JP2001228153A

JP2001228153A - 免疫学的測定方法

Info

Publication number: JP2001228153A
Application number: JP2000036307A
Authority: JP
Inventors: Hirokazu Yago; 弘和矢後
Original assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Priority date: 2000-02-15
Filing date: 2000-02-15
Publication date: 2001-08-24

Abstract

(57)【要約】【解決手段】抗原物質、イオン交換官能基を担持した
不溶性担体及び抗体のうちのいずれか２つの組み合わせ
では凝集を起こさないｐＨ及びイオン強度を有する反応
溶液中において、試料中に存在する抗原物質、イオン交
換官能基を担持した不溶性担体、及び抗体を反応させ、
不溶性担体を選択的に凝集させることを特徴とする抗原
物質の免疫学的測定方法。【効果】試料中に存在する抗原物質を特異的に、簡便
かつ迅速に測定することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料中の抗原物質
を、凝集反応を利用して簡便かつ迅速に測定する方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】病院、検査センター等においては、人員
及び経費の削減に伴い、臨床検査の自動化、簡便化、測
定時間の短縮化が図られている。ここで使用される汎用
性の自動分析器に適用される免疫学的測定法としては、
不溶性担体を利用して抗原物質を定性及び定量する凝集
法で、主にラテックス凝集免疫測定法が用いられてい
る。例えば、被検試料中に存在する抗原物質を測定する
場合、試料と、抗原物質に特異的に反応する抗体又はそ
のフラグメントを担持させたラテックスとを混合して、
凝集の程度を測定することにより、抗原物質を検出及び
定量するものである。

【０００３】ここで、抗体としては、抗原物質が、(1)
特定のエピトープが１個である多価抗原物質の場合、
(2)特定のエピトープが複数含まれる多価抗原物質の場
合、(3)分子量の小さいハプテン等の１価の抗原物質で
ある場合に、各抗原物質に適した測定方法や、抗体の特
徴等に応じて、ポリクローナル抗体又はモノクローナル
抗体が使い分けられている。例えば、ポリクローナル抗
体は、前記(1)、(2)及び(3)の抗原物質いずれにおいて
もラテックス凝集免疫測定法に汎用されている。(1)及
び(2)の抗原物質の場合、免疫凝集の増加で抗原物質が
測定され、(3)の抗原物質の場合には、通常、ポリクロ
ーナル抗体と反応しても凝集は起こらないことから、ポ
リクローナル抗体と反応して凝集が生じる凝集素（例え
ば、ポリハプテン等）を用い、被検試料と反応させ、試
料中の抗原物質がどの程度凝集を阻害したかを測定する
凝集阻害方法が汎用されている。しかし、ポリクローナ
ル抗体は、抗体の作成において、使用する抗原に含まれ
るわずかの夾雑成分に対する抗体や、目的の抗原物質と
構造が類似する他の成分と交差反応する抗体が含まれる
場合があり、特異抗体に精製する段階での該抗体の損失
も大きく、常に同じ品質のものを得ることは難しいとい
う問題がある。

【０００４】モノクローナル抗体を用いる方法として、
抗原物質が(1)又は(2)の場合、２種又は３種のモノクロ
ーナル抗体を用いたラテックス凝集免疫測定法（特公平
3-40341号）が知られている。しかし、各抗原物質に応
じて、それぞれに特殊な２種又は３種のモノクローナル
抗体を選択するのは困難であるという問題がある。ま
た、(2)の抗原物質の場合、１種類のモノクローナル抗
体を用いたラテックス凝集免疫測定法で測定が可能な場
合があるが、特定のエピトープが複数含まれる特殊な抗
原に限定される。更に、(1)及び(3)の抗原物質の場合、
１種類のモノクローナル抗体では、通常、凝集は起こら
ないことから、ポリハプテン等の凝集素を用いる凝集阻
害法が知られている。しかし、凝集素としてのポリハプ
テンが試料中のネイティブな抗原物質と同一の反応性を
示す保証はなく、ポリハプテンと反応するモノクローナ
ル抗体がネイティブな抗原物質と反応しない場合もある
ことから、ネイティブな抗原物質の反応性に近づけるた
めの何らかの特殊な処理が必要になるという問題があ
る。

