ES2908437T3 - Reactivo y procedimiento para la prueba del complejo trombina antitrombina - Google Patents

Reactivo y procedimiento para la prueba del complejo trombina antitrombina Download PDF

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Abstract

Procedimiento para medir complejos TAT en una muestra separada de un organismo vivo, en el que TAT se mide mediante una prueba de aglutinación en látex utilizando un reactivo de la prueba de TAT que comprende: un anticuerpo unido a una partícula de látex que se une a la parte de antitrombina del complejo TAT y reconoce el complejo; y un anticuerpo unido a una partícula de látex que se une a la parte de trombina del complejo TAT y reconoce el complejo; en el que el anticuerpo que se une a la parte de antitrombina del complejo TAT y reconoce el complejo tiene una reactividad a TAT que es 100 o más veces y 50.000 o menos veces mayor que la reactividad a la antitrombina libre; y en el que el reactivo de prueba se ajusta a un pH de 5,8 a 6,6; y en el que la prueba de aglutinación en látex se realiza en condiciones de pH de 5,8 a 6,6.

Description

DESCRIPCIÓN
Reactivo y procedimiento para la prueba del complejo trombina-antitrombina
SECTOR TÉCNICO
La presente invención se refiere a un procedimiento para la prueba del complejo trombina (T)-antitrombina (AT) (TAT) en una muestra biológica.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
El complejo trombina-antitrombina (TAT) es un complejo proteico generado en la sangre durante la coagulación de la sangre y la cuantificación de los complejos TAT en la sangre es útil para el diagnóstico de la trombosis, tal como la coagulación intravascular diseminada (CID). Sin embargo, la abundancia del complejo TAT es aproximadamente 1/100.000 de la abundancia de antitrombina libre y, por lo tanto, la medición del complejo TAT no es fácil.
Entre los ejemplos de un procedimiento de cuantificación de TAT prevalente actualmente se incluyen kits de reactivos que utilizan tecnologías de inmunoensayo enzimático (ELISA), tales como micro TAT Enzygnost® de Siemens AG y equipos de reactivos que utilizan tecnologías de inmunoensayo enzimático quimioluminiscente (CLEIA, chemiluminiscent enzyme immunoassay), tales como TAT de CLEIA sTa CIA® de LSI Medience Co. Sin embargo, cualquiera de ellos son procedimientos de prueba que requieren la separación entre las fases sólida y líquida (separación B/F, Bound/Free separation), que necesitan laboriosas operaciones de lavado a mano o con máquinas especiales.
Los documentos de patente 1-3 y 5 han divulgado sistemas de reactivos para la prueba de TAT basados en la prueba de aglutinación en látex, cualquiera de los cuales tiene como objetivo analizar muestras preparadas mediante la dilución de complejos TAT sintetizados ex vivo con una solución tampón. Sin embargo, no existe ninguna divulgación sobre algún reactivo que permita medir la concentración exacta de complejos TAT en muestras humanas utilizando la prueba de aglutinación en látex. Además, en cualquiera de los procedimientos descritos en estos documentos, el efecto de la reactividad cruzada de un anticuerpo utilizado se evita estableciendo un reactivo de la prueba de TAT basado en la especificidad del mismo o añadiendo un agente aditivo. El documento de patente 4 da a conocer una prueba de TAT mediante un procedimiento sándwich que utiliza un anticuerpo sin reactividad cruzada pero la prueba carece de suficiente sensibilidad para utilización clínica. Además, en ninguno de los documentos se examina cuánto influye el pH durante la reacción de medición en los resultados de la medición cuando se cuantifican los complejos TAT en las muestras. No ha habido ningún intento hasta el momento de permitir que la reacción se produzca a un pH ácido en la prueba de TAT mediante la prueba de inmunoaglutinación en látex. Por consiguiente, existe la necesidad de un reactivo y de un procedimiento para la prueba de complejos TAT en una muestra biológica con alta sensibilidad y alta precisión basado en la prueba de aglutinación en látex, que se caracteriza por operaciones de medición simplificadas.
DOCUMENTOS DEL ESTADO DE LA TÉCNICA
Documentos de patente
Documento de patente 1: Publicación de patente japonesa no examinada No.2001-289850
Documento de patente 2: Publicación de patente japonesa no examinada No. Hei7-238099
Documento de patente 3: Publicación de patente japonesa no examinada No.2002-316999
Documento de patente 4: Publicación de patente japonesa no examinada No. Hei3-48158
Documento de patente 5: Publicación de patente japonesa no examinada No.2001 -228153 CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN PROBLEMAS A RESOLVER POR LA INVENCIÓN
Un objetivo de la presente invención es dar a conocer un procedimiento para la prueba de complejos TAT en una muestra biológica basado en una prueba de aglutinación en látex, que esencialmente no requiere separación B/F y operaciones de lavado, y dar a conocer un procedimiento para seleccionar un anticuerpo para su utilización en la prueba.
La prueba de TAT se ha considerado clínicamente útil con respecto a la mejora de la sensibilidad y la especificidad de los criterios de diagnóstico para CID o con respecto a la disponibilidad de la medición como diagnóstico por exclusión, en la que se observa que la CID es negativa cuando el valor de TAT medido es normal. Sin embargo, el hecho de que un ELISA, que requiere operaciones laboriosas, y un CLEIA, que requiere una máquina especial, sean procedimientos de la prueba de TAT actualmente predominantes es probablemente una razón de la lenta difusión de la prueba.
Por consiguiente, existe la necesidad de un reactivo y un procedimiento para la prueba de complejos TAT en una muestra biológica con alta sensibilidad y alta precisión basado en la prueba de aglutinación en látex, que se caracteriza por operaciones de medición simplificadas.
Además, teniendo en cuenta la importancia clínica de la prueba, esta requiere una sensibilidad de detección que permita mediciones de cantidades de nanogramos, tal como se observa en un CLEIA; sin embargo, es una tarea muy desafiante lograr el mismo nivel de sensibilidad en la prueba de aglutinación en látex que en un CLEIA, en base a su principio de medición, que incluye las propiedades de las partículas utilizadas y similares.
Además, dado que, a diferencia de un ELISA, CLEIA y similares, el prueba de aglutinación en látex no comprende la etapa de separación B/F mediante lavado y similares, es un objetivo en el establecimiento de un reactivo y un procedimiento de prueba superar la reactividad cruzada con sustancias distintas de la diana original de interés, tales como la antitrombina libre y similares.
MEDIOS PARA RESOLVER LOS PROBLEMAS
Los inventores estudiaron intensamente para resolver los problemas descritos anteriormente. En consecuencia, los inventores descubrieron que en una prueba de complejos TAT en una muestra biológica basada en una prueba de aglutinación en látex, se produjo con éxito un reactivo de la prueba de TAT con alta sensibilidad y alta precisión mediante la utilización de un anticuerpo con reactividad cruzada y la utilización de la diferencia en la reacción cruzada del anticuerpo. Es decir, los inventores descubrieron que los complejos TAT en una muestra biológica se midieron con éxito y con precisión, a la vez que se minimizaba la influencia de la antitrombina libre mediante la utilización de un anticuerpo, como uno de los anticuerpos, seleccionado mediante ELISA de inhibición indirecta y con una reactividad a TAT de 100 o más veces mayor que la reactividad a la antitrombina libre. Además, el inventor descubrió que en la prueba de complejos TAT en una muestra biológica basada en una prueba de aglutinación en látex, los complejos TAT en una muestra biológica se midieron con éxito de manera sensible y específica, permitiendo que tuviera lugar la reacción de aglutinación en condiciones ácidas débiles y, de este modo, se completa la presente invención.
Es decir, la presente invención dará a conocer los siguientes puntos.
[1]
Un procedimiento para medir complejos TAT en una muestra separada de un organismo vivo, en el que TAT se mide mediante una prueba de aglutinación en látex utilizando un reactivo de la prueba de TAT que comprende: un anticuerpo unido a una partícula de látex que se une a la parte de antitrombina del complejo TAT y reconoce el complejo; y
un anticuerpo unido a una partícula de látex que se une a la parte de trombina del complejo TAT y reconoce el complejo;
en el que el anticuerpo que se une a la parte de antitrombina del complejo TAT y reconoce el complejo tiene una reactividad a TAT que es 100 o más veces y 50.000 o menos veces mayor que la reactividad a la antitrombina libre;
y
en el que el reactivo de prueba se ajusta a un pH de 5,8 a 6,6;
y en el que la prueba de aglutinación en látex se realiza en condiciones de pH de 5,8 a 6,6.
