JP5676316B2 - ヒトtsh及び犬tshに対する抗体 - Google Patents
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Description
好ましくは、本発明のモノクローナル抗体又はその断片は、犬TSHと人TSHに対する解離定数が10-7M以下である。
上記の条件を満たせば、本発明の抗体は、犬TSHと人TSHのどちらの分析にも使用できるからである。
好ましくは、本発明のモノクローナル抗体又はその断片は、サブクラスがIgG1、2a, 2b,又は3である。
好ましくは、本発明のモノクローナル抗体又はその断片は、人TSHを抗原として免疫動物に投与することによって生成される抗体の中から犬TSHに対する反応性を有する抗体を選別することにより得られる。
好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、FERM AP−22073、FERM AP−22074、FERM AP−22075、FERM AP−22076又はFERM AP−22077を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体である。
好ましくは、FERM AP−22073、FERM AP−22074、FERM AP−22075、FERM AP−22076又はFERM AP−22077を有するハイブリドーマが提供される。
本発明によればさらに、上記した本発明の抗体又はその断片を含む、免疫分析試薬が提供される。
本発明によればさらに、色素または蛍光色素を含むラテックス粒子で標識した上記した本発明の抗体又はその断片を含む、免疫分析試薬が提供される。
本発明によればさらに、酵素で標識した上記した本発明の抗体又はその断片を含む、免疫分析試薬が提供される。
本発明によればさらに、FERM AP−22075又はFERM AP−22076を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を色素または蛍光色素を含むラテックス粒子で標識した標識抗体と、FERM AP−22073、FERM AP−22074又はFERM AP−22077を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体との組み合わせからなる、免疫分析試薬が提供される。
好ましくは、本発明の免疫分析試薬は、犬TSH測定用である。
本発明によればさらに、上記した本発明の犬TSH測定用免疫分析試薬に、試料を接触させることを含む、試料中のヒトTSH又は犬TSHの測定方法が提供される。
本発明の抗体は、犬TSHと人TSHに結合するモノクローナル抗体である。なお、本発明で言う抗体とは、抗体分子全体を意味するのみならず、その断片(例えば、Fab、F(ab')2又はFab'断片)をも意味する。
(1)免疫原の調製
BIODESIDG International社製(cat#A81550H)Thyroid Stimulating Hormone, Human Pituitaryを2mg量購入し、免疫感作抗原とした。
感作用抗原(hTSH)2 mgを使用した。初回免疫50〜100μg/匹、2回目以降50μg/匹とした。感作抗原をマウス背部皮下に免疫した。初回は完全アジュバント(FCA)と混合したエマルジョンを投与した。2〜4回目は不完全アジュバント(FIA)と混合したエマルジョンを投与した。2週間隔で5回免疫を行い、3回目4回目免疫の翌週には採血し抗体価の測定を実施した。採血血清の一部(100〜200μL)をELISA測定に用いた。抗体価の上昇が認められた場合、5回目免疫を最終免疫とする。最終免疫は抗原AをPBS(-)で希釈し、腹腔内へ投与した。最終免疫3日後に脾臓を摘出した。
(1) 動物: BALB/c マウス、♀、6-7 週齢
(2) 匹数: 3 匹
(3) 免疫量: 50-100 μg/匹/回
(4) 免疫箇所: 尾静脈または腹腔内接種
(5) 抗体価測: ELISA
抗体価測定の結果、選定されたマウス(1〜3匹)より脾臓を摘出し、細胞融合を行った。
免疫マウスより摘出した脾臓細胞をミエローマと混合して細胞融合を実施した。
融合方法:PEG法
使用細胞:最終免疫3日後の脾臓細胞
ミエローマ:P3-X63-Ag8-U1
細胞比、脾臓細胞:ミエローマ=5-10:1
