JPH05288748A

JPH05288748A - イヌｃｒｐの簡易検出試薬及びその製法

Info

Publication number: JPH05288748A
Application number: JP11417592A
Authority: JP
Inventors: Shizuo Yamamoto; 静雄山本; Eiji Furukawa; 英司古川; Tadao Nagae; 忠男長江; Hiromoto Asai; 宏基浅井; Juichi Awatani; 寿一粟谷; Masatsune Kurono; 昌庸黒野; Kiichi Sawai; 喜一澤井
Original assignee: Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd
Current assignee: Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd
Priority date: 1992-04-08
Filing date: 1992-04-08
Publication date: 1993-11-02

Abstract

(57)【要約】【目的】炎症や感染症疾患時に、血中に著しい増加が
認められるイヌ CRP の簡易検出試薬及びその製法を提
供する。【構成】精製されたイヌ血清 CRP をヤギ又はウサギ
に免疫させて得た抗血清を精製し、この抗血清から得た
抗イヌ CRP 抗体をラテックス粒子に感作させ、この抗
体感作粒子を緩衝液中に存在せしめたイヌ CRP の検出
試薬である。【効果】従来の検出試薬は検体試料として血液から分
取した血清又は血漿、一般的には血清を用いる必要性が
あったが、本検出試薬はイヌ CRP の検出感度が極めて
高く、全血でも測定が可能なので、往診時においても炎
症性及び感染性疾患の診断を、その場で行うことができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はイヌ CRP の簡易検出試
薬及びその製法に係る。

【０００２】

【従来の技術】CRP (C Reactive Protein, C 反応性蛋
白) はカルシウムイオンの存在下で、肺炎球菌の細胞壁
に含まれている C 多糖体と特異的に反応するヒトの血
清成分として発見された物質であり、その後 CRP は C
多糖体に対する抗体ではなく、急性炎症、組織破壊に伴
い肝臓で合成されて血中に出現する急性相蛋白であっ
て、炎症時には正常時の 500 - 1,000 倍に迄増加し、
回復と共に速やかに減少することが判明し、従ってヒト
に関して CRP 濃度は炎症や感染症疾患の診断、経過及
び予後判定の指標とされており、その測定は必須の臨床
検査項目となっている。

【０００３】しかしながら、ヒト以外の動物に関して、
CRP は一般にその存在すら殆ど知られていなかったのが
実情であった。即ち、ヒト CRP を抗原として生体に感
作せしめ、得られる抗血清による炎症等の診断、経過の
推移判定に CRP 測定を利用する試みは、ヒト医学領域
でなされているものの、ヒト CRP を精製して高純度に
なす操作が煩雑であり、又収量の向上が困難である等工
業的生産性に限界があり、家畜動物類における炎症の診
断等の獣医学領域でヒト CRP に対する抗血清が利用さ
れるには至っていなかったのである。処で、イヌは古来
よりヒトと共存する形で狩猟用動物、家畜、ペットとし
て愛用されており、近年実験動物としてもその利用価値
は拡大する傾向にあり、健康状態を管理する必要性が望
まれている。そこで、本発明者等は鋭意研究の結果、イ
ヌに関する CRP の分離精製に成功し、イヌ CRP とヒト
CRP とは一部共通性を有するが、抗原性の異なること
を発見し、イヌに対するその診断試薬等の利用方法を提
案した (特開昭 62 - 155299公報)。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記の特開昭 62 - 15
55299 公報に開示されている方法を具象化し、イヌのCR
P 濃度を測定して健康状態の指針とする試みは、本発明
者等により既に行われているが、当該方法は下記の点に
関して改良すべき余地のあることが判明した。 a) 測定試料として血清又は血漿が必要であり (上記の
公開公報に開示されている方法においては血清が使用さ
れているが、血漿でも使用可能、イヌから採血した後に
血清と血漿とを分離する必要がある、及び b) 炎症性疾患の診断にあっては極めて精度が高く簡便
な方法ではあるが、ウイルス性疾患等の感染症に関して
は炎症症状が増幅されない限り CRP に顕著な増加が認
められない。

