲和纯化抗血清。可以使用本领域中已知的规程通过分离抗血清内的免疫球蛋白级分进一步纯化经亲和纯化的抗血清。所得的物质会是与AAD-1反应性的异质性免疫球蛋白群。

使用纯化的AAD-1容易制备抗AAD-1单抗。用于生成单抗的方法已经实施数十年，并且是本领域中普通技术人员公知的。佐剂中AAD-1的重复腹膜内或皮下注射会在大多数动物，特别是小鼠中引发免疫应答。将经过超免疫的B淋巴细胞自动物取出，并与能够无限培养的合适的融合配偶细胞系融合。众多哺乳动物细胞系是适用于生成杂交瘤的融合配偶。许多这类系可购自ATCC和商业供应商。

一旦融合，将所得的杂交瘤在选择性生长培养基中培养1至2周。两种公知的选择系统可用于从混合的杂交瘤培养物中消除未融合的骨髓瘤细胞或骨髓瘤细胞间的融合物。选择系统的选择取决于免疫的小鼠品系和使用的骨髓瘤融合配偶。可以使用由Taggart和Samloff,Science219,1228(1982)描述的AAT选择系统；然而，由Littlefield,Science145,709(1964)描述的HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)选择系统由于其与小鼠细胞和上文提及的融合配偶的相容性而是优选的。

然后，对用过的生长培养基筛选免疫特异性单抗分泌。酶联免疫吸附测定法规程最好地适合于此目的；尽管，适合于大体积筛选的放射性免疫测定法也是可接受的。必须实施设计为连续削减相当多数目的无关或不太期望的培养物的多种筛选，以分离小百分比的本发明的单抗。使用商品化试剂盒对分泌与AAD-1反应性的单抗的培养物测定同种型。

分泌寻求的抗AAD-1单抗的杂交瘤培养物应该经过数次亚克隆以建立单克隆性和稳定性。用于亚克隆真核的、非粘附细胞培养物的公知方法包括有限稀释、软琼脂糖和荧光激活细胞分选技术。在每次亚克隆后，必须对所得的培养物再测定抗体分泌，并再次确定同种型以确保已经建立稳定的抗体分泌培养物。

可以将要求保护的抗AAD-1抗体固定化到表面，从而一些抗体结合位点保持暴露，并且能够结合AAD-1。在过去的数十年里已经开发出用于固定化抗体的一大批方案。可以通过直接将抗体与期望的表面共价偶联或者通过将抗体与表面桥接来实现固定化。

抗体与基于多糖的珠诸如

(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.;Pistcataway,NJ)的CNBr和碳二亚胺偶联例示了与本发明一致的直接偶联方案。一般地，直接偶联不以任何特定的方式对抗体定向；然而，一些类型的直接偶联能够在固定化物质上对抗体可再现地定向。

优选的偶联方案将抗体定向为使其抗原结合区保持暴露。一种这类方案利用存在于抗体重链上的天然碳水化合物。通过首先将碳水化合物模块氧化为相应的醛，反应性醛与基质表面上的伯氨基团进一步相互作用，有可能以有利的取向连接抗体。

许多类型的桥是有可能的，并且包括将抗体共价结合到固定化物质的小的有机接头。这类间隔物臂是可接受的，并且优选地，在形成桥后不应与蛋白质相互作用。

上述讨论决不意图限制本发明的范围。众多其它公知的用于将抗体与固定化物质连接的方案与本发明是一致的。

公知的是，可以使用用报告基团标记的抗体来鉴定多种环境中抗原的存在。用放射性同位素标记的抗体在放射性免疫测定法中已经使用了数十年，以便以很大的精确性和灵敏性鉴定多种生物学流体中抗原的存在。新近，已经在流行的ELISA中使用酶标记的抗体作为放射性标记的抗体的替代。

本发明的抗体可以结合至固定化物质诸如聚苯乙烯孔或颗粒，并在免疫测定法中使用以测定测试样品中是否存在AAD-1。在本发明的此实施方案中，使样品与免疫亲和表面接触，并允许温育。在清洗步骤后，通过使所述表面与用报告基团标记的本发明的另一种抗体接触来检测已经结合至免疫亲和表面的任何AAD-1。