細胞播種: 脾臓細胞として0.5〜1.0 × 10^5 cells/wellで96-well plateに播種
使用培地: RPMI-1640 + 10 % FBS + HAT(場合によっては更にHCF or IL-6を添加)
モノクローナル抗体の一次スクリーニング(細胞融合後のスクリーニング)
測定用抗原を500 ng/mLとなるようPBS(-)で希釈し固相化を行い、HAT培地による選択培養で増殖したハイブリドーマの培養上清をELISAによりスクリーニングした。2次抗体として抗マウスIgG HRP標識抗体を用いた。スクリーニング陽性ハイブリドーマを24ウェルプレートで培養し、培養上清を各1 mL評価に使用した。SPRによる選択試験結果をもとに、クローニングウェルを選択した。SPRでは、センサーチップにCM5を使用し、アミンカップリング法で、hTSHをRU=200程度固定化した。
抗体濃度を規格化:ΔRU at hTSH/ΔRU at Capture×100)
ヒト由来とイヌ由来TSHのアミノ酸配列を比較すると、イヌ、ヒトでの共通配列があるため、ヒトTSH(hTSH)とcTSHの両方に反応する抗体が取得できる可能性がある。そこで、cTSH抗原を用いて、hTSHと同様にスクリーニングすることにした。
HBS-EP buffer, Flow: 30μl/min, contact time: 5 min, Flow: 5 min, Wash: 5 min(Gly pH 1.5)
cTSH抗原:Scrips社製(100μg)比活性5%程度
Chip:CM5
Fc1: ベースライン
Fc2: cTSH固定化(RU=2000〜4000程度)
モノクローナル抗体の二次スクリーニング(限界希釈後のスクリーニング)を実施例3及び4と同様に行った。結果を図3及び図4に示す。サブクラスの決定は、Isotyping kit(ロッシュ製)を用いて行った。また、各親クローンの中で、SPRシグナルの高い上位数株を選択し、凍結バイアル作製へ進めた。その結果を以下の表2に示す。
最終クローンの中から、SPRスクリーニングを行った結果、シグナルの高かった上位クローンについてマウス腹水法(マウス2匹を使用)により抗体を作製し、以下の量を得た。
上記の表4に記載した5種の抗体(#1, #8, #18, #13, #16)の速度論解析を行った。
装置:Biacore T100
(測定条件)
接触時間(Contact time): 120 s
流速(Flow rate): 60μL/min
解離時間(Dissociation time): 1800 s
再生(Regeneration): 10 mM Gly pH 1.5, contact time: 300s, Flow rate: 30μL/min
チップ: CM5, hTSH(calbiochem), RU = 12固定化
抗体TSH #13(4-9C2)又はTSH #16(4-10A1)を蛍光粒子に結合したものと、既存の市販の抗TSH抗体を基盤に固定化し、以下の手順によりSPFアッセイを行った。
2%(固形分濃度)蛍光ラテックス粒子水溶液250μLに、2mg/mLのTSHモノクローナル抗体(抗体TSH #13(4-9C2)又はTSH #16(4-10A1))、50mMのMESバッファー(pH6.0)溶液250μLを加え室温で15分間攪拌した。その後、10mg/mLのWSC(品番01−62−0011、和光純薬)水溶液を5μL加え、室温で2時間撹拌した。2mol/LのGlycine水溶液を25μL添加し、30分間撹拌した後、遠心分離(15,000rpm、4℃、15分)にて、蛍光ラテックス粒子を沈降させた。上清を取り除き、PBS溶液(pH7.4)を500μL加え、超音波洗浄機により蛍光ラテックス粒子を再分散させた。さらに遠心分離(15,000rpm、4℃、15分)を行い、上清を除いた後、1%BSAを含むPBS(pH7.4)溶液500μL加え、蛍光ラテックス粒子を再分散させることで、TSH抗体結合蛍光ラテックス粒子の1%(w/v)溶液を得た。
カートリッジ作製の説明
ポリメタクリル酸メチルを基体として基盤に金膜を蒸着したチップを用いて、金膜上に抗体液を点着して抗体固定化を行った。その後、抗体標識蛍光粒子を用いて、以下の手順に従って、免疫アッセイを行った。