【０００５】

【課題を解決するための手段及び方法】本発明者等は上
述の課題に鑑みて鋭意検討を重ねた結果、 A) イヌ CRP の抗原としての精製度を高め、 B) 感作動物の種を特定し、 C) 抗血清から抗イヌ CRP 抗体の純化精度を高め、 D) 反応試薬の調製方法を改良することにより、検体試料として全血を使用することがで
き、これによって血清と血漿とに分離する操作を省略す
ることが可能であり、又検体試料の希釈操作を必要とせ
ず、従ってイヌ CRP を簡易に検出することの試薬組成
及びその製法を見い出して本発明を完成するに至った。

【０００６】本発明によるイヌ CRP の簡易検出試薬は
イヌ血清由来の CRP を抗原として哺乳動物に感作させ
ることにより得た抗イヌ CRP 血清から得られた抗イヌ
CRP 抗体を球径 0.1 - 1.0μm のラテックス粒子に、ラ
テックス 1mg 当り 10 - 500μg の割合で感作させるこ
とにより調製された抗体感作ラテックスと、塩化ナトリ
ウム 0.50 - 1.50%、ウシ血清アルブミン 0.50 - 2.50
%、ポリエチレングリコール 0.05 - 3.00%、アジ化ナト
リウム 0.05 - 0.25% を添加した緩衝液とを含有してい
ることを特徴としている。本発明による試薬において、
上記の緩衝液はグリシン、トリス及び燐緩衝液から選択
されたものが有利であり、抗体感作ラテックス粒子は該
緩衝液中に 1.0 -2.5% (W/V) の量割合で存在している
のが好ましい。

【０００７】本発明によるイヌ CRP の簡易検出試薬の
製法は、イヌ血清由来の CRP を抗原として哺乳動物に
感作させ、該感作動物から採血し、得られた抗イヌ CRP
血清を純化して抗イヌ CRP 抗体を得る工程と、該抗イ
ヌ CRP 抗体を球径 0.1 - 1.0μm のラテックス粒子
に、ラテックス 1mg 当り 10 - 500μg の割合で感作さ
せることにより抗体感作ラテックスを調製する工程と、
塩化ナトリウム 0.50 -1.50%、ウシ血清アルブミン 0.5
0 - 2.50%、ポリエチレングリコール 0.05 -3.00%、ア
ジ化ナトリウム 0.05 - 0.25% を含有する緩衝液を調製
する工程と、該緩衝液中に上記の抗体感作ラテックス粒
子を添加する工程とを具備している。上記の抗原感作哺
乳動物としてはヤギ又はウサギが選択される。

【０００８】次ぎに、本発明方法において採用されてい
るイヌ CRP の取得及び抗イヌ CRP血清の精製法並びに
抗イヌ CRP 抗体の純化方法について、若干詳細に説明
する。 a) イヌ CRP の取得及び抗イヌ CRP 血清の精
製法イヌに例えばスタフィロコッカス・アウレウスを腹腔内
投与して人為的に炎症を惹起させ、この腹腔内投与から
1 - 2 日後に全採血し、血清を分取して急性相血清と
する。p-ニトロフェニルホスホリルコリン (p-PC) をCH
-セファロース4B に結合させカラムに充填した PC カラ
ムを用いて上記の急性相血清から分離したCRP 画分をヤ
ギ又はウサギに免疫し、採血して抗イヌ CRP 血清を分
取する。このようにして得られた抗血清は CRP 以外に
他の血清成分に対する抗体を含有しているので、当該他
の血清成分に対する抗体（非特異抗体）を吸収除去する
ために、抗イヌ CRP IgG カラムを作製し、このカラム
を用いて抗イヌ CRP 血清を分離取得する。

【０００９】b) 抗イヌ CRP 血清の精製法 (別法) 上記の a) 項の途次で得られた抗イヌ CRP 血清は下記
の方法を用いて精製することもできる。即ち、健常イヌ
血清蛋白を結合させたセファロースを用いてアフィニテ
ィー・クロマトグラフィーを行うか、健常イヌ血清を不
溶化した蛋白抗原を用いて、抗イヌ CRP 抗体以外に存
在する可能性のある抗体を吸着除去するのである。