[2]
El procedimiento, según [1], en el que el reactivo de la prueba de TAT comprende:
un segundo reactivo que comprende
partículas de látex acopladas al anticuerpo que se une a la parte de antitrombina del complejo TAT y reconoce el complejo y
partículas de látex acopladas al anticuerpo que se une a la parte de trombina del complejo TAT y reconoce el complejo; y
un primer reactivo que comprende una solución tampón a un pH de 5,8 a 6,6.
EFECTO VENTAJOSO DE LA INVENCIÓN
De manera convencional, el descubrimiento empírico de la mejor combinación de anticuerpos era una técnica utilizada habitualmente en la selección de anticuerpos para su utilización en procedimientos de pruebas inmunológicas. Es decir, se examinan tantas combinaciones de anticuerpos como sea posible y se selecciona una combinación de anticuerpos que proporcione excelentes resultados en fidelidad, sensibilidad y especificidad para un procedimiento de prueba. Sin embargo, la combinación aleatoria de varios tipos de anticuerpos no siempre puede establecer algún reactivo y/o sistema de medición con las propiedades deseadas en cuanto a sensibilidad y especificidad, sino que puede ser completamente ineficaz. De este modo, en muchos casos, el establecimiento de procedimientos de pruebas inmunológicas ha dependido en gran medida de la especificidad de los anticuerpos y, por lo tanto, incluso los expertos en la materia a menudo han tenido que soportar cargas excesivas. En consecuencia, ha sido difícil producir algún reactivo o establecer algún sistema de medición con fidelidad, sensibilidad y especificidad elevadas.
Según una realización de la presente invención, pueden resolverse los problemas descritos anteriormente. Es decir, se pueden seleccionar de manera eficaz anticuerpos disponibles para la prueba de aglutinación en látex y, de este modo, se puede comercializar oportunamente un reactivo con una fidelidad, sensibilidad y especificidad excelentes. Además, el reactivo para la prueba de aglutinación en látex utilizado en la presente invención puede medir (cuantificar) con precisión una pequeña cantidad de TAT en una muestra biológica, a la vez que evita el efecto de sustancias de base, tales como matrices de plasma. Además, es una ventaja del reactivo que este permita la medición en un autoanalizador de uso general y elimine limitaciones, tales como las etapas de operación manual y la medición en una máquina especial.
Es posible preparar un reactivo que proporcione una sensibilidad y especificidad excelentes manteniendo el pH durante la reacción en el intervalo ácido débil de pH 5,8 a 6,6. Se descubrió que el aumento en el pH tendía a disminuir en el valor del blanco de solución salina, el valor del blanco de plasma y la reactividad a TAT de una manera dependiente del pH. El hecho de que la reactividad disminuía a un pH superior al neutro fue un fenómeno sorprendente descubierto por los inventores. De este modo, ahora es posible proporcionar un reactivo que tenga una reactividad elevada y una especificidad elevada manteniendo el pH durante la reacción en el intervalo ácido débil. DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS
La figura 1 muestra un diagrama esquemático del procedimiento de la prueba de TAT basado en la prueba de aglutinación en látex.
La figura 2 muestra un diagrama esquemático del sistema de reacción mediante ELISA de inhibición indirecta. La figura 3 muestra los resultados de la evaluación de la reactividad del clon TAT-5 a cada antígeno indicado en un ELISA de inhibición indirecta.
La figura 4 muestra los resultados de la evaluación de la reactividad de un reactivo de látex acoplado a cada anticuerpo indicado contra TAT.
La figura 5 muestra los resultados de la evaluación de la reactividad cruzada de un reactivo de látex acoplado a cada anticuerpo indicado contra la antitrombina libre.
La figura 6 muestra el cambio en la absorbancia de referencia observado cuando el pH se cambió de 6,0 a 7,2. La figura 7 muestra el efecto del cambio de pH sobre la reactividad a TAT observado cuando el pH se cambió de 6,0 a 7,2, donde la referencia del plasma se ha restado.
La figura 8 muestra el cambio en la absorbancia de referencia observado cuando el pH se cambió de 5,7 a 6,2 (donde la solución tampón para el primer reactivo es el tampón Bis-Tris).
La figura 9 muestra el cambio en la absorbancia de referencia observado cuando el pH se cambió de 5,7 a 6,2 (donde la solución tampón para el primer reactivo es el tampón MES).
La figura 10 muestra la correlación entre los resultados de la medición en muestras clínicas evaluadas utilizando el reactivo utilizado en la presente invención y utilizando un CLEIA.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
A continuación, en el presente documento, se describe un ejemplo de un reactivo de la prueba de TAT, que está compuesto por un anticuerpo que se une a la parte de antitrombina del complejo TAT y que reconoce el complejo como un primer anticuerpo y un anticuerpo que se une a la parte de trombina del complejo TAT y que reconoce el complejo como un segundo anticuerpo, pero el alcance de la presente invención no se limitará a ello.
Por ejemplo, el reactivo de la prueba de TAT utilizado en la presente invención es un reactivo para un inmunoensayo para medir complejos TAT en una muestra biológica mediante una prueba de aglutinación en látex en un sistema sándwich que utiliza partículas de látex acopladas a cualquiera de dos anticuerpos diferentes contra TAT.
El primer anticuerpo no está limitado, siempre que sea un anticuerpo contra TAT que se una a la parte de antitrombina del complejo TAT y reconozca el complejo, pero, de manera preferente, se utiliza un anticuerpo contra TAT que tenga un nivel bajo de reactividad cruzada con la antitrombina libre porque la abundancia de complejos TAT en la sangre es muy baja en relación con la de la antitrombina libre.
De manera específica, el reactivo de la prueba de TAT utilizado en la presente invención es un reactivo de la prueba de TAT que comprende un primer anticuerpo unido a una partícula de látex que se une a la parte de antitrombina del complejo TAT y reconoce el complejo, y un segundo anticuerpo unido a una partícula de látex que se une a la parte de trombina del complejo TAT y reconoce el complejo, en el que el primer anticuerpo tiene una reactividad a TAT que es 100 o más veces y 50.000 o menos veces mayor que la reactividad a la antitrombina libre. Para los anticuerpos unidos a partículas de látex, los dos anticuerpos diferentes pueden acoplarse a dos tipos diferentes de partículas, respectivamente, o los tipos plurales de anticuerpos pueden acoplarse a un tipo de partícula, o cualquiera de los anticuerpos puede acoplarse a varios tipos de partículas y, a continuación, mezclarse para su utilización. Tal como se demuestra en los ejemplos a continuación, fue un resultado sorprendente que se consiguiera un efecto suficiente mediante un primer anticuerpo que tenía una reactividad a Ta T que era, como mínimo, 100 veces y 50.000 o menos veces mayor que la reactividad a la antitrombina libre. Es decir, la reactividad del primer anticuerpo a TAT puede ser 100 o más veces mayor que la reactividad a la antitrombina libre y es, de manera preferente, 1.000 o más veces mayor y, de manera más preferente, 10.000 o más veces mayor que la reactividad a la antitrombina libre. El límite superior es 50.000 o menos veces. Es mejor un nivel más bajo de reactividad cruzada.
En la preparación del primer anticuerpo descrito anteriormente, se puede utilizar antitrombina libre o TAT para la inmunización en animales que no sean humanos y el anticuerpo resultante se puede utilizar en la presente invención siempre que pueda unirse a la parte de antitrombina del complejo TAT y reconozca el complejo.
Tal como se utiliza en la presente invención, la frase “que se une a la parte de antitrombina” significa que se une a la antitrombina en un complejo (TAT) formado por la asociación de antitrombina libre, que es la más abundante en una muestra, con trombina libre. Por consiguiente, en los casos en que la antitrombina en una conformación conseguida cuando forma el complejo se denomina antitrombina en la estructura de forma compleja y la antitrombina en una conformación conseguida cuando no forma el complejo se denomina antitrombina en la estructura de forma libre (antitrombina libre), la frase “que se une a la parte de antitrombina” significa que se une a la antitrombina en la estructura de forma compleja.