【０００５】凝集阻害方法ではない、モノクローナル抗
体を用いたラテックス凝集免疫測定法として、被検試料
中の抗原物質を主に疎水結合により不溶性担体粒子に吸
着させた後、該抗原物質に対する抗体を反応させて不溶
性担体を選択的に凝集させる方法が知られている（特開
平7-35752号）。しかし、この方法は、微量の生体成分
や不溶性担体への吸着が困難な抗原物質の測定には適用
し難く、また、不溶性担体に物理的に吸着した抗原物質
は変性しやすいため、変性した抗原物質と特異的に反応
する特殊な抗体を用いなければならないという問題があ
る。

【０００６】更に、測定対象に対するモノクローナル抗
体と、糖に対して親和性を有する物質とをそれぞれ担持
した不溶性担体を検体と反応させて不溶性担体を選択的
に凝集させる糖化タンパク質の測定方法が提案されてい
る（特開平7-83921号）。しかし、生体成分中の糖化タ
ンパク質の糖化度合いは一定でなく、特定の抗原物質に
複数の糖化が生じるため、糖親和性物質結合不溶性担体
と糖化タンパク質で凝集が生じ、抗原物質を特異的に測
定できないという問題がある。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、試料中の抗原物質を特異的に、簡便かつ迅速に測定
する方法を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、イオン交
換官能基を担持した不溶性担体を用い、反応溶液のｐＨ
及びイオン強度を調整することにより、試料中の抗原物
質を特異的に、簡便かつ迅速に測定できることを見出
し、本発明を完成した。

【０００９】すなわち、本発明は、抗原物質、イオン交
換官能基を担持した不溶性担体及び抗体のうちのいずれ
か２つの組み合わせでは凝集を起こさないｐＨ及びイオ
ン強度を有する反応溶液中において、試料中に存在する
抗原物質、イオン交換官能基を担持した不溶性担体、及
び抗体を反応させ、不溶性担体を選択的に凝集させるこ
とを特徴とする抗原物質の免疫学的測定方法を提供する
ものである。また、本発明は、イオン交換官能基を担持
した不溶性担体及び抗体を含み、抗原物質、イオン交換
官能基を担持した不溶性担体及び抗体のうちのいずれか
２つの組み合わせでは凝集を起こさないようにｐＨ及び
イオン強度が調整されていることを特徴とする、試料中
に存在する抗原物質、イオン交換官能基を担持した不溶
性担体、及び抗体を反応させ、不溶性担体を選択的に凝
集させて抗原物質を免疫学的に測定するための測定用試
薬を提供するものである。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明において、測定の対象とな
る抗原物質としては、いずれかのｐＨの反応溶液中で電
荷を有する物質であれば特に限定されず、臨床上測定意
義の高い物質等を測定することができる。例えば、血液
凝固線溶関連因子であるアンチトロンビンIII（ＡＴII
I）、トロンビン・ＡＴIII複合体、フィブリン・フィブ
リノーゲン分解産物（ＦＤＰ）、プラスミノーゲン等；
糖化タンパク質であるヘモグロビンAlc等；リポタンパ
ク質であるアポＡI、アポＡII、アポＢ、アポＥ等；腫
瘍マーカーであるＣＥＡ、ＡＦＰ等；ホルモンであるＨ
ＣＧ、ＬＨ、インスリン等；自己抗体であるＲＦ、抗核
抗体等；感染症で測定されるＣＲＰ、各種ウイルスの抗
原（HBs等）、各種ウイルス・細菌に対する抗体（HBs抗
体、HBe抗体、HCV抗体等）などが挙げられる。また、こ
のような抗原物質が含まれる試料としては、血液、尿、
唾液、細胞抽出液等が挙げられる。