【００１０】

【実施例等】次ぎに、参考例、製造例及び試験例によ
り、本発明を更に詳細に且つ具体的に説明する。

【００１１】参考例 1 (イヌ CRP の精製) a) CH-Sepharose 4B 15g を0.5M NaCl 含有水溶液 (pH
4.5) 3,000ml で洗浄した。 b) リガンドとして用いる P-ニトロフェニルホスホリル
コリン 23g を 120mlの水に溶解し、pH を 4.5 に調整
した。 c) 1-エチル-3-(3-ジメチル-アミノプロピル)-カルボジ
イミド (塩酸塩) 600gを 60ml の水に溶解し、pH を 4.
5 に調整した。 d) 上記のリガンド溶液を CH-セファロース 4B のゲル
縣濁液と混合し、穏やかに撹拌しながら、上記のカルボ
ジイミド溶液を滴下した後に、室温で一晩反応させた。 e) 反応が終了したゲルをガラスフィルター上で pH 4.5
の水で洗浄し、過剰のリガンド及び未反応のカルボジ
イミドを洗除した。これをカラムに充填することにより
PC カラムを作成した。 f) 緩衝液 A (0.02M Tris/HCl, 0.01M CaCl2, 0.15M Na
Cl, 0.01M NaN₃ を含有、pH 7.8) で平衝化した上記の
PC カラムに CRP を高値に含有するイヌ血清(特開昭 62
- 155299 公報に開示されているように、ビーグル犬の
腹腔内に1.6 x 10¹¹ 個/ml のスタフィロコッカス・ア
ウレウスを 2ml 接種して急性炎症を惹起させ、該接種
から 2 日後に全採血して分取した血清) を約 150ml 程
度通過させて、CRP を吸着させた。このカラムを上記
の緩衝液 A で O.D. 値が0.002 以下になるまで充分に
洗浄した。 g) CRP の解離には、緩衝液 B (0.05M Tris/HCl, 0.01M
EDTA・2Na, 0.1M NaCl, 0.01M NaN₃, 0.03M クエン酸ナトリウムを含有、
pH 7.2) を用いた。 h) PC カラムから解離した CRP 画分には、混入物が認
められたので、次ぎにその画分を濃縮し、上記の緩衝液
A で平衝化したセファロース 4B カラムを用いてゲル
濾過を行った。その結果、 3 つのピークが得られたの
で、CRP を含有する最初のピークを採取した。

【００１２】参考例 2 (抗イヌ CRP 血清の調製) 参考例 1 で得た CRP を抗原として、ウサギに免疫さ
せ、その後に採血し、分取することにより抗イヌ CRP
血清を得た。

【００１３】参考例 3 (抗イヌ CRP 血清の調製 - 別
法) 参考例 1 の g) 項で PC カラムから溶出した画分を CR
P 抗原として、ヤギに免疫させ、その後に採血し、分取
することにより抗イヌ CRP 血清を得た。この抗血清を
用いてオクタロニー法による免疫沈降試験を実施した
処、正常血清との間でも、CRP 抗体以外の混入抗体に起
因するものと考えられる非特異的な沈降線が 2 - 3 本
認められた。そこで、健常ビーグル犬の血清蛋白 (CRP
抗原を全く有していないか、その含有量が極めて微量)
を結合させたセファロース 4B カラムを用い、アフィニ
ティー・クロマトグラフィーにて上記の抗イヌ CRP 血
清を処理することにより抗イヌ CRP 抗体以外に存在す
る可能性のある抗体を吸着除去して純化された抗イヌCR
P 血清を得た。この精製抗血清を用いてオクタロニー法
による免疫沈降試験を実施した処、正常血清に関しては
沈降を示さず、CRP 抗原を含有している急性相血清との
み単一な沈降線を示した。従って、この抗血清は特異ヤ
ギ抗イヌ CRP血清と云うことができる。