La antitrombina en la estructura de forma libre tiene una conformación diferente de la de la antitrombina en la estructura de forma compleja. La razón es que la antitrombina en la estructura de forma libre cambia su conformación a través de la formación de un complejo asociado con la trombina libre y mantiene la conformación cambiada.
El segundo anticuerpo no está limitado, siempre que sea un anticuerpo que pueda unirse a la parte de trombina del complejo TAT y reconozca el complejo, pero se puede utilizar un anticuerpo que reaccione de manera específica con la trombina. Incluso, a menudo, puede utilizarse un anticuerpo que tenga reactividad cruzada con la trombina libre porque las moléculas de trombina libre son bastante raras en una muestra. Los expertos en la materia podrán seleccionar y utilizar los anticuerpos apropiados.
En la preparación del anticuerpo descrito anteriormente, se puede utilizar trombina libre o TAT para la inmunización en animales que no sean humanos y el anticuerpo resultante se puede utilizar en la presente invención siempre que pueda unirse a la parte de trombina del complejo TAT y reconozca el complejo.
Tal como se utiliza en la presente invención, la frase “que se une a la parte de trombina” significa que se une a la trombina en un complejo (TAT) formado por la asociación de trombina libre, que está presente en una muestra, con antitrombina. Por consiguiente, en los casos en que la trombina en una conformación conseguida cuando forma el complejo se denomina trombina en la estructura de forma compleja y la trombina en una conformación conseguida cuando no forma el complejo se denomina trombina en la estructura de forma libre, la frase “que se une a la parte de trombina” significa que se une a la trombina en la estructura de forma compleja.
Es posible que la trombina en la estructura de forma libre tenga una conformación diferente de la de la trombina en la estructura de forma compleja. La razón es que la trombina en la estructura de forma libre cambia su conformación a través de la formación de un complejo asociado con la antitrombina y mantiene la conformación cambiada.
Se pueden utilizar anticuerpos policlonales o monoclonales para el primer y segundo anticuerpos descritos anteriormente. Los expertos en la materia podrán obtener estos anticuerpos según procedimientos conocidos.
Se pueden utilizar animales, tales como ovejas, caballos, cabras, conejos, ratones, ratas y similares, como animales para ser inmunizados con un inmunógeno para la preparación de un anticuerpo, y se utilizan, de manera preferente, conejos, cabras y similares, especialmente para la preparación de anticuerpos policlonales. Además, los anticuerpos monoclonales se pueden obtener mediante procedimientos conocidos para preparar células de hibridoma, y en ese caso, se utilizan, de manera preferente, ratones, ratas, conejos o similares.
TAT se puede utilizar como un inmunógeno, tal como se ha descrito anteriormente. De manera alternativa, también se puede utilizar como inmunógeno en la presente invención, un anticuerpo producido mediante la utilización de un complejo asociado con vitronectina, VTAT. Además, se pueden utilizar antitrombina y trombina para el primer y segundo anticuerpos, respectivamente.
Para estos inmunógenos, se pueden utilizar complejos TAT purificados a partir de una materia prima, es decir, una muestra recogida de un organismo vivo o complejos TAT sintetizados in vitro mediante la combinación de moléculas de trombina libre y antitrombina libre. Los complejos TAT sintéticos pueden ser, por ejemplo, complejos TAT obtenidos mediante la incubación in vitro de moléculas de trombina y antitrombina disponibles como productos biológicos, mientras que los complejos TAT expresados utilizando un sistema de traducción conocido, tal como los de E. coli, células de mamíferos, células de insectos infectadas con baculovirus y similares, se pueden recuperar, purificar y utilizar como un inmunógeno.
Además, en los casos en los que la inmunidad para reconocer una diferencia en la conformación puede inducirse con un péptido parcial solo, de manera específica, en los casos en los que se desea especificar el sitio de unión del anticuerpo en la producción de un anticuerpo, los péptidos parciales de antitrombina y trombina se pueden utilizar para la producción del primer y segundo anticuerpos, respectivamente. En ese caso, como procedimiento para seleccionar una secuencia de péptido para un antígeno, procedimiento para sintetizar un fragmento de péptido y procedimiento de inmunización, se pueden utilizar procedimientos conocidos.
El procedimiento de prueba basado en la prueba de aglutinación en látex se describirá con referencia a la figura 1. Tal como se muestra en la figura 1, cuando el primer anticuerpo se une a la parte de antitrombina del complejo TAT y el segundo anticuerpo se une a la parte de trombina del complejo TAT, se produce la aglutinación de las partículas de látex y se permite la determinación de la concentración de TAT en base a la absorbancia medida en ese momento.
Se considera que la proporción de TAT con respecto a antitrombina libre que no forma TAT ambas presentes en un organismo vivo varía entre 1:60.000 y 1:110.000 en base al intervalo medido en sujetos normales y, en general, se considera que es aproximadamente de 1:100.000. Además, aunque se sabe que la proporción puede cambiar en pacientes con sepsis y/o enfermedades hepáticas, se considera que la proporción es de aproximadamente 1:50.000, incluso en los casos en que la cantidad de antitrombina libre es relativamente baja. De este modo, si el primer anticuerpo también tiene reactividad a la antitrombina libre, la cuantificación de TAT resultará difícil. Entonces, se debe utilizar un anticuerpo que tenga un nivel bajo de reactividad a la antitrombina libre para la cuantificación de TAT. Aunque se considera que la reactividad del anticuerpo a TAT debe ser de 50.000 a 100.000 o más veces mayor que la reactividad a la antitrombina libre en la base de cálculo, se descubrió en la presente invención, tal como se demuestra en los ejemplos a continuación, que la cuantificación de TAT es totalmente posible mediante la utilización de un anticuerpo como primer anticuerpo, en el que el anticuerpo tiene una reactividad a TAT que es 100 o más veces y 50.000 o menos veces mayor que la reactividad a la antitrombina libre.
Tal como se utiliza en la presente invención, la frase “una reactividad a TAT que es 100 o más veces mayor que la reactividad a la antitrombina libre” se refiere a un caso en el que la proporción de afinidades por antígenos individuales (TAT y antitrombina libre) es 100 o más, un caso en el que la proporción de las cantidades de antígenos requeridas para mostrar una cierta tasa de inhibición en la medición por medio de ELISA de inhibición indirecta descrita a continuación, es 100 o más, y similares.
Se describirá el caso en el que un anticuerpo que tiene una reactividad a TAT que es 100 o más veces mayor que la reactividad a la antitrombina libre se examina o criba mediante ELISA de inhibición indirecta.
En primer lugar, se prepara un anticuerpo que se une a la parte de antitrombina del complejo TAT y que reconoce el complejo (un anticuerpo candidato para el primer anticuerpo). Dicho anticuerpo como anticuerpo dirigido contra un sitio de unión en la parte de antitrombina del complejo TAT y que reconoce el complejo puede seleccionarse entre anticuerpos obtenidos previamente mediante un procedimiento, tal como el procedimiento descrito a continuación para preparar anticuerpos monoclonales mediante células de hibridoma. Por supuesto, un anticuerpo previamente conocido dirigido contra un sitio de unión en la parte de antitrombina del complejo TAT y que reconoce el complejo también se utilizaría en el sistema de evaluación a continuación.
Es decir, se deja que un anticuerpo candidato reaccione con una solución que contiene TAT o un antígeno capaz de inhibir la reacción con TAT en una cantidad determinada (por ejemplo, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 |xg/ml) durante un período de tiempo suficiente (por ejemplo, 12 horas). A continuación, se deja que el líquido de reacción reaccione con un sustrato inmovilizado con TAT durante un período de tiempo determinado. Posteriormente, después del lavado, se utiliza un anticuerpo secundario marcado para medir la cantidad de anticuerpo unido al TAT en el sustrato (el porcentaje de anticuerpo residual).