【００１１】本発明で用いる不溶性担体は、イオン交換
官能基を担持したものである。不溶性担体の材質は特に
制限されず、従来用いられている物質であればいずれで
も良く、有機高分子物質、無機物質、細胞膜、血球、微
生物等が挙げられる。有機高分子物質としては、ラテッ
クス粒子が好ましく、特にアクリル酸重合体、スチレン
重合体、メタクリル酸重合体等の樹脂の微粉末が１種又
は２種以上均一に懸濁したラテックス粒子が好ましい。
また、無機物質としては、シリカ、アルミナ等の微粒子
が好ましい。さらに、不溶性担体としては、従来生体試
料等からの物質の精製、定性分析、定量分析等のクロマ
トグラフィーで広く使用されているイオン交換体の担体
である、高分子ポリマーのデキストラン、アガロース、
セルロース、ポリスチレン等を使用することができる。
また、このような担体にイオン交換体が結合された市販
品等をそのまま、又は粒径等を調整して使用することも
できる。

【００１２】このような不溶性担体が担持するイオン交
換官能基としては、従来生体試料等からの物質の精製、
定性分析、定量分析等のクロマトグラフィーで広く使用
されているイオン交換体の官能基であればいずれでも良
く、例えば陽イオン交換官能基としては、酸性水酸基で
あるリン酸基等、カルボキシル基であるカルボキシメチ
ル基等、スルホン基であるスルホメチル基、スルホプロ
ピル基等の酸性基が挙げられ；陰イオン交換官能基とし
ては、アミノ基であるジエチルアミノエチル基、トリメ
チルアミノメチル基、ジエチル−（２−ヒドロキシプロ
ピル）アミノエチル基等の塩基性基が挙げられる。イオ
ン交換官能基の不溶性担体への担持方法は特に制限され
ず、例えばイオン交換官能基を不溶性担体に直接結合す
る、イオン交換官能基が適切なスペーサーを介して不溶
性担体に結合する、イオン交換官能基をキャリアタンパ
ク質に結合させたものを不溶性担体に結合する等の方法
が挙げられる。これらの場合、結合方法は、化学的結
合、物理的結合のいずれでも良い。

【００１３】イオン交換官能基を担持した不溶性担体の
粒径は特に制限されないが、生成した凝集体を光学的に
測定する場合には、平均粒子径が１．６μｍ以下のもの
が好ましく、特に平均粒径が０．０５〜１μｍ、更に
０．０５〜０．５μｍのものが好ましい。また、凝集体
を肉眼で観察する場合には、平均粒子径が１μｍ以上、
特に１〜２０μｍであるのが好ましい。

【００１４】イオン交換官能基を担持した不溶性担体
は、測定対象である抗原物質の電荷特性や、試料中の夾
雑物質の電荷特性等を考慮して、適宜選択される。例え
ば、タンパク質（抗原物質）は両性電解質で、その総荷
電はｐＨに依存し、タンパク質の等電点において総荷電
は０になる。このとき、タンパク質は陰イオン及び陽イ
オン交換体のいずれとも結合しない。等電点より低いｐ
Ｈではタンパク質の総荷電は正になり、陽イオン交換体
に結合し、等電点より高いｐＨではタンパク質の総荷電
は負になり、陰イオン交換体に結合する。そして、タン
パク質の等電点とｐＨの差が大きいほどイオン交換体に
結合する力が強く、イオン強度が高くてもイオン交換体
に結合できる。

【００１５】また、イオン強度は、タンパク質がイオン
交換官能基を担持した不溶性担体に結合し、かつ使用す
る抗体がイオン交換官能基を担持した不溶性担体に結合
しない濃度に設定する。例えば、ＡＴIII（抗原物質）
の等電点は５．１（生化学データブックによる）であ
り、ｐＨ８．０では総荷電が負になり、陰イオン交換体
と結合できる。また、抗体は中性付近（ｐＨ６〜８；抗
体により異なる）が等電点であり、イオン強度をＮａＣ
ｌで０．１〜０．２Ｍにすることにより、イオン交換体
と結合しなくなる。