用要求保护的抗体和测定方法使用侧向流动条或免疫层析条与本发明一致。侧向流动测定法是本领域中公知的。参见例如US6,485,982。在此模式中，可以使用侧向流动测试单独或与其它分析物同时定性或半定量检测AAD-1。侧向流动测试是本文中描述的所有测试形式中使用最简单的，并且特别可用于田间背景，在那里将植物材料快速提取到溶液中，并在侧向流动条上测试。在此模式中，仅必需将侧向流动条放置于液体样品中或向侧向流动条应用该液体样品，并在预定的时间后读出结果。所有侧向流动测试都应当并入用于验证测试结果的规程性对照线或样品对照线。因此，出现两条线指示阳性结果，而有效阴性测试仅产生对照线。如果仅出现测试线，或者如果没有线出现，那么其是无效的。

典型的侧向流动测试条由四个主要构件组成；对其应用测试样品的样品垫，含有与有色颗粒(通常为胶体金颗粒，或胶乳微球)缀合的本发明抗体的缀合物垫；反应膜诸如疏水性硝酸纤维素或乙酸纤维素膜，在其上以横跨整个膜的线形式固定化本发明的不同抗体作为捕捉带或测试线；最后，设计为通过毛细管作用将样品拉过整个反应膜的废物池。

侧向流动条的各构件通常固定至惰性基底材料，并且可以以简单的浸渍片形式或者在具有样品口和显示捕捉和对照带的反应窗的塑料铸件内呈现。在该测定法实施方案的另一种模式中，将怀疑含有AAD-1的测试样品干燥于表面上，形成固定化测试样品。然后，使经标记的本发明的抗体与该固定化测试样品接触，并允许温育。如果该样品含有AAD-1，那么该经标记的抗体将结合固定化的AAD-1。此方法也可以使用未标记的本发明的抗体，接着是经标记的二抗来完成，所述经标记的二抗结合已经结合AAD-1的本发明的抗体。在清洗后，测量固定化的测试样品以检测任何报告基团的存在。

报告基团通常是酶诸如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或β-D-半乳糖苷酶。合适的底物在与酶起反应时产生颜色变化。这样做时，可以使用分光光度计定量颜色强度的测量。如果报告基团是放射性同位素，那么可以使用适当的γ或β射线检测仪来量化报告基团。报告基团的强度与测试样品中AAD-1的量正相关。

以下实施例会帮助描述如何实施本发明，并且会例示要求保护的抗AAD-1抗体和测定法的特征。

实施例1

免疫原制备

在添加有稳定剂的基于PBST(具有0.05%

20的磷酸盐缓冲盐水，pH7.4)的缓冲液中自冻干的自转基因玉米收集的叶组织提取AAD-1蛋白，并在离心后在上清液中收集可溶性蛋白质。将上清液过滤，调节至1M AmSO₄，并允许可溶性蛋白质结合苯基Sepharose^TM HIC(疏水相互作用珠)(GEHealthcare)。温育1小时后，用PBST清洗HIC珠，并用Milli-Q^TM水洗脱结合的蛋白质。添加氯化钠以提高电导率，并将经HIC纯化的蛋白质加载到已经与AAD-1特异性多克隆抗体缀合的抗AAD-1免疫亲和柱上。针对荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中生成的重组AAD-1生成多克隆抗体，如记载于WO2005/107437的。自柱收集未结合的蛋白质，并将该柱用预冷的PBS(磷酸盐缓冲盐水，pH7.4)充分清洗。用3.5M NaSCN,50mM Tris^TM,pH8.0缓冲液从该柱洗脱结合的蛋白质。通过SDS-PAGE和Western印迹检查微生物衍生的AAD-1和玉米衍生的AAD-1。

在微生物衍生的AAD-1中，如在经考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上显现的，主要的蛋白质条带是约32kDa。相应的植物衍生的AAD-1蛋白在大小上与微生物衍生的蛋白质相同。另外，植物衍生的AAD-1样品含有少量杂质，其与AAD-1抗血清是非免疫反应性的。共纯化的蛋白质有可能通过与柱基质的弱相互作用而保持在柱上。