Por ejemplo, al principio, se inmoviliza una cantidad determinada de complejos TAT sobre un sustrato, tal como una placa, en una condición en la que no está presente ningún antígeno que inhiba la reacción con el anticuerpo correspondiente. Los expertos en la materia podrán determinar de manera apropiada la cantidad del antígeno (TAT) inmovilizado sobre un sustrato en vista de las relaciones entre la cantidad del antígeno utilizado y el tipo de anticuerpo evaluado.
Se deja que el anticuerpo candidato descrito anteriormente para el primer anticuerpo en cada concentración (por ejemplo, de 0,04 a 1 |xg/ml) reaccione con el sustrato inmovilizado con TAT descrito anteriormente durante un período de tiempo determinado en una condición en la que no está presente ningún antígeno que inhiba la reacción con el anticuerpo correspondiente. Posteriormente, después del lavado, se utiliza un anticuerpo secundario marcado (contra IgG de ratón marcada con HRP) para medir la cantidad de anticuerpo unido al TAT en el sustrato. Se determina la concentración del anticuerpo que produce una absorbancia de aproximadamente 1,0 (correspondiente a 1.000 según el procedimiento descrito en la tabla 1). Esta concentración de anticuerpo se puede considerar como una concentración del anticuerpo en la inhibición con el antígeno (tabla 3; concentración durante la reacción [|xg/ml]). A continuación, se deja que el anticuerpo candidato en una concentración determinada mediante el procedimiento descrito anteriormente reaccione con una solución que contiene TAT o antitrombina libre en una cantidad determinada (por ejemplo, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 |xg/ml) durante un período de tiempo suficiente (por ejemplo, 12 horas). A continuación, se deja que el líquido de reacción reaccione con un sustrato inmovilizado con t At durante un período de tiempo determinado. Posteriormente, después del lavado, se utiliza un anticuerpo secundario marcado (contra IgG de ratón marcada con HRP) para medir la cantidad de anticuerpo unido al TAT en el sustrato (el porcentaje de anticuerpo residual).
Adicionalmente, el porcentaje de anticuerpo residual se puede calcular en relación con el valor de detección obtenido para el caso en el que no se realice la absorción con el antígeno, que se considera como el 100 %.
En los casos en los que la reactividad del anticuerpo a la antitrombina libre es elevada, el anticuerpo capaz de unirse a TAT disminuye en cantidad y, por tanto, el anticuerpo detectado por el anticuerpo secundario marcado disminuye en cantidad (disminuye el porcentaje de anticuerpo residual), mientras que en los casos en los que la reactividad del anticuerpo a la antitrombina libre es baja, una mayor cantidad del anticuerpo sigue siendo capaz de unirse a TAT y, por tanto, el anticuerpo detectado por el anticuerpo secundario marcado aumenta en cantidad (aumenta el porcentaje de anticuerpo residual).
Este porcentaje de anticuerpo residual se comparará con un porcentaje de anticuerpo residual obtenido cuando el anticuerpo se hace reaccionar primero con TAT (la reacción de inhibición se realiza con TAT) y, a continuación, el líquido de reacción se hace reaccionar con el TAT inmovilizado.
A continuación, en los casos en los que, por ejemplo, se obtiene un porcentaje de anticuerpo residual del 50 % en la reacción de inhibición mediante la adición de antitrombina libre hasta una concentración de 50 |xg/ml, la cantidad de TAT requerida para conseguir el mismo porcentaje de anticuerpo residual se calcula basándose en el resultado descrito anteriormente de la inhibición con TAT. En los casos en los que la cantidad de antígeno inhibidor TAT requerida para conseguir un porcentaje de anticuerpo residual del 50 % es inferior a 0,50 |xg/ml cuando la inhibición se realiza con TAT, la reactividad a TAT puede considerarse que es 100 o más veces mayor que la reactividad a la antitrombina libre.
El anticuerpo así seleccionado se puede seleccionar como un primer anticuerpo. Adicionalmente, en los casos en que el primer anticuerpo sea un anticuerpo monoclonal, su afinidad (Kd) por TAT es, de manera preferente, igual o menor que 10-8. Sin embargo, los expertos en la materia podrán seleccionar de manera apropiada un anticuerpo adecuado para un reactivo de látex en base al valor de afinidad por TAT.
Entre los ejemplos del anticuerpo utilizado en la presente invención se incluyen fragmentos de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo son fragmentos de un anticuerpo deseado, que, además, tienen la misma reactividad que la del anticuerpo original. Entre los ejemplos de un fragmento de anticuerpo que se puede utilizar en la presente invención se incluyen fragmentos, tales como Fab, Fab', F(ab')2 o Fv. Cualquiera de estos fragmentos puede obtenerse, por ejemplo, mediante digestión de un anticuerpo con una enzima de degradación de proteínas, según un procedimiento convencional, seguida de separación y purificación, según procedimientos convencionales para la separación y purificación de proteínas. Estos fragmentos pueden inmovilizarse directamente sobre partículas de látex y utilizarse, mientras que los fragmentos pueden prepararse como fragmentos Fab' o F(ab')2 e inmovilizarse sobre partículas de látex. Los fragmentos Fab' y F(ab')2 son más preferentes cuando se considera evitar una reacción no específica de un anticuerpo a fragmentos Fc.
Un anticuerpo utilizado en la presente invención se puede obtener mediante la producción, en primer lugar, de anticuerpos contra TAT (anticuerpos candidatos) mediante un procedimiento de producción de anticuerpos monoclonales con células de hibridoma y similares, y, a continuación, la selección de un anticuerpo que muestra un nivel bajo de reactividad cruzada con la antitrombina libre, de manera específica, un anticuerpo que tiene una reactividad a TAT que es 100 o más veces mayor que la reactividad a la antitrombina libre, entre los anticuerpos contra TAT (anticuerpos candidatos), según los procedimientos y criterios descritos anteriormente.
Los anticuerpos candidatos se pueden obtener, por ejemplo, mediante un procedimiento de producción de anticuerpos monoclonales con células de hibridoma producidas mediante un procedimiento de fusión celular conocido. Las células productoras de anticuerpos se pueden seleccionar de animales, excepto seres humanos, por ejemplo, ratones, ratas, cobayas y similares. Las células de hibridoma y los anticuerpos monoclonales se pueden preparar, según procedimientos convencionales, por ejemplo, procedimientos descritos en “Zoku-Seikagaku Jikken Koza” (Curso de capacitación para experimentos bioquímicos; The Japanese Biochemical Society, ed.) o “Men-eki Seikagaku Kenkyu-hou” (Procedimientos de investigación inmunobioquímicos; The Japanese Biochemical Society, ed.).
El segundo anticuerpo no está particularmente limitado, siempre que sea un anticuerpo que se una a la parte de trombina del complejo TAT y reconozca el complejo. En los casos en los que sea un anticuerpo monoclonal, su afinidad (Kd) por TAT es, de manera preferente, igual o menor que 10-8. Sin embargo, los expertos en la materia podrán seleccionar de manera apropiada un anticuerpo adecuado para un reactivo de látex en base al valor de afinidad por TAT. Para el procedimiento para seleccionar el anticuerpo, se pueden utilizar anticuerpos producidos de manera similar al primer anticuerpo.
La combinación del primer anticuerpo y del segundo anticuerpo no está particularmente limitada, siempre que permita la prueba de TAT mediante la prueba de aglutinación en látex, pero se selecciona, de manera preferente, una combinación de los anticuerpos que se vea mínimamente afectada por las matrices contenidas en una muestra biológica, tal como plasma (base).
La sensibilidad requerida para el reactivo de la prueba de TAT debe ser suficiente para medir el valor de referencia con el que pueden distinguirse claramente los sujetos normales de los pacientes, o una concentración 2 veces mayor que el valor de referencia y, por lo tanto, el reactivo utilizado en la presente invención es, de manera preferente, un reactivo capaz de cuantificar complejos TAT a una concentración de 10 a 15 ng/ml, de manera más preferente, un reactivo capaz de cuantificar complejos TAT a una concentración de 3 a 4 ng/ml y, de manera más preferente, un reactivo capaz de cuantificar complejos TAT, incluso a una concentración de aproximadamente 1 ng/ml, en una muestra biológica.