【００１６】本発明で用いる抗体としては、測定対象で
ある抗原物質と特異的に結合し得るものであれば良く、
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでも
良い。ポリクローナル抗体の場合には、抗原物質との組
み合わせでは、ｐＨやイオン強度を調整しなくても凝集
を起こさないものが好ましい。また、測定対象である抗
原物質が、抗核抗体、抗HBs抗体等の抗体である場合に
は、これら抗体と特異的に結合し得る核酸、HBs等の抗
原物質を用いることができる。本発明においては、抗原
物質とイオン交換官能基を担持した不溶性担体とが、主
に静電的に結合するため、抗原物質の変性が少なく、抗
原に対する通常の抗体を用いることができる。

【００１７】また、抗体は、遊離の抗体でも、不溶性担
体に担持させた抗体でも良いが、測定感度の点から、不
溶性担体に担持させた抗体が好ましい。抗体を不溶性担
体に担持させる方法は特に制限されず、物理吸着、化学
結合、免疫的結合等が挙げられる。また、抗体に対して
結合性を有する物質を予め不溶性担体に担持させ、この
物質を介して抗体を結合させる方法でも良い。なお、不
溶性担体としては、前記のイオン交換官能基を担持する
ものと同様のものが挙げられ、特に有機高分子物質のラ
テックス粒子が好ましい。本発明においては、１種の抗
体があれば良いが、より高感度の測定を行なうために、
２種以上の抗体を用いることもできる。

【００１８】本発明においては、抗原物質、イオン交換
官能基を担持した不溶性担体及び抗体のうちのいずれか
２つの組み合わせでは凝集を起こさないよう、反応溶液
のｐＨ及びイオン強度を調整する。ｐＨの調整には、通
常用いられる緩衝液、例えば酢酸、クエン酸、リン酸、
トリス、グリシン、ホウ酸、炭酸、グッドの緩衝液等が
用いられ、測定する抗原物質の等電点等に応じて使用さ
れる。また、イオン強度の調整には、塩化ナトリウム、
硫酸ナトリウム、塩化カリウム等の電解質が用いられ、
一般的には塩化ナトリウムが好ましい。

【００１９】ｐＨ及びイオン強度は、抗原物質の電荷特
性（特に等電点等）や、用いるイオン交換官能基を担持
した不溶性担体の種類、抗体等に応じて、設定すれば良
い。例えば、後記の実施例のように、抗原物質としてＡ
ＴIIIを測定する場合、反応溶液のｐＨはｐＨ６〜９、
イオン強度は塩化ナトリウム濃度で０．１〜０．２Ｍと
なるように調整するのが好ましい。

【００２０】本発明の測定方法は、前記のようにｐＨ及
びイオン強度を調整した反応溶液中において、試料中に
存在する抗原物質、イオン交換官能基を担持した不溶性
担体、及び抗体を反応させる。反応の際には、３成分が
混合されたときに、所望のｐＨ及びイオン強度になるよ
うに混合すれば良く、反応条件は測定する抗原物質や用
いる抗体等により異なるが、一般に、室温〜３７℃、１
〜２０分間の条件で行なうのが好ましい。なお、前記３
成分が反応することにより、不溶性担体が選択的に凝集
するが、抗原物質と不溶性担体との反応、抗原物質と抗
体との反応は、同時に行なっても良いし、いずれかを先
に行なっても良い。

【００２１】凝集が起こった後、凝集の程度を測定す
る。凝集の程度を定性する場合は肉眼で観察すれば良
く、定量する場合は凝集体を光学的に測定すれば良い。
光学的な測定方法は、通常行われている方法であれば特
に制限されず、汎用の分光光度計、分光光度測定を測定
原理とした生化学用自動分析装置、近赤外を測定波長と
した装置、積分球濁度を測定原理とした装置、散乱光強
度を測定する装置等の光学的測定機器などを用いること
ができる。

【００２２】本発明の測定試薬は、イオン交換官能基を
担持した不溶性担体及び抗体を含み、測定対象である抗
原物質、イオン交換官能基を担持した不溶性担体及び抗
体のうちのいずれか２つの組み合わせでは凝集を起こさ
ないようにｐＨ及びイオン強度が調整されたものであ
る。試薬は、１剤又は２剤以上の構成にすることができ
る。また、本発明の測定試薬は、測定対象となる試料と
混合することにより使用され、試料中に存在する抗原物
質と、試薬中のイオン交換官能基を担持した不溶性担体
及び抗体が反応して凝集することにより、当該抗原物質
を測定することができる。