微生物衍生的AAD-1和植物衍生的样品在使用抗AAD-1抗血清的Western印迹上显示期望大小的阳性信号。在AAD-1Western印迹分析中，没有在阴性对照(天然玉米)提取物中观察到免疫反应性蛋白质，在来自转基因植物的样品中也没有看到其它(alternate)大小的蛋白质(为聚集体或降解产物)。

实施例2

杂交瘤制备

用纯化的AAD-1免疫小鼠，并使用标准的融合技术来制备一组表达抗AAD-1单克隆抗体的杂交瘤。从含有杂交瘤培养物的每个孔中无菌取出用过的组织培养基样品，并使用下述抗体捕捉ELISA方法测定AAD-1反应性。将微量滴定孔用纯化的AAD-1的1-10μg/mL溶液包被。清洗孔，将用过的组织培养基样品置于孔中，并允许温育。清洗孔，添加辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗血清，并允许温育。清洗板，添加底物以显现颜色反应，并对板读取OD(光密度)。将具有高OD读数的孔返回定位到含有杂交瘤的培养孔。对AAD-1抗体阳性培养物连续筛选抗体产生以确保在扩充培养物时的生长稳定性和抗体生成。实施数轮有限稀释克隆以建立每种培养物的真正单克隆性。对抗体阳性克隆进行进一步的测定法，以确定每种抗体在目前要求保护的定量检测方法（植物材料的田间使用）中使用的适合性。

实施例3

测定法开发

对测定条件评估最佳包被浓度、包被缓冲液组分、包被形式和pH、和抗体-生物素比率和浓度。最终的测定形式使用序贯或同时三明治式形式。开发经HRP(辣根过氧化物酶)和AP(碱性磷酸酶)标记的系统两者。对于这两种系统，将单抗473H274.2#36在反应孔表面上包被并干燥。

在HRP系统中，将单抗473F185.2#18与HRP缀合。将AAD-1样品添加至反应孔，并于室温温育1小时。在清洗步骤后，将473F185.2#18-HRP缀合物添加至反应孔，并于室温温育30分钟。然后，清洗反应孔，并添加底物以与HRP起反应。在存在AAD-1蛋白的情况中，HRP缀合物结合至反应孔，随后与孔中的底物产生颜色变化。在30分钟底物温育期后，添加停止溶液，并以450nm减去650nm的波长在96孔读板仪中阅读反应孔。

在AP系统中，将473F185.2#18单抗与生物素缀合。将样品和生物素化的单抗添加至反应孔，并于室温温育1小时。清洗步骤后，将抗链霉亲合素-AP缀合物添加至反应孔，并于室温温育30分钟。然后，清洗反应孔，并添加底物以与AP起反应。在存在AAD-1蛋白的情况中，AP缀合物结合至反应孔，随后与孔中的底物产生颜色变化。在30分钟底物温育期后，以405nm的波长在96孔读板仪中阅读反应，将其结果绘图，并计算标准曲线，如图1中所显示的。

在基于HRP的测定法的测试期间，用玉米组织样品观察到非特异性信号。相反，AP系统在使用玉米组织时没有表明任何显著的非特异性信号。因此，基于AP的测定法是更优选的形式；尽管，基于HPR的测定法仍是一种可行的系统。

实施例4

测定法特征

用不同批次试剂评估所得的AP形式以确定测定法的灵敏度和范围及建立测定法的吸光度变化性和精确性。在这些研究中，三名操作员通过运行两个标准曲线和单点分析来测试两个板/试剂批次。测定法的标准曲线的总体吸光度范围为0.1abs₄₀₅至1.5abs₄₀₅。下文表1中显示了结果。

表1

测定法的有效定量范围在1ng/mL至32ng/mL的范围，其中平均板间和分析员间%误差和百分比变异系数(%CV)分别为3.40%和2.62%(表2)。操作员、板批次、缀合物批次或日期对%CV测定没有显著影响。板间批次%误差和精确性与板内批次结果是非常相似的(表3和4)。