Las partículas de látex a las que se acoplan el primer y segundo anticuerpos descritos anteriormente no están particularmente limitadas, siempre que puedan utilizarse en la reacción de aglutinación en látex, pero tienen un tamaño de partícula promedio, de manera preferente, de 0,05 pm a 0,5 pm y, de manera más preferente, de 0,2 a 0,4 pm.
Para utilizar las partículas de látex, se puede utilizar solamente un tipo de partículas de látex o múltiples tipos de partículas de látex. Por ejemplo, se puede utilizar una combinación de partículas de látex con diferentes tamaños de partículas. Debido a que en la práctica es difícil fabricar partículas de látex con un solo tamaño de partícula, cualquier partícula de látex se especifica con el tamaño de partícula promedio de todas las partículas. Por consiguiente, en referencia a un tamaño de partícula promedio de 0,05 pm a 0,5 pm, también puede incluirse en la presente invención un caso que comprenda partículas de látex fuera de este intervalo. El hecho de que las partículas de látex con diferentes tamaños de partícula se incluyan en una partícula de látex determinada está dentro del sentido común de los expertos en la materia y estos serán capaces de establecer un reactivo de látex mediante la utilización de una solución que contiene un grupo de partículas que tienen una distribución de tamaño no muy heterogénea.
Adicionalmente, el tamaño de partícula promedio se puede medir según un procedimiento conocido y, por ejemplo, se puede calcular en base al análisis de imágenes utilizando un sistema de microscopio electrónico de transmisión. La partícula de látex utilizada en la presente invención no está particularmente limitada, siempre que se utilice habitualmente en la técnica, pero entre los ejemplos de la partícula de látex se incluyen partículas fabricadas de homopolímeros (por ejemplo, poliestireno, polímeros de metacrilato, polímeros de acrilato y similares) compuestos por monómeros de vinilo polimerizados, tales como estireno, cloruro de vinilo, acrilonitrilo, acetato de vinilo, acrilato, metacrilato y similares; partículas fabricadas de copolímeros de butadieno (por ejemplo, copolímero de estireno-butadieno, copolímero de metacrilato de metilo-butadieno, copolímero de acrilonitrilo-butadieno y similares); y partículas fabricadas de otros copolímeros (por ejemplo, copolímero de estireno-sulfonato de estireno, copolímeros de metacrilato, copolímeros de acrilato, copolímeros de cloruro de vinilo-acrilato y similares). Entre los ejemplos de partículas de látex se incluyen partículas que portan un grupo carboxilo, un grupo amina primaria, un grupo carbamoílo (-CONH2), un grupo hidroxilo, un grupo aldehído, o similares, como grupo funcional y que tienen un cuerpo base compuesto por cualquiera de los materiales pariculados orgánicos descritos anteriormente.
Para el procedimiento para inmovilizar los anticuerpos sobre partículas de látex, los anticuerpos se pueden inmovilizar según un procedimiento conocido y se pueden inmovilizar mediante tratamientos utilizados habitualmente en la técnica, tales como, por ejemplo, la suspensión del anticuerpo y de las partículas de látex en una solución tampón, permitiéndoles reaccionar a 25 °C durante una hora, seguida de centrifugación, tratamiento de bloqueo y similares. Además, se puede seleccionar un procedimiento para inmovilizar los anticuerpos sobre partículas de látex mediante enlace químico o a través de interacción biotina-avidina.
El acoplamiento de los anticuerpos a las partículas de látex se realiza en condiciones en las que los anticuerpos pueden mantener la reactividad y la especificidad para TAT descritas anteriormente.
Para facilitar la preparación de reactivos preferentes, se puede preparar un líquido de látex inmovilizado con anticuerpos para cada anticuerpo como una primera partícula de látex y una segunda partícula de látex sobre las que se han inmovilizado el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo, respectivamente, mientras que los reactivos se pueden preparar inmovilizando el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo sobre un único tipo de partículas de látex. Los expertos en la materia podrán diseñar de manera apropiada cómo inmovilizar los anticuerpos sobre partículas de látex y preparar reactivos.
El reactivo utilizado en la presente invención puede ser un sistema de un solo reactivo o un sistema de dos reactivos. Si el reactivo utilizado en la presente invención es un sistema de un solo reactivo, los complejos TAT en una muestra biológica se pueden medir añadiendo una suspensión de partículas de látex que portan los anticuerpos inmovilizados a la muestra biológica y provocando una reacción antígeno-anticuerpo. Si el reactivo utilizado en la presente invención es un sistema de dos reactivos, los complejos TAT en una muestra biológica se pueden medir añadiendo el primer reactivo compuesto principalmente por ingredientes tampón a la muestra biológica y, a continuación, añadiendo adicionalmente el segundo reactivo que contiene partículas de látex sobre las que se han inmovilizado los anticuerpos, y provocando una reacción antígeno-anticuerpo.
El grado de aglutinación de las partículas de látex se puede medir, por ejemplo, utilizando la absorbancia, mientras que la concentración de complejos TAT en una muestra se puede cuantificar buscando una concentración correspondiente al grado de aglutinación en una curva patrón de la referencia obtenida previamente. Adicionalmente, la medición de la absorbancia se puede realizar a una longitud de onda de medición normalmente de 340 nm a 1.000 nm y, de manera preferente, de 500 nm a 900 nm. Cuando la reacción de aglutinación en látex se analiza mediante fotometría, la cinética de aglutinación o la variación de la aglutinación durante un intervalo de tiempo fijo durante el desarrollo de la reacción de aglutinación en látex se pueden determinar mediante fotometría. Por ejemplo, cuando se realiza la medición de la absorbancia, la cinética de los cambios de absorbancia o la variación de la absorbancia durante un intervalo de tiempo fijo dentro del período de 30 segundos a 5 minutos después del inicio de la reacción de aglutinación en látex se pueden determinar mediante fotometría. La temperatura de reacción es, de manera preferente, de 10 °C a 50 °C y, de manera más preferente, de 20 °C a 40 °C. El tiempo de reacción se puede determinar de manera apropiada y la medición se puede realizar, por ejemplo, dentro de un tiempo de reacción de 10 a 15 minutos en un autoanalizador de uso general. Adicionalmente, los expertos en la materia podrán determinar de manera apropiada la temperatura de reacción, el tiempo de reacción, la longitud de onda de medición, el tiempo de medición, la composición del reactivo, la concentración de látex, la concentración de un anticuerpo para inmovilizar sobre partículas de látex y las concentraciones de diversos agentes aditivos en el análisis utilizando un instrumento óptico o un autoanalizador de uso general.
La concentración de partículas de látex utilizada en la presente invención no está particularmente limitada, siempre que sea una concentración aplicable a un reactivo para un prueba inmunológica basada en la prueba de aglutinación en látex, pero la concentración de partículas de látex durante la reacción requerida para la prueba de TAT es, de manera preferente, del 0,005 % (p/v) al 0,2 % (p/v) y, de manera más preferente, del 0,01 % (p/v) al 0,1 % (p/v).
La muestra de prueba aplicable al reactivo utilizado en la presente invención no está particularmente limitada, siempre que sea una muestra de prueba que contenga potencialmente complejos TAT, pero, de manera preferente, es una muestra biológica. Entre los ejemplos de la muestra biológica se pueden incluir células cultivadas, pero también las que se utilizan, de manera preferente, en la medición con suero o plasma. La muestra biológica es, de manera preferente, una muestra derivada de cualquier animal mamífero y, de manera más preferente, una muestra derivada de un ser humano.
El reactivo utilizado en la presente invención puede comprender, además, adicionalmente a las partículas de látex sobre las que se han inmovilizado los anticuerpos, excipientes que se pueden añadir a un reactivo para una prueba inmunológica basada en la prueba de aglutinación en látex, tal como, por ejemplo, un tampón, un promotor de la aglutinación, un supresor de unión no específica, un agente sensibilizante y similares. Entre los ejemplos del agente sensibilizante que se puede añadir al reactivo utilizado en la presente invención se incluyen alginato de sodio, alginato de propilenglicol y similares. Además, se utiliza, de manera preferente, un polímero o proteína soluble en agua como promotor de la aglutinación, que se puede añadir al reactivo utilizado en la presente invención. Entre los ejemplos del promotor de la aglutinación se incluyen polímeros solubles en agua, tales como dextrano y sulfato de dextrano, alcohol polivinílico, polietilenglicol, polivinilpirrolidona y similares; albúminas, tales como albúmina de suero bovino; y globulinas, tales como y-globulina.