上板をセンサチップの流路に付ける前に、センサチップの測定エリアに、10μg/mLに調製したTSHモノクローナル抗体(既存の市販の抗TSH抗体)の150mM塩化ナトリウム溶液を100μL添加し、室温で1時間静置した。抗体溶液を除去し、予め調製した洗浄用バッファー(0.05%(w/v) Tween-20を含むPBS(pH7.4))で洗浄した(300μL/回、3回)。洗浄終了後、抗体の未吸着部分のブロッキングを行うため、1%カゼインを含むPBS(pH7.4)を300μL添加し、1時間、室温で静置した。上記の洗浄用バッファーで洗浄後、安定化剤としてImmunoassay Stabilizer(ABI社製)を300μLずつ各ウェルに添加し、室温で30分間放置後、溶液を除去し乾燥機中で水分を完全に取り除いた。TSH抗体結合処理後に、蓋材を用いてセンサチップの流路を封入し、流路型センサチップを作製する。流路の封入には超音波溶着などの方法を用いることができる。
TSH抗原をそれぞれ、15pM、48pM, 187 pM添加したイヌ血漿を調製し、試料溶液とした。
各試料溶液500μLに、上述の手順で調製した1%抗TSH抗体結合蛍光標識物質溶液を5μLずつ添加し混合させ反応液とした。試料セルを用いて、反応液を、測定エリア上を流下させつつ、測定エリアからの蛍光信号を、異なる複数の時刻で測定した。蛍光信号の測定は、金膜上の複合体(抗体−抗原―抗体)が形成された領域に対して、抗体が結合していない側から近赤外レーザを照射し、エバネッセント波を発生させることによって行った。エバネッセント波は金膜近傍にのみ到達するので、主に上記のサンドイッチ複合体に含まれる標識を励起して蛍光を発する。フォトダイオードを用いてその蛍光を検出した。この際、試料セルの空気孔にポンプを接続し、一定流速(線速度1.4mm/s)となるようにポンプ吸引を行い、反応液のうち300μLを測定エリア上に送液しつつ、測定を行った。反応条件:1次反応10分, 流速10μL/分、Flow time: 5分, 洗浄時間: 5分
抗体TSH #13(4-9C2)又はTSH #16(4-10A1)の何れかを蛍光標識抗体として用いた場合における基板側抗体のスクリーニングを以下の手順で行った。なお、基板側抗体の候補としては以下の抗体を使用した。
(測定条件)
接触時間(Contact time): 120 s
流速(Flow rate): 30μL/min
解離時間(Dissociation time): 120 s
再生(Regeneration): 10 mM Gly pH 1.5, 接触時間(contact time): 300s, 流速(Flow rate): 30μL/min
チップ: CM5, cTSH(scrips), RU = 4000固定化
Claims (8)
- FERM BP−11489(FERM P−22073から移管)、FERM P−22074、FERM P−22075、又はFERM P−22077を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体。
- FERM BP−11489(FERM P−22073から移管)、FERM P−22074、FERM P−22075、又はFERM P−22077を有するハイブリドーマ。
- 請求項1に記載の抗体又はその断片を含む、免疫分析試薬。
- 色素または蛍光色素を含むラテックス粒子で標識した請求項1に記載の抗体又はその断片を含む、免疫分析試薬。
- 酵素で標識した請求項1に記載の抗体又はその断片を含む、免疫分析試薬。
- FERM P−22075を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を色素または蛍光色素を含むラテックス粒子で標識した標識抗体と、FERM FERM BP−11489(FERM P−22073から移管)、FERM P−22074又はFERM P−22077を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体との組み合わせからなる、免疫分析試薬。
- 犬TSH測定用であることを特徴とする請求項3から6の何れか1項に記載の免疫分析試薬。
- 請求項3から7の何れか1項に記載の免疫分析試薬に、試料を接触させることを含む、試料中のTSHの測定方法。
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