【００２３】

【発明の効果】本発明によれば、試料中に存在する抗原
物質を特異的に、簡便かつ迅速に測定することができ
る。

【００２４】

【実施例】次に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらにより何ら制限されるもので
はない。

【００２５】製造例１（抗ＡＴIII固定化抗体溶液の調
製）抗ＡＴIIIモノクローナル抗体が１．４ｍｇ／ｍＬの濃
度になるように、０．２５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８）
と混合した溶液５ｍＬに、平均粒径０．２μｍのポリス
チレンラテックス（積水化学工業社製）の２重量％懸濁
液５ｍＬを加え、４℃にて５時間攪拌した。次に、２％
牛血清アルブミンを含む５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ
８）１０ｍＬを加え、４℃で一晩攪拌した。遠心洗浄に
より上清を除去した後、５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ
８）１０ｍＬを加えて良く混合し、抗ＡＴIII固定化抗
体溶液の原液を調製した。この原液を２０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８）で１／１５に希釈して、抗ＡＴIII
固定化抗体溶液とした。

【００２６】製造例２（陰イオン交換官能基を担持した
不溶性担体溶液の調製）陰イオン交換樹脂であるDEAE-Sephacel（セルロースに
ジエチルアミノエチル基を担持させたもの；ファルマシ
ア社製）を乳鉢にて磨り潰し、得られた細粒子（平均粒
径約１０μｍ）を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）
で１／１０に希釈し、陰イオン交換官能基結合不溶性担
体溶液とした。

【００２７】実施例１（ＡＴIIIの測定）製造例で得られた抗ＡＴIII固定化抗体溶液、及び陰イ
オン交換官能基結合不溶性担体溶液、並びに１．６７Ｍ
塩化ナトリウム水溶液、精製ＡＴIII（アンスロンビン
Ｐ、ヘキストジャパン社製）の１ｍｇ／ｍＬ溶液を用
い、表１に示す割合で混合し、分光光度計を用いて６０
０ｎｍにおける１５〜７５秒間の吸光度変化量を測定し
た。結果を表１に併せて示す。また、表１中のｐＨ及び
イオン強度は、各溶液を混合後の反応溶液のものであ
る。

【００２８】

【表１】

【００２９】表１の結果より、イオン強度を調整してい
ないNo.２では、吸光度変化量が０．０２１で、不溶性
担体と抗体が反応していること示しており、この系で抗
原物質を測定することはできない。No.３〜５では、塩
化ナトリウム溶液を加えてイオン強度を調整することに
より、不溶性担体、抗体及び抗原物質のうちのいずれか
２つの組み合わせでは凝集を起こさない系が得られ、３
成分を混合したNo.６では吸光度変化量が０．０１７で
凝集が起こっており、この反応系において、抗原物質の
測定ができることが確認された。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】抗原物質、イオン交換官能基を担持した
不溶性担体及び抗体のうちのいずれか２つの組み合わせ
では凝集を起こさないｐＨ及びイオン強度を有する反応
溶液中において、試料中に存在する抗原物質、イオン交
換官能基を担持した不溶性担体、及び抗体を反応させ、
不溶性担体を選択的に凝集させることを特徴とする抗原
物質の免疫学的測定方法。
【請求項２】抗体が、不溶性担体に担持されたもので
ある請求項１記載の免疫学的測定方法。
【請求項３】イオン交換官能基を担持した不溶性担体
及び抗体を含み、抗原物質、イオン交換官能基を担持し
た不溶性担体及び抗体のうちのいずれか２つの組み合わ
せでは凝集を起こさないようにｐＨ及びイオン強度が調
整されていることを特徴とする、試料中に存在する抗原
物質、イオン交換官能基を担持した不溶性担体、及び抗
体を反応させ、不溶性担体を選択的に凝集させて抗原物
質を免疫学的に測定するための測定用試薬。