Además, se puede añadir un tercer anticuerpo para su utilización. Para la utilización de un tercer anticuerpo, se utiliza como tercer anticuerpo, de manera preferente, un anticuerpo que tenga una velocidad de reacción diferente en los casos en los que, por ejemplo, se desea que el intervalo medible del reactivo de la prueba de TAT cubra un amplio intervalo desde una concentración baja hasta una concentración elevada.
Con respecto al tampón descrito anteriormente, la solución tampón tiene una capacidad tampón a un pH, de manera preferente, de 5,8 a 6,6, de manera más preferente, de 6,0 a 6,4, de manera más preferente, de 6,1 a 6,3, de manera particularmente preferente, de 6,15 a 6,25 y, de la manera más preferente, de aproximadamente 6,2. En el caso de un sistema de un solo reactivo, el pH del reactivo debe ajustarse entre 5,8 y 6,6, mientras que en el caso de un sistema de dos reactivos, los reactivos deben estar compuestos, de manera que el pH alcance entre 5,8 y 6,6 cuando se mezclen. Por ejemplo, en un aspecto en el que el sistema de reactivos comprende un primer reactivo compuesto principalmente por ingredientes tampón y un segundo reactivo que contiene partículas de látex sobre las que se han inmovilizado los anticuerpos, el pH del primer reactivo se ajusta entre 5,8 y 6,6 y el pH de la mezcla alcanza de 5,8 a 6,6 cuando se mezclan ambos reactivos.
El pH se puede ajustar mediante un agente modificador del pH y se ajusta, de manera preferente, mediante una solución tampón. Se utiliza, de manera preferente, una solución tampón, tal como tampón Tris, tampón Bis-Tris, tampón fosfato o tampón de Good y la concentración de la solución tampón durante la reacción es, de manera preferente, de 10 a 500 mmol/l y, de manera más preferente, de 20 a 200 mmol/l.
Adicionalmente, en los casos en los que el pH de una mezcla obtenida cuando se mezcla una muestra de sangre con el reactivo está fuera del intervalo de 5,8 a 6,6, el pH puede ajustarse adicionalmente mediante un agente modificador del pH y similares.
Entre los ejemplos del supresor de unión no específica que se puede añadir al reactivo utilizado en la presente invención se incluyen anticuerpos o receptores contra sustancias responsables de una reacción no específica; soluciones tampón, tales como tampón Tris, tampón fosfato, tampón glicina, tampón borato, tampón citrato, tampón acetato o tampón de Good; agentes quelantes, tales como EDTA, CyDTA, DTPA, EGTA, NTA y NTP; sales, tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, sulfato de sodio, sulfato de calcio, sulfato de magnesio, carbonato de calcio y carbonato de sodio; y surfactantes no iónicos, tales como dietanolamidas de ácidos grasos, polioxietilen alquil éteres, polioxietilen alquilfenil éteres, ésteres de sorbitán de ácidos grasos, poliglucósidos de alquilo, alquil monogliceril éteres, ésteres de ácidos grasos de polioxietilen sorbitán, alcanolamidas de ácidos grasos y glicósidos de alquilo.
El reactivo utilizado en la presente invención puede incluir complejos TAT que se pueden utilizar como sustancia patrón. Los complejos TAT pueden ser complejos TAT purificados de un organismo vivo o sintetizados mediante tecnología de ADN recombinante y similares. Los complejos TAT sintéticos se pueden obtener, por ejemplo, mediante la incubación de moléculas de trombina y antitrombina in vitro disponibles como productos biológicos. Además, los complejos TAT también se pueden sintetizar mediante la recuperación y purificación y mezcla de los componentes que se han expresado utilizando un sistema de traducción conocido en E. col, células de mamífero, células de insecto infectadas con baculovirus y similares.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Preparación de complejos TAT sintéticos
Una formulación de trombina humana disponible en el mercado (fabricada por Japan Blood Products Organization) y una formulación de antitrombina disponible en el mercado (fabricada por Japan Blood Products Organization) se diluyeron por separado con PBS (producido disolviendo polvo de PBS (-) de Dulbecco “Nissui (fabricado por Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.)” hasta una concentración de 9,6 g/l) y esas diluciones se mezclaron en una proporción molar de 1:3 y, a continuación, se dejaron reaccionar a 37 °C durante 30 minutos. Después de los 30 minutos, se añadió DFP (fluorofosfato de diisopropilo, fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) hasta una concentración de 0,75 mM para detener la reacción.
Debido a que el reactivo obtenido contenía trombina y antitrombina sin reaccionar, se realizó la purificación con un Hiload 26/60 Superdex 200 HR (fabricado por GE Healthcare) equilibrado previamente con tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) que contenía NaCl 500 mM.
Las fracciones de TAT se recuperaron después de la identificación mediante SDS-PAGE. La fracción de TAT obtenida se diluyó con solución salina que contenía el 0,5 % de BSA y se analizó utilizando un reactivo de CLEIA (TAT de CLEIA STACIA®, fabricado por LSI Medience Co.) para determinar la concentración. Los complejos TAT así obtenidos se utilizaron como complejos TAT sintéticos.
Ejemplo 2: Preparación de un anticuerpo contra TAT
Se llevó a cabo un procedimiento de fusión celular, según el procedimiento descrito en Tamie Ando y Tatsuo Iwasaki, “Monoclonal Antibody/Hybridoma and ELISA” (Kodansha Ltd.).
Se mezcló el complejo TAT sintético preparado en el ejemplo 1 en una cantidad de 50 |xg con adyuvante completo de Freund (fabricado por DIFCO) para proporcionar un antígeno administrado.
El antígeno se administró a ratones BALB/c (hembra, de cuatro semanas de vida) tres veces con un intervalo de dos semanas y se inyectaron 25 |xg del antígeno, es decir, la mitad de la cantidad del antígeno original administrado por vía intravenosa en la cuarta administración.
Una semana más tarde, se aislaron linfocitos del bazo y se mezclaron con células de mieloma P3x63-Ag.8 y, a continuación, se fusionaron utilizando polietilenglicol (PEG 4000, fabricado por Merck).
Las células de hibridoma se seleccionaron en medio de selección HAT y, a continuación, se cribaron una semana más tarde para buscar clones de hibridoma que produjeran un anticuerpo de interés sobre la base de la actividad de unión para el complejo TAT sintético. Es decir, el complejo TAT sintético se diluyó individualmente con tampón carbonato 0,05 M (pH 9,5) hasta una concentración de 0,2 pg/ml y se añadió a 50 pl/pocillo a una inmunoplaca (Maxisorp, fabricada por NUNC). Después de la reacción a 4 °C durante una noche, cada pocillo se lavó tres veces con PBS que contenía el 0,05 % de Tween-20 y, a continuación, se bloqueó añadiendo al mismo 100 pl de PBS que contenía el 1,0 % de BSA.
Posteriormente, se añadió el sobrenadante del cultivo en un volumen de 50 pl a cada pocillo y se dejó reaccionar a 37 °C durante una hora y, a continuación, cada pocillo se lavó tres veces con PBS que contenía el 0,05 % de Tween-20. Se diluyó un anticuerpo contra inmunoglobulina de ratón marcado con peroxidasa (fabricado por Dako) 1000 veces en PBS que contenía el 0,05 % de Tween-20 y, a continuación, se añadió en un volumen de 50 pl a cada pocillo.
Después de la reacción a 37 °C durante una hora, cada pocillo se lavó cinco veces de forma similar y, a continuación, se añadió una solución de o-fenilendiamina (fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) en un volumen de 50 pl a cada pocillo. Después de la reacción a temperatura ambiente durante de 5 a 10 minutos, se detuvo la reacción con ácido sulfúrico 2 N.
La absorbancia se midió a 492 nm en un espectrofotómetro de placa (EL312e, fabricado por BioTek Instruments, Inc.). Se seleccionaron las células productoras de anticuerpos que mostraban una buena reactividad al complejo TAT sintético y, a continuación, se clonaron mediante dilución limitante. Diez días más tarde, esas células se cribaron adicionalmente para obtener clones de hibridoma productores de anticuerpos que reaccionaban con el complejo TAT sintético.