表2

表3

表4

实施例5

测定法特异性

针对脱调节的(deregulated)商业性状蛋白质运行实施例3的免疫测定法以测定是否有任何不能接受的交叉反应性。将含有蛋白质Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F、Cry34Ab1、Cry35Ab1、和PAT(膦丝菌素乙酰基转移酶)的测试样品在反应孔中温育，并依照实施例3运行免疫测定法。类似地，表达Cry1F(DASTC1507),Cry34Ab1/35Ab1(DAS-59122-7),Cry3Bb(MON863),Cry2Ab/Cry1A(MON89034),Cry3Bb/CP4(MON88017),GA21(GA21),Cry1Ab(MON810和Bt11),Cry3A(MIR604)和CP4(NK603)的转基因玉米种子在免疫测定法中运行，并且不产生阳性信号。发现测定法对于AAD-1蛋白是高度选择性的。对测试中的非靶蛋白没有测量到交叉反应性或干扰效应。因此，推断要求保护的测定法AAD-1微量滴定板ELISA对存在于商品化玉米转基因品种的其它重组蛋白没有交叉反应性。

实施例6

AAD-1定量ELISA方案

1.一般要求

A.材料

·珠，1/8’’铬钢，产品目录编号BS-0125-C，Small Parts Inc.,MiamiLakes,FL或等同物。

·帽(用于2.0-mL圆锥管)，产品目录编号02-681-361,Fisher Scientific或等同物

·多通道移液管管理器，12道，10-300μL

·移液管尖端，各种大小

·板覆盖物或等同物

·试剂贮液器，非无菌

·各种大小的单通道移液管管理器，10μL-1.0mL

·管，聚丙烯，5mL，产品目录编号14-956-1D,Fisher Scientific

·管，15-mL具有帽的聚丙烯离心管，产品目录编号05-539-12,FisherScientific

·管，2.0-mL圆锥微离心管，产品目录编号02-681-344,Fisher Scientific

·U底板，非结合96孔，BD Falcon产品目录编号35-3918或等同物

B.设备

·天平，分析用，AB54-S型，Mettler Instrument Corporation或等同物

·离心机，其能够容纳2-mL Eppendorf管、Eppendorf-5417C或等同物

·制冷器，其能够维持–20°C，75F型，U-Line Corporation,Milwaukee,WI或等同物

·读板仪，其能够阅读405-650nm，Molecular Devices产品目录编号0200-2018或等同物

·冰箱，其能够维持2–8°C的温度

·涡旋振荡器(Vortex)，Genie-2型，产品目录编号12-812，FisherScientific或等同物

·摇动器/研磨机，Geno/Grinder型，产品目录编号2000-115，Certiprep,Metuchen,New Jersey或等同物

·洗涤器(Washer)，96孔微板，Elx405型，Bio-Tek Instruments,Inc.或等同物

2.试剂和试剂制备

A.经抗体包被的96孔微量滴定板；AAD-1抗体缀合物(l20mL)；颜色试剂(120mL)；停止溶液(120mL)。

B.PBST,pH7.4,产品目录编号P-3563,Sigma。于2-8°C贮存。

C.磷酸盐缓冲液盐水+0.05%Tween-20(PBST)，pH7.4。于2-8°C贮存，直到6个月。可以使用PBST粉末来制备缓冲液，产品目录编号P-3563,Sigma。

D.30%牛血清清蛋白(BSA)溶液，免疫血液学级(SerologicalsCorporation,Inc.1-800-431-4505产品目录编号81-070或等同物。于2-8°C贮存。