【００１４】試験例 1 (CRP 抗体の分離、ラテックスへ
の抗体感作及び検出濃度の検討) a) 抗イヌ CRP 抗体の分離参考例 2 で得た特異ヤギ抗イヌ CRP 血清を Protein G
カラムにて処理することにより抗イヌ CRP 抗体として
の IgG 画分を得た。 b) ラテックスへの抗体感作積水化学工業株式会社製の「セキスイラテックス」(粒
径 : 0.12μm) を供試ラテックスとし、上記の a) 項で
得た抗体を、自体周知の方法でラテックスに感作させ
た。 c) 検出可能濃度抗体の感作量を、ラテックス 1mg 当り 5、10、30、5
0、100、200、300、400及び 500μg に設定し、CRP の
検出限界濃度を調べた処、ラテックス 1mg 当り300μg
以上の抗体を感作させれば 4.6μg/ml の CRP を確実
に検出することができ、ラテックス 1mg 当り 500μg
の抗体を感作させれば CRP の検出可能濃度範囲は 4.6
- 300μg/ml となることが判明した。尚、炎症や感染症
に伴って血中に出現する CRP 濃度は高く、100 - 300μ
g/ml又はそれ以上であることが判明しており、従って低
濃度域の CRP は測定できなくても現実には差し支えが
ないこと並びに感作量を多く設定すれば必然的にコスト
高を招くことを考え併せれば、ラテックス 1mg 当りの
抗体感作量は 10 - 500μg 程度、例えば 50 - 100μg
程度で充分であることが判明した。

【００１５】参考例 4 (抗イヌ CRP の分離・精製法 -
別法) 試験例 1 の a) 項で得た IgG 画分 (抗イヌ CRP 抗体)
を CNBr activatedセファロース 4B を吸着させ、これ
をカラムに充填した。このカラムに、CRP 濃度の高いイ
ヌ急性相血清を流し、抗原・抗体反応により CRP をカ
ラムに残留させ、PBC で充分に洗浄した後に、0.14M グ
リシン-塩酸緩衝液 (pH 2.3) を流して CRP を解離させ
ることにより抗イヌ CRP を得た。この方法によれば、
簡単な操作で純度の高い CRP を得ることができる。

【００１６】製造例 (イヌ CRP 検出試薬の調製) 粒径 0.5μm のラテックス粒子を使用し、ラテックス粒
子 1mg 当り 150μgの抗イヌ CRP 抗体 [試験例 1 の
a) 項参照] を感作させ、下記の組成を有するグリシン
緩衝液に 1.8% (W/V) 含有するように添加することによ
りイヌ CRP 検出試薬を調製した。塩化ナトリウム 0.50 (%) ウシ血清アルブミン 2.50 ポリエチレングリコール 1.00 アジ化ナトリウム 0.10

【００１７】試験例 2 a) 全血、血漿及び血清中の CRP 濃度測定健常状態の犬及び炎症性疾患の認められる犬 (計 30
頭) から採血し、この血液の一部を血漿及び血清に分離
し、上記製造例により調製した検出試薬を用いてCRP 濃
度の測定を行ない、全血中の CRP 濃度と血清中の CRP
濃度との相関並びに血漿中の CRP 濃度と血清中の CRP
濃度との相関を調べた。結果は図 1 及び 2 に示されて
いる通りであって、全血中の CRP 濃度と血清中の CRP
濃度との相関は y = 0.489x ＋ 26.948 (r = 0.892) で
あり、又血漿中の CRP 濃度と血清中の CRP 濃度との相
関は y = 0.973x ＋ 6.534 (r =0.994) であり、何れも
良好であった。従って、製造例による検出試薬を用いれ
ば、検体として全血を使用することが可能であり、血液
を血漿と血清に分離する必要性が必ずしもないことが判
る。

【００１８】b) 従来法 (ELISA) との相関性健常状態の犬及び炎症性疾患の認められる犬 (計 290
頭) から採血して血清を分取し、上記製造例により調製
した検出試薬を用いて CRP 濃度の測定を行なった。一
方、上記と同一の血清検体に関して、従来法 [抗イヌ C
RP 血清を用いるELISA (サンドイッチ法)] により CRP
濃度を測定して、両方法による測定値の相関を調べ
た。結果は図３に示されている通りであり、両者の相関
は y = 1.348x ＋ 1.53(r = 0.913) であって、良好で
あった。