Ejemplo 3: Preparación del anticuerpo contra la trombina
Los anticuerpos contra la trombina se obtuvieron mediante un procedimiento similar al del ejemplo 2 utilizando trombina como antígeno inmunizante. Se seleccionaron anticuerpos que reaccionaban de manera específica con la trombina y se utilizó uno de esos clones como anticuerpo contra la trombina (T-1).
Ejemplo 4: Evaluación de la especificidad del anticuerpo mediante ELISA de inhibición indirecta
Se evaluó la reactividad de cada anticuerpo mediante ELISA de inhibición indirecta. En la figura 2 se muestra un modelo esquemático del sistema de reacción mediante ELISA de inhibición indirecta.
Se mezcló cada candidato a anticuerpo que reconocía TAT (anticuerpo contra TAT) para ser evaluado a una concentración de 0,04 a 0,4 pg/ml y se incubó con cada antígeno inhibidor (protrombina (fabricada por Enzyme Research Laboratories), trombina, antitrombina, complejo TAT sintético). Los anticuerpos candidatos, que incluían un grupo de anticuerpos inhibidos, se utilizaron como anticuerpos primarios y se les dejó unirse a complejos TAT sintéticos inmovilizados en placas de 96 pocillos. Además, se utilizó un anticuerpo contra inmunoglobulina de ratón marcado con peroxidasa (fabricado por Dako) como anticuerpo secundario y se le dejó unirse a las placas y, a continuación, se añadió un sustrato cromógeno a las placas para medir la absorbancia. Además, el porcentaje de anticuerpo residual en cada anticuerpo candidato se calculó en base a la velocidad del cambio de color.
Para un anticuerpo particular (TAT-5), los valores de absorbancia obtenidos cuando se utilizó cada antígeno inhibidor se presentaron en la tabla 1, mientras que las proporciones de anticuerpo residual calculadas a partir de los valores de absorbancia se presentaron en la tabla 2.
Por ejemplo, si la concentración del antígeno inhibidor TAT es de 10 pg/ml, el porcentaje de anticuerpo residual será de 285/1.066 x 100 = 26,7 (%). Se calculó el porcentaje de anticuerpo residual en cada anticuerpo para cada concentración de cada antígeno. Adicionalmente, en las tablas, Pro-T representa protrombina, T representa trombina y AT representa antitrombina.
T l 1. R l m i i n rir ELI A inhi i i n in ir
Figure imgf000011_0001
Tabla 2. Porcentae de anticuer o residual
Figure imgf000012_0002
Además, se calculó la cantidad del antígeno TAT requerida para conseguir un índice de inhibición correspondiente al porcentaje de anticuerpo residual obtenido mediante la inhibición con antitrombina a 50 |xg/ml y se comparó con la cantidad de antitrombina para obtener la diferencia (aumento en número de veces) en la reactividad de cada anticuerpo a TAT con respecto a la antitrombina. Una mayor diferencia en la reactividad de un anticuerpo indica una mayor especificidad del anticuerpo para TAT en relación con la especificidad para antitrombina. El cálculo se realizó en base a la curva de inhibición por TAT (el logaritmo de la concentración del antígeno inhibidor añadido frente al porcentaje de anticuerpo residual) dibujada con la función “spline”.
Por ejemplo, en el caso de TAT-5, el porcentaje de anticuerpo residual obtenido con antitrombina a 50 |xg/ml es del 74,0 %, mientras que la cantidad del antígeno TAT requerida para conseguir un porcentaje de anticuerpo residual similar a ese porcentaje es de 1,144 |xg/ml. Es decir, la diferencia de reactividad resulta ser de 50/1,144 = 44 veces (figura 3).
Además, el aumento en número de veces descrito anteriormente se calculó para 27 clones de anticuerpos. La diferencia (aumento en número de veces) en la cantidad de complejos TAT añadidos con respecto a la de antitrombina añadida fue de 100 o más en trece de ellos, 1000 o más en siete de ellos y 10000 o más en dos de ellos. Cinco de esos anticuerpos se presentan en la tabla 3.
Tabla 3
Figure imgf000012_0001
Ejemplo 5: Evaluación de la reactividad a TAT en reactivos para la prueba de aglutinación en látex
Los anticuerpos contra la parte de antitrombina evaluados mediante ELISA de inhibición indirecta en el ejemplo 4 (TAT-1, TAT-2, TAT-3, Ta T-4 y TAT-5) y el anticuerpo contra la parte de trombina obtenido en el ejemplo 3 (T-1) se utilizaron en la sensibilización de partículas de látex y las partículas resultantes se utilizaron para la evaluación de la reactividad.
Las partículas de látex se sensibilizaron con cada anticuerpo dejando que las partículas de látex de poliestireno con un tamaño de 0,32 |o.m adsorbieran el anticuerpo, bloqueándolas con una solución de BSA al 0,3 %, a continuación, centrifugando y lavándolas con una solución al 0,05 % de azida sódica (fabricada por Kishida Chemical Co., Ltd.) y, a continuación, dispersándolas nuevamente en una solución de azida sódica al 0,05 %.
Se prepararon reactivos que contenían las partículas de látex producidas anteriormente y sensibilizadas con cada anticuerpo para la evaluación de la reactividad a TAT. Las composiciones de los reactivos utilizados son las indicadas a continuación. Para el primer reactivo, se utilizó una composición de Bis-Tris 100 mM (fabricado por Dojindo Laboratories), pH 6,0, NaCl 500 mM y BSA al 0,15 %. Para el segundo reactivo, las partículas sensibilizadas con cada anticuerpo se diluyeron con azida sódica al 0,05 % hasta una absorbancia de 1,0 a una longitud de onda de 700 nm y se mezclaron para su utilización.
Dado que el suero contiene una gran cantidad de complejos TAT, el suero se diluyó con solución salina que contenía el 0,5 % de BSA y se analizó con el reactivo de CLEIA para determinar la concentración de complejos TAT y la dilución se utilizó como la fracción sérica de TAT. La fracción sérica de TAT analizada se diluyó con plasma agrupado (fabricado por VitroLogic) hasta una concentración de TAT de 1000 ng/ml y la dilución resultante se utilizó como muestra de medición.
Se utilizó el analizador 7170S (fabricado por Hitachi High-Technologies Co.) como aparato de medición. Los parámetros de medición se establecieron en 12 p.l de volumen de muestra, 90 p.l del primer reactivo, 90 p.l del segundo reactivo, 570 nm de longitud de onda principal y 800 nm de longitud de onda secundaria. A la absorbancia en el punto de medición fotométrica 34 se le restó la absorbancia en el punto de medición fotométrica 20 y, a continuación, se multiplicó por 10000 para determinar AAbs y, de este modo, se completó la medición.
Los resultados se muestran en la figura 4. En cualquiera de los cinco anticuerpos que se muestran en la tabla 3, la reactividad indicada mediante AAbs fue de 100 o más con la adición de TAT a 1000 ng/ml, a diferencia de ninguna adición de TAT.
En TAT-1, TAT-2 y TAT-3 que se muestran en la tabla 3, la prueba de aglutinación en látex confirmó con éxito la reactividad elevada de estos anticuerpos. Además, también en los anticuerpos TAT-4 y TAT-5, se confirmó cierto nivel de reactividad, aunque inferior a la de TAT-1, TAT-2 y TAT-3.
Ejemplo 6: Evaluación de la reactividad cruzada con antitrombina en reactivos para la prueba de aglutinación en látex
La reactividad cruzada con antitrombina en los reactivos preparados se evaluó utilizando muestras preparadas, tal como se ha descrito en el ejemplo 5, mediante la dilución de suero humano con solución salina que contenía el 0,5 % de BSA hasta una concentración de 1000 ng/ml y se complementó adicionalmente con antitrombina hasta una concentración de 250 o 500 |xg/ml.
La reactividad obtenida cuando no se añadió antitrombina se comparó con la reactividad obtenida cuando se añadió antitrombina en cada concentración.