E.AAD-1标准蛋白。

F.测定缓冲液：加有0.5%BSA(w/v)的PBST(PBST/BSA)。可以使用PBST粉末来制备缓冲液，产品目录编号P-3563,Sigma。

·将1mL30%BSA添加至容器中的30mL PBST；

·充分混合，并且其可以当天使用。实验后弃去残留物。

G.清洗缓冲液：加有0.05%Tween-20(w/v)的PBST。可以使用PBST粉末来制备缓冲液，产品目录编号P-3563,Sigma。

·将0.5mL Tween-20添加至容器中的1L PBST；

·充分混合，并于室温贮存。若观察到任何可见的污染，则弃去溶液。

H.AAD-1储备溶液，1000ng/mL。

·基于PBST/BSA中的液体标准品浓度，制备1000-ng/mL储备溶液。将其在冰中保持以在2小时内使用。若观察到任何可见的污染，则弃去。弃去剩余的AAD-1储液；不将其再次冷冻以供再次使用。

3.规程

A.使ELISA试剂为20-25°C，其通过在实施测定法前至少30分钟自冰箱取出它们来进行。

B.如下在5-mL聚苯乙烯管中在测定缓冲液中制备AAD-1标准品。涡旋振荡几秒，之后转移到下一稀释度。在冰上贮存管；刚好在将样品添加到板前对每个测定法制备新的标准品。(注意：在转移储备参照抗原时，请在分配后在目的溶液中将移液管尖端漂洗一次)。

^a最终的溶液体积是在其已经充当下一标准浓度的储备溶液并且转移相关量的溶液后在容器中的剩余体积。

C.制备测试样品：

·对于新鲜的叶样品，生成4个叶冲孔，并放入2-mL聚丙烯管中。将两个或三个金属珠添加至每个管。然后，添加0.80mL测定缓冲液。对所有管加帽。

·使用350标度盘设置的Geno/Grinder自动摇动器/研磨机和1X设置(每分钟约1500击)的拨动开关提取样品达5分钟作为一个循环。可以使用备选的等同研磨或提取方法。

·以14,000(或更大)rpm离心样品5分钟或直至分离(上清液中没有可见的颗粒)。可以将上清液转移到不同的管或等分取样以进行分析。将溶液在冰上保持，并在2小时内将其测定。

D.如下将AAD-1样品添加至ELISA板：

·将ELISA标准品稀释液转移到非结合96孔U底微量滴定板上的栏1-3(约130μl/孔)。对于测试的每块板，一式三份运行标准品溶液。

·在需要时制备样品稀释液，并将稀释的样品转移至含有标准品校正溶液的非结合96孔微量滴定板(约130μl/孔)，并在96孔测定模板表上记录位置。

E.覆盖预先包被的板，并在台式或板式摇动器上温和涡旋振荡约5秒以混合。容许于周围温度温育1小时(±5分钟)。

F.通过用PBST充满每个孔来将预先包被的板清洗3-5次。在纸巾上敲出过量液体。可以通过洗板器将其清洗。

G.将100μL AAD-1抗体缀合物移液至经抗体包被的96孔微量滴定板的每个孔。然后，将100μL ELISA标准品溶液和稀释样品从U底微量滴定板转移到预先包被的板，与将样品转移至预先包被的板保持相同的取向。每行更换移液管尖端。

H.覆盖板，将其在摇动器上放置，并于周围温度温育30分钟(±5分钟)。

I.通过用清洗缓冲液充满每个孔来将板清洗3-5次。在纸巾上敲出过量液体。可以通过洗板器将其清洗。

J.将100μL TMB底物添加至反应板的每个孔。覆盖并温和混合。容许于周围温度在黑暗中温育20±2分钟。

K.将100μL停止溶液添加至每个孔以停止反应。温和混合板，并使用MAXline Vmax读板仪以双重波长模数450nm-650nm阅读吸光度。

L.保存原始数据文件，并进行数据分析，如第4节中描述的。

4.数据分析和计算

A.校正曲线：

应当使用来自参照标准品的吸光度值来形成校正曲线。使用SOFTmaxPRO^TM软件或Microsoft Excel来提供必需的分析和计算。使用标准品的预期浓度及其随后的吸光度(光密度)的二次回归构建AAD-1ELISA的校正曲线。

B.基于如下的方程式，方程式将最佳的抛物线拟合至标准曲线：

y=A+Bx+Cx²

其中：

y=均值吸光度值(OD)

x=参照标准品浓度

C.测试样品中AAD-1的计算：

可以使用SOFTmax PRO^TM或Microsoft Excel来计算每个测试样品的AAD-1浓度。在二次方程中使用曲线系数和光密度(OD)读数测定预测的浓度。如下应用回归方程：