【００１９】試験例 3 (炎症等の発生から治癒に至る迄
の CRP 濃度変化) 2 才令の雌性ビ−グル犬 2 頭を使用して卵巣及び子宮
の摘出術を施した後、1頭には皮膚切開部および筋肉内
にペニシリン投与を施して感染を防止し、他の 1頭には
ペニシリン投与を行わず感染を惹起せしめ、創傷部に化
膿を認めた時点(7 日目) でペニシリン投与を開始し、
術前、術後、化膿時及び治癒に至る適宜時点で採血し、
既述の製造例による検出試薬を用いて CRP 濃度を測定
した。その結果、CRP 濃度は術後急速に増加し、化膿時
も増加傾向を示し、施療により速やかに減少するが、そ
の濃度の推移は施術、感染症発生及び治癒に至る状態変
化をほぼ完全に反映するものであることが判明した。

【００２０】

【発明の効果】本発明によるイヌ CRP 検出試薬は、イ
ヌに独自の且つ充分に精製されたイヌCRP 抗体を用いて
おり、検出感度が極めて高いので、採取した血液を何等
処理せずに検体試料とし使用することができる。尚、本
発明による試薬を利用する検出法は、所謂「ラテックス
凝集法」であるために、イヌ CRP を極めて簡便・迅速
に測定することができる。従って、本発明による試薬を
使用すれば、イヌの炎症性疾患の診断、予後判定及び術
後感染症の診断が容易になる以外に、往診時においても
炎症性疾患の診断をその場で行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明によるイヌ CRP 検出試薬を用い且つ検
体試料として全血と、同一血液由来の血清とを用いて、
両検体試料中の CRP 濃度を測定し、測定値の相関を調
べた結果を示すグラフである。

【図２】図１と同様の、但し検体試料として同一血液由
来の血漿と血清とを用いて CRP濃度を測定して測定値の
相関を調べた結果を示すグラフである。

【図３】多数の検体血清試料を対象として、一方では本
発明による検出試薬を使用するラテックス凝集法で、他
方では従来技術による ELISA (サンドイッチ法）で CRP
濃度を測定し、両方法による測定値の相関を調べた結果
を示すグラフである。

フロントページの続き (72)発明者浅井宏基名古屋市東区東外堀町35番地株式会社三和化学研究所内 (72)発明者粟谷寿一名古屋市東区東外堀町35番地株式会社三和化学研究所内 (72)発明者黒野昌庸名古屋市東区東外堀町35番地株式会社三和化学研究所内 (72)発明者澤井喜一名古屋市東区東外堀町35番地株式会社三和化学研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】イヌ血清由来の CRP を抗原として哺乳
動物に感作させることにより得た抗イヌ CRP 血清から
得られた抗イヌ CRP 抗体を球径 0.1 - 1.0μm のラテ
ックス粒子に、ラテックス 1mg 当り 10 - 500μg の割
合で感作させることにより調製された抗体感作ラテック
スと、塩化ナトリウム 0.50 -1.50%、ウシ血清アルブミ
ン 0.50 - 2.50%、ポリエチレングリコール 0.05 -3.00
%、アジ化ナトリウム 0.05 - 0.25% を添加した緩衝液
とを含有していることを特徴とする、イヌ CRP の簡易
検出試薬。
【請求項２】緩衝液がグリシン、トリス及び燐緩衝液
から選択されたものであり、抗体感作ラテックス粒子が
該緩衝液中に 1.0 - 2.5% (W/V) の量割合で存在してい
ることを特徴とする、請求項１に記載のイヌ CRP の簡
易検出試薬。
【請求項３】イヌ血清由来の CRP を抗原として哺乳
動物に感作させ、該感作動物から採血し、得られた抗イ
ヌ CRP 血清を純化して抗イヌ CRP 抗体を得る工程と、
該抗イヌ CRP 抗体を球径 0.1 - 1.0μm のラテックス
粒子に、ラテックス 1mg 当り 10 - 500μg の割合で感
作させることにより抗体感作ラテックスを調製する工程
と、塩化ナトリウム 0.50 - 1.50%、ウシ血清アルブミ
ン0.50 - 2.50%、ポリエチレングリコール 0.05 - 3.00
%、アジ化ナトリウム 0.05- 0.25% を含有する緩衝液を
調製する工程と、該緩衝液中に上記の抗体感作ラテック
ス粒子を添加する工程とを具備していることを特徴とす
る、イヌ CRP の簡易検出試薬の製法。
【請求項４】抗原感作哺乳動物がヤギ及びウサギから
選択されることを特徴とする、請求項３に記載のイヌ C
RP の簡易検出試薬の製法。