Para realizar la medición, cualquiera de los reactivos de medición, aparato de medición y parámetros de medición fueron similares a los del ejemplo 4. Los anticuerpos contra TAT utilizados para la evaluación son TAT-1, TAT-2, TAT-3, TAT-4 y TAT-5.
Los resultados de la evaluación de la reactividad cruzada de los reactivos de látex con antitrombina se muestran en la figura 5. Los anticuerpos que alcanzaron una especificidad de 100 veces o más en el ELISA de inhibición indirecta del ejemplo 4 (TAT-1, TaT-2, TAT-3) retuvieron no menos del 70 % de la reactividad original, incluso en el caso de añadir antitrombina hasta una concentración de 500 |xg/ml. Por otro lado, en cualquiera de los anticuerpos que alcanzaron una especificidad de 100 veces o menos (TAT-4, TAT-5), se observó una reducción extrema de la reactividad debido al aumento de la concentración de antitrombina (figura 5).
La reactividad cruzada en cada anticuerpo, cuya reactividad había sido confirmada en el sistema de reacción de aglutinación en látex del ejemplo 5, se comprobó mediante ELISA y, en consecuencia, se indicó que si bien se observaba un nivel elevado de especificidad para cada uno de los anticuerpos TAT-1, TAT-2 y TAT-3 en ambos sistemas de reacción de aglutinación en látex, la especificidad fue insuficiente en cada uno de los anticuerpos TAT-4 y TAT-5, aunque se observó un cierto nivel de reactividad para los mismos en la prueba de aglutinación en látex. Por tanto, se confirmó que los anticuerpos que habían sido identificados mediante el ELISA de inhibición indirecta del ejemplo 4 para mostrar una diferencia de reactividad de 100 veces o más, fueron muy útiles para su utilización como reactivos.
Ejemplo 7: Efecto del pH del primer reactivo
Se evaluó el efecto del pH de un reactivo de látex sobre la reactividad cambiando el pH de 5,7 a 7,2.
Para la composición de los reactivos, se utilizó una composición de Bis-Tris o MES 100 mM (fabricado por Dojindo Laboratories), NaCl 700 mM, BSA al 0,15 %, alginato de sodio al 0,20 % (fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) y EMULGEN-150 al 0,05 % (fabricado por Kao Co.) para un primer reactivo, mientras que se utilizaron TAT-1 y T-1 como anticuerpos contra la parte de antitrombina y la parte de trombina, respectivamente, para un segundo reactivo con la dilución de partículas sensibilizadas con cada anticuerpo en azida sódica al 0,05 % a una absorbancia de 1,0 a una longitud de onda de 700 nm y la mezcla de las mismas. La sensibilización de las partículas de látex con cada anticuerpo se realizó de manera similar a la del ejemplo 5, excepto que se utilizaron partículas con un tamaño de partícula de 0,20 pmi.
En la preparación de las muestras a medir, se utilizaron solución salina que contenía BSA al 0,5 % (denominada solución salina) y plasma humano agrupado (denominado plasma). Además, el suero humano analizado con el reactivo de Cl EiA se diluyó con el plasma agrupado descrito anteriormente a cada concentración (10, 50, 100 ng/ml) y las diluciones resultantes se utilizaron como muestras de TAT. Para realizar la medición, el aparato de medición y los parámetros de medición fueron similares a los del ejemplo 4.
Se observó una tendencia, tal como se describe a continuación, en relación con el efecto del cambio de pH de 6,0 a 7,2 sobre la reactividad cuando se utilizó tampón Bis-Tris como solución tampón para el primer reactivo. En primer lugar, una línea conocida como base salina cayó por debajo de cero a pH 6,7 (figura 6). Para el efecto sobre la reactividad a TAT corregido por la sustracción de los valores de la base de plasma, se observó una tendencia gradualmente decreciente de la reactividad cuando se incrementó el pH (figura 7).
Con el objetivo de mejorar el rendimiento del reactivo hasta un nivel que permita una medición muy sensible de los complejos TAT, se utilizó como indicador una señal (AAbs) no inferior a 100 a una concentración de TAT de 50 ng/ml y, a continuación, se descubrió que era preferente un pH no superior a 6,6 para el líquido de reacción (figura 7). Además, se examinó el efecto del cambio de pH de 5,7 a 6,2 sobre los valores del blanco con el fin de asegurar la supresión de los valores del blanco, así como una alta reactividad. En consecuencia, se observó una tendencia decreciente para la absorbancia de las muestras de blanco en el caso de utilizar tampón Bis-Tris o MES cuando se incrementó el pH. En particular, se descubrió que la disminución de la absorbancia fue grande en el intervalo de pH de 5,7 a 5,8 y la absorbancia disminuyó por debajo de 100 en el transcurso de pH 6,0 a pH 6,2 (figuras 8 y 9).
Se descubrió que el aumento en el pH tendía a disminuir el valor del blanco de solución salina, el valor del blanco de plasma y la reactividad a TAT de una manera dependiente del pH. El hecho de que la reactividad disminuía a un pH superior al neutro fue efecto sorprendente descubierto por los inventores.
Por consiguiente, se descubrió que mientras que el límite inferior del pH era 5,8 y, de forma particularmente preferente, 6,2 desde el punto de vista de la supresión de los valores del blanco, el límite superior del pH era de 6,6 y, de forma particularmente preferente, 6,2 desde el punto de vista del mantenimiento de la reactividad.
Ejemplo 8: Prueba de correlación utilizando muestras clínicas
Se utilizaron muestras clínicas para probar si el reactivo de látex para la medición de TAT utilizado en la presente invención se utilizó con éxito para medir la concentración de complejos TAT en sangre.
Para la composición de los reactivos, se utilizaron reactivos preparados, tal como se describe a continuación. Como primer reactivo se utilizó un reactivo que contenía Bis-Tris 100 mM, pH 6,2, NaCl 700 mM, EMULGEN-150 al 0,05 %, alginato de sodio al 0,20 % y BSA al 0,15 %. Se utilizó un segundo reactivo similar al del ejemplo 7.
Se utilizó el reactivo de CLEIA como reactivo de control para la medición. El calibrador de TAT (fabricado por LSI Medience Co.) se utilizó como patrón junto con el reactivo de látex o el reactivo de CLEIA.
Para las muestras a utilizar, se utilizaron 20 muestras de plasma citratado. Para realizar la medición, cualquiera de los aparatos de medición y los parámetros de medición fueron similares a los del ejemplo 4. El analizador STACIA (fabricado por LSI Medience Co.) se utilizó como aparato de medición para el reactivo de CLEIA y la medición se realizó según los parámetros descritos en el prospecto.
Los resultados de las mediciones por ambos reactivos se presentaron en la figura 10.
El reactivo de látex utilizado en la presente invención indicó una buena correlación con el reactivo de prueba, según un reactivo de CLEIA convencional, dentro del intervalo de 3 ng/ml a 120 ng/ml, incluso en el caso de utilizar muestras clínicas. Por tanto, la utilización de la presente invención permite una medición muy sensible de muestras clínicas sin tratamientos, tales como la separación B/F.

Claims (2)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para medir complejos TAT en una muestra separada de un organismo vivo, en el que TAT se mide mediante una prueba de aglutinación en látex utilizando un reactivo de la prueba de TAT que comprende:
un anticuerpo unido a una partícula de látex que se une a la parte de antitrombina del complejo TAT y reconoce el complejo; y
un anticuerpo unido a una partícula de látex que se une a la parte de trombina del complejo TAT y reconoce el complejo;
en el que el anticuerpo que se une a la parte de antitrombina del complejo TAT y reconoce el complejo tiene una reactividad a TAT que es 100 o más veces y 50.000 o menos veces mayor que la reactividad a la antitrombina libre; y
en el que el reactivo de prueba se ajusta a un pH de 5,8 a 6,6;
y en el que la prueba de aglutinación en látex se realiza en condiciones de pH de 5,8 a 6,6.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el reactivo de la prueba de TAT comprende:
un segundo reactivo que comprende
partículas de látex acopladas al anticuerpo que se une a la parte de antitrombina del complejo TAT y reconoce el complejo y
partículas de látex acopladas al anticuerpo que se une a la parte de trombina del complejo TAT y reconoce el complejo; y
un primer reactivo que comprende una solución tampón a un pH de 5,8 a 6,6.
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