通过用预测的浓度乘以使用的稀释因子获得测试样品(即，单一稀释液的各个重复)的测定AAD-1浓度。

5.分析批次的接受标准

每个分析批次应当满足使规程有效的接受标准，如下文所列的。如果数据不能满足这些运行标准，那么分析员应当评估结果，确定变化的潜在来源，并在必要时重复分析。

测定缓冲液空白	吸光度450nm-650nm<0.150
		0-ng/mL标准品	吸光度450nm-650nm<0.150
20-ng/mL标准品	吸光度450nm-650nm≥0.85

校准曲线	r2(测定关联性)>0.990
		所有阳性参照标准品，OD	一式三份CV(OD)≤15%
未知或QC样品，溶液	一式三份CV(OD)≤20%
		质量控制样品，溶液(若可适用的话)	测量值≤±20%预期值

Claims (15)

1.一种特异性结合酶芳氧基链烷酸酯双加氧酶(AAD-1)的单克隆抗体，其由以选自下组的登录号保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的杂交瘤生成：PTA-11251(473F185.2#18)、PTA-11252(473F225.2#7)、PTA-11253(73F274.2#36)、PTA-11254(473H46.2)、和PTA-11255(473H172.3)。

2.权利要求1的单克隆抗体，其由具有登录号PTA-11251(473F185.2#18)的杂交瘤生成。

3.权利要求1的单克隆抗体，其由具有登录号PTA-11252(473F225.2#7)的杂交瘤生成。

4.权利要求1的单克隆抗体，其由具有登录号PTA-11253(73F274.2#36)的杂交瘤生成。

5.权利要求1的单克隆抗体，其由具有登录号PTA-11254(473H46.2)的杂交瘤生成。

6.权利要求1的单克隆抗体，其由具有登录号PTA-11255(473H172.3)的杂交瘤生成。

7.一种杂交瘤细胞系，其生成权利要求1的单克隆抗体，并且以选自下组的登录号保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)：PTA-11251(473F185.2#18)、PTA-11252(473F225.2#7)、PTA-11253(73F274.2#36)、PTA-11254(473H46.2)、和PTA-11255(473H172.3)。

8.权利要求7的杂交瘤，其以ATCC登录号PTA-11251(473F185.2#18)保藏。

9.权利要求7的杂交瘤，其以ATCC登录号PTA-11252(473F225.2#7)保藏。

10.权利要求7的杂交瘤，其以ATCC登录号PTA-11253(73F274.2#36)保藏。

11.权利要求7的杂交瘤，其以ATCC登录号PTA-11254(473H46.2)保藏。

12.权利要求7的杂交瘤，其以ATCC登录号PTA-11255(473H172.3)保藏。

13.一种用于鉴定AAD-1酶的存在的方法，包括：

a)将权利要求1的第一单克隆抗体固定化到测定表面上，然后清洗所述测定表面；

b)使所述测定表面与怀疑含有AAD-1的液体接触一段时间，该时间段足以容许结合，然后清洗所述测定表面；

c)使所述测定表面与同报告基团缀合的权利要求1的不同第二抗体接触一段时间，该时间段足以容许所述第二缀合单克隆抗体的结合，然后清洗所述测定表面；并

d)检测所述报告基团的存在或缺乏。

14.一种用于定量测定AAD-1酶的方法，包括：

a)将AAD-1抗血清固定化到测定表面上；

b)使所述测定表面与怀疑含有AAD-1的液体接触一段时间，该时间段足以容许结合，然后清洗所述测定表面；

c)使所述测定表面与同报告基团缀合的权利要求1的不同第二抗体接触一段时间，该时间段足以容许所述第二缀合单克隆抗体的结合，然后清洗所述测定表面；并

d)通过与校正曲线比较来量化所述报告基团的存在。

15.权利要求14的方法，其中所述缀合单克隆抗体是473F185.2#18(PTA-11251)。

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